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UNIVERSIDAD DE ORIENTE

NCLEO DE NUEVA ESPARTA


ESCUELA DE CIENCIAS APLICADAS DEL MAR
BOCA DEL RIO

PROYECTO DE TRABAJO DE GRADO

Evaluacin del rendimiento de fucoidanos a partir de dos especies de algas sometidas


a cultivo, Sargassum spp, y Spatoglossum spp. (OCROPHYTAS, PHEOPHICEAE)
presentes en la costa Oeste de la isla de Margarita, Estado Nueva Esparta.

JESUS LUNA

FECHA

FABIOLA RUGUIEIRO

FECHA

JULIO CESAR RODRGUEZ

FECHA

___________________________
Coordinador de la CTG- Acuacultura

UNIVERSIDAD DE ORIENTE
NUCLEO NUEVA ESPARTA
DEPARTAMENTO DE ACUACULTURA
2010

Evaluacin del rendimiento de fucoidanos a partir de dos especies de algas sometidas


a cultivo, Sargassum spp, y Spatoglossum spp. (OCROPHYTAS, PHEOPHICEAE)
presentes en la costa Oeste de la isla de Margarita, Estado Nueva Esparta.
INTRODUCCION

La mayora de los estudios realizados en el campo de la ficologa se han


enfocado en la investigacin sobre aspectos ecolgicos, taxonmicos y de
distribucin de las algas. A pesar de esto, ciertos investigadores de muchos
pases han mostrado un gran inters por el estudio de sus propiedades
qumicas, fsicas y biolgicas. Estos trabajos han demostrado que muchas
especies poseen propiedades con un sinnmero de aplicaciones industriales
(Charzeddine & Farias 2001), donde las qumicas le confieren gran
importancia para su utilidad en la industria farmacutica.
Las especies pertenecientes a la clase Phaeophyceae o feofceas (algas
pardas) son las de mayor tamao en ecosistemas marinos y las ms
abundantes en regiones subtropicales y subtempladas del mundo. Desde la
antigedad el grupo de las algas pardas han sido utilizadas como fertilizantes
para suelos por su elevado contenido en minerales, vitaminas, protenas y
polisacridos (McHugh, 2003). No obstante, en los ltimos 30 aos se han
realizado numerosas investigaciones sobre los usos y aplicaciones de estas,
tanto como material para alimentacin de humanos y animales, fertilizantes en
cultivos de hortalizas y fitoplancton, y sobretodo en la intensiva bsqueda de
drogas en la industria farmacutica.

Dentro de la gama de compuestos que presentan las algas, se


encuentran los fucoidanos, los cuales son polisacridos prcticamente lineales
o con ramificaciones muy cortas, de peso molecular disperso, que dependiendo
de la cantidad de L-Fucosa presente en la molcula, pueden clasificarse como
homofucanos o heterofucanos y se han extrado de las feofceas (Martines
1998).
Las algas pardas contienen alrededor de un 4,6% de polisacridos
sulfatados, estos poseen propiedades farmacolgicas importantes, entre las
ms

estudiadas

tenemos

propiedades

antivirales,

anticancergenos,

antitrombticas, antiinflamatrias y anticoagulantes (Roger et al. 2002, Casas


et al. 2006, lvarez et al. 2006). Con el paso de los aos la comunidad
cientfica ha incrementado el inters por el aislamiento e identificacin de
nuevos polisacridos bioactivos especialmente los polisacridos sulfatados
(Fucoidanos). Sus actividades biolgicas, son el resultado de la interaccin de
carbohidratos y protenas, sin embargo es necesario desarrollar mtodos que
faciliten la deteccin de polisacridos de bajo peso molecular para su
identificacin, caracterizacin y estudios de sus funciones biolgicas (Roger et
al. 2002).
Los polisacridos sulfatados presentes en las algas pardas han
mostrado actividad antiviral contra muchos virus que atacan el cuerpo humano,
tales como el virus del herpes simple (HSV) 1 y 2 y contra el virus (RSV). Los
compuestos fucoidanos aislados es de especies de Sargassum poseen amplia
actividad antibitica, aglutinante, coagulante, mitognica, anticoagulante, antitumorales, anti-cancergena, anti-inflamatoria, insecticida, eutoxinas y otras
muchas mas (Smit 2004).
Entre algunos de los estudios realizados tenemos el fraccionamiento de
fucoidanos con etanol a varias concentraciones, dichas fracciones han
mostrado actividades anticoagulantes correspondientes a un 60 y 80 % de la
actividad de la heparina en la sangre humana (Pelegrn 2001).
Las investigaciones ms recientes llevados a cabo en el Instituto
Francs de Investigacin y Explotacin del Mar (IFREMER) demostraron que el
alga parda Ascophyllum nodosum es una especie de la cual se puede extraer

compuestos bioactivos para combatir la trombosis. Existen estudios con otras


especies tropicales como Turbinaria ornate y Sargassum mangarevense, las
cuales son usadas en la industria alimenticia en el sur de Asia, como fertilizante
en Vietnam y colectadas para la produccin de alginatos en Filipinas e India
(Pelegrn, 2001).
A nivel mundial la FAO ha reportado que la demanda de ficocoloides o
gomas marinas aumenta anualmente y se necesita materia prima y extractos
que suplan las necesidades de las diferentes industrias a nivel mundial. En los
aos 1990-2000 el volumen y el valor de las macroalgas increment de US $ 4
a 5.5 billones- US $ 6 billones por un volumen de 10 millones de toneladas
anuales, y se reporta que la produccin de algas pardas tuvo un increment en
los aos 1991-1993 de 5-5.5 millones de toneladas con un valor de US $ 1.8
billones y su demanda sigue aumentando a nivel mundial (NDP Marine RTDI
Desk Study Series. 2004).
Adems de esto, las algas marinas como organismos fotosintticos,
estn expuestos a una combinacin de luz y altas concentraciones de oxgeno,
lo cual permite la formacin de radicales libres y otros agentes oxidantes. Los
elementos del aparato fotosinttico son especialmente vulnerables al dao
fotodinmico ya que los cidos grasos poliinsaturados son importantes
componentes estructurales de la membrana de los tilacoides. La ausencia de
estos daos en las algas nos lleva a pensar que las clulas de estos
organismos marinos deben tener mecanismos y compuestos que previenen y
protegen de la oxidacin. De esta forma constatamos que las algas marinas
constituyen una fuente importante de compuestos antioxidantes y de enzimas
protectoras que permiten luchar contra las especies reactivas del oxgeno
formadas a partir de nuestro metabolismo. Estas sustancias antioxidantes son
de naturaleza variada y pueden estar aisladas (Pelegrn 2001).
Los principales compuestos bioactivos producidos por las algas marinas
estn formados por muchos metabolitos secundarios, cada uno de estos posee
una funcin especfica dentro de su medio, esto hace que cuenten con una
gran defensa qumica contra herbvoros marinos. Estos metabolitos tambin

estn asociados a la disminucin de epifitos, inhibiendo a los organismos


competidores y patgenos microbianos (Magallanes 2003).
De acuerdo a Fenical (1982), existen dos tipos de metabolitos, los
primarios y los secundarios, al primer grupo pertenecen los carotenoides y los
esteroles. Por lo que respecta a los metabolitos secundarios, al igual que
sucede en las plantas terrestres, las estructuras son modificadas debido a los
elementos presentes en el medio marino, tales como los cloruros, bromuros y
yoduros. Dichos elementos son incorporados a los organismos marinos y
participan en las sntesis de compuestos halogenados, va comn en el medio
marino, mientras que en el terrestre es un proceso complejo.
Los tres principales tipos de metabolitos secundarios de acuerdo a
Fenical (1982) son terpenos, acetogeninos y los metabolitos nitrogenados. Los
terpenos son los metabolitos secundarios ms importantes en el medio marino,
se forman va condensacin de unidades de isopentenil de pirofosfato y son
metabolitos de peso molecular alto como los diterpenos. Por el contrario, en las
plantas terrestres, es comn la obtencin de terpenos de menor peso molecular
como los monoterpenos responsables del aceite aromtico de las plantas. En la
biosntesis de terpenos marinos participan los halgenos, especialmente los
bromuros, a travs de reacciones cclicas produciendo haloterpenos.
El segundo grupo de metabolitos secundarios es el de los acetogeninos,
compuestos lineales producidos a travs del precursor acetil CoA, este patrn
es el responsable de la sntesis de lpidos como los cidos grasos. A este grupo
pertenecen los halometanos, considerados como potentes biocidas, como
ejemplo se tiene al cido actico halogenado. Finalmente, los metabolitos
nitrogenados son comunes en el medio terrestre y marino, en ste ltimo,
existen las condiciones que propician la sntesis de una gran cantidad de
aminocidos como algunos derivados de la tirosina.
Por otro lado, el metabolismo del aminocido triptofano es un proceso
que genera residuos indol, como los polihaloindoles de Laurencia brongniartii y
Rhodophyllis membranaceae. En general, dichas molculas son las que

confieren a las algas su actividad antimicrobiana. El aislamiento de los


metabolitos depender en primer lugar del tipo de solvente usado en la
obtencin del extracto, es decir, del grado de afinidad polar entre los
metabolitos y los solventes utilizados; y en segundo lugar, de la metodologa o
tcnica de separacin de los metabolitos del extracto.

Ciertos estudios han demostrado que especies pertenecientes al Orden


Fucales poseen excelentes propiedades anticoagulantes, hemaglutinante,
antibacterianas, antivirales y anticancergenos, entre las ms importantes
(Pelegrn 2001).
Especies como Sargassum spp. han sido usada hace muchos aos para
la alimentacin, medicina, comida para animales y fertilizantes, especialmente
en Asia. En China, Filipinas, India y Vietnam es colectada como materia prima
del medio para procesos industriales de extraccin de alginatos, de igual forma
muchas especies de algas pardas han sido cultivadas en pases como India,
Filipinas y Vietnam, siendo estos los de mayor produccin (Zubia 2003).
El gnero Sargassum C. Agard 1820, se caracteriza por ser plantas
erectas, fijas por un slido pie basal o por crecimientos externos rizoidales de
los ejes principales, o de flotacin libre; ejes principales cilndricos, con ramas
determinadas e indeterminadas produciendo lminas con costilla central,
anchas a filiformes, simples ocasionalmente bifurcadas, enteras o aserradas;
vesculas pediceladas comunes; ramas receptaculares desarrollndose en las
axilas de las hojas o paniculadas, generalmente cilndricas, con menos
frecuencia prismtica comprimida o aplanadas; monoica o dioica (Martnez
1998).
En margarita se encuentran reportadas tres especies de este Gnero,
las cuales son: S cymosum, S. vulgare y S. filipendula. (Aponte, 1985,
Cappechi, 1989, Pardo y Sol, 2007). De estas las ms regulares durante todo
el ao son las dos ltimas estando establecidas durante casi todo el ao.
Durante los meses de Enero a Julio se originan en la isla arribazones causado
por el embate del oleaje y la excesiva biomasa en los fondos costeros. Los
arribazones se consideran como una representacin muestral de los bancos

naturales en las costas, por lo que la presencia de estas especies siguiere la


existencia de acumulaciones densas que garanticen su presencia en prcticas
de extraccin o para siembra en acuacultura.
Por su parte, existe en la isla un alga parda de gran tamao y de
importante presencia en arribazones durante casi todo el ao (Aponte, 1985
Cappechi, 1989, Pardo y Sol, 2007). Se trata de Spatoglossum schroederi, la
cual es perteneciente a la familia Dyctiotaceae y ha demostrado tambin gran
rendimiento de los componentes glucoso-sulfatados mostrando inhibicin a la
adhesin celular (Rocha et al 2001). Adems de ello, se demostr una
particular actividad del compuesto aislado (Xilofucoglucoronano) en la
estimulacin del heparan sulfato (Leite et al 1998).
Los recursos algales presentes en la Costa margaritea no han sido
valorizados ni explotados y cuentan con una gran riqueza y diversidad de
especies aun sin explorar. En muchos pases estos estn siendo aprovechados
econmicamente, la demanda de estos productos a nivel mundial es grande y
actualmente no se suple toda esta demanda. Es por ello que la realizacin de
estudios sobre la composicin qumica y el desarrollo de productos y
compuestos de inters farmacolgico como los fucoidanos se hacen
necesarios.
Se espera que el presente trabajo pueda generar, aunque sea de
manera preliminar, una valiosa informacin para las industrias farmacuticas
permitiendo al mismo tiempo destacar la urgente necesidad de realizar
programas y estrategias de aprovechamiento sostenible de este importante
grupo de algas marinas. Es por esto, que se hace necesaria la presente
investigacin como un primer paso hacia los conocimientos de la composicin
qumica de las especies de los gneros Sargassum spp, y Spatoglossum spp
en la costa margaritea y su posible utilizacin y aplicacin farmacolgica.

Caracteristica de las especies


Sargassum cymosum Ktz. (Fig. 25)
Taylor (1960); Daz-Piferrer (1970); Ros (1972); Bertossi (1973);
Schnetter (1978); Lemus (1979); Szchy & Cordeiro (1991); Ardito et al. (1995);
Camacho (2003).
Alga color marrn oscuro, 13,5 cm de alto; eje y ramas cilndricas con
protuberancias; sin espinas. Ramificacin lateral, alterna y abundante. Filoides
simples, aplanados, lanceolados a lineales, de (0,2) 0,33 (0,36) (DS = 0,12) cm
de ancho, (1,50) 1,71 (2) (DS = 0,33) cm de largo, con base simtrica; filoides
en la parte media del talo oblongos lanceolados; criptstomas de (113) 170,12
(208) (DS = 32,1) m de dimetro, ubicados irregularmente, cerca de la vena
central; aerocistes ausentes. Margen de los filoides ondulado, entero. Regin
interna de los filoides formada por ms de seis capas de clulas ovaladas,
circulares, incoloras, de (98,4) 107,38 (131,5) (DS = 19,68) m de ancho y de
(24,6) 43,73 (61,5) (DS = 15,04) m de largo; clulas de la corteza, cuadradas,
pigmentadas, de (12,3) 13,94 (16,4) (DS = 2,24) m de ancho y de (16,4) 18,04
(20,5) (DS = 2,24) m de largo. Receptculos verrugosos, creciendo en forma
de racimos de (3,2) 3,98 (5,12) (DS = 0,87) mm de ancho, con un pedicelo
corto que las sostiene. Ramificacin dictoma, presentes en ramitas de primer
y segundo orden, disminuyendo el tamao y el nmero de filoides por rama.
Creciendo sobre sustrato rocoso, en la zona mesolitoral. Los ejemplares
estudiados concuerdan con las caractersticas dadas por Lemus (1979) y
Bertossi (1973) en estudios para Venezuela.
Sargassum vulgare C.Agardh nom. illeg. (Fig. 26)
Taylor (1960); Ros (1972); Bertossi (1973); Schnetter (1976); Lemus
(1979); Aponte (1985); Szchy & Cordeiro (1991); Garca (1999); Littler & Littler
(2000); Camacho (2003).
Alga de color marrn claro, 33,52 cm de alto; eje y ramas terete con
espinas, de (0,05) 1,37 (2,49) (DS = 1,2) mm de largo, adheridas al sustrato por
medio de un disco crneo del cual se desprenden varios ejes. Ramificacin

alterna y radial. Filoides oblongos, lineales, de (0,41) 0,52 (0,68) (DS = 0,13)
cm de ancho y (1,52) 2,42 (3,35) (DS = 0,66) cm de largo. Margen dentado;
base asimtrica; criptstomas circulares de (48,6) 75 (103) (DS = 15,21) m de
dimetro, esparcidos por ambos lados de la vena; aerocistes esfricos de (2,7)
3,38 (4,16) (DS = 0,57) mm de dimetro, con un pedicelo de 3,34 mm de largo.
Regin interna de los filoides formada por dos a cuatro capas de clulas
ovaladas, incoloras, de (49,2) 69,7 (82) (DS = 14,2) m de ancho y de (28,7)
36,9 (45,1) (DS = 6,48) m de largo; clulas de la corteza rectangulares,
ovaladas, pigmentadas, de (16,4) 18 (20,4) (DS = 2,19) m de ancho y de
(12,3) 14,76 (16,4) (DS = 2,24) m de largo. Receptculos verrugosos,
pedicelados, dispuestos en grupos, con ramificacin dictoma y trictoma de
(4,1) 5,58 (7,45) (DS = 1,14) mm de largo. Creciendo sobre sustrato rocoso,
arenoso en las zonas mesolitoral e infralitoral. Sargassum vulgare se diferencia
morfolgicamente de S. cymosum por la forma y tamao de sus filoides, los
cuales son de cuatro a seis veces ms anchos que largos y presentan margen
dentado, caractersticas que coinciden con la descripcin realizada por Szchy
& Cordeiro (1991); internamente S. vulgare muestra de dos a cuatro capas,
mientras que S. cymosum tiene ms de cuadro capas celulares, adems las
clulas de esta especie son ms grandes que las de S. vulgare.
Spatoglossum schroederi (C.Agardh) Ktz. (Fig. 24) Vickers (1908);
Taylor (1960); Hammer & Gessner (1967); Joly (1967); Ros (1972); Lemus
(1974); Richardson (1975); Schnetter (1976); Lemus (1979); Szchy & Cordeiro
(1991); Littler & Littler (2000).
Alga de color marrn oscuro, 17,52 cm de alto. Talos cintiformes,
laminares, ondulados, de (0,75) 1,13 (1,09) (DS = 0,32) cm de ancho;
proliferaciones en la parte basal. Ramificacin subdictoma, irregular, grupos
de pelos largos sobre la superficie, ubicados irregularmente en ambas caras.
Margen dentado. pices obtusos y algunas veces agudos, con clulas de
crecimiento ordenadas en una fila longitudinal. Regin medular prxima al
pice del talo, compuesta por dos hastacuatro capas de clulas, pigmentadas,
de (20,5) 37,31 (53,3) (DS = 11) m de ancho y (49,21) 64,82 (86,1) (DS =
11,1) m de largo; porcin basal hasta de siete capas de clulas; corteza

formada por una capa de clulas cuadradas, rectangulares, pigmentadas, de


(12,3) 22 (69,71) (DS = 19,51) m de ancho y (16,4) 30,8 (53,30) (DS = 12,4)
m de largo. Creciendo sobre sustrato rocoso, en la zona mesolitoral.
El nmero de capas celulares reportadas para Spatoglossum schroederi
presenta gran variabilidad, puede tener desde cuatro (Ros 1972) hasta 10
capas celulares (Vickers 1908); sin embargo, Szchy & Cordeiro (1991)
consideran que este nmero vara de acuerdo al crecimiento de esta especie,
ya que el nmero mayor de capas se encuentra en la zona basal (20 capas)
dando as mayor rigidez y dureza, mientras que la parte apical posee como
mximo dos capas, es ms flexible y se encuentra expuesta al movimiento
directo del agua. En los ejemplares estudiados se observaron alturas dentro de
los rangos reportados por Lemus (1974), Ros (1972) y Taylor (1960).

OBJETIVOS
General

Evaluar el rendimiento de fucoidanos y de de dos especies de algas cultivadas:


Sargassum spp y Spatoglossum spp. presentes en el Litoral Oeste
margariteo.
Especficos

Identificar taxonmicamente las especies de los gneros Sargassum, y


Spatoglossum spp recolectadas en las dos zonas de muestreo.

Establecer un modelo de cultivo estndar para las dos algas identificadas.

Determinar el rendimiento de fucoidanos por deteccin qumica de las


muestras

de

macroalgas

cosechadas

en

los

sistemas

de

cultivo

implementados, luego de tres meses de cultivo.

Comparar la concentracin de fucoidanos de las diferentes especies


cosechadas en los cultivos y entre

estas y las presentes en los bancos

naturales de donde se las extrajo.


Relacionar los parmetros temperatura, salinidad, luminosidad, nutrientes y
transparencia, con la concentracin de fucoidanos extrados de las especies
estudiadas.

METODOLOGA

ESTUDIO DE CAMPO
1. Colecta
Las algas sern recolectadas en zonas meso y sublitoral rocosas de diferentes
estaciones de la costa oeste de la isla, durante el mes de Septiembre del 2010.
Paralelo al muestreo, se medirn ciertos parmetros ambientales como temperatura y
transparencia del agua con ayuda de un termmetro de mercurio y un disco Secchi
respectivamente, ya que la temperatura y luminosidad en el agua son los parmetros
que tienen mayor incidencia en el crecimiento de las algas marinas (Bula, 1990, 2004).
Adems de ello, se recogern muestras de agua para determinar los niveles de
nutrientes y salinidad presentes en los bancos naturales.
Las muestras se lavarn con agua de mar para eliminar los organismos epifitos
y los restos de sedimento, arena y organismos adheridos a estas. Luego sern
colocadas en bolsas plsticas debidamente identificadas para su traslado en cavas
con hielo (Charzeddine & Farias 2001) hasta las instalaciones del laboratorio para su
eventual identificacin y preservacin en fro (congelado a -20 C) luego se proceder
a iniciar la fase de laboratorio desglosada a continuacin:

2. Fase de laboratorio.
a. Identificacin taxonmica
Las algas recolectadas sern identificadas en lo posible con la ayuda de las
claves taxonmicas de Joly (1976), Taylor (1939) y Littler & Littler (1989).
b. Extraccin de fucoidanos
Las algas se descongelarn a temperatura ambiente en el laboratorio para
luego secarlas en estufa a 40 C el tiempo suficiente hasta lograr peso constante.
Posteriormente sern triturados unos 100 g de muestra con un molino y sern tratadas
con etanol al 90% para remover los compuestos lipoflicos segn la metodologa
descrita por Lee (2004). Diez (10) g de alga seca sern tratados con 0.05M de HCl por
3 horas a temperatura ambiente realizando movimientos constantes, luego esta
mezcla ser sometida a centrifugado a 23000 g por 20 min. El sobrenadante ser

filtrado con una membrana de Celite 545 y neutralizado con una solucin 0.5M de
NaOH, posteriormente se precipitar con etanol al 90%. La muestra obtenida ser
secada al vaco y se obtendr el fucoidano crudo (Zhu 2003).
c. Purificacin del fucoidano crudo.
A esta fraccin de fucoidano crudo le ser agregada una solucin de BaCl 2 al
1,0%, luego ser filtrado con una membrana de Celite 545, dializado con agua
destilada por 24 horas a temperatura ambiente, la muestra obtenida se filtra
nuevamente con un filtro Celite 545 y se proceder a desionizar en una columna
Amberlite IR-120(H+). Posterior a la desionizacin se neutraliza la muestra con NaOH
al 0.05M para finalmente ser liofilizada, el producto ser molido con ayuda de un
mortero y se obtendr el fucoidano puro (Zhu 2003).

3. Elaboracion de Sistemas de cultivo


Una porcin de las macroalgas colectadas sern utilizadas para el encordado
en hebras de polipropileno, que se suspender en el medio a modo de monolneas
simples con manojos a 20cm de separacin y profundidad de 0,70cm. Se construirn
dos mdulos de cultivo para cada alga cultivada, de manera que se pueda obtener una
rplica por sistema empleado. Los sistemas se anclaran mediante muertos de
concreto elaborados y la flotacin estar llevada a cabo por envases de

polietilentereltalato de 5L.
Luego de transcurrido tres meses bajo cultivo para las dos especies algales, se
proceder a cosechar todo el contenido, homogeneizar toda la muestra obtenida y
utilizar una porcin al azar para la determinacin de Fucoidano crudo llevada a cabo
de igual manera para las muestras naturales.

4. Anlisis de los resultados


Los datos de temperatura, transparencia de agua, salinidad y nutrientes, as
como tambin los obtenidos en la fase de laboratorio se consignarn en tablas
estadsticas con ayuda del programa Excel, estos datos sern procesados con
estadstica bsica: Media, Mediana y Anlisis de Varianza.

Los datos de los parmetros ambientales medidos sern tratados con Anlisis de
componentes principales, para determinar el componente medioambiental que define
el comportamiento biolgico de las especies estudiadas con ayuda del programa
estadstico Stat Graphic.
.

PRESUPUESTO

BIBLIOGRAFIA CONSULTADA
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http://dx.doi.org/10.1016/S0144-8617(02)00030-9

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TIEMPO DE EJECUCIN DEL PROYECTO

2010
Acciones a realizar

Jun.

Jul.

Revisin

2011

Ago.

Sep.

Oct.

Nov.

Dic.

Ene.

Feb.

Mar.

Abr.

Bibliogrfica
Elaboracin

y entrega del proyecto


Muestreo
Elaboracin de los bioensayos (sistemas).

Anlisis de parmetros.

Anlisis de muestras y datos


Redaccin del documento.
Defensa de tesis

May.