Vacuna conjugada contra Haemophilus tipo B: cintica posterior a la vacunacin de las

respuestas de anticuerpos IgM e IgG en diez nios vacunados.

Un nuevo tipo de vacuna conjugada con polisacrido capsular polirribosil-ribitol-fosfato (PRP)
purificado de Haemophilus influenzae tipo b (Hib) unido covalentemente a toxoide tetnico est
disponible en Francia y otros pases.
Hemos estudiado la cintica de la respuesta inmune en diez nios de 17 a 50 meses, durante las 4
semanas despus de la inmunizacin con una dosis de la vacuna contra el Haemophilus tipo b
conjugada. Ocho muestras de suero se obtuvieron de cada nio en el da 0 (D0), D2, D4, D7, D10,
D14, D21 y D28. Un mtodo de ELISA se ha utilizado para discriminar entre clases IgM e IgG de
anticuerpos anti- polirribosil-ribitol-fosfato. Un alto nivel de IgM apareci en el D7 y persisti hasta
el D28. El aumento de la IgG era regular y progresiva desde el D7.
MATERIALES Y METODOS
Diez nios franceses, 17-50 meses de edad, participaron en el estudio, que fue aprobado por el
comit de tica, tras el consentimiento informado de sus padres.
Ocho de estos nios vivan en un instituto mdico (Tabla 1).

Tabla 1: La edad y el sexo de los diez

nios que reciben una dosis de
Vacuna
conjugada
contra
Haemophilus tipo B

Vacuna
La vacuna conjugada contra Haemophilus de tipo b, contena 10 ug de PRP conjugado
covalentemente con 20 ug de toxoide tetnico usando dihidrazida de cido adpico. Se liofiliz y se
diluy en un tampn de solucin salina justo antes de la inyeccin. Los nios recibieron una sola
inyeccin subcutnea en la regin deltoidea.
Suero
La sangre se recogi en el da 0 (DO) antes de la vacunacin, y luego a D2, D4, D7, D10, D14, D21 y
D28 y los sueros se mantuvieron congeladas a -20 C. Un patrn interno positivo (adultos
vacunados) que contiene 32ug anticuerpo capsular Hib PRP por ml y un nivel negativo interno que
contiene < 1 ug de anticuerpo por ml se incluyeron en cada placa ELISA. La cantidad de anticuerpos
totales contenidos en los estndares se determin por un mtodo no publicado RIA
(Raidioinmunoensayo) original de Institut Mrrieux, utilizando un poliosido que se yoda y se purific
por cromatografa en Sephadex G50 y Sepharose CL-2B.

Figura I: Cintica de los anticuerpos

anti-PRP de clase IgM despus de
una sola inyeccin de la vacuna
contra el Haemophilus tipo b
conjugada para diez nios 17-50
meses de edad

Antgeno
El antgeno de prueba consista en el PRP capsular de Hib a la que se adjunta ADH (poliosido AH 290 bis Institut M6rieux) a fin de permitir la fijacin de biotina.
Mtodo ELISA
Un mtodo inmunoenzimtico se utiliz para el ensayo de anticuerpos IgM e IgG en el suero. Placas
de microtitulacin se recubrieron mediante la adicin de 100uL de 4ug ml-1 de estreptavidina en
PBS que contena 0,1% de azida de sodio a los pocillos. Despus de reposar durante la noche a
temperatura ambiente (RT), se lav tres o ms veces con solucin salina tamponada con fosfato
(PBS). La alta afinidad de estreptavidina por la biotina permite la slida unin de 1ug ml-1 de
polisacridos biotinilado de Hib a las placas (2 h de contacto en RT). Estas placas se pueden
almacenar durante varios meses a 4 C. Antgenos, sueros, anticuerpos monoclonales y enzimas
conjugados se diluyeron con PBS recin preparado que contiene 10 gL-1, protenas de la leche 30 gL1
de polietilenglicol (PEG) 6000 y 1 g L-1Triton X100. El PBS suplementado se us para lavar las placas
tres o ms veces en cada paso de la prueba. A continuacin, se aadi 100uL de una dilucin 1/100
de los sueros ensayados a los pocillos y se dej reposar a RT durante la noche. Posteriormente, se
aadi 100uL de una dilucin 1/1000 de anticuerpo monoclonal murino de cualquiera de IgG antihumana o IgM anti-humana a los pocillos se lavaron y se dej reaccionar durante 2 h a anticuerpos
RT. Los anticuerpos unidos se hicieron reaccionar con 100 uL de un 1 / 1000 dilucin de marcado
con fosfatasa alcalina de inmunoglobulina G anti-ratn (H + L), y despus de 2 h a RT, la etiqueta
unida se revel mediante la adicin de 100 uL de sustrato de fosfato de paranitrofenilo 1 mg mL-1
en Tris-HCl 1M, pH 9.2. La reaccin fue bloqueada despus de 30 minutos mediante la adicin de

100 l de NaOH de 2 M. La placa se ley a 405 nm. Los ttulos se expresaron como unidades arbitrarias
(AU) con referencia al suero positivo estndar de acuerdo con la frmula:
UA = 100 x [(Ax ABX) - (AN- ABN)] / [(AP-ABP) - (AN - ABN)]
Donde AB es la absorbancia (A) correspondiente a 'blancos' emparejado con cada pocillo de
microtitulacin, X el suero probado, N el estndar negativo interno y P el estndar positivo interno.
RESULTADOS

Figura 2: Cintica de los anticuerpos

anti-PRP de clase IgG despus de
una sola inyeccin de la vacuna
contra el Haemophilus tipo b
conjugada para diez nios 17-50
meses de edad

La cintica de IgM e IgG anti-PRP se representaron grficamente por separado (Figuras I y 2). En
D0, los sueros de los siete hijos de cada diez no contenan anti-PRP. Las respuestas inmunitarias
individuales de los diez nios se distribuyeron en tres grupos: alto (n = 4), moderada (n = 3) y baja o
inexistente (n = 3). Los altos niveles de IgM anti-PRP se detectaron en un nio en D2 y en otros en
D4 o D7. Adems en otro seis, persisti hasta D28. Las respuestas de IgG fueron significativas a D14
de cada cinco nios. El anlisis Friedman de dos vas de la varianza para los diez nios ha demostrado
que la evolucin de los niveles de IgM e IgG contra el tiempo fue altamente significativa. La prueba
de Dunnett, que analiza cada muestra de vez en contra de DO, ha demostrado una diferencia
significativa en D7 para IgM y en D14 para IgG. No hubo variacin significativa como una funcin del
tiempo en el perodo postvacunal inmediata.
DISCUSION
La nueva vacuna Haemophilus tipo b conjugada exhibe una inmunogenicidad mejorada en
comparacin con la de la vacuna no conjugada Haemophilus tipo b, medida en bebs y nios.
Encontrado un aumento de diez veces en la respuesta inmune despus de la inmunizacin con la

vacuna conjugada en comparacin con la vacuna no conjugada en nios de 18 a 24 meses de edad.

Adems, a diferencia de la vacuna Haemophilus tipo b, el conjugado era inmunognico en lactantes
y nios de 2 a 18 meses de edad con la reactivacin de la inmunizacin despus de la segunda y
tercera inyeccin. Cleasson y sus colaboradores midieron una media geomtrica (GM) para los
niveles de Ab-PRP contra de 3.7ug ml-1 despus de la segunda inyeccin en lactantes vacunados a
la edad de 3 a 5 meses. Kayhty y sus colegas la observ una respuesta inmune (anti-PRP aumento
Ab GM: 0,82 ug ml-1) despus de la primera dosis en nios de 6 meses de edad, y un nivel medio
(GM) de 6.10 ug ml-1 1 mes despus la segunda inyeccin (a los 7 meses de edad). Despus de la
vacunacin de los nios a la edad de 3, 4 y 5 meses con tres dosis de la vacuna contra el Haemophilus
tipo b, determinaron 0.7, 6.7 y 8.7 ug ml-1 significan los niveles de anti-PRP Ab respectivamente. En
un estudio realizado por Parke y colegas que incluyeron lactantes inyectados con la vacuna contra
el Haemophilus tipo b conjugada a los 3, 5 y 7 meses de edad, un nivel de proteccin que se alcanz
(> 1 ug ml-1) en el 36% de los nios despus de la primera, 80% despus de la segunda y el 92%
despus de la tercera dosis. Anti-PRP Ab se midieron por RIA en los estudios anteriores, pero por
ELISA en el presente estudio. La ventaja de este mtodo cualitativo es que las subclases de
inmunoglobulinas pueden ser distinguidas. Adems, es ms fcil de realizar y por lo tanto fcilmente
podra ser utilizado para probar la respuesta inmune a la vacuna. El lmite de este estudio fue el
pequeo nmero de nios utilizados. De hecho, no fue posible incluir ms de diez nios a causa de
las muchas muestras de sangre (ocho) que deban tomarse. La tolerancia a la vacuna Haemophilus
tipo b conjugada era bueno.
Nuestros resultados confirman que una buena respuesta inmunitaria en nios compuesta de 17 a
50 meses a la vacuna de conjugado de Haemophilus tipo b puede verse tan pronto como la primera
vacunacin, ya que siete de los diez nios convertidos a altos niveles de IgM. Las mltiples muestras
de suero ensayadas por ELISA nos han permitido estudiar la cintica de IgM e IgG anti-PRP Ab. Es el
resultado de este estudio que la respuesta inmune a la vacuna fue rpida. Hubo un aumento
repentino IgM entre D4 (D2 para un nio) y D7. El nivel de IgG aument progresivamente de manera
significativa desde D14 en adelante. Inesperadamente, en el suero de tres nios en el grupo de edad
estudiado (17-50 meses), anti-PRP Ab especfica se detectaron antes de recibir la vacuna contra el
Haemophilus tipo b conjugada. Este resultado podra explicarse por el hecho de que estos nios
fueron institucionalizados.