UNIVERSIDAD MAYOR DE SAN ANDRS

FACULTAD DE INGENIERA
INGENIERA AMBIENTAL
GESTIN II/2013

INGENIERA BIOQUMICA
PRQ-216 L

INFORME DE PROYECTO

DETERMINACIN Y AISLAMIENTO DE BACTERIAS

DEL RUMEN
DE LA VACA QUE DEGRADAN CELULOSA
Docente:
Estudiantes:
Fecha:

M. Sc. Ing. Virginia Rojas Mercado

Aguilar Coria Ximena Gabriela
Marin Antezana Katherine Stephanie
4 de Diciembre

INFORME DE PROYECTO

DETERMINACIN Y AISLAMIENTO DE BACTERIAS DEL RUMEN

DE LA VACA QUE DEGRADAN CELULOSA
1. ANTECEDENTES
La celulosa es el principal componente de la pared celular de los vegetales, es el elemento ms
abundante de la biomasa terrestre, y es uno de los materiales ms utilizados por el hombre desde los
tiempos remotos. Esta fibra natural, es utilizada como materia prima para la fabricacin de diversos
objetos de uso cotidiano, por lo que se producen grandes cantidades de residuos con este material;
se estima que la biosfera recibe hasta 10 15 toneladas anuales de celulosa en forma de desechos
biolgicos.
La celulosa no es digerible ni aprovechable por el hombre, sin embargo, los rumiantes que son
animales fibrosos, pueden digerir grandes cantidades, gracias a la accin de microorganismos como
bacterias y hongos presentes en el rumen. Estos microorganismos son capaces de degradar los
componentes fibrosos, principalmente celulosa, hemicelulosa y pectina, a travs de diferentes
mecanismos, que de manera efectiva los convierte en compuestos sencillos como cidos grasos y
alcoholes.
El aislamiento e identificacin de microorganismos, con actividad celuloltica representan un
importante recurso, para la disminucin del impacto ambiental producido por los residuos vegetales,
y la generacin por medio de stos residuos, de productos fermentables como el etanol, que podra
convertirse en un biocombustible.
Siendo una gran contribucin para el desarrollo sostenible de los biocombustibles, a travs del
aprovechamiento de residuos.
2. OBJETIVO
2.1. Objetivo General:

Aislar las principales bacterias del rumen de bovinos procedentes de mataderos del
departamento de La Paz que degradan celulosa.

2.2. Objetivos Especficos:

Obtener muestras de rumen bajo condiciones estriles para posteriormente utilizarlas

como punto de partida de este proyecto.
Preparar y utilizar agares especficos para el aislamiento de los microorganismos
objetivo.
Aislar los microorganismos a partir del rumen de vaca para causar una mayor
degradacin de aserrn.

3. JUSTIFICACIN
Actualmente en el mundo se procesa una gran cantidad y diversidad de residuos de celulosa, como
resultado de actividades en la agricultura y la industria. Entre los residuos con alto contenido de
celulosa encontramos los generados por explotacin forestal como el aserrn y de explotacin
agrcola como la quinua, estos residuos a pesar de ser altamente estables y poseer un gran potencial
energtico, no tienen uso alternativo a gran escala.
Los mtodos actuales de disposicin de los residuos forestales, el largo periodo para degradarse y el
inadecuado manejo, generan un alto impacto en el ambiente.
Lo mencionado anteriormente, es un importante argumento para el desarrollo y estudio de
alternativas, que permitan identificar mtodos para degradar y aprovechar la celulosa de los
residuos. El uso de microorganismos con actividad celuloltica, constituye una opcin viable en la
solucin de la problemtica de los residuos vegetales no aprovechados.

4. PROCEDIMIENTO
4.1. Toma de muestras
Las muestras de lquido ruminal se recolectarn en envases estriles de 50 ml. y jeringas de
20 ml. Se recolectaran en forma aleatoria cuatro muestras de lquido ruminal fresco
evitando tocar las paredes del estmago y trasladadas inmediatamente al laboratorio del
IIDEPROQ.
4.2. Diagrama de Flujo

INICIO

Localizacin del lugar de muestreo: (Matadero Municipal "Los

Andes")

En tres envases esterilizados

de 100ml. Directamente del
estmago del vacuno.
Muestreo del lquido ruminal

Esterilizar aserrn a 120C duracte 15 min en el autoclave y luego secar a 50 C en estufa.

Segn especificaciones
anteriores
El aserrn debe tener un
tamao menor a 2 mm.
Preparar el medio de cultivo: Agar Base sangre adicionando 1 % p/p de aserrn

Preparar el liquido ruminal: filtrar y centrifugar.

En tubos ependorf

Crear atmosfera anaerobia: Dentro de una bolsa ziploc hacer

reaccionar cido ctrico, bicarbonato de sodio y agua para
produccin de CO2 y crecimiento de microorganismos
anaerobios.
Introducir las cajas Petri a la
bolsa y sellar bien

Medio de Cultivo: en dos cajas petri con el medio de cultivo

inocular 1 ml de liquido ruminal preparado

Solo aquellas que presenten

crecimiento, si fuese as
esperar 24 horas ms Incubar por 92 horas a 25 C

Procesar cajas para el aislamiento

Emplear la tcnica de siembra a profundidad de las cajas petri con medio

de cultivo antes mencionado, sin embargo se cambio la fuente de celulosa
por papel filtro.

Repetir procedimiento incubando por 24 hrs. hasta que se presente el

crecimiento de bacterias separadas y de un solo tipo

recuperar el papel filtro, labarlo con

agua para remover todas las particulas
de agar que queden, y secar.

pesar la masa final del papel filtro y comparar con la masa

inicial, la resta de estas masas deber representara la masa
de celulosa consumida por el microorganismo.

FIN

5. MATERIALES Y REACTIVOS
-

Materiales

CANTIDAD
20
1
1
1
1
3
1
2
1
5
1
2
1
2
2
1
1
1
1
10
1
-

MATERIAL
Caja Petri
Incubadora
Termmetro de Mercurio
Esptula
Varilla de Vidrio
Matraz Erlenmeyer con tapa rosca
Matraz aforado
Matraz aforado
Vidrio reloj
Vasos de precipitado
Recipiente hermticamente cerrado
Cepillos
Hornilla Elctrica
Pipeta graduada
Pipeta graduada
Autoclave
Garrafa
Piseta
Balanza elctrica
Tubos ependorf
Centrifugadora

Reactivos

REACTIVOS
alcohol
Agua destilada
Aserrn
Agar- Agar
cido ctrico
Bicarbonato de sodio
Muestras de lquido de Rumen de Vaca
Triptosa
Cloruro sdico
Infusin de corazn
Agua peptonada
Papel filtro

6. CRONOGRAMA

CARACTERSTICA
0-100 C
500 ml
250 ml
100 ml
100 ml

10 ml
1 ml

15 ml

ACTIVIDAD

Obtencin del lq. ruminal

Filtrado del lq. ruminal y esterilizacin.
Esterilizacin del aserrn
Esterilizacin de tubos
Preparacin del agar
Incubacin del medio de cultivo
Aislamiento de las cepas obtenidas
Incubacin de cepas aisladas en cajas Petri con papel filtro
Determinacin de la masa del papel filtro 1 da
Determinacin de la masa del papel filtro 1 da
Determinacin de la masa del papel filtro 1 da

COLOR

DA
Trabajo
Das no hbiles
Das de incubacin

7. VARIANTES DEL PROCESO

Primera etapa de aislamiento
- Los cambios que se realizaron en la preparacin del medio fueron:
Para la preparacin de 250 ml de medio se utilizaron los siguientes reactivos en las siguientes
relaciones:
Reactivo
Infusin de cerebro y corazn
Triptona
Agar-Agar
NaCl

Masa utilizada (g)

9.25
0.185
1.0
0.0925

Se realiz la esterilizacin del medio respectivo a 111C durante 15 min

Conjuntamente se autoclabaron 50 g de aserrn en un embase separado.
- Preparacin del inoculo
Para la preparacin del inculo se tomaron muestras del lquido ruminal de vaca, provenientes del
altiplano (La Paz, Oruro, de 3 animales, estas muestras fueron tomados en frascos de vidrio color
mbar previamente esterilizados.
Las muestras tomadas se mantuvieron a temperaturas de 20 C en frascos hermticamente cerrados
durante 3 das, pasado este tiempo se procedi a centrifugar con la ayuda de tubos Eperndorf a 250
rpm durante 15 min. El lquido obtenido libre de slidos suspendidos se utiliz como inoculo.
Volumen del inoculo (ml)
-

Preparacin del CO2

10 ml

Para obtener un medio anaerobio se utilizaron las siguientes cantidades de los compuestos:
Reactivo
cantidad
cido ctrico
3.46 g
Bicarbonato de sodio
4.54 g
Agua destilada
20 ml
Segunda etapa de aislamiento
- Los cambios que se realizaron en la preparacin del medio fueron:
Para la preparacin de 150 ml de medio se utilizaron los siguientes reactivos en las siguientes
relaciones:
Reactivo
Infusin de cerebro y corazn
Triptona
Agar-Agar
NaCl

Masa utilizada (g)

3.5
0.162
0.7999
0.0112

Se realiz la esterilizacin del medio respectivo a 111C durante 15 min

Se procedi tambin a la preparacin de los papeles filtro para nueve cajas petri en vez del aserrn
como fuente de celulosa.
- Preparacin de Agua Peptonada
Para la segunda etapa de aislamiento se inocularon los m.o. hallados a profundidad, y para enjuagar
los mismos se realiz la toma de muestra con agua peptonada de la cual se utiliz las siguientes
cantidades:
Para un volumen de 100 ml:
Reactivo
Agua Peptonada

Masa utilizada (g)

1.5

8. CLCULOS
DATOS OBTENIDOS EXPERIMENTALMENTE
- Primera etapa de aislamiento
Cantidades del medio y del aserrn utilizados por caja petri:
Reactivo
Cantidad Utilizada
Volumen de medio
25 ml
Masa de aserrn
1g
Solo 6 cajas petri tuvieron resultados
- Segunda etapa de aislamiento
Las cantidades utilizadas de medio y agua peptonada por caja petri:
Reactivo
Volumen del medio
Volumen de Agua peptonada

Cantidad Utilizada
16 ml
10 ml

Las masas de los papeles filtro colocados en cada caja al inicio y despus de la incubacin fueron:
# de Caja Petri
1
2

Masa inicial del papel filtro (g)

0,8046
0,9240

Masa final del papel filtro (g)

0,8046
0,9228

T (d)
1
1

3
4
5
6
7
8
9

0,8026
0,8174
0,8271
0,7325
0,8414
0,8984
0,8916

0,8021
0,8165
0,8271
0,7325
0,8370
0,8980
0,8912

PROCESAMIENTO DE DATOS
- En la segunda etapa se puede ver que la masa consumida de celulosa fue:

9. RESULTADOS
- Primera etapa:

# de Caja
Petri

Masa
inicial del
papel
filtro (g)

Masa
final del
papel
filtro (g)

Masa
consumid
a (g)

1
2
3
4
5
6
7
8
9

0,8046
0,9240
0,8026
0,8174
0,8271
0,7325
0,8414
0,8984
0,8916

0,8046
0,9228
0,8021
0,8165
0,8271
0,7325
0,8370
0,8980
0,8912

0
0,0012
0,0005
0,0009
0
0
0,0044
0,0004
0,0004

Foto 1. Medio de cultivo inoculado

Foto 2. Caja Petri despus de la incubacin de 92 hr

2
2
2
3
3
3
3

Foto 3. Caja Petri despus de la incubacin

Foto 4. Caja Petri despus de la incubacin de 92 hr. que presenta m.o. de color blanquecino

- Segunda etapa:
El promedio de lo consumido por el microorganismo en funcin del tiempo es:
Masa
de
celulos
a
promed
io (g)
0,0006
0,0005
0,0013

t (d)

1
2
3

Grfica 1. Masa de celulosa consumida versus tiempo de incubacin.

m(avg) Celulosa (g) Vs. t (d)

0
0
0
m Celulosa (g) Vs. t (d)

0
0
0
0
0
0.5

1.5

2.5

3.5

10. INTERPRETACIN DE RESULTADOS

- Primera etapa de Aislamiento:
Como se podr apreciar en las fotos 4 y 2 se puede apreciar levemente la presencia de
microorganismos de color blanquecino, de forma esfrica los cuales se encuentran en superficie, de
las 10 cajas Petri sembradas con el lquido ruminal solo se pudo detectar en 6 la presencia de
microorganismos, las restantes 4 no presentaron variacin alguna despus de la inoculacin como se
podr apreciar en la foto 3, la cual es idntica a la fotografa 1.
- Segunda etapa de aislamiento:
Como se podr apreciar en los datos obtenidos la variacin de las masas de los papeles filtro por
tiempo se tiene los siguientes resultados:
Primer da
En el primer da se realiz la medicin de la masa de papel de 2 cajas petri en las cuales se pudo
apreciar que en la primera caja no hubo consumo alguno de celulosa del papel filtro, mientras que la
segunda caja petri si hubo consumo de de celulosa.
Segundo da
En el segundo da se realiz la medicin de la masa de papel de 3 cajas petri, pudindose apreciar
en las primeras 2 un consumo de masa pequeo, menor que al del primer da, y en la ltima caja no
se tubo consumo de celulosa.
Tercer da
En el tercer y ltimo da de incubacin se pudo aprecia una cala petri sin cambio de masa del papel
utilizado como fuente de celulosa, y en las restantes tres cajas se pudo apreciar un cambio de masa
del papel en dos de ellas menores a los resultados de los anteriores das y en una de ellas un
consumo bastante alto en comparacin con los dems datos.
11. CONCLUSIONES
Para la primera etapa de aislamiento de microorganismos se logr separar un tipo de
microorganismos esto se evidenci por la formacin de burbujas en el agar, la turbidez del
medio, y por la leve identificacin de m.o. blanquecinos. Sin embargo no se obtuvo la
presencia de los m.o. en todas las cajas petri inoculadas slo en 3 de estas.
Para la segunda etapa de aislamiento de microorganismos se evidenci el leve consumo de
celulosa contenido en el papel, sin embargo se pudo apreciar que la masa consumida por los
mismos fue baja y en algunos casos nula.
Tambin se pudo notar que en la segunda etapa, algunas de las cajas petri no presentaron
crecimiento alguno de m.o. esto debido probablemente a la falta de algn nutriente en el
medio, o en este caso a la falta de CO 2 puesto que la inoculacin se realiz a profundidad y
no en superficie sin contacto con CO2.
12. RECOMENDACIONES
Se pudo apreciar que la presencia de ciertos componentes o la falta de otros en el medio
puede afectar el crecimiento y desarrollo de los m.o.
Un factor muy importante a tomar en cuenta es la temperatura de incubacin y el pH del
medio a utilizarse, en nuestro caso las temperaturas de incubacin fueron bajas por lo cual
el desarrollo de los microorganismos en algunos casos fue nula.
Si se desea utilizar como fuente de celulosa aserrn es aconsejable que este se encuentre lo
ms finamente molido y se recomienda tamizar para obtener una mejor fuente de celulosa.

13. BIBLIOGRAFA
-

Bravo Mara Amparo. (n.d.). Bacterias Anaerobias (Versin Digital). Universidad del
Cauca. Facultad de Ciencias de la Salud.

Mateo-Snchez Jos, Cobos-Peralta Mario A., Trinidad-Santos Antonio, Cetina-Alcal

Vctor, y Vargas-Hernndez Jess. (2002.). AISLAMIENTO DE BACTERIAS
RUMINALES DEGRADADORAS DEL ASERRN. Obtenido el 14 de Noviembre del 2013
de:www.produccion-animal.com.ar
Guerrero A. (2011). Aislamiento de Bacterias Ruminales degradadoras de celulosa (Versin
Digital). Univesidad Politecnica Salesiana. Cuenca.