MANUAL DE PRCTICAS

LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA BASICA

Y
MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS

PROGRAMA DE NUTRICION

ACADEMIA DE MICROBIOLOGIA
Y PARASITOLOGIA
DPTO. CIENCIAS QUIMICO BIOLOGICAS
ICB, UACJ.

DRA. EVANGELINA OLIVAS E. Y

M. EN C. LUIS ROBERTO ALARCON

AGRADECIMIENTOS:
A TODOS LOS PROFESORES DE LA ACADEMIA DE MICROBIOLOGIA Y
PARASITOLOGIA, POR SUS VALIOSAS SUGERENCIAS EN LA ELABORACION DE ESTE
MANUAL.

CONTENIDO:

Pag.

Portada.1
Agradecimientos..2
Contenido..3
Reglamento de laboratorios4
Introduccin a la Microbiologa.6
Bacteriologa7
Prctica # 1 Microscopa.9
Prctica # 2 Inoculacin y Aislamiento de Bacterias .12
Prctica # 3 Tcnicas Microscpicas de Bacterias .........16
Prctica #4 Medios de Cultivo ....20
Prctica # 5 Nutricin Microbiana .24
Prctica # 6 Factores Fsicos sobre microorganismos...26
Prctica # 7 Crecimiento Bacteriano..28
Prctica # 8 Metabolismo Bacteriano....33
Prctica # 9 Variaciones Genticas.. ..40
Prctica # 10 Control de los Microorganismos, efecto de agentes qumicos....42
Prctica # 11Microbiota Normal Humana ....44
Prctica # 12 Relacin Husped Parsito....46
Prctica # 13 Bacterias en el Ambiente..49
Prctica # 14 Eumycetos...51
Prctica # 15 Protozoarios.54
2 PARTE Microbiologa Alimentos..56
Bibliografia ..102

REGLAMENTO PARA ESTUDIANTES

INTRODUCCION
Este reglamento regir la actitud, el comportamiento y el desempeo del estudiante
dentro de los laboratorios de Microbiologa y tiene como finalidad evitar riesgos al personal y
estudiantes que laboran en l, ya que el laboratorio es un rea donde se manejan
microorganismos patgenos, parsitos y algunos compuestos qumicos peligrosos. Asimismo, se
debe cuidar el equipo valioso como son los microscopios y el material delicado como la
cristalera.
REGLAS
1. Todos los alumnos debern asistir con bata blanca larga y el cabello recogido.
2. La entrada al laboratorio quedar restringida exclusivamente a los alumnos inscritos
3. Se PROHIBE INTRODUCIR AL LABORATORIO CUALQUIER ALIMENTO O
BEBIDA, para evitar el riesgo de contaminacin con microorganismos patgenos.
4. Est estrictamente PROHIBIDO FUMAR dentro del laboratorio.
5. Queda prohibido introducir mochilas, cajas de herramienta, etc., debindose colocar estas
en los lockers de la entrada de
6. Cualquier accidente en el laboratorio o derrame de microorganismos, se deber
comunicar inmediatamente al profesor, para evitar el riesgo de contaminacin con los
microorganismos patgenos o parsitos manejados en las prcticas.
7. Se nombrar un jefe de mesa quien ser el responsable del cuidado del material y equipo
y de que la mesa quede aseada y desinfectada. Tambin vigilar que todos los integrantes
de la mesa se laven las manos con antisptico antes de retirarse. El jefe de mesa recibir
del profesor los microscopios y otros materiales y aparatos necesarios para el desarrollo
de las prcticas, y posteriormente los devolver en las mismas condiciones que los
recibi, a excepcin de los materiales especiales indicados por el profesor. (ejemplo
cultivos). En caso de algn dao al material o aparatos, los alumnos integrantes del
equipo estarn obligados a reparar dicho dao en forma que indique el profesor.
8. Para tener derecho a la evaluacin final en la teora, el alumno deber tener el 80 % de
asistencia.
9. Para poder tener derecho a la asistencia se dar 10 minutos como retardo
10. La calificacin final de la materia de Microbiologa quedar constituida por la puntacin
obtenida en la prctica y en la teora, cuya suma se efectuar en la forma siguiente:
a) La calificacin final obtenida en el laboratorio tendr un valor del 30 % de la calificacin
final total.
b) La calificacin total de la teora corresponder al 70 % de la calificacin final.
c) La suma de ambas calificaciones (teora y prctica) ser igual al 100 %.
d) El alumno no podr acreditar la materia si obtiene calificacin reprobatoria en el
laboratorio o en la teora. Debe aprobar ambas para promediarse.
11.- El alumno deber capacitarse con la NOM-087 sobre la Separacin, Tratamiento y
Destino de los Residuos Biolgico- Infecciosos

Introduccin.- El Sistema Nacional de Salud debe garantizar la prestacin de servicios para

promocin, prevencin, diagnstico, tratamiento y rehabilitacin de la salud, regulando los
servicios mdicos para que respondan a las demandas y necesidades de la poblacin.
Los servicios mdicos deben ser de alta calidad en todos los establecimientos,
independientemente del subsector de salud al que pertenezcan, ya sea pblico, social o privado.
Las soluciones tecnolgicas que se instrumenten en los establecimientos objeto de esta norma,
deben ser el resultado de las demandas de actividades de promocin y prevencin de la salud, as
como aqullas dirigidas al diagnstico y tratamiento de las diversas patologas. Se debe indicar
qu tecnologas diagnsticas, teraputicas y de rehabilitacin se utilizarn en los
establecimientos mdicos para atender correctamente tales demandas, lo cual integra el programa
mdico.
La indicacin o el uso de las tecnologas para la salud dependen de la motivacin, de los
conocimientos, de las habilidades y las capacidades del personal de salud y de una correcta
organizacin funcional de los establecimientos de atencin que asegure realizar las actividades
mdicas. Para ello es indispensable contar con una adecuada integracin de la infraestructura y el
equipamiento.
En esta norma se presentan los requisitos mnimos de infraestructura y equipamiento para
hospitales y consultorios de atencin mdica especializada, incluyendo la infraestructura y el
equipamiento para ejercer actividades directivas y de formacin de personal de salud, establecido
como obligatorio por la Ley General de Salud y su Reglamento en materia de prestacin de
Servicios de Atencin Mdica.
1. Objetivo
Esta Norma Oficial Mexicana tiene por objeto establecer los requisitos mnimos de
infraestructura y de equipamiento para los hospitales y consultorios que presten atencin mdica
especializada.
2. Campo de Aplicacin Esta Norma Oficial Mexicana es obligatoria para todos los hospitales
de los sectores pblico, social y privado, cualquiera que sea su denominacin, que realicen
internamiento de enfermos para la ejecucin de los procesos de diagnstico, tratamiento mdico.

MANUAL DE PRCTICAS DE MICROBIOLOGIA

INTRODUCCION.
La microbiologa es la rama de la biologa encargada del estudio de los microorganismos, seres
vivos pequeos (del griego mikros "pequeo", bios, "vida" y - -loga,
tratado, estudio, ciencia), tambin conocidos como microbios. Es la ciencia de la biologa
dedicada a estudiar los organismos que son slo visibles a travs del microscopio: organismos
procariotas y eucariotas simples. Son considerados microbios todos los seres vivos
microscpicos, estos pueden estar constituidos por una sola clula (unicelulares), as como
pequeos agregados celulares formados por clulas equivalentes (sin diferenciacin celular);
estos pueden ser eucariotas (clulas con ncleo) tales como hongos y protistas, procariotas
(clulas sin ncleo definido) como las bacterias. Sin embargo la microbiologa tradicional se ha
ocupado especialmente de los microorganismos patgenos entre bacterias, virus y hongos,
dejando a otros microorganismos en manos de la parasitologa y otras categoras de la biologa.
Aunque los conocimientos microbiolgicos de que se dispone en la actualidad son muy amplios,
todava es mucho lo que queda por conocer y constantemente se efectan nuevos
descubrimientos en este campo. Tanto es as que, segn las estimaciones ms habituales, slo un
1% de los microbios existentes en la biosfera han sido estudiados hasta el momento. Por lo tanto,
a pesar de que han pasado ms de 300 aos desde el descubrimiento de los microorganismos, la
ciencia de la microbiologa se halla todava en su infancia en comparacin con otras disciplinas
biolgicas tales como la zoologa, la botnica o incluso la entomologa.
Al tratar la microbiologa sobre todo los microorganismos patgenos para el hombre, se
relaciona con categoras de la medicina como patologa, inmunologa y epidemiologa.
La Microbiologa se puede definir, sobre la base de su etimologa, como la ciencia que trata de
los seres vivos muy pequeos, concretamente de aquellos cuyo tamao se encuentra por debajo
del poder resolutivo del ojo humano. Esto hace que el objeto de esta disciplina venga
determinado por la metodologa apropiada para poner en evidencia, y poder estudiar, a los
microorganismos. Con la invencin del microscopio en el siglo XVII comienza el lento despegue
de una nueva rama del conocimiento, inexistente hasta entonces. Durante los siguientes 150 aos
su progreso se limit casi a una mera descripcin de tipos morfolgicos microbianos, y a los
primeros intentos taxonmicos, que buscaron su encuadramiento en el marco de los "sistemas
naturales" de los Reinos Animal y Vegetal.
Tras la Edad de Oro de la Bacteriologa, inaugurada por las grandes figuras de Pasteur y Koch, la
Microbiologa qued durante cierto tiempo como una disciplina descriptiva y aplicada,
estrechamente imbricada con la Medicina, y con un desarrollo paralelo al de la Qumica, que le
aportara varios avances metodolgicos fundamentales.

BACTERIOLOGIA
La Bacteriologa es una disciplina de la Microbiologa, que ha estado presente a lo largo de la
historia de la humanidad.
Las bacterias son responsables de millones de muertes de personas a nivel mundial.
Entre algunas enfermedades infecciosas bacterianas, causantes de grandes epidemias que han
mermado la poblacin, se encuentran: la difteria, clera, tuberculosis, sfilis, ttanos, tos ferina, y
fiebre tifoidea. Sin embargo, tambin existen infecciones bacterianas que aunque estn asociadas
en menor frecuencia como causa de muerte, son un problema de salud pblica en pases en vas
de desarrollo como el nuestro, entre las que podemos mencionar: diarreas (causadas por Shigella
o Escherichia coli), infecciones de vas urinarias, faringoamigdalitis, gonorrea, tracoma y
brucelosis.
CLASIFICACIN DE LAS BACTERIAS
De acuerdo al rbol de la Vida de Woese, microbilogo creador de la nueva taxonoma
molecular basada en la comparacin entre especies de la fraccin 16s del ARN ribosomal, se
proponen 3 dominios Archaea, Bacteria y Eucarya, en los que se incluye a todos los seres
vivos, aunque existen controversias.

Los dominios Archeae y Bacteria corresponden a las clulas procariotas, una de cuyas
caractersticas es la de carecer de membrana nuclear. Con base en el estudio de fsiles y
modelos, se calcula que emergieron hace unos 3.6 - 4 billones de aos. Su importancia radica en
el hecho de haber desarrollado una pared celular o membrana externa que les confiri, desde el
principio, de autonoma y proteccin con respecto a su medio ambiente. Desde entonces
constituyeron la forma de vida ms abundante en el planeta en trminos de biomasa y nmero de
especies. A pesar de su menor complejidad en relacin a Eucarya, los integrantes de los
7

dominios Archeae y Bacteria pueden vivir en hbitats extremos: se les encuentra en las
profundidades de la Tierra, sobreviviendo gracias al lento catabolismo del carbono orgnico
depositado en los sedimentos, y en las profundas fuentes hidrotermales submarinas.Se acepta la
aparicin del dominio Eukarya, con membrana nuclear y orgnulos ms desarrollados, desde
hace unos dos billones de aos; de este dominio derivan todos los organismos eucariontes uni y
multicelulares. Otra clasificacin de los seres vivos muy utilizada es la propuesta por
Whitaker y Margulis. Ellos clasifican a los organismos en cinco reinos, Animalia, Plantae,
Fungi, Protista y Monera, en ste ltimo reino se incluyen todas las bacterias.

MORFOLOGA BACTERIANA

PRACTICA #1
MICROSCOPIOS Y MICROSCOPIA
OBJETIVO DE LA PRACTICA.
Que el alumno se familiarice con las partes del microscopio de luz, con su manejo y sus
cuidados y que conozca el fundamento de las diferentes clases de microscopios.

INTRODUCCION.
El microscopio es el instrumento ms frecuentemente utilizado y el ms til en el
laboratorio de microbiologa, debido a que proporciona la amplificacin o agrandamiento
aparente que nos permite ver organismos y estructuras invisibles a simple vista, con una
amplificacin desde cien a cientos de miles de veces. Las dos categoras de microscopios
disponibles son los microscopios pticos (de luz) y los microscopios electrnicos.

I. EL MICROSCOPIO OPTICO (de luz):

Utiliza un sistema de lentes pticos que va amplificando la imagen sucesivamente y comprende: microscopio de campo claro -microscopio de campo obscuro -microscopio de fluorescencia microscopio de contraste de fases.
1. El Microscopio de Campo Claro: Es el instrumento ms ampliamente utilizado para
microscopa de rutina. Aqu el rea observada est brillantemente iluminada y los objetos en estudio
aparecen ms obscuros. Generalmente producen un aumento til de unos l000 dimetros. La
amplificacin se logra mediante el uso de sistemas de lentes diseadas y acomodadas para
proporcionar la amplificacin en forma ptima. Presenta lentes en el condensador, en los objetivos y
en los oculares. La lente del condensador enfoca un cono de luz sobre el campo donde se coloca la
muestra. Algunos de los rayos de luz de este cono pasan directamente a la lente del objetivo para
formar el fondo de luz o campo claro. Los rayos de luz que chocan con los objetos
(microorganismos) que hay en la muestra y se "curvan", son conducidos a la lente del objetivo para
formar una imagen del objeto. La imagen es amplificada por la lente ocular. Comnmente los
microscopios estn equipados con tres objetivos montados en una plataforma llamada revlver, que
al hacerse girar pone a uno de ellos en la lnea del condensador. y cada uno proporciona distinto
grado de aumento El poder de resolucin de un microscopio est determinado por la longitud de onda
de la luz y por una propiedad del objetivo y de la lente del condensador.
Sistema mecnico: Base, brazo, cuerpo del tubo, tubo intercambiable del microscopio,
platina, revlver, objetivos de de 10, 40 y 100 X, tornillo macromtrico, tornillo micromtrico,
condensador y diafragma.
2
Microscopio de Campo Oscuro: Es similar al de campo claro, excepto que va equipado con
un condensador de campo oscuro y una abertura numrica baja. Esta clase de condensador dirige los
rayos de luz dentro del campo de la muestra, formando un angulo tal, que solo los rayos que chocan
contra el objeto que hay en el campo de la muestra son refractados (curvados) y penetran en el
objetivo. As, el objeto queda brillantemente iluminado y destaca sobre el fondo oscuro (campo
oscuro)
3
Microscopio de Fluorescencia: Est equipado con una fuente de luz ultravioleta, varios
filtros y un condensador de campo obscuro. Se usa para examinar muestras teidas con colorantes de

fluorocromo, denominados fluorescentes, los cuales absorben energa de longitudes de ondas cortas
invisibles, pero emiten ondas de longitudes de onda mayores visibles y el fenmeno es denominado
fluorescencia. Esta tcnica permite la identificacin rpida de algunos microorgnismos.
4
Microscopio de contraste de fases: Es un tipo de microscopio ptico que permite un mayor
contraste entre substancias de diferente grosor o diferente ndice de refraccin, mediante el uso de un
condensador y un objetivo especiales que controlan la iluminacin del objeto, de manera que acenta
las ligeras diferencias en el espesor o en los ndices de refraccin de las estructuras celulares. Las
diferencias se revelan en forma de distintos grados de brillo o de oscuridad (un mejor contraste),
pudiendo localizarse estructuras dentro de la clula sin teir, que no son visibles en la microscopa de
campo claro.
EL MICROSCOPIO ELECTRONICO
Emplea haces de electrones en lugar de ondas de luz, para producir una imagen amplificada. Un
campo magntico substituye a las lentes. Es posible lograr amplificaciones de un milln de veces, las
que posteriormente se logran ampliar ms en la imagen fotografiada. Esto hace posible la
observacin de microorganismos tan pequeos, que no se ven con el microscopio ptico, como los
virus. -Microscopio electrnico de transmisin: Un haz de electrones finamente enfocados,
pasa a travs de un corte ultradelgado del especimen. Los electrones son enfocados a una
pequea rea de la muestra y la iluminan, apareciendo con reas claras y obscuras. La resolucin
de es de 2.5 nm y la amplificacin es de 10,000 X a 100,000
X.
- Microscopio electrnico de Barrido: Resuelve el problema de seccionar los especmenes,
permitiendo observar clulas completas. Unos electrones son dirigidos a la superficie de la
muestra y otros colectados para formar la imagen tridimensional.
MATERIALES Y METODOS:
EJERCICIO PARA EL TRANSPORTE Y MANEJO DEL MICROSCOPIO:
1. El transporte del microscopio de un lugar a otro debe ser muy cuidadoso. Con una mano se
debe sujetar del brazo, mientras se coloca la otra mano bajo la base para
sostenerlo, mantenindolo en posicin vertical. Esto evita el desprendimiento de algunas de
las partes que no son fijas.
2
Nunca deposite el microscopio en la orilla de la mesa, sino a unos cm de distancia del borde.
3
No toque las lentes con los dedos.
4
No juegue con los componentes del instrumento. Si no funciona en forma adecuada,
notifquelo al profesor y no intente arreglarlo usted mismo.
5
No permita que ningn reactivo qumico entre en contacto con alguna parte del microscopio,
a excepcin del aceite de inmersin usado con la lente de l00 X.
6
Limpie las lentes slamente con papel especial para lentes (papel seda) sobre todo al terminar
de usarlo, para que no queden restos de aceite de inmersin.
EJERCICIO DE ENFOQUE
1
En base a las indicaciones del profesor vaya identificando las diferentes partes que
constituyen el microscopio.
2
El profesor le proporcionar una preparacin fija de bacterias en un portaobjetos para el
ejercicio.
3
Encienda el microscopio.
4
Mueva cuidadosamente el revlver y coloque el objetivo de 10 X sobre la platina.

10

5
Coloque en la platina un portaobjetos con un especimen y ajstelo en el carro. Haga coincidir
el haz de luz del condensador con el especimen.
6
Mueva el tornillo macromtrico para acercar el objetivo de 10 X a la platina, totalmente hasta
el tope.
7
Posteriormente, sin dejar de observar a travs del ocular, mueva lentamente el tornillo
macromtrico para ir alejando el objetivo de 10 X, hasta detectar una imagen o un color en la
preparacin; enseguida mueva lentamente el carro en la platina. Si la imagen se mueve, indicar que
est enfocando la preparacin. Mueva el tornillo micromtrico y afine el enfoque. Una vez logrado el
enfoque, ya no suba ni baje el tornillo macromtrico, solo use el micromtrico. Si se desenfoca,
vuelva a repetir el proceso.
8
A continuacin mueva el diafragma y determine la cantidad de luz ms efectiva para la
observacin.
9
Mueva el revlver lentamente para retirar el objetivo de 10X y cambie al objetivo de 40 X.
Ajuste el enfoque con el tornillo micromtrico. Con el diafragma determine la cantidad de luz
adecuada .
10
Mueva el revlver lentamente para retirar el objetivo de 40X y coloque una gota de aceite
de inmersin sobre la preparacin. A continuacin mueva de nuevo el revlver con cuidado, dejando
que la lente del objetivo de 100 X quede en contacto con el aceite. Ajuste el enfoque con el
micromtrico. Si no lo logra, regrese directamente al objetivo de 10 X, sin pasar por el de 40 X para
no ensuciarlo con el aceite y vuelva a enfocar. El aceite aumenta la cantidad de luz que pasa a la lente
del objetivo.
11
Al terminar, mueva el revlver antes de sacar la preparacin y enseguida limpie el aceite de
la lente, con papel seda. Puede usar un pauelo desechable por el lado que no suelta pelusa. No
utilice algodn ni otros materiales.
12
Nunca olvide retirar la preparacin de la platina al terminar, ni limpiar el aceite del lente
100X .
13
Apague el microscopio y enrolle el cable.
RESULTADOS, DISCUSION y CONCLUSIONES.
Haga dibujos de las observaciones a diferentes
esquema la formacin de la imagen que se observa

amplificaciones.

Comente su experiencia obtenida al hacer las observaciones

encontradas, as como las ventajas y desventajas que not en la tcnica.

Explique

las

con

un

dificultades

CUESTIONARIO.
1
2
3

Cmo se forma la imagen del microscopio?

Por qu se usa el aceite de inmersin con el objetivo de 100 X slamente.
Consulte la literatura y describa otras clases de microscopio no mencionadas.

11

PRACTICA #2
INOCULACION
Y AISLAMIENTO DE BACTERIAS
OBJETIVO DE LA PRCTICA.

Desarrollar las tcnicas comunes de inoculacin en medios de cultivo y las tcnicas de

aislamiento. Comprensin del fundamento en cada caso.
INTRODUCCION.
Las bacterias se cultivan en el laboratorio en materiales nutritivos denominados medios de
cultivo, cuyos componentes son muy variados. La eleccin del medio se basa en el propsito del
estudio.
El material que se inocula en el medio se denomina inculo. Cuando se inocula un medio
como el agar nutritivo u otros medios con agar en cajas de Petri, por el mtodo de "siembra por estra
cruzada en placa", las clulas quedan separadas individualmente. Durante la incubacin, las clulas
microbianas individuales se reproducen tan rpidamente que en 18 a 24 hs producen masas visibles a
simple vista, denominadas colonias. Cada colonia que se observe diferente, presumiblemente es un
cultivo puro de una sola clase de bacterias. Si dos clulas microbianas procedentes del inculo
original quedan muy cerca una de la otra sobre el medio de agar, las colonias que resultan pueden
quedar mezcladas o muy juntas. La siembra por estra permite aislar las bacterias que dan lugar a
colonias separadas y posteriormente, transfiriendo una sola colonia a un medio nuevo, se permite el
desarrollo de un cultivo puro bacteriano.

MATERIALES Y METODOS.
I. TECNICA DE LA ESTRIA CRUZADA EN PLACA (inoculacin y aislamiento de bacterias)
1
En todas las siembras siguientes deber quemar el asa al rojo vivo en la flama del mechero,
antes y despus de usarla.
2
Con el asa bacteriolgica previamente quemada y enfriada en el rea de esterilidad, siembre
una mezcla de dos o ms bacterias en una placa de agar nutritivo. Desarrolle el mtodo de siembra de
la estra cruzada en placa, girando la caja al ir rayando hasta formar un pentgono, siguiendo las
indicaciones del profesor, con el fin de ir diluyendo el inculo. Al final de la siembra las bacterias
quedarn bien separadas unas de otras. Al terminar, no olvide quemar el asa de nuevo. Con un
marcador indeleble marque cada caja con una clave para identificarla. Determine las caractersticas
coloniales de las diferentes especies sembradas.
3
Siembre por separado en placas del mismo medio, cultivos puros de las siguientes bacterias:
Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Pseudomonas fluorescens, Bacillus subtilis, Serratia
marcescens y Streptococcus faecalis. Desarrolle el mtodo de siembra de la estra cruzada en placa.

12

Marque las cajas. Incube igual que las anteriores. Describa las caractersticas coloniales de cada
especie.
4
Invierta todas las cajas (la tapa hacia abajo) para evitar la evaporacin. Incube a 35 C por 24
hs.
II. INOCULACION EN TUBO CON MEDIO LIQUIDO.
1
Inocule una asada de cada bacteria por separado, en tubos con caldo nutritivo. Deje un tubo
testigo sin inocular.
2
Inocule por estra las bacterias en tubos con agar nutritivo inclinado.
3
Incube todos los medios sembrados a 37 C por 24 hs.
4
Note el desarrollo de colonias bacterianas separadas en los medios slidos en placa. En el
caso de los medios lquidos, note slo una turbidez, un sedimento o una pelcula Haga deducciones y
explique.
III. SIEMBRA EN TUBO CON MEDIO SOLIDO (agar inclinado y agar sin inclinar).
1
Siembre separadamente bacterias en tubos con medio slido inclinado, por estra.
2
Siembre por picadura en el centro, con una asa recta (sin anillo) las mismas bacterias por
separado en tubos con medio slido sin inclinar.
3
Incube todos los tubos igual que en los puntos anteriores.
Anote detalladamente sus resultados en todos los experimentos. Compare sus resultados
personales con los de los otros equipos. Note las diferencias en el tipo de crecimiento de
cada
bacteria
en
los
medios
slidos
y
en
los
lquidos.
Haga un cuadro de resultados con los datos de la morfologa colonial, en base a la forma,
tamao, color, etc. en la siembra de las diferentes bacterias en medio slido. Explique los
resultados y los errores cometidos al estriar. Note la diferencia en el tipo de crecimiento de
las bacterias en el medio lquido y deduzca si esta tcnica sera til para aislar bacterias.
Explique a qu se debe la formacin de colonias en el medio slido.

13

Fig. 5 esterilizacin de asa

Fig. 7 siembra en medio lquido

Fig. 6 siembra en tubo con agar

inclinado

Fig. 8 Tcnica de estra cruzada

Resultados, Discusion y Conclusiones

14

15

PRACTICA #3
TECNICAS MICROSCOPICAS
DE BACTERIAS.
OBJETIVO DE LA PRACTICA
Conocer y desarrollar las tcnicas microscpicas comunes para observar, teir y medir a
las bacterias y sus estructuras.

INTRODUCCION
El tamao tan pequeo de las bacterias no permite observarlas a simple vista, ya que su
tamao promedio oscila entre 0.5 a 2.0 micrmetros (m) de dimetro. En cuanto a su
forma, las bacterias se agrupan en tres tipos principales: bacilos, cocos, curvos y
helicoidales. Los extremos de los bacilos pueden ser redondos, angulares o agudos y
pueden ser mviles o inmviles. Las esfricas (cocos) pueden presentarse solas, en pares,
en tetradas, en cadenas o en racimos.
Las caractersticas morfolgicas de las bacterias se pueden apreciar mediante tcnicas
microscpicas, ya sea en su estado vivo o muerto. Las ventajas del estudio directo al
microscopio de clulas vivas en su forma, disposicin y tamaos naturales, han sido
antagonizadas por el hecho de que, el ndice de refraccin del protoplasma de los
microbios se acerca al del agua y por ello, las clulas y sus estructuras no pueden
diferenciarse en forma neta entre s, ni del lquido en que estn includas. El estudio
microscpico de las bacterias se facilita notablemente al tratarlas con colorantes o tintes,
aprecindose su forma y tamao.
Preparacin en fresco:
Permite observar en los microorganismos su movilidad, color, tamao,
agrupacin en condiciones naturales, cuando estn vivos, sin alteraciones. Sin
la observacin es difcil debido al escaso contraste, por la poca diferencia entre
de refraccin del medio y de los microorganismos. Este problema se resuelve
el microscopio de campo oscuro y el de contraste de fases.

forma y
embargo,
el ndice
utilizando

La preparacin en fresco es utilizando un portaobjetos normal, con cubreobjetos encima. -Otra forma
es la preparacin en en gota suspendida, utilizando un portaobjetos excavado y un cubreobjetos.
Tcnicas de tincin: Tcnicas de tincin simples o directas:
Tien homogneamente la clula y solo utilizan un colorante, que puede ser azul de metileno,
safranina, cristal violeta, etc.
Tcnicas de tincin compuesta o diferencial:
Requieren combinaciones de dos o ms colorantes, como en la tcnica de Gram, la de Ziehl Neelsen,
tincin de esporas, etc.

16

Algunas de estas tcnicas permiten la demostracin de estructuras especficas como cpsula, flagelos,
esporas, etc. Otras tien selectivamente bacterias de un grupo especfico.
Tinciones negativas:
En realidad no colorean los microorganismos, ya que el colorante se limita a depositarse en el campo
del rededor, delimitando las clulas. Esto se explica debido a que las bacterias presentan muchas
cargas negativas asociadas con la pared, membrana y citoplasma, siendo repelidos los colorantes con
carga cida.
MATERIALES Y METODOS
I. Preparacin en fresco.
En este tipo de preparacin se perdern varios detalles de las bacterias.
A partir de cultivos en medio lquido: cargar el asa bacteriolgica con una gota de cultivo en
medio lquido, depositarla en el portaobjetos y cubrir con un cubreobjetos (procurando que no
queden burbujas de aire).
- A partir de cultivos en medio slido: colocar una gota de agua sobre el portaobjetos con
ayuda del asa. Cargar el asa (estril) con una pequea cantidad de bacterias de una colonia y
resuspenderlas en la gota de agua. Haga dibujos de lo observado. Detalle la forma,
agrupacin, color, movilidad (cilios,flagelos, deslizamiento,browniano), etc.
Nota: tenga en cuenta que el calor desprendido por el foco luminoso ir secando la
preparacin y como consecuencia habr perdida de movimiento.Adems podran aparecer
corrientes de lquido que pueden dificultar la observacin de la muestra.Cuando se observen
estos efectos se levanta el cubreobjetos y aadir ms lquido o bien, aplicar parafina o esmalte
en los bordes del cubreobjetos
. Diga si pudo observar la forma de las clulas y su agrupacin.
II. Tcnica de elaboracin de frotis bacterianos (antes de la tincin)
1
Queme el asa al rojo vivo en la flama del mechero y djela enfriar en el rea de esterilidad
2
Destape un cultivo bacteriano lquido junto a la flama del mechero y tome con el asa una
gotita del cultivo, depositndola en el centro de un portaobjetos limpio; extienda con el asa para
hacer un frote.
3
Si el cultivo no es lquido, coloque una gotita de agua destilada con el asa, en el centro de un
portaobjetos. Queme el asa y djela enfriar, tomando a continuacin una poca de la masa bacteriana
de la superficie del medio, para hacer una suspensin de bacterias en la gotita del porta. Enseguida
extienda con el asa para hacer un frote.
4
Deje secar el frote al aire libre.
5
Fije la preparacin con calor, pasndola tres veces sobre la flama del mechero en forma
rpida.
III.Tinciones Diferenciales Tincin
de Gram.
1
Prepare un frote de cada una de las siguientes bacterias: Staphylococcus aureus, Escherichia
coli y Bacillus subtilis
2
Despues de fijar los frotes, cbralos con cristal violeta durante un minuto y enjuague con
agua.
3
Cubra con lugol durante un minuto y lave con agua.
4
Decolore con alcohol-acetona unos segundos y lave con agua.

17

5
6
7
8
9

Cubra con safranina medio minuto y lave con agua.

Deje secar al aire libre y observe al microscopio a 100 X con aceite de inmersin.
Las bacterias teidas de rojo se consideran gramnegativas; las de morado, grampositivas.
Note las diferencias en la observacin de bacterias teidas con las no-teidas.
Explique el mecanismo qumico ocurrido durante la tincin.

Tcnica de Ziehl-Neelsen
Haga un frote con Mycobacterium sp., djelo secar al aire libre y fjelo con calor.
Coloque encima un pequeo rectngulo de papel filtro (2 x 3 cm).
Aplique unas gotas de carbol-fucsina sobre el papel, para humedecerlo bien y deje actuar 5
min., calentando la preparacin por el reverso cuidadosamente hasta emisin de vapores, sin permitir
la ebullicin. No deje secar el colorante, aplicando ms, si lo requiere.
3
Retire el papel con una pinza y enjuague con agua y escurra.
4
Decolore con alcohol cido, uno a dos min. y lave con agua.
5
Cubra con azul de metileno por 1-2 min y lave con agua corriente.
6
Deje secar y observe al microscopio.
7
Las bacterias teidas de rojo se consideran cido-resistentes (BAAR)
8
Las azules son no-cido resistentes.
1
2

Explique el mecanismo qumico ocurrido durante la tincin.

Tincin negativa de cpsula.
1
En el extremo de un portaobjetos coloque una gota de suspensin bacteriana de Klebsiella
pneumoniae o Leuconostoc en agua. Adicinele una gota de tinta china y mezcle con el asa.
2
Con otro porta extienda la preparacin, como para realizar un frote. Deje secar al aire libre.
No se requiere fijar con calor.
3
Cubra la preparacin con safranina por un minuto y lave con agua rpidamente y con
cuidado, para no despegar la preparacin.
4
Deje secar al aire libre y observe al microscopio a 10 y a 100 X.
Tincin de endosporas bacterianas.
1
Prepare un frote con Bacillus sp. Deje secar al aire libre y fje con calor.
2
Coloque sobre el portaobjetos una tira de papel filtro de menor tamao. Cubra con verde de
malaquita en solucin acuosa de fenol. Caliente a emisin de vapores durante 5 min. No permita que
ebulla.
3
Deje enfriar y lave.
4
Agregue safranina 30 seg. Y lave con agua. Deje secar. Observe a 10 y a 100 X.
Tincin de flagelos
1 Hacer un crculo en un portaobjetos perfectamente limpio para lo cual
2 Se recomienda lavado con agua destilada, enjuagado con alcohol y secado con un trozo
de tela limpio. Desengrasarlo pasando por una flama varias veces.
3 Colocar dentro del crculo con pipeta Pasteur, una gotita de la suspensin bacteriana e
inclinar el portaobjetos de uno y otro lado para extender la muestra.
4 Fijar la preparacin al aire ya que si esta operacin se hace usando la flama del mechero
se pueden destruir los flagelos.
5 Humedecer la preparacin con el Colorante de Leifson y dejarla en reposo a temperatura
ambiente durante 10 minutos en tiempo caluroso o en la incubadora en tiempo fro.

18

6 Lavar con agua corriente.

7 Secar y observar con objetivo de inmersin.

INTERPRETACION:
Los flagelos se tien bien de color rojo en aquellas bacterias que no presentan flagelos
extremadamente delicados.

Fig. 2 Tincin simple

Fig. 1 Preparacin de frotis

Fig. 3 Tincin endosporas

19

Fig. 4 Tincin gram

RESULTADOS, N Y

Fig. 3 Tincin de cpsula

Tincin de Gram

20

PRACTICA # 4
PREPARACION DE MEDIOS DE CULTIVO
OBJETIVO DE LA PRACTICA
Comprender las diferencias qumicas de los diferentes medios de cultivo y las tcnicas para su
preparacin, con el fin de obtener el criterio necesario para su eleccin, en base a las necesidades de
cada bacteria y a los propsitos del laboratorio.
INTRODUCCION.
Los medios de cultivo contienen los nutrientes necesarios para cultivar microorganismos, tales como
bacterias, hongos y otros. Los microorganismos no pueden estudiarse individualmente debido a su
tamao tan pequeo, por lo que solo pueden ser estudiados en poblaciones. Para ello es necesario
cultivarlos en medios artificiales. Los medios de cultivo para los microorganismos pueden ser
slidos, lquidos o semislidos. Los medios lquidos se pueden transformar en slidos al adicionarles
agar, gelatina o gel de slice. Al disminuir la cantidad del agente solidificante, se obtiene el medio
semislido. Antes de preparar un medio de cultivo para el cultivo de cualquier microorganismo, es
necesario entender sus necesidades bsicas. Cualquier medio de cultivo debe contener los siguientes
factores: agua, carbono, energa, nitrgeno, minerales, pH y factores de crecimiento. Los
componentes de los medios son muy variados. La eleccin del medio se basa en el propsito del
estudio. Los medios sintticos se preparan utilizando una composicin exacta conocida,
generalmente a base de compuestos altamente purificados. Los medios no-sintticos contienen
ingredientes de composicin imprecisa y pueden ser a base de extracto de carne, adicionados de
sangre, suero u otras sustancias complejas.
Los medios selectivos impiden el desarrollo de ciertos grupos microbianos y favorecen el desarrollo
de otros. Por ejemplo puede omitirse una fuente nitrogenada orgnica, adicionando slo una
inorgnica. Pueden adicionarse ciertas sustancias como telurito de potasio, sulfito de bismuto, y
otros. Algunos antibiticos tambin pueden ser aadidos para inhibir. Los medios diferenciales
contienen sustancias nutritivas o indicadoras que permiten desarrollar a las bacterias con una
apariencia colonial distintiva. Los medios para pruebas de caracterizacin e identificacin de los
microorganismos estn adicionados de sustratos especficos y permiten diferenciar unas especies de
otras, en base a su capacidad enzimtica especfica. Medios de enriquecimiento favorecen la
multiplicacin y aumento de un cierto grupo de microorganismos. Aqu se combina un medio
selectivo y la variacin de otros factores como pH, temperatura, iluminacin, aereacin, una fuente
nica de carbono, etc. Medios enriquecidos: algunas bacterias requieren medios especiales,
complejos y sofisticados, ya que son incapaces de crecer en medios comunes.
Medios de mantenimiento: preservan satisfactoriamente la viabilidad de los organismos,
conteniendo concentraciones limitadas de nutrientes.

En la actualidad el trabajo requerido en la preparacin de medios se ha simplificado,

mediante la utilizacin de medios deshidratados que se obtienen comercialmente, en las
variedades deseadas. Algo similar a las mezclas deshidratadas para la elaboracin de
pasteles. Slo se requiere disolver una cantidad conocida en un volumen medido de agua,
repartir en los recipientes necesarios (tubos de ensayo, matraces, frascos, etc.) esterilizar.

21

Un pequeo grupo de microorganismos no se ha logrado cultivar in vitro, hasta la fecha,

como Mycobacterium leprae, Treponema pallidum y las rickettsias.

La esterilizacin de los medios es indispensable antes de usarlos, para eliminar todos los
microorganismos presentes en ellos, cuidando que en los recipientes no vuelva entrar
ningn organismo. En esta forma, slo se cultivarn los organismos deseados. La
esterilizacin es un proceso mediante el cual se destruyen todas las formas de vida .
Esterilizar es un trmino absoluto. Algo est estril o no lo est, pero nunca est parcialmente
estril.
Esterilizacin con calor: La temperatura elevada puede inactivar muchas enzimas,
desnaturalizar protenas y como consecuencia la muerte de los microorganismos. El
efecto depende de la temperatura y del tiempo de exposicin.
-El calor hmedo en forma de vapor saturado a presin es uno de los agentes ms utilizados
para la esterilizacin de medios de cultivo. Con el ambiente hmedo se favorece la penetracin ms
rpidamente del calor a la clula, provocando una coagulacin de las protenas. Comnmente se usa
el autoclave, a 121 C, 15 libras de presin, por 15 min.
-El calor seco (aire caliente) utilizado en los hornos, da lugar a la oxidacin de componentes
celulares vitales. Es utilizado en materiales generalmente de vidrio, limpios y secos, como cajas de
Petri, pipetas, algunos instrumentos quirrgicos, etc. Puede esterilizarse a 180 C una hora.
Filtracin: El uso de filtros bacteriolgicos es til cuando se requiere esterilizar sustancias
termolbiles, como vitaminas, aminocidos u otras similares. Estas deben ser adicionadas a los
medios previamente esterilizados, en condiciones aspticas. La incineracin: su uso es limitado,
como en la esterilizacin del asa microbiolgica, cadveres de animales de laboratorio, algunos
desechos de hospitales y otros similares. Reparticin de los medios estriles: Si los medios
esterilizados se van a repartir en cajas de Petri u otros recipientes, stos deben estar estriles y se
debe trabajar dentro del rea de esterilidad.

MATERIALES Y METODOS
Cada equipo de alumnos puede preparar un medio de cultivo diferente, pesando en cada caso la
cantidad indicada en las instrucciones de la etiqueta del medio, para un litro de agua, o la cantidad
que se necesite preparar.

22

I. Medios esterilizados por calor hmedo.

Prepare medio en dos matraces de 500 ml con 200 ml c/u (por ejemplo un medio de
mantenimiento como Tripticasa-agar-soya). Para pesar, siga las instrucciones de la etiqueta. Tape con
algodn y un gorro de papel. Esterilice con calor hmedo en autoclave, a 121 C y 15 libras de
presin, durante 15 minutos. Reparta posteriormente en condiciones de esterilidad, en cajas de Petri
cuando el medio estril an est caliente aprox. a 60 C

Prepare tubos de ensayo de 16 x 150 mm con tapn de rosca o de algodn, con 5 ml aprox. de
un medio con agar (pueden ser los medios sintticos y no-sintticos de la siguiente prctica); no
apriete los tapones de rosca y esterilice en la misma forma. Deje solidificar la mitad de los tubos (an
calientes) en posicin inclinada. Deje solidificar el resto en forma vertical. Despus de solidificar
apriete los tapones.

Prepare un matraz de 250 ml con 50 ml de medio lquido. Reparta en tubos de 16 x 150 mm,
con tapn de rosca o de algodn. Deje flojos los tapones de rosca y esterilice, apretndolos al sacar.

Esterilizacin de material de vidrio vaco con calor seco, en el horno.

1
Para esterilizar algunas pipetas, primero colqueles algodn en la boca, a manera de filtro y
ensegida envuelva cada una en una tira de papel, siguiendo las instrucciones del profesor. Esterilice
en el horno a 180 C por una hora.
2
Esterilice cajas de Petri vacas en el horno.

RESULTADOS, DISCUSION Y CONCLUSIONES.

23

PRACTICA #5
NUTRICION MICROBIANA
OBJETIVO:
Observar el crecimiento de los organismos en diferentes sustratos, relacionando el
mayor crecimiento con requerimientos nutricionales adecuados.

INTRODUCCION
Los requerimientos nutricionales de un microorganismo estn determinados por la composicin
qumica de la clula, por su constitucin gentica y por factores del medio ambiente. Cualquier
sustrato puede constituir una fuente de nutrientes para ciertos microorganismos. Sin embargo, cada
grupo de organismos vara ampliamente en sus caractersticas genticas y por consiguiente tambin
en sus propiedades fisiolgicas y en su capacidad para utilizar y transformar los diferentes
compuestos qumicos. Los microorganismos se pueden clasificar de acuerdo con: a) la fuente de
carbono, N, S, P y O que utilicen, y b) segn la fuente de energa. En base a la fuente de C , se
denominan auttrofos a los microorganismos que utilizan CO2 o carbonatos, a diferencia de los
hetertrofos quienes slo son capaces de utilizar como fuente de C diferentes compuestos orgnicos
con varios grados de complejidad. Por lo que respecta a la fuente de energa, los fottrofos
transforman la energa luminosa en energa qumica; los quimitrofos obtienen su energa a partir de
la oxidacin de compuestos qumicos. Existen tambin grupos intermedios que se comportan como
facultativos en las clasificaciones anteriores. Por otro lado, existen algunos microorganismos
llamados prottrofos que requieren factores de crecimiento, es decir , compuestos orgnicos que son
utilizados como precursores o como constituyentes del material celular y que no pueden ser
sintetizados a partir de compuestos de carbono ms sencillos. Los que no requieren factores de
crecimiento son llamados auxtrofos. El ambiente natural donde vive cada microorganismo refleja el
tipo de nutrientes necesarios para su desarrollo. Utilizando medios de cultivo de composicin
qumica definida, se pueden determinar las necesidades nutritivas de un organismo. Al sembrar un
microorganismo en diferentes sustratos, se relaciona el crecimiento en los diferentes nutrientes, con
las caractersticas nutricionales del microorganismo en ese sustrato. Fuentes de nitrgeno y azufre:
Los nitratos y sulfatos pueden ser utilizados por unos microorganismos. Otros slo pueden usar
amonios o sulfuros, o compuestos orgnicos. Algunas bacterias son capaces de reducir el N2
atmosfrico, mediante el proceso denominado fijacin de N2. El fsforo generalmente es usado a
partir de fosfatos. El oxgeno es un nutriente obtenido por todos los organismos en cantidades
abundantes a partir del agua. Sin embargo, la mayora de los organismos son aerobios y requieren
oxgeno en forma molecular (O2) durante la produccin de energa como ltimo aceptor de
electrones. Pocos organismos utilizan otros aceptores finales de electrones.
MATERIALES Y METODOS.
1. Siembre separadamente los organismos Escherichia coli, Staphylococcus aures, Bacillus sp,. y un
hongo o un alga, en cada uno de los siguientes medios en tubo con agar inclinado
a) 15 gr de agar
b) 15 gr de agar + 0.5 gr de K2HPO4 + 0.5 gr de MgSO4 . 7H2O
c) 15 gr de agar + 10 gr de glucosa + 1 gr de NH4Cl + 0.5 gr de K2HPO4
+ 0.5 gr de MgSO4 . 7H2O

24

d) 15 gr de agar + 0.2 gr de extracto de levadura + 10 gr de glucosa + 1 gr de NH4Cl +

0.5 gr de K2HPO4 + o.5 g de MgSO. 7H2O
e) Agar nutritivo.
f) Sabouraud.

Todas las cantidades son para 1000 ml de agua destilada.

1
Deje un tubo de cada medio como control sin sembrar.
2
Incube todos los cultivos a 30C, por 48 hs, excepto las algas, que durarn varios das.
3
La mitad de los tubos con algas se incuban a temperatura ambiente en la obscuridad y el resto
bajo la luz.
4
Determine las diferencias en la abundancia del crecimiento y obtenga conclusiones, en base a
los nutrientes de cada medio, para cada organismo.
RESULTADOS, DISCUSIN Y CONCLUSIONES.

25

PRACTICA #6
FACTORES FISICOS
SOBRE EL CRECIMIENTO MICROBIANO
OBJETIVO DE LA PRACTICA.
Comparar la susceptibilidad de diferentes organismos ante diferentes factores fsicos del ambiente,
observando sus modificaciones en el crecimiento.

INTRODUCCION
Para obtener el crecimiento ptimo de los microorganismos, no solo son indispensables los
requerimientos nutricionales, sino otros factores ambientales tanto fsicos como qumicos. Un agente
fsico es una condicin fsica o propiedad fsica que causa un cambio. La humedad, la temperatura, la
presin osmtica, el pH, las radiaciones y los filtros son ejemplos de agentes fsicos. El crecimiento
de los microorganismos se modifica al cambiar los factores ambientales. El conocimiento de los
factores ambientales nos permite explicar la distribucin de los organismos en la naturaleza; por otro
lado, el conocimiento de los factores limitantes del crecimiento microbiano se puede utilizar para su
control, sobre todo en el caso de organismos que son patgenos, que causan deterioro en los
alimentos o que dan lugar a prdidas econmicas en diferentes formas.
MATERIALES Y METODOS.
I. Determinacin de la temperatura ptima de crecimiento de algunas bacterias.
La temperatura ambiental es uno de los factores fsicos ms importantes que afectan directamente el
funcionamiento de las enzimas bacterianas, mismas que se inactivan por debajo de la mnima y por
encima de la mxima. La temperatura ptima de crecimiento de un microorganismo es la temperatura
a la cual se multiplica a su mxima velocidad.
1
Siembre tres lotes de tubos de agar nutritivo inclinado con las bacterias E. coli,
Pseudomonas aeruginosa,, Serratia marcescens, Bacillus subtilis, Salmonella sp., S. aureus y otras.
2
Incube el primer lote a temperatura de refrigeracin, durante 24 hs y anote el resultado del
crecimiento en cruces. Diga cul bacteria es psicroflica.
3
Incube el segundo lote de las mismas bacterias a temperatura ambiente .
4
Incube el tercer lote de bacterias en una incubadora a 37 C.
5
Determine la temperatura ptima para cada bacteria, que ser donde se observe el mejor
crecimento. Con una cruz indique el crecimiento mnimo, con dos regular y con tres cruces el
mximo.
6
Tambin determine si alguna bacteria produjo pigmento a cierta temperatura.

II. Efecto letal de la temperatura sobre las bacterias.

Los organismos varan ampliamente en cuanto a su susceptibilidad a temperaturas elevadas. En este
experimento se determinar: a) el punto trmico mortal (temperatura a la cual un organismo muere en
diez minutos) y b) el tiempo trmico mortal (temperatura requerida para matar una bacteria
esporulada en diez minutos).
1
Divida el reverso de una placa de agar nutritivo en cinco partes, con un marcador.

26

2
A partir de un cultivo de E. coli de 24 hs en caldo nutritivo, siembre por estra cerrada una
divisin de la placa de agar nutritivo. Marque el reverso con una clave.
3
Coloque el tubo en un bao mara a 60 C y caliente. Tome una asada a intervalos de diez
minutos y siembre cada vez en uno de los sectores de la placa de agar. El tiempo total de
calentamiento ser de cuarenta minutos.
4
Determine el punto trmico mortal en E. coli.
5
Otro grupo de estudiantes puede trabajar igualmente con una bacteria esporulada como
Bacillus subtilis (un cultivo de 48 hs o ms), para determinar el tiempo trmico mortal.
III. El calor hmedo combinado con elevacin de la presin atmosfrica.
Aqu queda includa la tcnica de esterilizacin en autoclave, utilizada en la preparacin de
medios de cultivo.
IV. Influencia de la presin osmtica. El crecimiento bacteriano puede ser afectado grandemente
por las cantidades de agua que entran o que salen a la clula. Cuando el medio que rodea a un
organismo es hipotnico (contiene pocos solutos) resulta una presin osmtica mayor dentro de la
clula, excepto para algunas especies marinas que no son afectadas. La pared celular de la mayora
de las bacterias es tan fuerte y rgida, que un hinchamiento celular ligero, generalmente es inaparente.
Sin embargo, cuando las bacterias son colocadas en una solucin hipertnica (contiene ms cantidad
de solutos) su crecimiento puede ser inhibido considerablemente. El grado de inhibicin depender
del tipo de soluto y de la naturaleza del organismo; el citoplasma se deshidrata y el agua sale de la
clula, causando una plasmolisis. En estos casos la clula es inhibida en ausencia de agua celular
suficiente. En casos extremos hay una inactivacin enzimtica permanente y las clulas no se
recuperan en soluciones isotnicas.
1
Prepare 2 series de 6 tubos de caldo nutritivo adicionado de NaCl en diferentes
concentraciones, al 0.85%, 3.5%, 7 %, 10% y 15% y un control sin NaCl y mrquelos.
2
Prepare dos series de 6 tubos de caldo nutritivo adicionado de Sacarosa al 3.0%, 7.5%, 15%,
30% y un control sin sacarosa y mrquelos.
3
Inocule una serie de tubos de cada compuesto con 0.1 ml (por tubo) de Escherichia coli y
otra serie con Staphylococcus aureus. Homogenice cada tubo.
4
Incube a 37 C por 28 hs.
5
Registre la turbidez de los tubos y comprelos entre s. Concluya.
V. Influencia del pH
1
Prepare dos series de tubos con caldo nutritivo y con diferentes pH (3.0, 5.0, 7.0 y 9.0)
2
Inocule una serie con 0.1 ml de Escherichia coli y otra serie con la levadura Saccharomyces
cerevisiae
3
Incube la bacteria a 37 C y la levadura a 28 C.
4
Registre la turbidez presentada y compare.

VII. Efecto de la luz ultravioleta.

Siembre una placa de agar nutritivo con E. coli por estra y exponga la caja abierta por 5 min a la luz
ultravioleta. Incube igual que en el punto anterior. Determine si hay crecimiento bacteriano.
RESULTADOS, DISCUSION Y CONCLUSIONES.

27

PRACTICA #7
CRECIMIENTO BACTERIANO
OBJETIVO DE LA PRACTICA
Desarrollar algunas tcnicas comunes para medir el crecimiento bacteriano en poblaciones, tanto
en clulas viables como en clulas vivas y muertas, comprendiendo su fundamento y aplicacin.
INTRODUCCION
El trmino crecimiento en las bacterias se refiere a cambios cuantitativos en la poblacin total de
las bacterias, es decir un aumento en la masa total de clulas, ms bien que a cambios en un
organismo en forma individual. Con frecuencia el inculo contiene miles de organismos y el
crecimiento slo denota el incremento del nmero o de la masa, por encima del inculo original.
El mtodo caracterstico de reproduccin bacteriana es la fisin binaria transversal; una clula se
divide en dos. En este caso, si se parte de una sola bacteria, el incremento de la poblacin se hace
en progresin geomtrica: una bacteria produce dos, dos dan cuatro, cuatro dan ocho; ocho dan
dieciseis, y as hasta 2n (smbolo del ltimo nmero, es decir el nmero mximo de clulas que
eventualmente alcanzara la poblacin). El tiempo de generacin se refiere al intervalo de tiempo
requerido para que la clula se divida, o lo que es lo mismo, para que la poblacin se duplique).
Muchos estudios bacteriolgicos requieren la determinacin del nmero de bacterias presentes
en una unidad de volumen. Los recuentos se pueden efectuar por diferentes mtodos, ya sea
contando solo clulas vivas o tambin vivas y muertas. La cantidad y tipo de microorganismos
en una muestra dependen de la composicin qumica de la misma y de los tratamientos a que
haya sido sometida. El mtodo de conteo elegido depende del objetivo del conteo. En esta forma,
se puede determinar la presencia o ausencia de microorganismos, as como su nmero presente
en el material de estudio. Un conteo total establece el grado de contaminacin microbiana.
Conociendo el nmero se puede estandarizar la concentracin de inculos y seguir la dinmica
poblacional de un cultivo puro y muchos otros estudios.

Mtodos de conteo directos al microscopio:

Permiten efectuar el conteo de las clulas totales vivas y muertas. Su ventaja es que son rpidos.
-Conteo microscpico directo por el mtodo de Breed: Un volumen conocido de la
muestra (generalmente 0.01 ml) se extiende sobre un portaobjetos normal, en una superficie
conocida. Se examina en un microscopio calibrado, donde se conoce el dimetro del campo
microscpico. Se cuentan las clulas en diversos campos. Se obtiene el valor medio de clulas
por campo y se multiplica por el nmero de campos microscpicos comprendidos en la
preparacin. El resultado corresponde al nmero de clulas en el volumen extendido (0.01 ml).
Multiplicando este valor por 100 se obtiene el nmero total de organismos por ml o por gramo de
muestra.
-Conteo microscpico directo en cmara de Petroff-Hauser: Es una placa de vidrio
con una cuadrcula en depresin donde se deposita la muestra medida. Es posible relacionar el
nmero de clulas observadas en la superficie de un cuadro, con el volumen de esa rea.
Considerando los volmenes en la cuadrcula se puede calcular la concentracin de
microorganismos por ml.
Conteo Turbidimtrico: En una suspensin microbiana, la cantidad de clulas est directamente
relacionada con la turbiedad o densidad ptica de la misma e inversamente relacionada con la
28

cantidad de luz que pasa a travs de ella. Esto permite determinar con bastante exactitud la
cantidad de microorganismos en la suspensin mediante la determinacin de la turbiedad
mediante un nefelmetro o un espectrofotmetro. Los resultados se comparan con una curva
estndar construda con una suspensin testigo de concentraciones conocidas. La turbiedad que
resulta en la suspensin microbiana se aproxima a la producida por un cierto nmero de clulas
en suspensin. Esta tcnica es til slamente para organismos unicelulares de pocos m, como
las bacterias, lo que les permite mantenerse suspendidos y homogneamente distribudos.
Contadores electrnicos: Se hace pasar un volumen conocido de la muestra con
microorganismos a travs de un orificio de 5 a 10 m de dimetro, mediante manipulacin con
una micropipeta de mercurio. La resistencia elctrica a travs del orificio est normalizada y se
altera cada vez que un microorganismo pasa a travs de l. La modificacin de la resistencia se
amplifica y se registra electrnicamente.
Mtodos de Conteo en medio de cultivo:
Mediante cultivo de la muestra, se detectan nicamente las clulas vivas. En todos los casos se
parte de un volumen o peso de muestra conocido. Conociendo la procedencia de la muestra se
puede esperar la obtencin de cuentas bajas o altas o incluso ausencia de organismos. Si se
esperan pocos microorganismos, las muestras se pueden centrifugar o filtrar. Si se esperan
cuentas altas, se puede diluir la muestra en cantidades conocidas del diluyente, utilizando
solucin salina, agua peptonada u otros.
- Mtodo de las diluciones y vaciado en placa,
- Tcnica de conteo en placa por extensin superficial,
- Recuento por filtro de membrana,
- Siembra en tubo o recuento del nmero ms probable
- Mtodo de la gota o de Miles y Misra.
Otros mtodos: Determinacin del peso seco, determinacin del Nitrgeno en las cluas
cultivadas, medicin de actividades bioqumicas.
MATERIALES Y METODOS.
I.
Conteo directo al microscopio Mtodo de Breed:
1
En un portaobjetos limpio y desengrasado, marque un rea de 2 cm cuadrados. Invierta
la laminilla.
2
Deposite 0.01 ml de un cultivo y extindalos en el rea marcada del portaobjetos y deje
secar a temperatura ambiente.
3
Fije con calor y tia con azul de metileno de Leffler
4
Lave con agua de la llave. Deje secar a temperatura ambiente.
5
Coloque el objetivo micromtrico en la platina del microscopio y observe a 100 X.
6
Mida el dimetro del campo microscpico.
7
Cada divisin del objetivo micromtrico mide 10m (= 0.01 mm = 0.001 cm)
2
8
Determine la superificie del campo microscpico con la siguiente frmula: r en cm x 3.
1416 = Superficie de campo microscpico en cm
9
Determine el nmero de campos microscpicos que existen en la preparacin con la frmula:
Superficie de la preparacin = nmero de campos microscpicos Superficie del campo microscpico
29

10
Coloque en la platina del microscopio la preparacin teida de las bacterias y cuente las
bacterias en 10 campos. Obtenga el valor medio de organismos por campo microscpico.
11

Calcule el nmero de bacterias que hay en la preparacin (0.01 ml) y en 1 ml del

cultivo, con la frmula: # de bacterias x #de campos = # de bacterias x 100 = # bacterias/ml por
campo microscpicos en la preparacin de cultivo

II. Conteo por el mtodo de las diluciones y vaciado en placa.

Es un recuento de clulas bacterianas vivas slamente.
1
Prepare 7 tubos de ensayo de 16 x 150 mm con 9 ml de diluyente estril cada uno (agua
-2
peptonada al 0.1 % o una solucin salina isotnica). Mrquelos con las diluciones desde 1 x 10
-8
hasta 1 x 10 .
2
Marque 7 cajas de Petri vacas estriles con los mismos nmeros de las diluciones. Haga
duplicados con otras 7 cajas.
3
En condiciones estriles tome 10 ml de una suspensin bacteriana (puede ser E. coli), con
una pipeta estril y depostelos en el frasco con diluyente. Descarte la pipeta y colquela en un frasco
con desinfectante.
4.
Tape el frasco con la muestra y agite vigorosamente, aprox. 25 veces. Esta ser la
dilucin
1:10.
4
Con una nueva pipeta estril tome 1 ml y transfiera al tubo de la dilucin 1:100, mezclando
en igual forma. y descartando la pipeta.
5
Con una nueva pipeta distribuya alcuotas de 1 ml a al tubo de la dilucin 1:1000 y a las dos
cajas de Petri correspondientes marcadas. Descarte la pipeta.
6
Repita el procedimiento mezclando bien la dilucin 1:1000 y con una nueva pipeta distribuya
alcuotas al tubo de la siguiente dilucin y sus dos cajas correspondientes y as
sucesivamente con las siguientes diluciones.
7. Enseguida adicione a cada caja aprox. 20 ml de medio de cultivo previamente fundido y mantenido a
50C. Al tapar cada caja, vaya mezclando el contenido muy cuidadosamente, para que no se derrame
el lquido.
Deje solidificar e incube 24 hs a 37 C.
9

Cuente las colonias desarrolladas, bajo la cmara cuentacolonias. Calcule la cantidad de colonias
por ml o por gr de muestra, mediante la siguiente frmula:

10
Promedio de colonias contadas
UFC=unidades formadoras de colonias
.

recproco

de

la

dilucin

UFC

ml

30

III.

Curva de crecimiento.
1
Obtenga un cultivo de E. coli de 24 hs en caldo nutritivo.
2
Siembre 0.l ml del cultivo en tubos con 5 ml de caldo nutritivo. Incube a 37 C. Guarde un
tubo control sin inocular.
3
A las cero hs mida la turbidez en un espectrofotmetro. Ajuste el aparato con el control
4
Cada hora saque un tubo de la incubadora y haga la lectura, hasta completar 12 hs.
5
Dibuje una curva de crecimiento.

31

IV. Determinacin turbidimtrica. Esta medicin en un fotocolormetro se basa en el hecho de que

un cultivo de bacterias acta como una suspensin coloidal que intercepta la luz que pasa a travs de
ella. Dentro de ciertos lmites, la cantidad de luz que es absorbida es directamente proporcional a la
concentracin de clulas . Un fotocolormetro es un instrumento con una fotocelda que puede medir
la cantidad de luz que pasa a travs del cultivo. La luz que pasa a travs del cultivo activa un fototubo
que registra el porcentaje de transmitancia en un galvanmetro. Mientra ms alto sea el porcentaje de
transmitancia, ms bajo es el nmero de clulas en suspensin. El aparato debe ser calibrado antes de
cada lectura, con un tubo del medio estril sin cultivo, para establecer el 100 % de transmitancia.
Este mismo experimento permitir medir el crecimiento de una bacteria y obtener su curva de
crecimiento.
1
Siembre 0.1 ml de E. coli en 13 tubos con 10 ml de caldo nutritivo a partir de un cultivo
lquido.
2
Incube todos los tubos a 37 C.
3
Deje un tubo con el mismo medio estril, sin inocular, como testigo y gurdelo en el
refrigerador.. Este tubo servir para ajustar el fotocolormetro a 100 % de transmitancia, antes de las
lecturas.
4
A intervalos de una hora saque un tubo y determine la transmitancia en el fotocolormetro.
5
Dibuje una curva con los valores obtenidos, conforme se efectu el crecimiento de la
bacteria. Con los mismos cultivos de E. coli puede desarrollar simultneamente la curva de
crecimiento, por la tcnica de las diluciones y vaciado en placa inoculando 1 ml (haciendo
diluciones seriadas.) Se puede planear el experimento para empezar a las 7.a.m. y terminar a las
7.00 p.m. Dibuje la curva de crecimiento en papel logartmico. Investigue la frmula para
determinar el tiempo de generacin y compare los resultados con los datos de la literaratura, en
el caso especfico de la bacteria estudiada.
RESULTADOS, DISCUSION Y CONCLUSIONES

32

PRACTICA #8
METABOLISMO BACTERIANO
OBJETIVO DE LA PRACTICA.
Desarrollar tcnicas comunes para observar la accin enzimtica bacteriana en diferentes sustratos,
relacionando los resultados con cada especie. Estos datos son esenciales en su identificacin.
INTRODUCCION. Las clulas de los microorganismos, al igual que las de todos los seres vivos,
por medio de su metabolismo incorporan y transforman los diversos compuestos obtenidos del
medio ambiente, en compuestos requeridos para vivir, para su crecimiento y para su reproduccin.
En estas transformaciones participan diferentes enzimas que catalizan las reacciones de oxidacin,
reduccin, hidrlisis, transferencia de grupos, isomerizacin y sntesis, dando lugar a la degradacin
de los compuestos incorporados ( catabolismo) y a la sntesis de nuevos compuestos ( anabolismo).
Las exoenzimas son secretadas por la clula y actan fuera de ella sobre el sustrato, disminuyendo el
tamao de las molculas complejas en el medio ambiente, hasta lograr un tamao que pueda difundir
al interior de la clula, donde servirn de sustrato a las endoenzimas. Asmismo, cada grupo de
microorganismos muestra una capacidad enzimtica diferente para transformar los compuestos,
regida por su constitucin gentica y por factores ambientales. Pueden poseer una batera reducida de
enzimas actuando sobre pocos sustratos o pueden presentar un amplia variedad de sistemas
enzimticos (actuando sobre gran diversidad de sustratos.
MATERIALES Y METODOS
FERMENTACION. Fermentacin de carbohidratos: glucosa, lactosa, sacarosa, maltosa y
manitol: En la fermentacin las molculas orgnicas sirven a la vez como donadores de electrones y
como aceptores. Por ejemplo, cuando la glucosa es fermentada por las bacterias del cido lctico,
primero es oxidado a piruvato, produciendo energa. El piruvato entonces, sirve como aceptor de
electrones y es reducido para formar cido lctico, con una produccin total de 2 molculas de ATP
por cada molcula de glucosa oxidada. Los productos finales de la fermentacin dependen del
microorganismo asociado y son muy variados, como cidos, alcoholes, diferentes molculas
orgnicas gases, los cuales pueden ser utilizados en la identificacin del organismo. Los cidos
liberados en el medio bajan el pH y la acidez se detecta mediante la adicin de un indicador de pH al
medio, como el rojo de fenol. Los gases producidos se detectan por medio de un tubo pequeo
(campana de Durham) introducido en forma invertida en el tubo con el medio lquido, donde quedan
atrapados, como una burbuja, en la parte superior de la campana.
1.
Siembre tres bacterias como Escherichia coli, Enterobacter, Proteus vulgaris, en
tubos de caldo-carbohidratos y campana de Durham. Deje un control sin bacterias. Cada medio se
prepara a partir de caldo rojo de fenol para fermentacin, adicionando por separado el carbohidrato al
0.7 %
2
Incube 24 hs a 37 C.
3
Observe los cambios ocurridos. El vire del indicador de pH a amarillo indica la degradacin
del azcar con produccin de cido. La burbuja indica la produccin de gas. El vire a un color rojo
indica la produccin de amonaco y alcalinizacin cuando no se utiliza el carbohidrato.
Fermentacin cido-mixta ( prueba del Rojo de Metilo):

33

Algunas bacterias como las entricas (del tracto gastrointestinal), fermentan la glucosa y producen
grandes cantidades de productos cidos que bajan el pH del medio a 5.0
1
siembre un tubo de medio MR-VP (rojo de metilo-Voges Proskauer) con E. coli y otro con
Enterobacter aerogenes.. Deje un tubo testigo sin sembrar.
2
Incube a 37 C por 24-48 hs.
3
De cada tubo transfiera 2 ml a tubos limpios y aada a cada unos 5 gotas de reactivo rojo de
metilo. Este indicador de pH es detectado para detectar la acidez, virando a rojo a pH 4.4 y
tornndose amarillo a pH 6.2. Si la fermentacin cido-mixta tom lugar, el rojo de metilo
permanece rojo. Si no ocurri, se desarrolla el color amarillo.
Fermentacin 2,3-butanediol (prueba de Voges Proskauer):
Algunas bacterias fermentadoras de azcares producen 2,3-butanediol como producto principal que
se acumula en el medio. La adicin de KOH al 40% y solucin de alfa naftol al 5 % en etanol
absoluto, revelar la presencia de acetona (acetil-metil-carbinol), un precursor en la sntesis de
2,4butanediol. La acetona en presencia de KOH desarrolla un color rosa. Esta reaccin es acelerada
por la adicin de alfa-naftol. El desarrollo del color es ms favorable en la porcin del cultivo
expuesto al aire, debido a que algo del 2,3-butanediol es oxidado en forma regresiva a acetona,
incrementando as, la intensidad del color en la reaccin. As, con el fin de obtener resultados ms
claros, los cultivos en caldo MR-VP y el reactivo aadido se tapan y se agitan muy suavemente para
aumentar la aereacin y la velocidad de la oxidacin de 2,3-butanediol a acetona.
1. Siembre un tubo de caldo MR-VP con E. coli y otro con Enterobacter aerogenes e
incube 24-48 hs a 37 C. Deje un tubo testigo sin sembrar.
3. Transfiera 5 ml de cada cultivo a otro tubo limpio y aada 10 gotas de KOH al 40 % y 15 gotas
de alfa-naftol a cada tubo y mezcle bien para facilitar la aereacin, lo cual incrementa la
oxidacin. Los resultados positivos son evidentes despus de 30 min, con la aparicin del color
rojo.
RESPIRACION AEROBIA Y ANAEROBIA
Los azcares son comnmente usados como fuente de energa mediante su oxidacin durante la
gliclisis, hasta piruvato, en la que se obtienen 2 ATP por cada molcula de glucosa oxidada. En
presencia de un aceptor de electrones externo (como el O2), el piruvato es oxidado a acetato (AcetilCoA), la cual entra al ciclo de Krebs donde es oxidada. En este ciclo la principal funcin es oxidar
varias molculas (remover los electrones y protones). Estos electrones y protones obtenidos entran a
los sistemas de transporte de electrones, donde se genera ms energa en forma de ATP, durante la
fosforilacin oxidativa. Finalmente, los electrones y protones son donados a un aceptor tal como el
O2 o el ( NO3-) que se encuentran en el medioambiente de la clula. Si el O2 es el aceptor de
electrones, este proceso es llamado respiracin aerobia. Si el aceptor es el (NO3-) u otra molcula
inorgnica que no sea O2, es llamado respiracin anaerobia.
Prueba de la oxidasa. Esta prueba detecta la presencia de citocromo oxidasa, enzima que transfiere
electrones del citocromo c al oxgeno. Cuando las colonias de las bacterias son tratadas con el
reactivo oxidasa (oxalato de dimetil-p-fenilendiamino) se tornan de color negro en 30 minutos,
debido a la enzima oxida el reactivo (color negro), mismo que es incoloro en su forma reducida.
1
Siembre una placa de agar nutritivo con E. coli, otra con Pseudomonas aeruginosa (control
positivo) y deje una tercera como testigo sin bacterias.
2
Elija en cada placa una colonia aislada de las bacterias y deposite en cada colonia dos gotas
de del reactivo oxidasa
3
Las colonias oxidasa positivo se tornan negras.

34

Prueba de la catalasa. La catalasa y la peroxidasa son las enzimas que catalizan el rompimiento del
perxido de hidrgeno H2O2. La oxidasa rompe el H2O2 en agua y O2, siendo importante porque
destoxifica a los organismos aerobios del H2O2, el cual inactiva las enzimas celulares esenciales. Este
se forma durante el metabolismo aerbico, cuando los componentes de la cadena respiratoria donan
electrones al oxgeno molecular.
1
Cultivos en placa de 24 hs de S. aureus como control positivo y otros dos organismos ,a 37 C
y un control sin sembrar.
2
Elija una colonia aislada de bacterias en cada placa y agregue, unas gotas del reactivo
catalasa (perxido de hidrgeno) sobre las colonias.
3
La actividad de la catalasa se detecta por la formacin de burbujas de oxgeno (una rpida
efervescencia) al liberarse oxgeno gaseoso.
Reduccin de nitratos.

En la Respiracin anaerobia, algunos microorganismos utilizan molculas diferentes al

oxgeno como ltimo aceptor de electrones, por ejemplo el nitrato (NO3 ), quedando
-

reducido a nitrito (NO2 ).

1
Siembre Bacillus subtilis como testigo nitrato-reductasa positivo en tubos con caldo nitrato y
campana de Durham. Siembre otros dos tubos con bacterias diferentes y un control sin sembrar.
2
Incube 24-48 hs a 37 C.
1
Observe la presencia de gas en la campana.
2
Agregue 4 gotas de solucin A (cido sulfanlico) y 4 gotas de la solucin B (alfanaftilamina). Los iones nitrito reaccionan con los reactivos, dando un color rojo. Esto indica que hubo
reduccin de nitratos a nitritos.
HIDROLISIS DE GRANDES MOLECULAS.
En la naturaleza existen grandes molculas y muy complejas, como los polisacridos, las
protenas, los lpidos y los cidos nucleicos. Estas macromolculas son hidrolizadas por
los organismos quimiorganotrficos, mediante la accin de sus exoenzimas hidrolticas,
antes de que la clula pueda utilizarlas como nutrientes. La hidrlisis es el rompimiento
de una molcula por adicin de agua.
Hidrlisis del almidn:
Cuando el almidn (amilosa) es hidrolizado por la accin de exoenzimas amilasas, se
degrada a maltosa (disacrido de dos glucosas) y glucosa. Estos azcares son
transportados al citoplasma de la clula y usados como fuente de carbono y fuente de
energa.
1
2

Con un marcador divida externamente en cuatro, una caja de Petri con agar-almidn.
Siembre por estra en el primer sector a Bacillus subtilis, organismo testigo hidroltico del

35

almidn. En el segundo y tercero siembre otras dos bacterias de actividad desconocida. El cuarto
sector ser un control del sustrato sin microorganismos.
3
Incube48hsaa37C
4
Cubra la superficie de las cajas con lugol y observe la reaccin. Compare con los resultados
de las bacterias. Busque halos sin color azul alrededor de las colonias. En el sector control sin
bacterias observe el color azul del lugol con el almidn. El almidn reacciona qumicamente con
Iodo para producir un color azul oscuro, cuando las molculas de Iodo se insertan en los huecos de la
molcula espiralada del almidn (amilosa). Este resultado es debido a que la molcula absorbe ms
luz visible excepto el azul. Si el almidn se rompe en maltosa y glucosa, no se desarrolla ningn
color debido a que desaparece la espiral y no quedan los huecos para que entre el Iodo. Esta ausencia
de color es asociada con la hidrlisis del almidn,
Hidrlisis de la casena.
La casena es una protena encontrada en la leche, Como todas las protenas, est compuesta de
aminocidos que son utilizados por los microorganismos como fuente de energa y fuente de
carbono. Cuando la leche es mezclada con un medio de cultivo, el medio pierde su transparencia y se
vuelve turbio, debido a que la casena reacciona con los iones calcio y forma complejos coloidales
insolubles de caseinato de calcio. Cuando la enzima caseinasa cataliza la hidrlisis de la casena, los
aminocidos resultantes se disuelven en el medio acuoso y el medio se torna de nuevo transparente
alrededor de la colonia del microorganismo. Este fenmeno permite detectar la degradacin de la
protena.
1
2

Divida en cuatro partes con el marcador, una caja con agar-leche descremada.
Siembre en un sector Bacillus subtilis, organismo testigo que hidroliza la casena.

1
El segundo y tercer sectores simbrelos con dos bacterias desconocidas. El cuarto sector
djelo como testigo sin bacterias.
2
Incube todos los cultivos 48 hs a 37 C. Observe un halo de transparencia alrededor de las
colonias que hidrolizaron la casena. Determine cules organismos hidrolizaron la casena.
Hidrlisis de la gelatina. La gelatina es una protena fibrosa que se obtiene al hervir huesos,
cartlgo y otros tejidos conectivos, que al enfriarse forma un gel. Ciertos microorganismos tienen
habilidad para romper la molcula, mediante la exoenzima gelatinasa, liberando aminocidos que se
usan como nutrientes. La gelatina hidrolisada se vuelve lquida.
1
Siembre tubos con gelatina, en el centro por picadura, los organismos Pseudomonas
aeruginosa como testigo hidroltico de la gelatina y otras dos bacterias, as como un tubo control sin
sembrar.
2
Incube todos los cultivos 24-48 hs a 37 C. Observe y si es necesario vuelva a incubar.
Observe diario.
2. Coloque los tubos en el hielo unos minutos y determine si hay licuefaccin de la gelatina en el
sitio de la picadura.
Hidrlisis de Grasas: Las grasas son steres de glicerina y cidos grasos que requieren la accin de
enzimas lipasas que hidrolicen los enlaces ster entre ambos compuestos, como en los triglicridos,
resultando cidos grasos de cadena larga y glicerol.. Las fosfolipasas hidrolizan los fosfolpidos. En
un medio de cultivo slido con mantequilla se observa un halo transparente alrededor de la colonia

36

del microorganismo que hidroliza la grasa. Estas molculas resultantes son usadas como fuente de
energa y de carbono. La hidrlisis de grasas en los alimentos origina la rancidez, misma que se
refleja en el sabor y olor desagradables. En el medio de cultivo con agar, los cidos grasos liberados
acidifican el medio, lo que puede detectarse mediante un indicador de pH en el medio.
1
Siembre solo el centro de una placa de medio agar-spirit-blue-aceite de olivo, con Proteus
mirabilis o con Staphylococcus epidermidis. Deje un control sin bacterias.
2
Incube 48hs a 37C
3
La hidrlisis de grasas es indicada por una zona azul alrededor del crecimiento bacteriano.
Donde no hay hidrlisis se conserva el color original del medio (lavanda claro).
Hidrlisis de la urea. La urea o carbamida es una diamida que se degrada por medio de una
amidasa llamada ureasa. Se rompe el enlace del nitrgeno con el carbono, con liberacin de
amonaco y CO2 . El medio con urea es adicionado de un indicador de pH (rojo de fenol). El
amonaco libre alcaliniza el pH y el indicador vira a color violeta.
1. Siembre Proteus vulgaris en tubos con medio urea-agar inclinados e incube 48 hs a 37
C.
2. El cambio de color del medio de naranja a violeta indica la hidrlisis de la urea.
UTILIZACION DE AMINOACIDOS.
Los aminocidos son molculas que contienen un grupo cido (COOH), un grupo amino (NH2) y un
grupo radical (R), y son utilizados por las clulas para la sntesis de protenas. Los aminocidos son
los compuestos orgnicos nitrogenados ms utilizados por los microorganismos, originando la
separacin del grupo carboxilo, del grupo amino o del sulfhidrilo. La descarboxilacin permite la
formacin de aminas, con frecuencia malolientes. La desaminacin puede ser oxidativa, produciendo
un cetocido y amonaco. La desaminacin reductiva es frecuente por los clostridia (anaerobios),
produciendo un cido graso saturado y amonaco.
Utilizacin del Triptofano y produccin de indol
El triptofano es un aminocido que resulta del rompimiento de la mayora de las protenas. Algunas
bacterias producen la enzima triptofanasa que cataliza la separacin de residuos de indol, a partir del
triptofano. La degradacin es intracelular mediante un sistema enzimtico llamado triptofanasa,
dando lugar a amonaco, cido pirvico y tres metabolitos: indol, cido indol-actico y escatol.. El
indol se acumula en el medio de cultivo como un metabolito de desecho, mientras que el resto de la
+
molcula del triptofano (piruvato y NH4 ) es usada para satisfacer necesidades nutricionales. El indol
puede detectarse en el medio de cultivo, por adicin del reactivo de Kovac, el cual reacciona con el
indol en unos segundos, dando un compuesto rojo insoluble en agua,.
1
Siembre en tubos con caldo triptona la bacteria E. coli como testigo positivo productor de
triptofanasa y del metabolito indol. Siembre otras dos bacterias en tubos del mismo medio y deje un
control sin bacterias.
2
Incube 24 hs a 35 C
3
Aada 5 gotas del reactivo de Kovac a cada tubo. El desarrollo de un color rojo indica la
presencia de Indol.
Produccin de sulfuros, a partir de aminocidos con azufre.

37

Muchas protenas son ricas en aminocidos con azufre, como la cistena y la metionina, los cuales
son liberados con la hidrlisis de las protenas. La produccin de H2S a partir de aminocidos con
azufre, mediante la enzima desulfurasa, indica la capacidad de los microorganismos para utilizarlos.
El olor del H2S es asociado tpicamente con el de los huevos podridos. Si adems de los aminocidos
con azufre, el medio de cultivo tambin contiene iones ferrosos, stos reaccionan con el H 2S,
produciendo sulfuro ferroso (FeS), compuesto insoluble de color negro. El ennegrecimiento del
medio se observa primero donde hay mxima acidez.
1
Siembre tubos con medio de SIM con un Proteus vulgaris como testigo positivo productor de
H2S , as como dos bacterias ms y un control sin sembrar.
2
Este medio SIM contiene polipptidos ricos en aminocidos azufrados, principalmente
triptofano y adems iones ferrosos. Por lo tanto, en este medio se puede hacer simultneamente la
prueba de produccin H2S y la de Indol
2. Incube 48 hs 35 C. El color negro indica la presencia del sulfuros de un metal pesado..
Prueba de la lisin-descarboxilasa
La descarboxilacin es la separacin de un grupo carboxilo de molculas orgnicas como los
aminocidos, con liberacin de CO2. La descarboxilacin permite neutralizar los ambientes cidos.
Las enzimas descarboxilasas separan los grupos cidos de los aminocidos, produciendo aminas, que
hacen el medio ms alcalino. La descarboxilacin de la lisina puede detectarse en un medio
conteniendo lisina, junto con glucosa y un indicador de pH (prpura de bromocresol), para observar
visulamente los cambios. Los cidos de la fermentacin de la glucosa bajan el pH del medio
induciendo el cambio de color a amarillo . En este punto ocurre la descarboxilacin de la lisina
(activada por la acidez) resultando en la produccin de aminas y neutralizacin del medio y sto hace
que el indicador regrese a su color prpura al neutralizarse el medio.
1. Inocule Salmonella tiphymorium o Proteus mirabilis y otro con Escherichia coli por picadura
en un tubo de medio solido con Agar Lisina Hierro (LIA).
Incube todos los tubos 24 hs a 37 C.
En el medio de cultivo La glucosa es el hidrato de carbono fermentable, y la lisina es el sustrato
utilizado para detectar la presencia de las enzimas decarboxilasa y deaminasa. El citrato de hierro
y amonio, y el tiosulfato de sodio, son los indicadores de la produccin de cido sulfhdrico. El
purpura de bromocresol, es el indicador de pH, el cual es de color amarillo a pH igual o menor a
5.2, y de color violeta a pH igual o mayor a 6.8.
Por decarboxilacin de la lisina, se produce la amina cadaverina, que alcaliniza el medio y esto
produce el viraje del indicador al color violeta. La decarboxilacin de la lisina, tiene lugar en
medio cido, por lo que es necesario que la glucosa sea previamente fermentada.
Los microorganismos que no producen lisina decarboxilasa, pero que son fermentadores de la
glucosa, producen un viraje de la totalidad del medio de cultivo al amarillo, pero a las 24 hs de
incubacin se observa el pico de color violeta debido al consumo de las peptonas, y el fondo
amarillo.
UTILIZACION DE CITRATO COMO UNICA FUENTE DE CARBONO Y DE ENERGIA.
El medio citrato de Simmons es un medio de composicin definida, adicionado del indicador de pH
Azul de Bromotimol. Cuando la bacteria utiliza el citrato, elimina el cido del medio y el indicador
cambia de verde a azul en las condiciones alcalinas.

38

1
Siembre Escherichia coli como testigo en tubos con citrato, as como otras dos bacterias y un
control. Incube igual.
2
El crecimiento indica utilizacin del Carbono. Un color azul indica la formacin de productos
alcalinos
RESULTADOS, DISCUSION Y CONCLUSIONES.
Como complemento de los resultados agregue las reacciones bioqumicas ocurridas en
cada ejercicio.
APENDICE:
Medio agar Leche descremada:
Triptona..5 gr
Extracto de levadura ....2.5 gr
Dextrosa..1.0
Agar 15 gr
Agua destilada ..1000 ml.
Se autoclavea. Por separado se esteriliza la leche descremada. Al vaciar el medio en las placas se le
adicionan 2 ml de leche a cada placa, se mezcla y se deja solidificar.
Medio Agar-almidn: Extracto de
carne..3.0 g Almidn
soluble10 g
Agar..12 g Agua
destilada1000 ml Autoclavear.

Medio Agar Lisina Hierro (LIA)

Peptona de gelatina5.0 g
Extracto de levadura 3.0 g
Glucosa 1.0 g
Lisina10.0 g
Citrato de hierro y amonio 0.5g
Tiosulfato de sodio0.04 g
Purpura de Bromocresol0.02 g
Agar 15.02 g
Agua destilada 1000 ml
Suspender 35 g del medio deshidratado en 1000 ml de agua destilada. Dejar hidratar por 15 min.
Calentar agitando y hervir por 1 min hasta disolucin. Distribuir y autoclavear. Dejar enfriar con
inclinacin .

39

PRACTICA #9
VARIACIONES GENETICAS BACTERIANAS
OBJETIVO DE LA PRACTICA. Desarrollar algunas tcnicas para inducir mutantes,
comprendiendo su importancia y su aplicabilidad
INTRODUCCION Variaciones temporales: se refieren a variaciones en las bacterias debidas a
factores ambientales y que no incluyen reestructuracin del DNA. Tales variaciones pueden ser
morfolgicas o fisiolgicas y desaparecen tan pronto como los cambios ambientales que las
indujeron desaparecen tambin. Por ejemplo, un cultivo de E. coli al hacerse viejo, cuando los
nutrientes en el medio de cultivo se agotan, las clulas nuevas son ms cortas, cocoides, pero al
inocular la bacteria en un medio fresco, recupera su forma y tamao originales. Variaciones
permanentes: son cambios resultantes de alteraciones en la molcula del DNA, dando lugar a que
permanezcan durante un gran nmero de resiembras de la bacteria. Estas modificaciones son debidas
a mutaciones y ocurren espontneamente. Pueden ser inducidas por factores fsicos y qumicos.
Transferencia de DNA (recombinacion bacteriana): Algunas variaciones permanentes tambin
pueden ser causadas por la transferencia de DNA de un organismo a otro, por diferentes mecanismos
directos, tales como la conjugacin o indirectamente por medio de un fago.
MATERIALES Y METODOS.
I. Aislamiento de mutantes que ilustren la variacin del genotipo (por efecto de la luz
ultravioleta).
1
Siembre 0.1 ml de cultivo de Serratia marcescens en cada una de siete placas de agar
nutritivo, y extienda por estra.
2
Destape las cajas bajo una lmpara de luz ultravioleta (use lentes para luz U.V. con el fin de
proteger los ojos). Retire las cajas de una en una a intervalos de 6, 30, 60, 90, 120 y 150 segundos.
Deje una caja como testigo sin tratamiento de luz. Marque todas las cajas.
3
Incube 48 hs a 25 C (temperatura ambiente).
4
La mayora de las colonias deben ser rojas. Busque colonias sin color, o colonias con sectores
sin color.
5
Elija una colonia sin color y resimbrela en una placa nueva e incube 48s a 25 C. Las
colonias de mutantes deben permanecer sin color.
II. Aislamiento de mutantes resistentes a estreptomycina por el mtodo de gradiente en placa
En este experimento se formar un gradiente en placa usando estreptomycina en el medio de agar
nutritivo. Escherichia. coli que normalmente es sensible a este antibitico, ser inhibido.
Cualquier colonia que desarrolle en en el rea de concentracion alta, proceder de una bacteria
mutante resistente al antibitico.
1
Se funde el medio de dos tubos con 10 ml de agar nutritivo y se mantienen a 50 C en un bao
Mara.
2
Se vaca el contenido de uno de los tubos en una caja de Petri estril ligeramente inclinada
(uno de los extremos de la caja estar apoyado en un trozo de madera de 1/8 x x 2 pulgadas) y se
deja solidificar a temperatura ambiente.
3
Una vez solidificado el agar, se retorna la caja a su posicin horizontal normal sobre la mesa
(retire el fragmento de madera).

40

4
Se retira del bao el segundo tubo con agar nutritivo y se le adicionan 0.1 ml de solucin de
estreptomycina al 1%. Se mezcla vigorosamente y se vierte el medio en la caja, en una segunda capa.
Se deja solidificar.
5
Una vez solidificado el medio, deben marcarse las reas de mayor concentracin de
estreptomycina y las de ms baja.
6
En el centro de la placa se depositan 0.1 ml de una suspensin de E. coli y se extiende el
inculo con una varilla de vidrio estril, doblada en forma de L. (la la varilla sucia se coloca en un
recipiente con desinfectante. La placa invertida se introduce en una bolsa de plstico (para evitar la
deshidratacin del medio) y se incuba durante 7 das a 37 C
7
Se cuenta el nmero de colonias desarrolladas en el rea ms concentrada del antibitico,
constitudas por bacterias mutantes resistentes al antibitico.
8
Elija una de las mutantes bien separada de las otras y extindala in poco con el asa y vuelva a
incubar dentro de la bolsa de plstico, durante dos o tres das a 37 C. Explique los resultados.
RESULTADOS, DISCUSION Y CONCLUSIONES.

41

PRACTICA #10
CONTROL MICROBIANO EFECTO DE AGENTES QUIMICOS
OBJETIVO DE LA PRACTICA. Comprender la diferencia entre esterilizacin y desinfeccin y
adquirir el criterio para probar la sensibilidad bacteriana a diferentes agentes qumicos. En los
mtodos de esterilizacin queda implcita la destruccin total de todas las formas de vida. En la
desinfeccin no se logra la destruccin total.
INTRODUCCION
Es necesario disponer de procedimientos para controlar la contaminacin y el crecimiento
microbianos. La palabra control, aqu se refiere a la inhibicin, muerte o eliminacin de los
microorganismos. Los microorganismos pueden ser controlados por agentes fsicos, procesos fsicos
o por agentes qumicos. Un agente qumico es una sustancia (slido, lquido o gas) que se
caracteriza por una composicin molecular definida y que causa una reaccin. Por ejemplo los
compuestos fenlicos, los alcoholes, los halgenos y sus derivados como el cloro, el bromo y el
yodo: los metales pesados y sus compuestos, los detergentes, los aldehdos y los quimioesterilizantes
gaseosos como el xido de etileno.
MATERIALES Y METODOS.
II. Efectividad del lavado de manos con detergente.
1
Un primer estudiante se vaca unas gotas de suspensin de suelo, en la palma de la mano
derecha y hace que se extiendan en toda la superficie de la palma (1gr de suelo fresco en 9 ml de
agua estril)
2
Un segundo estudiante le saluda de mano al 1er estudiante. Un tercer estudiante le saluda al
segundo y un cuarto al tercero (todos los estudiantes usan la mano derecha).
Con un hisopo estril humedecido en s.s.f. estril, se frota la mitad de la palma de la mano y se
descarga el inculo en la mitad de una placa de agar nutritivo. Se repite la operacin con el segundo
estudiante y se siembra en la I. Actividad bacteriosttica o bactericida de algunos compuestos
qumicos (incluyendo antibiticos)
1
Siembre la superficie de una placa totalmente por medio de un hisopo impregnado de una
suspensin bacteriana de Staphylococcus aureus. Haga lo mismo en otra caja con Escherichia coli.
2
Distribuya varios crculos de papel impregnados con antispticos, limpiadores comerciales y
domsticos, colorantes, desinfectantes, jabones, antibiticos, etc. Deben ser los mismos para las dos
bacterias. En el caso de antibiticos, los crculos impregnados se obtienen comercialmente.
3
Incube a 37 C por 24 hs. mida el radio de inhibicin alrededor de cada crculo de papel para
cada compuesto y compare entre las dos bacterias probadas. Determine si hay diferencias en el efecto
del mismo compuesto para las dos bacterias.
3
mitad de otra placa nueva de agar nutritivo, y as sucesivamente con los otros estudiantes.
4
Que todos los estudiantes se laven la mano con detergente y se enjuaguen con agua estril.
Enseguida se repite el muestreo de la misma mano con un hisopo estril (ahora no se requiere
humedecerlo), y se siembra la mitad de la placa que qued sin sembrar,
5
Incube todas las placas a temperatura ambiente por 24 hs. Compare los resultados de las
siembras de manos sin lavar y manos lavadas. Note si hubo diferencias en la cantidad de bacterias
desarrolladas en cada caso.

42

6
Otros estudiantes pueden modificar el experimento usando jabn bactericida o jabn
antisptico, etc.

RESULTADOS, DISCUSION Y CONCLUSIONES.

Anote detalladamente los resultados en cada experimento y vaya interpretando los
resultados.
Forme una tabla con los datos del halo de inhibicin medido en mm., para hacer las
comparaciones.

CUESTIONARIO.
1. Defina los trminos esterilizacin, desinfeccin, antisptico, bacteriosttico, Bactericida,
higienizante, teraputico,

43

PRACTICA #11
MICROBIOTA NORMAL HUMANA
OBJETIVO DE LA PRACTICA.
Conocer la microflora normal de las diferentes partes del cuerpo y comprobar su presencia en piel y
cavidad bucal mediante tcnicas de laboratorio.

INTRODUCCION.
Los microorganismos normalmente existen en diversas regiones del cuerpo y estas poblaciones
representan lo que se conoce como microflora nativa, pero su simple presencia no debe interpretarse
como indicacin de enfermedad. La contaminacin microbiana del cuerpo se inicia durante el
nacimiento y contina al respirar y al alimentarse. Abarca superficies de partes anatmicas, tales
como el tracto digestivo, el tracto respiratorio, el tracto genitourinario, la piel y odo externo. Sin
embargo, los microorganismos en todos estos lugares slo estn superficialmente y nunca en el
interior de los tejidos. La microbiota normal se encuentra constantemente en un sitio dado, a una
edad dada y est compuesta por grupos relativamente fijos, permaneciendo sin alterarse. Si se le
trastorna, vuelve a restablecerse. Si la microflora normal sufre alteraciones o es eliminada, los
microorganismos patgenos pueden responder aprovechando la situacin y entonces proliferar,
llegando a causar enfermedad. Las poblaciones de esta microflora de varias regiones del cuerpo,
pueden contribuir en varias funciones tiles. Por ejemplo la flora intestinal sintetiza varias vitaminas
y tambin ayuda en la digestin de alimentos. Normalmente, ella tiende a desalojar formas que
puedan ser patgenas. En cualquier situacin ecolgica se puede lograr un equilibrio entre la flora
normal y los parsitos, sin evidencia de enfermedad.
MATERIALES Y METODOS
I. Estudio de la microbiota normal de la boca.
1
Con ayuda de un palillo estril extraiga una pequea cantidad del sarro existente entre los
dientes y con cuidado depostela en el extremo de una placa con tripticasa-agar-soya; enseguida
proceda a extender el inculo en la superficie con una asa bacteriolgica, por estra cruzada.
2
Con otro palillo tome otra muestra de sarro y extindalo en un portaobjetos para hacer un
frote. Deje secar y fije con calor. Tia con Gram. Observe a 100 X. Haga dibujos.
3
Acerque a la boca una placa abierta de agar nutritivo y pronuncie cinco veces cada una de las
siguientes palabras: fantstico, pstula, satisfecho, chichimecas, pusilnime, ferrocarril.
II. Estudio de la microbiota normal de la piel.
1
Con un hisopo estril humedecido en s.s.f. estril, frote la palma de la mano y deposite el
inculo en una placa de tripticasa-agar-soya, extendiendo despus con el asa por estra cruzada.
2
Lave con agua la misma mano y sin secar, nuevamente frtela con otro hisopo estril,
depositando el inculo en otra placa de agar nutritivo y extendiendo con el asa por estra cruzada.
3
Incube todas las placas sembradas a 37 C por 24 hs. y compare la abundancia del crecimiento
bacteriano, en los diferentes experimentos. Compare tambin los diferentes tipos de crecimiento
bacteriano, y determine si hay variaciones en las diferentes cajas. Haga deducciones.
III. Determinacin de microbiota normal en vegetales.

44

1
Con un hisopo estril empapado en sol. sal. estril frote un poco la superficie de cualquier
vegetal o fruta y siembre una placa de tripticasa agar soya (para aislar bacterias) y una de sabouraud
adicionado de penicilina (para aislar hongos).
2
Incube a 25 C todas las cajas, durante 48 hs para bacterias y una semana para hongos.
Observe.
RESULTADOS, DISCUSION y CONCLUSIONES.
En cada experimento relate detalladamente lo observado al microscopio y en los cultivos, e
interperete los resultados.Obtenga conclusiones.

CUESTIONARIO.
1. Diga el nombre de dos bacterias que sean de la flora normal de piel y dos del intestino, que
eventualmente se reporten como patgenas.

45

PRACTICA #12
RELACION HUESPED PARASITO
Reacciones antgeno-anticuerpo
OBJETIVO DE LA PRACTICA
Desarrollar una tcnica inmunolgica sencilla donde se observe la reaccin Ag-Ac, comprendiendo
su utilidad en el diagnstico microbiolgico.
INTRODUCCION.
En los vertebrados reside la capacidad de los sistemas inmunitarios para distinguir entre clulas o
sustancias de su propio organismo y las que tienen otro origen. Entre los extraos se incluyen clulas
de otros organismos, virus, bacterias, toxinas, toxoides, vacunas, etc. Cuando estos materiales
penetran en el organismo son reconocidos como sustancias extraas o antgenos.
La Inmunologa estudia principalmente el desarrollo de la resistencia del hospedador frente a
enfermedades causadas por microorganismos, es decir, estudia la inmunidad adquirida especfica.
Las clulas germinales de la mdula sea que participan en las respuestas inmunitarias, se diferencian
en una de dos posibles poblaciones de linfocitos: 1.-Linfocitos B, o Clulas B. Reciben ese nombre,
porque las clulas precursoras maduran en un pequeo rgano linfoide llamado Bolsa de Fabricio en
las aves (en los mamferos hay tejidos linfoides equivalentes, como las placas de Peyer del tracto
digestivo) y se transforman en linfocitos B. Slo el 20 % de los linfocitos circulantes son Clulas B;
el resto de las clulas estn en el tejido linfoide. Viven das o semanas. Las Clulas B son las
responsables de la respuesta inmunitaria humoral, ya que al entrar en contacto con el antgeno,
originan clulas plasmticas productoras de anticuerpos. Tambin pueden originar clulas con
memoria, linfocitos de larga supervivencia que estn en reposo despus de haber sido estimulados
por un antgeno; cuando se renueva el contacto con un antgeno igual, producen la llamada "respuesta
secundaria" que es ms rpida y vigorosa que la "respuesta primaria", porque hay una mayor y ms
rpida produccin de anticuerpos. El resultado es que el individuo responda con mayor prontitud e
intensidad a una segunda exposicin al antgeno.
2.-Linfocitos T, o Clulas T, que tambin se originan a partir de precursores producidos en mdula
sea por las clulas germinales. Se desarrollan en el Timo, de donde toman su nombre. Abandonan el
timo y se concentran en bazo, ganglios linfticos y tambin van a la sangre. Viven durante varios
meses. Como consecuencia de la activacin antignica, los Linfocitos T dan lugar a las clulas
efectoras responsables de la respuesta inmunitaria celular. Los linfocitos T participan en la muerte o
eliminacin de materiales extraos y microorganismos invasores, e incluso clulas cancerosas. Son
las principales responsables del rechazo de trasplantes y de reacciones alrgicas cutneas. Se
encargan de movilizar a los macrfagos en la destruccin de patgenos y de estimular a las clulas B
para intensificar la produccin de anticuerpos (hay una "cooperacin celular").
Aunque ms difcil de medir, la inmunidad celular tambin est reforzada por una segunda
exposicin a un antgeno, lo que es representado por una nueva y mayor poblacin de clulas T con
memoria, capaces de responder a la segunda aparicin del antgeno.

46

En el laboratorio clnico, la Serologa permite el estudio de las reacciones antgenoanticuerpo que se encuentran en el suero sanguneo. Las reacciones serolgicas son especficas entre
un antgeno y un anticuerpo y pueden ser usadas para el trabajo de diagnstico. Cuando uno de los
componentes es conocido, el desconocido puede ser detectado con un alto grado de sensibilidad y
exactitud. Las pruebas serolgicas de reaccin antgeno-anticuerpo, amplan la capacidad diagnstica
del clnico y orientan la teraputica. Hay muchas tcnicas disponibles.

MATERIALES Y METODOS
REACCION DE AGLUTINACION EN PLACA:
Prueba de Reacciones febriles: Esta prueba representa un mtodo de laboratorio til para
seguir la secuencia de ciertas infecciones con acceso febril, causadas por bacterias. Son reacciones de
aglutinacin entre los antgenos de Salmonella, Brucella y Proteus y los anticuerpos contra estos
antgenos presentes en el suero del paciente.
Esta
tcnica
comprende:
-Reaccin de Widal para diagnstico de la fiebre tifoidea, entrica y ondulante. La
reaccin mide el ttulo de anticuerpos (aglutininas) en el suero contra una suspensin de
antgenos conocidos de Salmonella typi , S. paratyphi A y S. paratyphi B.
-Reaccin de Huddleson para la brucelosis (Brucella abortus, B.suis o B. melitensis).
-Reaccin de Weil-Felix para el tifo. Las especies de Rickettsias que causan tifo, tienen
componentes antignicos idnticos a Proteus (cepas OX-19, OX-2 y OX-K). En esta prueba se
utilizan antgenos de Proteus para diagnstico de tifo.

Antgenos comerciales:
Brucella (B. abortus)
Tfico O (somtico)
Paratfico A (flagelar)

|
|
|

Paratfico B (flagelar)
Tfico H (flagelar)
Proteus OX-19

Sueros control comerciales : control negativo control positivo

Obtencin de la muestra sangunea:
1
Se revisan ambos brazos del paciente para localizar una vena adecuada.
2
En el brazo elegido se coloca una ligadura de hule ltex, aproximadamente a 6 cm por
encima de la vena.
3
Se limpia toda la zona con una torunda impregnada con alcohol. Deje secar antes de
sangrar, para evitar posibles reacciones alrgicas y que no arda.
4
Introduzca la aguja del vacutainer paralelamente a la vena para no perforarla, cuidando
que el en el visel de la aguja, el orificio quede hacia arriba.
5
Se introduce el tubo para recoleccin de muestra, en el soporte del vacutainer y
automticamente se obtendrn 3 ml.
6
Saque la aguja de la vena y presione con la torunda hasta que no salga ms sangre del
47

paciente.
7
Deje coagular la sangre y centrifugue.
8
Separe el suero con una pipeta Pasteur y depostelo en un tubo limpio, para las pruebas
serolgicas.
PRUEBA CUANTITATIVA
Pozo # Suero problema

1
2
3
4
5
6
7

ml
0.08
0.04
0.02
0.01
0.005
suero control (+)
Suero control (-)

Antgeno Aglutinacin Ttulo

1 gota
1 gota
1 gota
1 gota
1 gota
1 gota
1 gota

4+
4+
3+
2+
1+
3+
Sin aglut

1:20
1:40
1:80
1:160
1:320
1:80

Interpretacin de los resultados: Se observa la aglutinacion macroscpica y se valoran los

resultados en la siguiente forma:
4+ 100% aglutinacin
3+ 75% "
2+ 50% "
1+ 25% "
0Los enfermos de brucelosis aguda mostrarn un ttulo de aglutininas 1:80 o mayor. Pueden
persistir por meses o aos. Un ttulo tfico somtico (O) significativo es 1:80, pero mayor es
importante. Para el tifo, el menor ttulo significativo es 1:80. Un aumento cudruple se considera
importante. Para las reacciones febriles se toman dos muestras con un intervalo de siete das. Si
en la segunda muestra se encuentra un ttulo ms elevado que en la primera, indicar una
infeccin activa. Si por el contrario en la segunda muestra se encuentra un ttulo menor que en la
primera, indica que el paciente est en recuperacin y los anticuerpos detectados son de
memoria.
RESULTADOS, DISCUSION Y CONCLUSIONES.
Anote el resultado de las pruebas febriles, por ejemplo tfico O positivo 1:80, Proteus negativo,
etc. Discuta los resultados, indicando en las reacciones positivas, cmo se puede saber en base al
ttulo obtenido, si el resultado de una titulacin alta es a consecuencia de una enfermedad activa
o de inmunoglobulina (IgG) de memoria.
CUESTIONARIO
1. Cul es la diferencia entre el antgeno O y el H
48

PRACTICA #13
LAS BACTERIAS EN EL AMBIENTE
OBJETIVO DE LA PRACTICA.
Demostrar la presencia de las bacterias en la naturaleza y sus actividades.

INTRODUCCION
Los hbitats de las bacterias, al igual que los de cualquier microorganismo, son extremadamente
diversos. Cualquier hbitat adecuado para los seres superiores, tambin lo es para los
microorganismos. En muchos lugares donde las condiciones ambientales son extremas, no se
encuentran organismos superiores, pero puede haber microorganismos variados.
Los ciclos del carbono y del oxgeno estn altamente interrelacionados a travs de las actividades
complementarias de los microorganismos autotrficos y de los heterotrficos. La degradacin de la
materia orgnica hasta compuestos inorgnicos en la naturaleza, se efecta va microbiana,
constituyendo la mayor fuente de CO2 para la atmsfera. En nuestro planeta el principal compuesto
de nitrgeno es el N2, mismo que slamente puede ser utilizado por las bacterias fijadoras de
nitrgeno, formando amonaco, y ste a su vez es transformado por muchos organismos en
compuestos nitrogenados orgnicos. Algunas bacterias de las encontradas naturalmente en el medio
ambiente, son utilizadas en la industria o en proyectos ecolgicos contra la contaminacin.
La habilidad de las bacterias para degradar materiales tales como pinturas, textiles, concreto y
petrleo (biodeterioracin), pueden causar problemas serios en una gran variedad de ambientes
industriales. Los alimentos sufren dao al haber desarrollo microbiano, originando cambios
detrimentes, que hacen los alimentos indeseables. Los alimentos con carbohidratos, protenas y
grasas utilizables, son nutrientes ideales para proporcionar un buen ambiente en los alimentos. Lo
ms importante es que los alimentos enlatados actan como un buen medio para la transmisin de
bacterias patgenas humanas.
En la naturaleza todos los microorganismos conviven en poblaciones mixtas que interactan entre s,
estableciendo relaciones de diferente grado de complejidad. Estas relaciones pueden ser benficas,
perjudiciales o indiferentes, repercutiendo sobre uno o sobre mbos microorganismos involucrados.
Simbiosis (mutualismo): hay beneficio para ambos organismos, ya sea entre dos microorganismos,
entre un microorganismo y un organismo superior, por ejemplo mamferos rumiantes y protozoarios,
o como las bacterias fijadoras de nitrgeno asociadas con races de plantas leguminosas.
Comensalismo: en esta relacin slo uno de los organismos resulta beneficiado y el otro no es
afectado. Un ejemplo comn lo constituyen los organismos aerobios, que al consumir el oxgeno
permiten el desarrollo de los anaerobios. En las cadenas de degradacin orgnica, cada etapa es
desarrollada por un grupo de organismos. Los
vegetales y animales superiores presentan una microflora normal en algunas der sus
partes.
Antagonismo: Una de las especies inhibe a la otra o causa su muerte, por ejemplo en el
caso de bacterias productoras de antibiticos.
Sinergismo: Aqu la actividad cooperadora de dos organismos es mayor a la suma de las

49

dos actividades realizadas por separado.

MATERIALES Y METODOS.
I. Comensalismo. Entre dos
bacterias:
1
Con un marcador divida a la mitad externamente, dos cajas con agar nutritivo,
2
Siembre la mitad de cada placa con S. aureus y la otra mitad con Clostridium sp.
3
Selle los bordes de la placa con cinta adhesiva e incube a 32 C durante 24 hs y compare el
crecimiento en ambas cajas, sin quitar la cinta adhesiva.
4
Vuelva a incubar hasta completar 48 hs. Compare el crecimiento.
Siga incubando hasta 72 hs. Concluya la forma en que actu cada organismo sobre el otro.
Entre bacterias y humanos: un buen ejemplo es la microflora normal, ya demostrada en una
prctica anterior.
II. Antagonismo:
1. Entre dos bacterias.
En un tubo con 15 ml de agar nutritivo siembre 1 ml de Pseudomonas aeruginosa.
Mezcle rpido y vace en una caja de petri. Deje solidificar. Enseguida siembre en el
o
centro de la placa una estra recta de Escherichia coli. Incube a 37 C por 24 hs.
Determine si crecieron las dos bacterias o slo una.
Concluya.
En un tubo con caldo nutritivo inocule una asada de Pseudomonas aeruginosa, luego una
de E. coli, otra de S. aureus y una de Bacillus subtilis. Inocule a 37 C por 48 hs.
Tome una asada del cultivo y siembre por estra cruzada una placa de agar nutritivo.
Incube 24 hs a 37 C. Observe el nmero de colonias diferentes y si concuerda con el
nmero de bacterias diferentes sembradas en el caldo.

2. Entre un hongo y una bacteria:

Siembre una estra de Penicillium en el extremo de una caja de tripticasa agar soya. E incube 5
das a 25 C. Posteriormente siembre perpendicularmente una estra de Streptococcus pyogenes e
incube a 37 C por 24 hs. Determine el crecimiento de la bacteria.
III. Simbiosis (mutualismo)
1. Entre un hongo y un alga (lquenes)
Obtenga en el campo unas muestras de lquenes y con una aguja de diseccin separe a los dos
organismos en una caja de petri conteniendo agua destilada. Observe al microscopio a 10 y a 40 X
entre porta y cubre.
RESULTADOS, DISCUSION Y CONCLUSIONES.

50

PRACTICA #14
EUMYCETOS
OBJETIVO DE LA PRACTICA
Aprender a determinar las caractersticas macro y microscpicas ms sobresalientes de los diferentes
grupos de eumicetos, y que compruebe su alta distribucin en el ambiente.
INTRODUCCION
Los hongos son organismos eucariotes, unicelulares o pluricelulares y presentan una pared celular, de
composicin diferente a la de las plantas. No contienen clorofila ni sintetizan macromolculas a
partir del CO2 ni de la luz. Todos son heterotrficos. Se encuentran ampliamente distribudos en la
naturaleza y los de mayor inters son los ornamentales, los comestibles, los venenosos, los txicos,
los alucingenos, los medicinales, los patgenos (de humanos, animales, plantas), los degradadores
de materia orgnica y los que descomponen los alimentos.
REINO FUNGAE:
Subdivisin

Clase

Zygomycotina
Ascomycotina
Basidiomycotina
Deuteromycotina

Zygomycetes
Ascomycetes
Basidiomycetes
Deuteromycetes o Fungi Imperfecti (aqu se encuentra la mayora
de los hongos)

El cuerpo de los hongos se denomina talo, ya sea unicelular o pluricelular. a) Talo unicelular: de
forma ovoide o amiboide, por ej: las levaduras b) Talo pluricelular: con aspecto filamentoso,
esponjoso, o carnoso.
-A los hongos filamentosos se les conoce como mohos, formados por hifas que consisten de
filamentos tubulares ramificados, con un crecimiento apical; las hifas pueden ser cenocticas
(sin divisiones y multinucleadas) o tabicados (divididas en segmentos). La masa de hifas
constituye el micelio. En las hifas se producen diferentes clases de esporas reproductivas:
-esporas asexuales: talosporas, conidios, esporangiosporas. -esporas sexuales: ascosporas,
basidiosporas.
-A los hongos carnosos macroscpicos se les llama setas (championes). Los hongos
presentan requerimientos nutricionales muy simples, pero su desarrollo es ms lento que el de las
bacterias, requiriendo varios das de incubacin.
Identificacin:
Las caractersticas ms empleadas para la identificacin de los hongos filamentosos son: El
tipo de talo, morfologa macroscpica del micelio, micelio areo y profundo (caractersticas
coloniales, tanto de frente como en el reverso), morfologa microscpica del micelio, tipo
de hifas, estructura y modo de formacin del cuerpo reproductivo sexual, tipo de esporas:
forma, tamao, aspecto externo, agrupacin, nmero de clulas, flagelos.

51

Para la identificacin de levaduras se requiere conocer adems de la morfologa, la

determinacin de caractersticas fisiolgicas y bioqumicas, especialmente su accin sobre
azcares.
MATERIALES Y METODOS
I. Aislamiento de hongos del ambiente
1
Abra una caja de Sabouraud-agar-penicilina en el jardn, en alguna habitacin, o en
cualquier cualquier otro lugar, durante 15 min. Despus de este tiempo tpela e incubela a 28 C
por una semana, hasta observar el desarrllo de colonias de hongos.
2
En otra caja espolvore unas cuantas partculas de polvo del jardn e incube igual por una
semana.
3
Una vez desarrolladas los hongos, haga una descripcin de las colonias y comprelas
entre s. Compare el frente con el reverso de la colonia. Haga dibujos de las que sean diferentes.
4
Haga una impronta de una de las colonias con cinta adhesiva transparente y monte sobre
un porta, con una gotita de lactofenol. Observe al microscopio a 10 y 40 X. La cinta transparente
hace el papel de cubreobjetos.
5
Trate de identificar hasta gnero, mediante una comparacin de las hifas y esporas
observadas al microscopio, con los dibujos mostrados en los libros. Haga dibujos detallados, con
los nombres de las estructuras del hongo y el nombre del gnero identificado.
II. Desarrollo de hongos en vegetales
1
Guarde en una bolsa de plstico unas frutas, verduras o semillas, durante una o dos
semanas, a temperatura ambiente. Revise peridicamente, hasta observar el desarrollo de
colonias de hongos.
2
Compare las colonias desarrolladas entre s, tanto en los medios de cultivo como en los
vegetales, notando las diferencias de color y apariencia en general.
3
Haga una impronta de una de las colonias con cinta adhesiva transparente y monte sobre
un porta, con lactofenol. Observe al microscopio a 10 y 40 X.
4
Trate de identificar hasta gnero, mediante una comparacin de las hifas y esporas
observadas al microscopio, con los dibujos mostrados en los libros. Haga dibujos detallados, con
los nombres de las estructuras del hongo y el nombre del gnero identificado.
II. Microcultivo de cepas puras de hongos:
1
Prepare unas cajas de Petri con un crculo de papel filtro en el fondo, una varilla doblada,
un portaobjetos y un cubreobjetos. Esterilcelas.
2
2
Con un bistur estril corte cuadros de agar-Sabouraud de aprox. 1 cm y acomode uno en
el centro de cada portaobjetos, dentro de la caja.
3
Con una asa micolgica obtenga fragmentos (aprox. 1 mm de dim.) de una colonia pura de
un hongo y vaya inoculando los lados del cuadro.
4
Enseguida cubra el cuadro de agar con un cubreobjetos, humedezca el papel filtro con aguaglicerinada, y tape la caja. Incube una semana a 30 C.
5.
Separe cuidadosamente el cubreobjetos y mntelo sobre un cubreobjetos conteniendo
una gota de lactofenol-azul de algodn. Por otro lado, separe el portaobjetos y en su
centro deposite una gota de lactofenol, montando con un cubreobjetos. Cuide que en ninguna
preparacin quede reactivo fuera del cubreobjetos. Selle los bordes de ambas preparaciones con
barniz de uas y deje secar.
5
Observea10Xya40X..
52

6
Mediante este mtodo las estructuras reproductivas se conservan intectas, lo cual permite
hacer una descripcin ms rpida para la identificacin.
7
Haga dibujos detallados de los hongos observados y compare con las claves de identificacin.

RESULTADOS, DISCUSION Y CONCLUSIONES

.

53

PRACTICA 15
PROTOZOARIOS
OBJETIVO DE LA PRACTICA:
Aplicacin de las tcnicas para cultivo y estudio microscpico de protozoarios. Descripcin de las
principales caractersticas morfolgicas y estructurales.
INTRODUCCION.
Los protozoarios son organismos eucariticos unicelulares, del reino animal, que varan
en forma y tamao.
Se encuentran en hbitats hmedos y son muy comunes en agua dulce, como estanques,
lagos, ros, arroyos, suelos hmedos, aguas negras estanques costeros, vegetacin
flotante, estuarios, bahas, aguas termales, estanques glaciares, etc.
Se subdividen en tres grupos, de acuerdo con su mecanismo de locomocin:
Sarcomastigophora: Sarcodina: se desplazan por pseudpodos.
Mastigophora: se desplazan por flagelos Ciliophora: Se desplazan por medio de cilios Apicomplexa:
Los miembros de este philum (antes Sporozoa) son parsitos estrictos tisulares, intracelulares.
Presentan ciclos biolgicos muy complejos, con una alternancia de generaciones sexuales y
asexuales. Carecen de rganos de locomocin.
Los protozoos juegan un papel importante en la ecologa. Algunos aportan materia aorgnica en
ambientes acuticos y otros actan como depredadores de otros microorganismos y como
degradadores de materia orgnica. Son particularmente importantes en el suelo y en aguas
contaminadas. Ciertos grupos viven en asociaciones de comensalismo o de mutualismo, otros son
parsitos de animales o de humanos. Los protozoarios de vida libre son relativamente fciles de
cultivar en medios de laboratorio que contengan infusiones de vegetales y bacterias. Los parsitos en
general no son cultivables, teniendo que recurrir a animales de laboratorio.
Para el aislamiento de protozoarios saprfitos son buenas las muestras de agua dulce que incluyan
fragmentos de algas filamentosas y lodo con abundante materia orgnica. Tambin son buenos los
suelos con abundante materia orgnica en descomposicin. Para la incubacin es buena una alta
humedad. Se recomiendo usar en los medios la misma agua de la muestra.
MATERIALES Y METODOS
I. Aislamiento de protozoarios de vida libre.
1
Siembre la muestra (agua, fango o suelo), en un frasco conteniendo medio a base de infusin
de chcharo, en proporcin de 1:1 (una parte de muestra y un volumen igual del medio). Tape el
frasco.
2
Inocule la muestra en en un frasco con medio A en proporcin de 1:4 ( un volumen de
muestra por 3 del medio)
3
En un frasco con medio Chalkley, agregue 7 a 12 gotas de leche descremada. Inocule la
muestra en la misma proporcion que en el punto 2.
4
En una caja de Petri vaca coloque un poco de lodo o de suelo y cubra la muestra con agua
del mismo charco o de la llave. Agregue 3 granos de arroz crudo y tape la caja.

54

5
En una caja de Petri conteniendo agar nutritivo , inocule 0.1 ml de una suspensin bacteriana
(gram -). Enseguida inocule la caja con una muestra de suelo suspendido en agua, en cantidad
suficiente para formar una pelcula lquida sobr el agar. Tape la caja.
6
Incube todos los cultivos a temperatura ambiente, con luz tenue, durante 7-10 das. Mantenga
la humedad inicial, agregando agua si es necesario.
7
Haga preparaciones entre porta y cubre de los protozoarios desarrollados y observe a 10 ya
40 X.
II. Estudio microscpico de los protozoarios cultivados.
Preparacin en Fresco
1
Forme un crculo de metilcelulosa en un portaobjetos
2
Con una pipeta Pasteur coloque una gota del cultivo de protozoarios en el centro del anillo
3
Adiciones una gota de rojo neutro sobre la muestra. Las vacuolas cidas se teirn de rojo y
las alcalinas de amarillo.
4
Monte la preparacin con un cubreobjetos. Observe a 10 X y a 40 X.
5
Puede repetir otras preparaciones, substituyendo el rojo neutro por lugol (tie el almidn de
azul, el paramilo de rojo y el glucgenode caf negruzco), por verde de metilo (tie el ncleo), o por
solucin de Noland para teir flagelos, cilios y otras estructuras.
RESULTADOS, DISCUSION Y CONCLUSIONES.

Apndice:
Medios y reactivos utilizados:
Medio infusin de chcharo: chcharos 5 granos
Agua de la llave 500 ml
Hervir el agua 10 min y aadir los chcharos. Hervir de nuevo 10 min. Enfriar y repartir la infusin
en frascos.
Medio de Chalkley:
NaCl ..0.1 g
KCl 0.004 g
CaCl 2 0.006 g
Agua dest. ..1000 ml
Disolver y distribuir en frascos.

55

U.A.C.J.

SEGUNDA PARTE

MICROBIOLOGA DE
ALIMENTOS
Programa de Nutricin

Dra. Evangelina Olivas E. y M. C Luis Roberto Alarcn M.

1/1/2012

56

INDICE
Pag.
Portada ....56
Reglamento...58
Practica # 1 Normas Generales Microbiolgicas de Alimentos......................................................60

Practica #2 Observacion Directa de microorganismos en Alimentos.66

Practica #3 Cambios Bioquimicos en Alimentos...68
Practica #4 Determinacion de Mesofilicos en Alimentos..71
Practica #5 Determinacion de Coliformes en Placa .....74
Practica #6 Determinacion de Coliformes por el numero mas probable77
Practica #7 Determinacion de Bacterias Proteoliticas y Lipoliticas....82
Practica #8 Determinacion de Salmonella en Alimentos..84
Practica #9 Determinacion de Mohos y Levaduras en Alimentos ..90
Practica #10 Pasteurizacion de la Leche ...93
Practica #11 Determinacion de Staphylococcus aureus en Alimentos....96
Practica #12 Bacterias Patogenas en Manipuladores de Alimentos....99
Bibliografia.........102

57

REGLAMENTO PARA ESTUDIANTES

INTRODUCCION
Este reglamento regir la actitud, el comportamiento y el desempeo del estudiante
dentro de los laboratorios de Microbiologa y tiene como finalidad evitar riesgos al personal y
estudiantes que laboran en l, ya que el laboratorio es un rea donde se manejan
microorganismos patgenos, parsitos y algunos compuestos qumicos peligrosos. Asimismo, se
debe cuidar el equipo valioso como son los microscopios y el material delicado como la
cristalera.
REGLAS
11. Todos los alumnos debern asistir con bata blanca larga y el cabello recogido.
12. La entrada al laboratorio quedar restringida exclusivamente a los alumnos inscritos
13. Se PROHIBE INTRODUCIR AL LABORATORIO CUALQUIER ALIMENTO O
BEBIDA, para evitar el riesgo de contaminacin con microorganismos patgenos.
14. Est estrictamente PROHIBIDO FUMAR dentro del laboratorio.
15. Queda prohibido introducir mochilas, cajas de herramienta, etc., debindose colocar estas
en los lockers de la entrada de
16. Cualquier accidente en el laboratorio o derrame de microorganismos, se deber
comunicar inmediatamente al profesor, para evitar el riesgo de contaminacin con los
microorganismos patgenos o parsitos manejados en las prcticas.
17. Se nombrar un jefe de mesa quien ser el responsable del cuidado del material y equipo
y de que la mesa quede aseada y desinfectada. Tambin vigilar que todos los integrantes
de la mesa se laven las manos con antisptico antes de retirarse. El jefe de mesa recibir
del profesor los microscopios y otros materiales y aparatos necesarios para el desarrollo
de las prcticas, y posteriormente los devolver en las mismas condiciones que los
recibi, a excepcin de los materiales especiales indicados por el profesor. (ejemplo
cultivos). En caso de algn dao al material o aparatos, los alumnos integrantes del
equipo estarn obligados a reparar dicho dao en forma que indique el profesor.
18. Para tener derecho a la evaluacin final en la teora, el alumno deber tener el 80 % de
asistencia.
19. Para poder tener derecho a la asistencia se dar 10 minutos como retardo
20. La calificacin final de la materia de Microbiologa quedar constituida por la puntacin
obtenida en la prctica y en la teora, cuya suma se efectuar en la forma siguiente:
e) La calificacin final obtenida en el laboratorio tendr un valor del 30 % de la calificacin
final total.
f) La calificacin total de la teora corresponder al 70 % de la calificacin final.
g) La suma de ambas calificaciones (teora y prctica) ser igual al 100 %.
h) El alumno no podr acreditar la materia si obtiene calificacin reprobatoria en el
laboratorio o en la teora. Debe aprobar ambas para promediarse.
11.- El alumno deber capacitarse con la NOM-087 sobre la Separacin, Tratamiento y
Destino de los Residuos Biolgico- Infecciosos

58

Introduccin.- El Sistema Nacional de Salud debe garantizar la prestacin de servicios para

promocin, prevencin, diagnstico, tratamiento y rehabilitacin de la salud, regulando los
servicios mdicos para que respondan a las demandas y necesidades de la poblacin.
Los servicios mdicos deben ser de alta calidad en todos los establecimientos,
independientemente del subsector de salud al que pertenezcan, ya sea pblico, social o privado.
Las soluciones tecnolgicas que se instrumenten en los establecimientos objeto de esta norma,
deben ser el resultado de las demandas de actividades de promocin y prevencin de la salud, as
como aqullas dirigidas al diagnstico y tratamiento de las diversas patologas. Se debe indicar
qu tecnologas diagnsticas, teraputicas y de rehabilitacin se utilizarn en los
establecimientos mdicos para atender correctamente tales demandas, lo cual integra el programa
mdico.
La indicacin o el uso de las tecnologas para la salud dependen de la motivacin, de los
conocimientos, de las habilidades y las capacidades del personal de salud y de una correcta
organizacin funcional de los establecimientos de atencin que asegure realizar las actividades
mdicas. Para ello es indispensable contar con una adecuada integracin de la infraestructura y el
equipamiento.
En esta norma se presentan los requisitos mnimos de infraestructura y equipamiento para
hospitales y consultorios de atencin mdica especializada, incluyendo la infraestructura y el
equipamiento para ejercer actividades directivas y de formacin de personal de salud, establecido
como obligatorio por la Ley General de Salud y su Reglamento en materia de prestacin de
Servicios de Atencin Mdica.
1. Objetivo
Esta Norma Oficial Mexicana tiene por objeto establecer los requisitos mnimos de
infraestructura y de equipamiento para los hospitales y consultorios que presten atencin mdica
especializada.
2. Campo de Aplicacin Esta Norma Oficial Mexicana es obligatoria para todos los hospitales
de los sectores pblico, social y privado, cualquiera que sea su denominacin, que realicen
internamiento de enfermos para la ejecucin de los procesos de diagnstico, tratamiento mdico.

59

PRCTICA #1

Normas generales microbiolgicas de alimentos

OBJETIVO DE LA PRCTICA
Comprender la importancia del muestreo para obtener un anlisis microbiolgico fidedigno del
alimento. Aprender los procedimientos para la toma, transporte y manejo de las muestras de
alimentos para su anlisis microbiolgico y valorar su importancia sobre los resultados
INTRODUCCIN
El objetivo principal del muestreo en el rea de la Microbiologa Alimentaria es obtener una
muestra representativa del alimento para su anlisis inmediato y conseguir datos confiables sobre
su manipulacin y estado higinico sanitario. Para lograrlo, es necesario en primer lugar conocer
las normas al respecto.
Norma Oficial Mexicana NOM-109-SSA1-1994. Procedimientos para la toma, transporte y
manejo de muestras de alimentos para su anlisis microbiolgico.
Para cumplir la norma, el producto en el momento de su anlisis, debe reunir las mismas
condiciones microbiolgicas que tena a la hora de ser muestreado y las mismas condiciones que
el resto de los productos a los cuales va a representar. Por esta razn, es necesario establecer los
lineamientos para conseguir una buena muestra.
Los alimentos se muestrean principalmente por tres razones:
1. Realizar el control de la calidad y determinar la vida de anaquel.
2. Verificar las tcnicas de manipulacin y produccin higinica.
3. Sospechar de intoxicaciones o infecciones transmitidas por alimentos.
En la mayora de los casos, el control de calidad se realiza por inters del productor para
demostrar la calidad del producto que elabora y si es posible demostrar la superioridad frente a
sus competidores. Sin embargo, el control sanitario de los alimentos plantea la necesidad de
indicar una fecha de caducidad que garantice el periodo til o de seguridad para consumir dichos
alimentos, esta fecha se establece con base en la vida de anaquel del producto.
El incremento en la demanda de los consumidores por productos de buena calidad, ha marcado la
pauta sobre la produccin higinica de los alimentos, as como el anlisis para determinar las
condiciones de almacenamiento o manipulacin deficientes como parte del control de calidad de
los mismos
Materiales utilizados en la toma de muestras de alimentos:
1. Envases: Deben estar perfectamente limpios, secos y estriles. Su tamao guardar
relacin con la muestra que se vaya a tomar. Sern hermticos e inaccesibles a cualquier
contaminacin posterior a su esterilizacin. Podrn ser de materiales como plstico,
vidrio o metal.
60

2. Instrumentos usados para la apertura del envase: tijeras estriles, pinzas estriles,
cuchillos estriles, cucharas estriles, esptulas estriles.etc.
3. Etiquetas y material para identificacin y rotulacin de la muestra: Etiquetas de
cartulina, etiquetas adhesivas de papel, lpiz encerado, bolgrafos, marcadores
permanentes.
4. Equipo de esterilizacin: autoclave, horno, filtros bactreriolgicos, lmpara de luz
ultravioleta, mechero Bunsen, incinerador bacteriolgico, estufa de gas o elctrica
5. Conservacin de la muestra: hielera porttil, cajas de material aislante para muestras
refrigeradas y congeladas, Congelador porttil, Tubos con medio de transporte, Gel
refrigerante
6. Desinfectantes lquidos: Alcohol etlico de 70, Solucin de fenol al 10 %, Desinfectantes
(bactericidas) comerciales
7. Control de la temperatura: Termmetro que marque entre - 20 C y + 100 C
Material utilizado en el muestreo
Todo el material utilizado para la toma de muestras y procesamiento microbiolgico de las
mismas, debe ser previamente esterilizado, por lo que se somete a uno o varios de los procesos
habituales de esterilizacin, como el calor seco (horno), calor hmedo (autoclave), esterilizacin
por gas (xido de etileno) y por radiacin (luz ultravioleta).
Condiciones del muestreo
Para obtener una muestra que proporcione datos representativos sobre las condiciones de manejo
y preparacin de los alimentos en un determinado establecimiento, se deben cumplir ciertas
condiciones:
1. La persona encargada de obtener las muestras debe estar bien capacitada para llevar a
cabo su labor, y estar consciente de la importancia y finalidad de la misma.
2. De ser posible, las muestras se tomarn en sus envases originales para ser transportadas al
laboratorio.
3. En ocasiones, las muestras que se deben recoger son nicas, circunstancia frecuente
cuando se trata de alimentos sospechosos de toxiinfeccin alimentaria.
4. Para tomar una muestra de uno o varios lotes, partidas, remesas, etc., de alimentos
(industria alimenticia). Se debe utilizar la tcnica de muestreo aleatorio, aplicando la
tabla de nmeros al azar, sobre un nmero de muestras preestablecido.
5. Si las muestras se encuentran empaquetadas en pequeas bolsas y dentro de cajas de
mayor tamao. Tanto las cajas grandes como los paquetes ms pequeos contenidos en
estas se escogen utilizado la tcnica del muestreo aleatorio.
6. Cundo no es posible transportar la muestra en su envase original, se toman en forma
asptica muestras representativas y se pasan a envases estriles ms pequeos.
61

7. Los alimentos a granel se muestrean tomando porciones de distintas zonas con material
estril y pasndolas, aspticamente, a envases estriles.
8. Si el producto que va a ser muestreado surge o fluye a travs de un conducto, se desechan
las primeras porciones antes de tomar la muestra.
9. Si son productos liquidos, se agitarn en su envase y se vertern aspticamente a
recipientes estriles.
10. Si la toma es de agua de la llave, se desinfecta sta con alcohol. Luego se abre y se
desecha el agua que sale primero. Se cierra de nuevo la llave y se flamea la gota que
queda en el borde hasta que se evapore. A continuacin se vuelve a abrir la llave, dejando
fluir el agua durante 1 - 2 minutos antes de recogerla en el recipiente estril utilizado para
la toma de muestras. Este ser bien cerrado en condiciones aspticas.
11. En el caso de alimentos slidos (queso, jamn cocido, productos congelados y similares),
las muestras se tomarn de varias aras diferentes del alimento utilizando un utensilio
estril y transfirindolas a algn recipiente estril.
12. Se recomienda anotar la temperatura de almacenamiento y la temperatura del producto
para remitir estos datos al laboratorio.
13. El transporte de las muestras tomadas deber ser rpido y se deber tener cuidado de
mantener la temperatura original de las muestras refrigeradas o congeladas, utilizando
una nevera o congelador porttil para su transporte.
Toma de muestras para el anlisis
La muestra de alimento que se va a analizar debe de ser representativa de la totalidad de la
muestra. Por lo general, la cantidad de muestra tomada tiene que ser de aproximadamente 200 g.
Para preparar las diferentes determinaciones, requeridas segn el alimento y conservar el resto
como reserva en caso de que sea necesario repetir el anlisis.
Si el alimento est integrado por distintos componentes, se tomarn fracciones
representativas de cada uno de ellos en superficie y profundidad.
Las condiciones y materiales utilizados para la toma de muestras debern ser estriles.
El pesado de la muestra
Se debe pesar con la mayor exactitud posible, pero evitando una excesiva manipulacin de la
muestra. La siguiente tcnica es la ms recomendada:
1. Pesar con anticipacin el recipiente estril que vaya a ser utilizado para la trituracin de
la muestra.
2. Verter, aspticamente, el volumen adecuado, de muestra, en dicho recipiente.
3. Pesar nuevamente para determinar el peso neto de la muestra.
4. Utilizando una probeta estril, aadir la cantidad necesaria de diluyente para obtener la
dilucin deseada.
Triturado y homogenizacin de las muestras.
La muestra ya pesada se tritura en una licuadora con vaso estril, o en un mortero estril,
adicionando el diluyente estril, segn lo describa la tcnica, de acuerdo con el estudio deseado.
62

Norma oficial mexicana NOM-110-SSA1-1994. Bienes y servicios, preparacin y dilucin de

muestras de alimentos para su anlisis microbiolgico.
Esta norma est orientada a proporcionar las guas generales para la preparacin de diluciones
para el examen microbiolgico de alimentos. En vista de la gran cantidad de productos en este
campo de aplicacin, estas guas pueden ser inapropiadas para todos ellos en forma detallada y
para otros requerirse otros mtodos diferentes. Sin embargo, en todos los casos donde sea posible
se recomienda apegarse a estas guas y modificarse nicamente cuando sea necesario.
La dilucin primaria tiene por objeto obtener una distribucin lo ms uniforme posible de
los microorganismos contenidos en la muestra destinada para el anlisis.
Objetivo y campo de aplicacin
Esta Norma Oficial Mexicana establece el procedimiento para la preparacin de diluciones para
el anlisis microbiolgico de productos alimenticios.
Procedimiento
1 Preparacin de la dilucin primaria.
1.1 A partir de muestras lquidas:
Para muestras lquidas no viscosas (agua, leche, refrescos, etc.) en las cuales la distribucin de
microorganismos es homognea o fcilmente homogeneizable por medios mecnicos (agitacin,
etc.).
Para muestras congeladas de un alimento originalmente lquido o licuable, fundir por completo
en bao de agua de 40 a 45C un tiempo mximo de 15 minutos y homogeneizar agitando
vigorosamente.
Para la parte lquida de una muestra heterognea la cual sea considerada suficientemente
representativa de la muestra total (por ejemplo la fase acuosa de grasas animales y vegetales).
1.2 Agitar la muestra manualmente con 25 movimientos de arriba a abajo en un arco de 30 cm
efectuados en un tiempo de 7 segundos. Tomar 1 ml de la muestra y diluir con 9 ml del diluyente
el cual debe encontrarse a una temperatura similar a sta, evitando el contacto entre la pipeta y el
diluyente.
1.3 Siempre que la cantidad de muestra lo permita, tomar alcuotas mayores, por ejemplo
volmenes de 10 u 11 ml, diluidos con 90 o 99 ml, de la misma forma que se describi
anteriormente
2. A partir de muestras slidas o semislidas.

63

Las muestras slidas y semislidas congeladas, deben descongelarse en refrigeracin de 4 a 8C

durante 18 horas y no ms de 24 horas antes de proceder a su anlisis.
2.1 Pesar una cantidad de 10 u 11 g de la muestra por analizar en un recipiente o bolsa plstica
estriles de tamao adecuado.
2.2 Adicionar un volumen de 90 a 99 ml del diluyente llevado a una temperatura similar a la de
la muestra.
2.3 Operar la licuadora o el homogeneizador peristltico de 1 a 2 minutos hasta obtener una
suspensin completa y homognea segn se indique en la tcnica correspondiente para cada
alimento. An en los equipos ms lentos, este tiempo no debe exceder de 2,5 minutos.
2.4 Permitir que las partculas grandes se sedimenten, y transferir la cantidad deseada tomando
de las capas superiores de la suspensin.
La seleccin de las diluciones que se vayan a preparar y de aquellas que se van a inocular,
dependen del nmero esperado de microorganismos en la muestra, con base a los resultados de
anlisis previos y de la informacin que se obtenga del personal de inspeccin que la haya
colectado. En ausencia total de informacin, trabajar con las diluciones de la primera a la sexta.
2.5 Utilizar pipetas diferentes para cada dilucin inoculando simultneamente las cajas que se
hayan seleccionado. El volumen que se transfiera nunca debe ser menor al 10% de la capacidad
total de la pipeta.
Duracin del procedimiento.
En general, las diluciones de la muestra deben ser preparadas inmediatamente antes del anlisis y
stas deben ser usadas para inocular el medio de cultivo dentro de los 20 minutos posteriores a su
preparacin.

El pesado de la muestra
Se debe pesar con la mayor exactitud posible, pero evitando una excesiva manipulacin de la
muestra. La siguiente tcnica es la ms recomendada:
1. Pesar con anticipacin el recipiente estril que vaya a ser utilizado para la trituracin de
la muestra.
2. Verter, aspticamente, el volumen adecuado, de muestra, en dicho recipiente.
3. Pesar nuevamente para determinar el peso neto de la muestra.
4. Utilizando una probeta estril, aadir la cantidad necesaria de diluyente para obtener la
dilucin deseada.
En el cuadro #1 se mencionan algunas de las normas oficiales mexicanas ms comunes
exigidas para segurar la calidad microbiolgica de los alimentos.

64

Cuadro #1. Normas Oficiales Mexicanas, SSA, para seguridad alimentaria.

Norma para muestreo alimentos
Norma para diluciones de la muestra
Cuenta mesofilicos en alimentos
Conteo coliformes en alimentos en
placa
Microbiologia del agua, nmp
Conteo mohos y levaduras en
alimentos
Pasteurizacion de la leche
Determinacion salmonella en
alimentos
Recuento de estaphylococcus aureus
Deteccin de bacterias patgenas,
utensilios
y manipuladores de alimentos

NOM 109 SSA1

1994
NOM 110 SSA1
1994
NOM 092 SSA1
1994
NOM 113 SSA1
1994
NOM 112 SSA1
1994
NOM 111 SSA1
1994
NOM 091 SSA1
2002
NOM 114 SSA1
1994
NOM 115 SSA1
1994
NOM 093 SSA1
1994

65

PRCTICA #2
Observacin directa de microorganismos
en alimentos
OBJETIVO DE LA PRCTICA
Conocer los grupos de microorganismos ms comunes que contaminan los alimentos y los
deterioran.
INTRODUCCIN
En el siglo diecinueve, con el inicio de la Microbiologa, se estableci la relacin entre los
microorganismos y la alteracin de los alimentos, lo cual condujo a la evolucin de los mtodos
de conservacin. Algunos microrganismos del medio ambiente se pueden desarrollar en los
alimentos, descomponindolos y causando grandes perdidas ecnomicas a las empresas
alimenticias. Por otro lado, algunos de esos organismos pueden ser patgenos y transmitidos al
ser ingeridos, causando severas enfermedades. Cada tipo de alimento est sujeto a
contaminacin microbiana y la mejor manera de evitarlo depender de las caractersticas de los
microorganismos existentes en el medio ambiente donde ste es preparado y/o en la materia
prima utilizada en su preparacin. Los microorganismos utilizan como nutrientes las protenas,
carbohidratos, grasas, vitaminas, sales, minerales y agua de los alimentos, originando su
descomposicin. Los grupos predominantes de microorganismos que se desarrollan en los
alimentos incluyen bacterias y hongos (tanto filamentosos como levaduriformes). Sin embargo,
pueden ir tambin contaminados con parsitos intestinales en menores cantidades y en este caso
se pueden mencionar ciertos protozoarios (amibas y giardias), y huevos microscpicos de
helmintos. Los alimentos tambin pueden transmitir virus patgenos humanos importantes.
MATERIALES Y MTODOS
Tcnica de observacin directa para determinar microorganismos en alimentos
En cada equipo se puede estudiar un alimento diferente, como frutas y verduras frescas con
manchas o con reblandecimientos (pudriciones). Por otro lado, pueden observarse embutidos,
quesos, leche, o alimentos cocinados y bebidas, descompuestos.
Bsqueda de bacterias
1. Coloque un fragmento de un alimento slido en un portaobjetos conteniendo una gota de
agua destilada. Fragmente el material ayudndose con una aguja de diseccin y coloque
encima un cubreobjetos lentamente, cuidando que no queden burbujas. No permita que la
muestra quede muy gruesa, porque interfiere con el paso de la luz durante la observacin;
si es necesario, adicione ms agua con el asa, por una orilla del cubreobjetos, para que
toda la preparacin permanezca hmeda. Observe en el microscopio a 10 X y a 40 X.
2. En el caso de una bebida, aplique la muestra directamente sobre un portaobjetos,
mediante una pipeta y coloque un cubreobjetos. Observe a 10 X y a 40X.
3. Haga dibujos de los microrganismos observados.

66

4. Retire el cubreobjetos a las preparaciones anteriores y deje secar a temperatura ambiente.

Fije la muestra con calor en la flama de un mechero. Tia con colorante Cristal violeta un
min, enjuague con agua y deje secar. Observe a 10 X para enfocar y enseguida a 100 X
con una gota de aceite de inmersin.
5. Examine al microscopio, por lo menos 10 campos en cada frotis.
6. Anote los tipos de microorganismos predominantes.
Bsqueda de hongos
Las mismas muestras de alimentos usadas anteriormente se pueden utilizar para buscar
hongos (mohos o levaduras). En este caso, haga una preparacin del alimento en una gota de
lactofenol/azul de algodn entre porta y cubre y observe a 10 X y a 40X.

RESULTADOS, DISCUSIN Y CONCLUSIONES

1.
2.
3.

4.
5.

Haga dibujos detallados de los diferentes grupos de microorganismos y note las

diferencias morfolgicas.
Investigue las diferencias bsicas en cada grupo de microorganismos.
Relacione los grupos de microorganismos observados (bacterias, hongos filamentosos o
levaduras) con los diferentes tipos de alimentos estudiados, de acuerdo con la literatura y
discuta sus resultados.
Si encontr parsitos, haga dibujos y trate de diferenciarlos, indicando si se trata de
Protozoarios o de huevos de Helmintos.
Explique por qu motivo no se detectaron virus con las tcnicas utilizadas en esta
prctica.

Cuestionario
Investigue cules son los microorganismos ms comunes que deterioran los alimentos
estudiados.

67

PRCTICA #3

Cambios bioqumicos en alimentos

por microorganismos
OBJETIVO DE LA PRCTICA
Relacionar los cambios qumicos provocados por los microorganismos en diferentes compuestos
con la descomposicin de los alimentos.
INTRODUCCION
Los alimentos en general estn sujetos al ataque de microorganismos, perjudicando su calidad.
Los alimentos son de naturaleza orgnica y por ello proporcionan los nutrientes adecuados para
el crecimiento de una gran variedad de bacterias hetertroficas. Las caractersticas fsicas y
qumicas de cada alimento y la forma en que se almacena, determinan: a) su grado de
susceptibilidad al ataque de los microorganismos, b) las clases de microorganismos que los
pueden afectar y c) las clases de alteraciones que pueden resultar.
Los alimentos se pueden clasificar en tres categoras principales:
1. Alimentos altamente perecederos, como carnes, pescados, huevos, leche y la mayora de
las frutas y verduras.
2. Alimentos semiperecederos, como papas, nueces, ajos.
3. Alimentos altamente estables o no-perecederos, como el azcar, la harina, el arroz, las
semillas de frijol.
Estas tres categoras difieren en funcin de su contenido de humedad. Los alimentos estables son
los de baja actividad acuosa y se pueden almacenar durante largos perodos de tiempo, sin que
les ocurran efectos indeseables. Los alimentos perecederos o semiperecederos deben
almacenarse bajo condiciones en las que el desarrolo microbiano sea lento o no tenga lugar.
Al considerar el desarrollo microbiano en los alimentos, es til recordar la curva estndar
de crecimiento.
La fase de latencia puede tener una duracin variable en los alimentos, dependiendo del
organismo contaminante. La velocidad de crecimiento durante la fase exponencial depender de
la temperatura, los nutrientes disponibles y otras condiciones del desarrollo.
El tiempo requerido para que la poblacin llegue a un nivel significativo en un producto
alimenticio dado, depender del inculo inicial y de la rapidez a la que ocurra el crecimiento en
la fase exponencial. Slo cuando la poblacin microbiana alcance un nivel sustancial, se
observarn los efectos perjudiciales en los alimentos.
En la descomposicin de los alimentos intervienen diversas bacterias y hongos.
Dependiendo de las propiedades qumicas de cada alimento, ste puede ser colonizado por un
determinado organismo o grupos de organismos, que seran los ms capacitados para aprovechar
los nutrientes disponibles. El deterioro de los alimentos es probablemente el problema
econmico ms serio en la industria procesadora de alimentos.
Las enterobacterias pueden deteriorar productos crnicos, porque su habitat es el
intestino de los animales de sangre caliente y pueden contaminar fcilmente la carne, cuando el

68

animal es sacrificado. En leche y productos lcteos las bacterias ms comunes son las del cido
lctico. Las pseudomonas son comunes en carne fresca, aves pescado, leche, frutas y hortalizas.
La hidrlisis de las protenas es conocida como proteolisis o peptonizacin. Muchas
bacterias producen la exoenxima caseinasa que degrada la casena, produciendo derivados ms
solubles y transparentes. Algunas bacterias producen cido sulfhdrico a partir de la
degradacin del aminocido cistena por medio de la cisten-desulfurasa; esta enzima trabaja en
conjunto con la enzima piridoxil fosfato. La produccin de H2S es el paso inicial en la
desaminacin de la cistena. Cuando el H2S reacciona con sulfato ferroso, se forma un
precipitado de sulfito de fierro de color negro y de mal olor. La habilidad de las bacterias para
descomponer las grasas juega un papel importante en la descomposicin de ciertos alimentos
conteniendo lpidos, como la margarina, por medio de una enzima lipasa.
MATERIALES Y MTODOS
1. Siembre Escherichia coli y Pseudomonas fluorescens en tubos con caldo nitrato, para
demostrar la reduccin de nitratos a nitritos.
Incube 24 hs a 37 oC. Adicione al tubo unas gotas de cido sulfanlico y enseguida otras
gotas de alfa-naftil amina. Si hubo reduccin del nitrato, hay reaccin con los iones nitritos
apareciendo un color rosa, como resultado de la respiracin anaerobia.
2. Siembre E. coli y Saccharomyeces cereviciae en tubos con campana conteniendo caldo
dextrosa e indicador de pH rojo de fenol. Incube igual y observe la acidificacin del medio,
cambiando a amarillo, que indica degradacin de la glucosa, hasta gas si hay burbuja en la
campana.
3. Siembre placas de medio agar spirit blue-aceite de olivo con Staphylococcus epidermidis y
Proteus vulgaris por estra, para observar la degradacin de lpidos. Incube igual. El medio
recin preparado presenta un color lavanda, el cual se torna azul alrededor de las colonias
lipolticas por liberacin de cidos grasos que acidifican el medio.
4. Siembre Escherichia coli y Bacillus subtilis por estra en placas de leche-agar, para observar
la degradacin de la casena. Incube igual y determine la aparicin de un halo transparente
alrededor de las colonias.
5. Siembre Proteus vulgaris en medio SIM para observar la movilidad, la degradacin del
triptfano y el ennegrecimiento del medio debido a la produccin de H2S por este
microorganismo.
RESULTADOS, DISCUSIN Y CONCLUSIONES
1. Anote detalladamente los resultados, observando los cambios producidos por las bacterias en
los diferentes sustratos (nitratos, carbohidratos, grasas, y proteinas). Haga una tabla de
resultados.
2. Discuta los resultados elaborando interpretaciones y saque conclusiones. En base al
mecanismo bioqumico de los cambios ocurridos en las pruebas, interprete los resultados.
Relacione los cambios qumicos observados en los diferentes compuestos, con ejemplos de
alimentos descompuestos.
Apndice

69

Medio Spirit Blue:

A un litro de medio base se le adicionan 30 ml de una emulsin de aceite de olivo preparada en
la forma siguiente:
400 ml de agua destilada tibia ms 25 % de aceite, ms 1 ml de Tween 80
Se esteriliza la mezcla del medio con el aceite.
Caldo nitrato:
Extracto de carne.3gr
Bacto peptona..5 gr
KNO3 ..1.0 gr
Agua dest. 1000 ml
Leche descremada-agar
Prepare tubos con 20 ml de Tripticasa-soya- agar
Esterilice
Por separado esterilice tubos con 3 ml de leche descremada
Vace los 3 ml de leche an caliente de un tubo en una caja de Petri vaca estril y
enseguida adicione la tripticasa fundida. Mezcle y deje solidificar.

RESULTADOS, DISCUSION Y CONCLUSIONES

70

PRCTICA #4

Cuenta total de bacterias mesoflicas

aerobias en alimentos NOM092-SSA-1-1994
OBJETIVO DE LA PRCTICA
Determinar la calidad microbiolgica del alimento mediante el conteo de bacterias aerobias
INTRODUCCIN
La mayora de los alimentos son buenos medios de cultivo para el crecimiento de muchas
clases de microorganismos, bajo condiciones favorables, especialmente entre 7 y 60 C y en
estas condiciones los organismos crecen a partir de los compuestos degradados,
produciendo cambios en los alimentos en su aspecto, sabor, color, olor y otras cualidades.
La presencia de microorganismos en los alimentos, especialmente su nmero y
clase, pueden indicar el nivel de calidad del alimento, ya que stos pueden ser responsables
de la descomposicin de los alimentos o de la transmisin de patgenos o toxinas.
El contenido microbiano de una muestra de alimento puede proporcionar
informacin que refleja la calidad del alimento en bruto, las condiciones sanitarias bajo las
cuales se elabor y la eficacia del mtodo para su conservacin.
La tcnica ms utilizada para determinar el contenido de microorganismos vivos en
un alimento, es la cuenta en placa. Esta tcnica se aplica para una gran variedad de
microorgnanismos y su fundamento consiste en contar las colonias que se desarrollan en el
medio de eleccin, despus de cierto tiempo y temperatura de incubacin, presuponiendo
que cada colonia proviene de un solo microorganismo de la muestra en estudio.
La determinacin de bacterias aerobias ha sido empleada como ndice microbiano
de calidad de los alimentos. Sin embargo, sto no es vlido para ciertos alimentos, como
quesos y algunos embutidos, en donde por procesos de fermentacin y maduracin, dan
lugar a un gran nmero de bacterias. El recuento de grmenes aerobios tiene un valor
limitado a la hora de juzgar la seguridad de los alimentos y si en la ejecucin de la tcnica
se siguen fielmente las condiciones que se sealan para el desarrollo de dichos
microorganismos, pueden llegar a ser lo bastante reproducibles para dar el significado a los
resultados que se obtengan.
El nmero de colonias contadas constituyan una estimacin de la cifra realmente presente
y la misma refleja si el manejo sanitario del producto ha sido el adecuado
Los alimentos en donde se pueden encontrar microorganismos con ms frecuencia
son: el agua, la leche y sus derivados, embutidos, cereales y mariscos.

71

La Norma Oficial Mexicana 092 establece el mtodo para estimar la cantidad de

microorganismos viables presentes en un alimento, agua potable y agua purificada, por la
cuenta de colonias en un medio slido, incubado aerbicamente
MATERIALES Y MTODOS
Cada equipo de alumnos puede trabajar con un alimento diferente, para efectuar la cuenta
de mesoflicos aerobios. Pueden ser alimentos domsticos o procesados industrialmente.
Tcnica de recuento por vaciado en placa
1. En condiciones estriles se pesan 10 g del alimento que se va a examinar, en un vaso de
licuadora estril previamente tarado.
2. Enseguida se le adicionan 90 ml. de diluyente estril (en este caso se utilizar agua
peptonada). Se muele durante 30 a 60 segundos y en esta forma el alimento quedar
3.

4.

5.

6.

diludo 1: 10.
Con una pipeta estril (sin quitarle el algodn del extremo) se transfieren 1 ml de la
mezcla diluida 1: 10 (debe tomarse del centro del lquido para no llevar fragmentos
gruesos de la muestra) a una caja de Petri estril vaca, marcada con el #1, dejando
escurrir el lquido en la caja y al terminar, tocar con la punta de la pipeta en tres
lugares diferentes del fondo de la caja donde no haya cado lquido. Se tapa y se agita la
botella con 25 movimientos, en un arco de 30 cm, completados en 7 segundos.
Con una nueva pipeta estril se transfiere 1 ml de la dilucin 1: 10 a in tubo con 9 ml. de
caldo peptonado para tener una dilucin 1: 100, de esta, transferir 1 ml a otro tubo con
9 ml de caldo peptonado y de este 1ml a otro tubo con 9 ml de caldo peptonado y de
esta manera se tienen la dilucin 1: 1000 y la dilucin 1: 10,000.
Pasar 1 ml de cada dilucin a su correspondiente caja petri, a cada caja de Petri con
muestra se le agregan 15 ml de agar-tripticasa-soya, fundido y enfriado a 50 C. Se
mezcla cuidadosamente el medio con la muestra, mediante 6 movimientos de derecha a
izquierda, 6 en el sentido de las manecillas del reloj, 6 en sentido contrario y 6 de atrs
aadelante, sobre una superficie lisa y horizontal hasta lograr una completa
incorporacin del inculo en el medio; cuidar que el medio no moje la cubierta de las
cajas. Dejar solidificar No deben pasar ms de 20 min. desde que se hizo la primera
dilucin hasta la adicin del medio.
Todas las cajas con muestras de alimentos se incuban a 35 C durante 24 h s.

Las cajas con muestras de leche y sus derivados se incuban a 32 C. Las de carnes en
refrigeracin y huevo en polvo, a 21 C.
7. Para el conteo de colonias, se seleccionan las cajas que presentan 20 a 200 colonias
slamante. El nmero de colonias se multiplica por la inversa de la dilucin que
corresponda a la placa contada, lo que dar el nmero de microorganismos viables por
gramo de muestra.
8. Compare el nmero de microrganismos obtenido en su alimento con los de otros
equipos y con los datos de la literatura.
9. Explique el significado del nmero de microrganismos encontrados en su alimento.
Cmo lo interpreta.
72

10. Discuta sus resultados con los de otros equipos, as como las interpretaciones
respectivas.

NOTA: Algunos alimentos pueden contener sustancias inhibidoras de microorganismos, ya

sean propias naturales, o incorporadas (pueden haber sido autorizados por un reglamento
o con fines fraudulentos), tales como antibiticos en la leche de los animales tratados,
restos de germicidas utilizados en la desinfeccin del equipo o sustancias inhibidoras. Esto
da lugar a un mayor nmero de colonias en la segunda dilucin, que en la primera. Esto
contrariamente a lo que debera ocurrir, es decir, cada vez menor nmero, conforme va
aumentando la dilucin .
Cuestionario
1. Qu peligros y resultados indeseables pueden ocurrir a partir de un alimento con un
alto conteo bacteriano?.
2. Qu patgenos pueden estar presentes en los alimentos congelados?.

RESULTADOS, DISCUSION, CONCLUSIONES

73

PRCTICA #5

Conteo de bacterias coliformes en alimentos.

Evaluacin de la calidad sanitaria.
NOM-113-SSA1-1994

OBJETIVO DE LA PRCTICA
Determinar la calidad sanitaria de un alimento, mediante el mtodo de conteo de bacterias
coliformes, establecido por la norma mexicana
INTRODUCCIN
Esta Norma Oficial Mexicana establece el mtodo microbiolgico para determinar el nmero de
microorganismos coliformes totales presentes en productos alimenticios por medio de la tcnica
de cuenta en placa., los cuales El mtodo permite determinar el nmero de microorganismos
coliformes presentes en una muestra, utilizando un medio selectivo (agar rojo violeta bilis) en el
que se desarrollan bacterias a 35C en aproximadamente 24 h, dando como resultado la
produccin de gas y cidos orgnicos viran el indicador de pH y precipitan las sales biliares.
Se ha determinado que no es prctico analizar todos los alimentos que son procesados para
detectar la presencia de bacterias patgenas. Desde hace mucho tiempo, la calidad sanitaria de
los alimentos se ha determinado buscando la presencia de bacterias indicadoras, es decir, ciertas
bacterias, cuya presencia en mayor nmero indica si el alimento es de calidad sanitaria aceptable.
La presencia de estos organismos no significa necesariamente que haya patgenos en el
alimento, por otro lado su ausencia tampoco es sinnimo de que no haya patgenos. Sin
embargo, el uso de indicadores acoplado con un conteo estndar en placa, en la mayora de los
casos proporciona datos para poder consumir alimentos de buena calidad sanitaria. Existen
varios grupos de organismos indicadores en la industria, como las bacterias coliformes totales y
las coliformes fecales.
Las bacterias coliformes son bacilos gramnegativos, aerobios o anaerobios facultativos,
no esporulados, que fermentan la lactosa con produccin de gas a las 48 hs de incubacin a 35
C. Se encuentran en forma abundante y constante en heces humanas y en menor grado en las de
animales. Su nmero vara alrededor de 5 a 500 millones de coliformes por gramo de heces. Con
gran facilidad entran en contacto con los alimentos crudos, ya sean de origen vegetal o animal,
cuando el saneamiento ambiental es pobre en una comunidad.
La interpretacin de la presencia y abundancia de coliformes en alimentos generalmente es
considerada con un triple significado en microbiologa sanitaria: a) como indicadores de
contaminacin fecal o de malas prcticas de trabajo en el manejo de los alimentos, b) como
causa de alteracin de los alimentos y c) como agentes etiolgicos de enteritis. El uso de los
coliformes como indicador sanitario puede aplicarse entonces para:

La deteccin de prcticas sanitarias deficientes en el manejo y en la fabricacin de los

alimentos.

74

La evaluacin de la calidad microbiolgica de un producto, aunque su presencia no

necesariamente implica un riesgo sanitario.
Evaluacin de la eficiencia de prcticas sanitarias e higinicas del equipo.
La calidad sanitaria del agua y hielo utilizados en las diferentes reas del procesamiento
de alimentos.
La demostracin y la cuenta de microorganismos coliformes, puede realizarse mediante
el empleo de medios de cultivos lquidos o slidos con caractersticas selectivas o
diferenciales

Los coliformes pueden descomponer los alimentos, tales como la leche y sus derivados y
frutas no muy cidas, causando cambios muy diversos, como produccin de malos olores, sabor
amargo, mucosidades, etc. En los de bajo contenido de carbohidratos como la carne de ganado,
aves, pescados, huevos, no suele haber graves problemas.
Estas bacterias coliformes son capaces de proliferar en los alimentos, incrementando su
nmero rpidamente, sin que necesariamente haya habido una alta contaminacin. Por otro lado,
su presencia en cualquier cantidad no implica un contacto inmediato previo con materia fecal.
La presencia de coliformes en ciertos alimentos , como por ejemplo en algunos tipos de quesos,
no guarda necesariamente un significado sanitario significativo, en relacin con los antecedentes
de manejo higinico del producto. En cambio, la presencia de coliformes en el agua potable
revela una exposicin reciente a heces, y son utilizados como indicadores de contaminacin fecal
para control sanitario, ya que en el agua en general no existen sustratos adecuados para su
proliferacin e incremento.
La demostracin y conteo de coliformes puede realizarse mediante el empleo de medios
de cultivo slidos que favorecen selectivamente su crecimiento y los diferencia de los
microorganismos con los que suelen encontrarse asociados en los alimentos, o bien recurriendo a
tubos de fermentacin conteniendo caldo lactosado o caldo triptosa lauril sulfato de sodio y
computando su nmero en las tablas de nmero ms probable (NMP).
Hay evidencias de que en los alimentos congelados, otro grupo de organismos
indicadores funcionan mejor que los coliformes, el llamado grupo de los estreptococos fecales o
enteroccocos, cuyos miembros son cocos grampositivos, catalasa negativos. Son variedades de
Streptococcus faecium y Streptococcus faecalis, y son considerados los ms comunes del grupo
D de estreptococos, encontrados en la industria.
MATERIALES Y MTODOS

1. Tcnica de recuento de coliformes por vaciado en placa

Cada equipo puede utilizar un alimento diferente, ya sea slido, lquido o agua.
1. Se pesan 10 g del alimento directamente en un vaso de licuadora previamente
esterilizado y tarado. Enseguida se le adicionan 90 ml. de agua peptonada y se
muele. En esta forma el alimento molido quedar diluido 1: 10.
75

2. Se transfieren 1 ml de la mezcla diluida 1: 10 con un pipeta estril a un tubo con 9

ml. de caldo peptonado, quedando una dilucin 1:100
3. De la dilucin 1: 100 se transfiere 1 ml a otro tubo con 9 ml. de caldo peptonado
quedando una dilucin 1: 1000 y de este tubo, transferir 1 ml. a otro tubo con 9 ml
de caldo peptonado. Se tapa y se agita con 25 movimientos en un arco de 30 cm
completados en 7 segundos. Esta dilucin quedar 1: 10,000.
4. Con pipeta estril se transfiere 1 ml de cada dilucin a su correspondiente caja
petri. A cada caja se le adicionan 15 ml de medio rojo-violeta-bilis-agar, fundido y
enfriado a 44 oC. Se mezcla cuidadosamente el medio con la muestra, mediante 6
movimientos de derecha a izquierda, 6 en el sentido de las manecillas del reloj, 6 en
sentido contrario y 6 de atrs aadelante, sobre una superficie lisa y horizontal hasta
lograr una completa incorporacin del inculo en el medio; cuidar que el medio no
moje la cubierta de las cajas. Dejar solidificar. Se incuba a 35 oC durante 24hs. Las
bacterias coliformes dan lugar a colonias de color rojo oscuro, con halo de
precipitacin o sin l.
5. Para el conteo de colonias se seleccionan las cajas con 20 a 200. El nmero de
colonias se multiplica por la inversa de la dilucin que corresponda a la placa
contada. As se obtendr el nmero de microorganismos viables por gramo de
muestra de alimento.

Informe de la prueba
Informar: UFC/g o ml en placa de agar rojo violeta bilis, incubados a 35C durante 24 2 horas.
En caso de emplear diluciones y no observar crecimiento, informar utilizando como referencia la
dilucin ms baja utilizada, por ejemplo dilucin 10-1.
En caso de no observar crecimiento en la muestra sin diluir se informa: "no desarrollo de
coliformes por ml".

RESULTADOS, DISCUSIN Y CONCLUSIONES

1. Haga los clculos necesarios para obtener los valores del conteo de bacterias en cada muestra
en la tcnica de vaciado en placa.
2. Consulte tablas y datos de la literaura, para interpretar sus resultados.
3. Explique el significado del nmero de coliformes obtenidos en el alimento que usted trabaj,
en cada tcnica y para cada alimento o agua.
4. Haga una comparacin de los resultados en su alimento con los de los otros equipos y discuta
los resultados, para sacar conclusiones.

76

PRACTICA # 6

Microbiologa del agua.

Determinacin de bacterias coliformes.
Tcnica del nmero ms probable
(NOM-112-SSA1-1994)
OBJETIVO DE LA PRCTICA
Aplicar el mtodo establecido por la norma mexicana para determinar la calidad
microbiolgica del agua de consumo humano
INTRODUCCIN

La falta de certeza en cuanto a su filiacin taxonmica y la imprecisa correlacin entre los

mtodos recomendados para la deteccin de coliformes han presentado problemas. El primero, es
que Escherichia coli es aceptada como bacteria coliforme, la especie contiene variantes que no
producen gas de la lactosa o lo hacen despus de 48 horas, por lo que no se les identifica por
medio de esta tcnica. Segundo, la capacidad de fermentar la lactosa est frecuentemente
asociada a genes localizados en plsmidos. Estos determinantes extracromosomales son
fcilmente transferidos entre otras bacterias Gram negativas no relacionadas a las coliformes,
que pueden, en consecuencia, ser recuperadas en la etapa inicial del anlisis. No obstante en la
prctica, la tcnica ha demostrado su efectividad.
El nmero de organismos se establece mediante la cuenta de unidades formadoras de
colonias, de acuerdo con la norma oficial mexicana NOM-113-SSA1-1994, Mtodo para la
Cuenta de Microorganismos Coliformes Totales en Placa, o el uso de la tcnica del nmero ms
probable, esta ltima, tambin llamada tcnica de dilucin en tubo, que proporciona una
estimacin estadstica de la densidad microbiana presente, mediante la probabilidad de obtener
tubos con crecimiento positivo, lo cual disminuye conforme es menor el volumen de muestra
inoculado. Esta Norma establece el mtodo microbiolgico para estimar el nmero de coliformes
presentes en productos alimenticios, por medio del clculo del nmero ms probable (NMP)
despus de la incubacin a 35 C de la muestra diluida en un medio lquido.
Este procedimiento puede aplicarse a agua potable, agua purificada, hielo y alimentos
procesados trmicamente, as como a muestras destinadas a evaluar la eficiencia de prcticas
sanitarias en la industria alimentaria. Este procedimiento debe seleccionarse cuando la densidad
esperada es como mnimo de una bacteria en 10 ml de producto lquido o una bacteria por gramo
de alimento slido.
Los microorganismos encontrados en el agua de los ros, lagos y mares son
extremadamente diversos. La cantidad y tipo de bacterias contenidas en sta depender de las
cantidades de materia orgnica disuelta en el agua, la presencia de sustancias txicas, su
contenido salino, y factores ambientales como el pH, temperatura y aeracin. La mayora de los
microorganismos hetertrofos se encuentran en el fondo y en los bancos de ros y lagos donde la
77

materia orgnica predomina. En la superficie y en el centro de grandes extensiones de agua

libres de materiales organicos, se encontraran pequeas cantidades de bacterias auttrofas.
La amenaza que existe de contaminacin de las fuentes de agua potable con agua de
desecho de los drenajes es de gran preocupacin para todo mundo. Las enfermedades entricas
como el clera, la fiebre tifoidea, y la disentera bacilar con frecuencia desencadenan epidemias
cuando las fuentes de agua potable no estn debidamente protegidas o tratadas. Por lo tanto, el
principal enfoque en esta prctica es la microbiologa sanitaria del agua.
EXAMEN CUALITATIVO
El agua que contiene una gran cantidad de bacterias puede ser perfectamente segura para el
consumo humano, siempre y cuando entre estas bacterias no se encuentren especies patgenas
intestinales como las causantes de fiebre tifoidea, clera, y disentera bacilar. El hecho de que la
materia fecal humana sea transportada por el agua a travs de los sistemas de drenaje y que esta
agua con frecuencia desemboque en ros y lagos representa un problema sanitario enorme; por lo
tanto se debe mantener un constante monitoreo de las fuentes de agua potable para detectar la
presencia de microorganismos asociados con la materia fecal y de esta manera mantener la
potabilidad de la misma.
El examen rutinario del agua para detectar patgenos intestinales puede ser dificil, si no
es que hasta imposible. Es mucho ms fcil demostrar la presencia de bacterias intestinales no
patgenas como lo son la Escherichia coli y el Streptococcus faecalis. Estos organismos estn
siempre presentes en los intestinos y normalmente no se encuntran presentes ni en el suelo ni en
el agua; por lo tanto su presencia indica contaminacin fecal. Todas las pruebas bacteriolgicas
cualitativas del agua estn basadas en la identificacin de indicadores de drenaje como lo son
estos dos organismos.
Una serie de pruebas son utilizadas para demostrar la presencia de coliformes o
indicadores de drenaje en las fuentes de agua potable. Un coliforme es una bacteria anaerobia
facultativa, bacilo Gram-negativo, fermentador de lactosa con produccin de gas, y que no
produce esporas. Escherichia coli y Enterobacter aerogenes entran dentro de esta categora. La
determinacin de coliformes se basa en tres tipos diferentes de pruebas: presuntiva, confirmativa
y complementaria.
El mtodo se basa en que las bacterias coliformes, fermentan la lactosa incubadas a 35
1C durante 24 a 48 horas, resultando una produccin de cidos y gas el cual se manifiesta en las
campanas de fermentacin.
Prueba presuntiva.
Inoculacin.
Agitar la muestra y transferir volmenes de 10 ml de muestra a cada uno de 3 tubos con 10 ml de
caldo lactosado de mayor concentracin y 1,0 ml y 0,1 ml de muestra a cada uno de los tubos de
las series de 3 respectivamente con 10 ml de caldo lactosado de concentracin sencilla o caldo
lauril sulfato triptosa con prpura de bromocresol.
Si despus de la incubacin se observa fermentacin y gas en cualesquiera de los tubos se
presume que hay coliformes presentes en la muestra de agua. Esta prueba se utiliza para
determinar el numero mas probable (NMP) de coliformes presentes en cada 100 ml de agua.
Antes de comenzar a realizar la prueba determine si su muestra de agua es clara o turbia;
se proporcionan dos tipos diferentes de instrucciones para cada tipo de muestra.
78

Nota:
DCCL designa a los tubos que contienen una concentracin doble de lactosa.
CSCL designa a los tubos con una concentracin sencilla.
Instrucciones
Si la muestra es de agua clara, y est relativamente cristalina, proceda de la siguiente manera
1. Obtenga tres tubos DCCL y seis tubos CSCL como se ilustra en la figura 1. Marque cada
tubo de acuerdo con la cantidad de agua que se les va a depositar: 10 ml, 1.0 ml, y 0.1 ml,
respectivamente.
2. Mezcle las muestras de agua agitndolas 25 veces.
3. Usando una pipeta de 10 ml, transfiera 10 mL de agua a cada tubo DCCL
4. Usando una pipeta de 1.0 ml, deposite 1 ml de agua a los primeros tres tubos CSCL y 0.1 ml
a los siguientes tubos CSCL.
5. Incube los tubos a 35 C por 24 horas.
6. Examine los tubos y anote el nmero de tubos de cada grupo, en que se produjo un 10% de
gas o ms.
7. Determine el nmero ms probable (NMP) utilizando la tabla I, donde se obtendr el
recuento por gramo o mililitro de muestra, tomando en consideracin lo siguiente:
Ejemplo: Si se observ gas en los primeros tres tubos, gas en solo un tubo de la segunda
serie, y ausencia de gas en los ltimos tres tubos, su prueba deber de ser leda como 3-1-0.
En la tabla I se indica que el NMP que corresponde a esta lectura es 43. Esto significa que
esta muestra de agua en particular contiene aproximadamente 43 microorganismos por cada
100 ml de agua con una probabilidad del 95% de que estos se encuentren entre 7 y 210
microorganismos. Mantenga en mente que el valor NMP de 43 es un valor estadstico.
8. Anote los valores obtenidos.
Instrucciones
Si la muestra de agua turbia est aparentemente muy contaminada, haga lo siguiente:
1. Prepare tres tubos DCCL y nueve tubos CSCL en una gradilla, con los tubos DCCL
acomodados a la izquierda. Marque los tres tubos DCCL como de 10 ml; los siguientes tres
tubos CSCL como de 1.0 ml; los siguientes tres tubos CSCL como de 0.1 ml; y los ltimos
tres tubos CSCL como de 0.01 mL.
2. Mezcle la muestra de agua agitndola 25 veces.
3. Usando una pipeta de 10 ml, deposite 10 ml de muestra en cada uno de los tubos DCCL.
4. Usando una pipeta de 1.0 mL, deposite 1 ml de la muestra a los siguientes tres tubos y 0.1 ml
al siguiente grupo de tres tubos.
5. Usando la misma pipeta de 1 ml, deposite 1 ml de muestra en el blanco de 99.0 ml de agua
estril y agite 25 veces.
6. Usando otra pipeta de 1.0 ml, deposite 1 ml de agua tomada del blanco en los ltimos tres
tubos de CSCL. Esto es el equivalente a depositar 0.01 ml de muestra sin diluir en estos tres
ltimos tubos.
7. Incubar los tubos a 35 C por 24 hrs.
8. Examine los tubos y apunte el nmero de tubos en cada grupo de tres que tienen un 10% de
gas o ms.
79

9. Determine el NMP refirindose a la tabla I. Esta tabla est adaptada para utilizarse con la
tcnica de nueve tubos solamente. Para aplicar la tcnica de los doce tubos a esta tabla haga
lo siguiente:
(a) Seleccionar los tres grupos consecutivos de tubos en los cules al menos uno de los tubos no
contenga gas.
(b) Si el primer grupo de tubos (10 ml) no es utilizado para la lectura en la tabla, multiplique el
NMP por 10.
Ejemplo: La lectura de sus tubos fue 3-3-3-1. Cul es el NMP? El primer grupo de tubos (10
mL) se ignora y los digitos 3-3-1 se aplican a la tabla. El NMP que corresponde a esta serie
de digitos es 460, que multiplicando por 10, el valor resultante para el NMP es de 4600.
Otro ejemplo: La lectura de sus tubos fue de 3-2-2-0. Cul es el NMP? Se aplican solamente
los primeros tres digitos de la lectura a la tabla. Al aplicarse esta serie de digitos a la tabla el
NMP resultante es de 210. Por haberse ignorado el ltimo grupo de tubos, el NMP
permanece como 210.
Prueba confirmativa
De cada tubo que muestre formacin de gas, tomar una azada y sembrar en un nmero
igual de tubos con medio de confirmacin, caldo lactosa lauril bilis verde brillante. Incubar a 35
0,5 C por 24 2 horas o si la formacin de gas no se observa en este tiempo, incubar por 48
2 horas.
Prueba complementaria
Los tubos positivos son resembrados en placas de agar EMB para confirmar si estos
contienen bacilos Gram-negativos (La principal preocupacin es determinar si las colonias
aisladas de las placas de agar verdaderamente entran en la definicin de un coliforme. Si se
produce gas en el tubo de Durham, y una tincin de las colonias revelan que se trata de un
bacilo Gram-negativo, no formador de esporas. Entonces se tiene ya la seguridad de que se trata
de un coliforme. El agar EMB de Levine contiene azul de metileno, que inhibe a las bacterias
Gram positivas. Las bacterias Gram-negativas, fermentadoras de lactosa (coliformes) al crecer en
este medio producen colonias nucleadas (con centros obscuros).
Las colonias de E. coli y E. aerogenes pueden diferenciarse entre si tomando como base
su tamao y la presencia del pigmento verde metalico. Las colonias de E.coli son pequeas y
producen el pigmento verde metalico, mientras que las colonias de E. aerogenes no producen el
pigmento y son ms grandes; la identificacin realizada de esta manera no es completamente
confiable. Se debe comprender que E.coli es un mejor indicador de contaminacin fecal, porque
esta bacteria no se encuentra usualmente en el suelo, mientras que E. aerogenes a sido aislada de
los granos y el suelo.
Al llevar a cabo estos tres exmenes con resultados positivos se establece que hay
coliformes presentes en la muestra de agua; pero no hay una seguridad de que sean E. coli. o E.
aerogenes. De estos dos organismos, E. coli es un mejor indicador del drenaje porque E.
aerogenes puede provenir de fuentes que no sea el drenaje. Para diferenciar estas dos especies, se
les deben realizar a las colonias las pruebas bioqumicas.

RESULTADOS, DISCUSIN Y CONCLUSIONES

80

TABLA #1. NMERO MS PROBABLE

Tres tubos
0.1ml
1:10
0
0
0
1
1
1
1
1
2
2
2
2
2
2
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3

Tres tubos
1 ml
1:100
0
0
1
0
0
1
1
2
0
0
1
1
2
2
0
0
0
1
1
1
2
2
2
3
3
3
3

Tres tubos
10 ml
1:1000
0
1
0
0
1
0
1
0
0
1
0
1
0
1
0
1
2
0
1
2
0
1
2
0
1
2
3

NMP de
Grmenes
Gr o ml
<3
3
3
4
7
7
11
11
9
14
15
20
21
28
23
39
64
43
75
120
93
1150
210
240
480
1,100
> 2,400

Figura 1. Inoculacin de tubos de caldo lactosado con agua.

81

PRCTICA # 7

Conteo de bacterias proteolticas

y lipolticas
OBJETIVO DE LA PRCTICA
Conocer y desarrollar la tcnicas de conteo de bacterias proteolticos y lipolticas en alimentos,
relacionando la actividad microbiana con la descomposicin de alimentos.
INTRODUCCIN
La composicin fsica y qumica de los alimentos difiere grandemente de uno a otro. Por
ejemplo, la textura, el color, el sabor y los nutrientes qumicos de una manzana, comparada con
los de la carne. Por otro lado, los microorganismos intervienen en la descomposicin de los
alimentos, modificando sus caractersticas organolpticas y hacindolos inaceptables para el
consumo. Cada organismo tender a degradar ciertos compuestos mediante la accin de sus
enzimas, para utilizarlos como nutrientes y a la vez se acumularn metabolitos de desecho.
Dependiendo del alimento en cuestin, estos organismos pueden ser lipolticos, proteolticos o
pectinolticos. Si los alimentos son adicionados de sal o azcar como preservativos, se
desarrollarn grupos haloflicos o sacaroflicos, respectivamente. Si el alimento fue tratado con
calor, los organismos que sobreviven pueden ser termoflicos, termodricos o esporulados.
La cuenta estndar en placa es utilizada rutinariamente en la industria de alimentos para
determinar el nmero de organismos en el alimento. Obviamente, a mayor nmero de
micoorganismos en un alimento, ms rpida su descomposicin. Mediante el uso de medios
selectivos, diferenciales, la cuenta estndar tambin puede ser utilizada para ennumerar
organismos especficos, como proteolticos, esporulados, etc.
MATERIALES Y MTODOS
I. Conteo de bacterias proteolticas en alimentos
Las bacterias proteolticas pueden descomponer los alimentos por degradacin de las protenas y
liberacin de productos indeseables. Estos organismos pueden contarse sembrando las muestras
por vaciado en placa, en medio conteniendo leche descremada, el cual contiene la protena
casena. Los organismos capaces de usar la casena son reconocidos como proteolticos.
1. Marque por duplicado, cajas de Petri vacas estriles, desde 103 hasta 106
2. Muela una muestra del alimento en estudio, por ejemplo carne, hamburguesa, etc., en
proporcin de 10 grs. en 90 ml de diluyente estril. En esta forma la muestra queda diluda
1:10
3. Contine haciendo diluciones seriadas decimales hasta 1:10,000. Utilice cada vez 1 ml de la
dilucin anterior, ms 9 ml de diluyente.
4. Aspticamente deposite alcuotas de 1 ml de cada dilucin en su caja correspondiente.
5. Ada 2 ml de de leche descremada estril a cada caja
6. Aada a cada caja medio fundido PCA y enfriado a 50C, y mueva cuidadosamente las cajas,
para homogenizar muestra y medio, sin permitir que se derrame el medio y deje solidificar.
(El medio PCA contiene: 5 g triptona, 2.5 de extracto de levadura, 1 g de dxtrosa, 15 g de
agar, 1000 ml de agua destilada).
82

7. Prepare una placa testigo de medio sin muestra (solo el medio y la leche) y deje solidificar.
Por el reverso marque tres sectores. En un sector siembre Bacillus subtilis y en el segundo E.
coli, bacterias que actuarn como un testigo positivo y uno negativo. Deje el tercer sector
sin sembrar, como blanco en el que no habr cambio.
8. Incube todas las cajas a 32 C 24-48 hs.
9. Acomode todas las placas en el orden de las diluciones y haga conteo slamente de las
colonias proteolticas (las que muestren un rea clara alrededor, por degradacin de la
casena), en las placas que contengan entre 30-300 colonias. Compare con la placa testigo.
10. Determine el # de bacterias proteolticas/ g de muestra.
II. Conteo de bacterias Lipolticas
Los organismos lipolticos degradan los lpidos, liberando cidos grasos. En alimentos tales
como la mantequilla, la acumulacin de cidos grasos contribuye a su enranciamiento.
1. Funda una muestra de mantequilla en un bao de agua. Cada equipo puede comparar
diferentes marcas, o variar con margarinas.
2. Marque por duplicado cajas de Petri vacas desde 101 hasta 103
3. A partir de una alcuota de 1 ml de la mantequilla fundida haga diluciones seriadas decimales
con 9 ml de diluyente tibio, (caldo peptonado) hasta 103 .
4. De cada dilucin vaya colocando 1 ml en su caja correspondiente y adicione el medio AgarGrasa (Fat agar) fundido y enfriado a 50 oC. Preparacin Fat agar: 100 ml Agar rojo bilis
violeta y 1 ml de tween 20. Mezcle para homogenizar y deje solidificar.
5. Prepare una caja de medio sin muestra como testigo y deje solidificar. Marque tres sectores
en el reverso. Siembre un sector con Pseudomona fluorescens y otro con Escherichia coli,
como bacterias control positivo y negativo. Deje el tercer sector sin sembrar como blanco
que no mostrar cambios.
6. Incube todas las placas a 35 oC durante 24-48 hs.
7. Acomode todas las cajas en el orden de las diluciones y determine las colonias lipolticas
(colonias rojas con reas de precipitado rosa, debido a la liberacin de cidos grasos, debido
a que la acidez resultante causa vire del indicador de pH a rojo en el medio)
8. Determine el nmero de colonias lipolticas / g de muestra
9. Compare los resultados de todos los alimentos estudiados. Compare los datos entre los
diferentes equipos.
RESULTADOS, DISCUSIN Y CONCLUSIONES

83

PRCTICA # 8

Determinacin de Salmonella en alimentos.

NOM-114-SSA1-1994
OBJETIVO DE LA PRCTICA
Determinar Salmonella en alimentos, utilizando el mtodo establecido por la Norma Oficial
Mexicana.

INTRODUCCIN
Los miembros del gnero Salmonella han sido muy estudiados como patgenos cuando se
encuentran presentes en los alimentos. El control de este microorganismo, tanto por parte de las
autoridades sanitarias, como en las plantas procesadoras de alimentos, depende en cierta medida
del mtodo analtico utilizado para su deteccin.
Este microorganismo fue inicialmente identificado en muestras clnicas y los mtodos empleados
para estos casos se adaptaron posteriormente para su deteccin en alimentos. Las modificaciones
a los mtodos consideraron dos aspectos principales, el primero es el debilitamiento o dao a las
clulas bacterianas presentes en un alimento, debido al proceso a que est sujeto (por ejemplo:
tratamiento trmico, secado, etc.) y segundo, la variabilidad inherente a la naturaleza del
producto bajo estudio.
Para diversos alimentos existen diferentes protocolos para el aislamiento de Salmonella, todos
ellos son esencialmente similares en principio y emplean las etapas de preenriquecimiento,
enriquecimiento selectivo, aislamiento en medios de cultivo selectivos y diferenciales,
identificacin bioqumica y confirmacin serolgica de los microorganismos.
Salmonella es la enterobacteria ms estudiada entre los patgenos aislados de alimentos, debido
a la alta incidencia del padecimiento que origina. Esta bacteria pertenece a la familia
Enterobacteriaceae, es de forma bacilar, no produce esporas, habitualmente mvil mediante
flagelos peritricos, aunque existen mutantes inmviles (ej. el serotipo Salmonella pullorumgallinarum), anaerobio facultativo, no produce ureasa, no utiliza el malonato de sodio, no lica la
gelatina, no se desarrolla en presencia de cianuro de potasio. No fermenta la sacarosa, la salicina,
la rafinosa ni la lactosa. Descarboxila la arginina, la ornitina y la lisina; produce cido en tartrato
de Jordan, fermenta el dulcitol, y el inositol es utilizado por algunas cepas. Existen mltiples
excepciones pero presenta dos cualidades especiales: la presencia de una estructura antignica
base para la identificacin entre sus miembros y la patogenicidad que exhibe hacia los humanos
y a los animales. Ultimamente se resolvi adoptar en la clasificacin, el sistema de slo tres
especies de Salmonella:
1. Salmonella typhi causante de una enfermedad diferente de las causadas por los dems
miembros
2. S. cholerae-suis.
3. S. enteritidis. El resto de las salmonelas se consideran serotipos de esta especie, por ejemplo
la S. enteritidis serotipo derby
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En el aislamiento deben considerarse a) los inhibidores naturales de Salmonella en el

alimento, b) el tratamiento con inhibidores qumicos al que se someti ste, durante el procesado,
y c) la carga microbiana del producto final, ya que ciertas enterobacterias pueden inhibirla.
Las salmonelas se multiplican libremente en la leche, en cambio en los productos lcteos
adicionados de grmenes lcteos, se afecta su sobrevivencia; la carne es un sustrato adecuado
para la bacteria. Su desarrollo se inhibe con temperaturas menores de 7 oC, pero sobrevive an
a temperaturas de congelacin; no resiste la pasteurizacin. Puede penetrar en latas con sellado
defectuoso despus de la esterilizacin, durante el enfriamiento con agua contaminada. Las
salmonelas se multiplican en el agua de albaal y de ah pueden contaminar el agua de ros y
lagos o el agua potable de tuberas rotas. Tambin se contaminan los mariscos que se desarrollan
en las costas del mar donde son arrojadas dichas aguas.
Procedimiento
El anlisis se efecta en la muestra del alimento en una proporcin de 1:9 muestra/caldo. Esta
cantidad puede variarse siempre que se mantenga la misma proporcin. Se recomienda una
muestra de 25 g o ms.
1. Para el procedimiento general, se pesan aspticamente 25 g de la muestra en un vaso
estril de licuadora o en una bolsa estril para trabajar en homogeneizador peristltico
(stomacher).
1.1. Preenriquecimiento. Adicionar al alimento 225 ml del medio de
preenriquecimiento estril, generalmente caldo lactosado, a menos que se indique
otro, y licuar si es necesario durante un min. Transferir aspticamente la mezcla
homogeneizada a un recipiente estril de boca ancha con tapn de rosca y dejar
reposar por 60 min a temperatura ambiente con la tapa bien enroscada. Mezclar bien
y determinar el pH aproximado, con papel pH. Ajustar, si es necesario, a un pH 6,8
&plusmn ; 0.2 con hidrxido de sodio 1N o cido clorhdrico 1N estriles. Mezclar y
cubrir el recipiente enroscando suavemente la tapa sin apretar.
1.2.
Incubar 24 hs a 35C. Continuar como se indica en 3.
2. Procedimiento especfico para la preparacin de muestra segn el producto
2.1 Huevo en polvo, claras de huevo en polvo, yema de huevo en polvo, huevos lquidos
pasteurizados y congelados, frmulas infantiles y mezclas preparadas en polvo (harinas para
hot cakes, galletas, donas, bisquets y pan).
2.2 De preferencia no descongelar la muestra. Si se requiere, preparar los alimentos congelados
justo antes de tomar la muestra analtica descongelndolos a 45C por 15 min
aproximadamente con agitacin constante en un bao de agua o por 18 h a una temperatura
entre 2-5C. Los productos que no son en polvo se trabajan como indica el procedimiento
general. Para los productos en polvo, pesar 25 g de muestra analtica en el medio de
preenriquecimiento, dejando que el polvo se humecte lentamente. Si es necesario
homogeneizando poco a poco con una varilla de vidrio estril u otra herramienta tambin
estril. Continuar igual que el procedimiento general.

85

3. Enriquecimiento.
3.1. En esta etapa se efecta un enriquecimiento selectivo, se estimula y favorece el
crecimiento de la Salmonella y se restringe la proliferacin de la flora competitiva. Se
agita suavemente la muestra del medio de preenriquecimiento y se transfiere
respectivamente 1 ml de la mezcla a un tubo que contenga 9 ml de caldo tetrationato
y a otro con 9 ml de caldo selenito cistina. Como alternativa, en sustitucin del caldo
tetrationato puede emplearse el medio Vassiliadis-Rappaport
3.2.
Antes de usar el medio caldo tetrationato, agregar unas gotas de solucin yodoyoduro y de solucin de verde brillante. Todos los tubos sembrados se incuban a 35
o
C durante 18-24 h.
4. Aislamiento de Salmonella e identificacin, en placas de medio selectivo
4.1. En esta etapa se restringe, an ms, el crecimiento de la flora competitiva y se
estimula el de la Salmonella. Por otra parte, la composicin de los distintos medios
permite el crecimiento de colonias con aspecto caracterstico en cada uno de ellos.
4.2.
Inocule por estra cruzada una placa de agar-sulfito de bismuto y otra de agarverde brillante a partir del caldo tetrationato, y otras por separado a partir del caldo
selenito-cistina. Incube todas las placas a 35 oC durante 24 hs.
4.3 Las colonias sospechosas de Salmonella en esos medios presentan caractersticas
determinadas:
4.4. En Agar Sulfito de Bismuto son colonias tpicamente negras, con o sin brillo
metlico, rodeadas de un halo caf que con el tiempo se oscurece. En ocasiones las
colonias aparecen de color caf.
4.5. En Agar Verde Brillante son Translcidas opacas, incoloras, rosas o fiusha y el
medio que las rodea vara entre rosceo y rojo. Algunas colonias presentan un color
verde translcido cundo estn rodeadas por organismos fermentadores de lactosa.
4.6. Agar SS son colonias translcidas, ocasionalmente opacas. Algunas colonias dan
centro negro. Las colonias fermentadoras de la lactosa son rojas.
5

Identificacin bioqumica
5.1 si las placas de sulfito de bismuto no presentan colonias sugestivas, se reincuban
por 24 horas ms. Y nuevamente se examinan.
5.2 Finalmente, de cada placa se seleccionan dos o ms colonias bien aisladas, tpicas y se
inoculan los siguientes pruebas bioqumicas: TSI, LIA.
5.3 Todos los tubos inoculados se incuban a 35 oC por 24 hs
5.4 Salmonella y Arizona ennegrecen el TSI y el LIA, al producir sulfuros.
5.5 En el TSI hay fermentacin de glucosa (coloracin amarilla en el fondo del tubo, en la
picadura) y no hay fermentacin de la lactosa o sacarosa (coloracin roja en la estra)
5.6 En el medio de LIA hay descarboxilacin de la lisina (coloracin prpura en todo el
medio). Si la reaccin en LIA es positiva, no puede descartarse la posibilidad de
presencia de Salmonella o Arizona, aunque el TSI sea negativo
5.7 A partir de los tubos de TSI positivo, se inoculan tubos con caldo urea rpido y se
incuban 2 hs a 37 C en bao-mara. Descartar los cultivos que muestren reaccin positiva
(coloracin prpura).
5.8 Si la ureasa resulta negativa se hacen pruebas de aglutinacin con antisuero O polivalente
y si la prueba es positiva, se continan efectuando pruebas con los antisueros del grupo.
Las pruebas se hacen en portaobjetos limpios con una suspensin homognea y densa del
86

desarrollo de la bacteria a partir del medio TSI, agregando una gota del antisuero,
mezclando con el asa y moviendo el portaobjetos durante 30 seg. En la prueba positiva se
forman grumos de aglutinacin en la gota.
6. Pruebas bioqumicas Complementarias
6.1 A partir del desarrollo en TSI, los tubos que hayan resultado ureasa negativo, se inoculan
los siguientes medios: caldo triptona, o SIM, medio RM-VP (duplicado),
Citrato de
Simmons (estra y picadura), caldo malonato, caldo cianuro (cerrar hermticamente despus
de inocular), caldo sacarosa, caldo lactosa, caldo manitol
6.2 Todos los tubos se incuban a 35 C por 48 hs, a excepcin del medio Simmons y
uno de RM-VP, que se incuban hasta los 4 das. Entonces se procede a la lectura
de los resultados:
6.3 Caldo triptona o SIM para la produccin de Indol: se agregan 2-3 gotas de reactivo de
Kovacs. Un color rojo intenso equivale a prueba positiva.
6.4 Medio RM-VP para la prueba de Vogues Proskauer. Al tubo incubado 48 hs se le
agregan 0.6 ml de alfa naftol y 0.2 ml de potasa al 40 %. Se agita para mezclar.
Despus de 4 hs se observa un color carmes para la prueba positiva. Tanto
Salmonella como Arizona son positivos.
6.5 Medio RM-VP para la prueba del rojo de metilo. Al otro tubo con este medio se le
agregan tres gotas de solucin de rojo de metilo. El medio vira a rojo en la
reaccin positiva. Salmonella y Arizona son positivas.
6.6 Medio de Citrato de Simmons para la prueba de utilizacin de citrato. La prueba es
positiva cuando aparece desarrollo y el medio vira a azul. Arizona es positiva y
Salmonella generalmente positiva.
6.7 Caldo Malonato para utilizacin del malonato, en la reaccin positiva (Arizona) el
medio se torna azul
6.8 Caldo cianuro, en la prueba positiva el germen se desarrolla y enturbia el caldo.
Ambas bacterias son negativas
6.9 Caldos para la fermentacin de sacarosa, lactosa y manitol. En la prueba positiva el
sustrato fermentado vira el indicador a amarillo. Si se genera gas se observa en la
campana. Salmonella y Arizona slo son positivos al manitol
RESULTADOS, DISCUSIN Y CONCLUSIONES
Cuestionario
1. Discuta los factores que permiten evitar la contaminacin de los alimentos con Salmonella.
2. Discuta los factores que permiten evitar el desarrollo de Salmonella en los alimentos, por
ejemplo inhibidores naturales o artificiales adicionados y carga microbiana en general.
3. Discuta los factores que permiten la sobrevivencia de Salmonella en el ambiente.
4. Qu nmero de Salmonellas se considera necesario para iniciar una infeccin.
5. En el alimento estudiado hubo posibilidad de encontrar salmonelas. Trate de relacionar los
resultados del aislamiento en placa, con los de las pruebas bioqumicas.
6. Discuta el significado de los resultados en el alimento y compare con los alimentos de otros
equipos

87

88

IDENTIFICACION BIOQUIMICA PARA SALMONELLA TYPHI

PRUEBA O
SUSTRATO
Glucosa (TSI)
LIA
H2S (TSI y LIA)
Urea
Caldo Lisina
Descarboxilasa
Caldo dulcitol rojo
de fenol
Caldo malonato

POSITIVO

NEGATIVO

Amarillo
Prpura
Negro
Fuscia
Prpura

Rojo
Amarillo
Sin color
No hay cambio
Amarillo

+
+
+
+

Amarillo o gas

+b

Prueba de Indol

Superficie de rojo a
violeta
Cambio de rosa a
rojo
Rojo difuso
Crecimiento y vire a
azl

No hay cambio de
color, ni gas
No hay cambio de
color
Sin cambio de color
Sin cambio de color

Amarillo difuso
Sin crecimiento ni
cambio color

+
v

Prueba Voges
proskawer
Rojo de metilo
Citrato de Simmons

Azul

REACCION

-c
-

A+, 90% o ms positivo en 1 o 2 das

-, 90% o ms negativo en 1 o 2 das
v, variable
b, la mayorade los cultivos S. arizonae son negativos
c, la mayora de los cultivos S. arizonae son positvos
Referencia: NORMA OFICIAL MEXICANA NOM-114SSA1-1994 Metodos para la
determinacin de salmonella en alimentos

89

PRCTICA # 9

Conteo de hongos totales en alimentos,

mohos y levaduras.
NOM-111-SSA1-1994
OBJETIVO DE LA PRCTICA
.
Determinar el nmero de mohos y levaduras viables presentes en productos destinados al
consumo humano por el mtodo establecido por la Norma Oficial Mexicana
INTRODUCCIN
Los mohos y levaduras estn ampliamente distribuidos en la naturaleza y se pueden encontrar
formando parte de la flora normal de un alimento, o como agentes contaminantes y en los
equipos sanitizados inadecuadamente, provocando el deterioro fisicoqumico de stos, debido a
la utilizacin en su metabolismo de los carbohidratos, cidos orgnicos, protenas y lpidos
originando mal olor, alterando el sabor y el color en la superficie de los productos contaminados.
Adems los mohos y levaduras pueden sintetizar metabolitos txicos termoresistentes, capaces
de soportar algunas sustancias qumicas, as como la irradiacin y presentan capacidad para
alterar sustratos desfavorables, permitiendo el crecimiento de bacterias patgenas.
Es de gran importancia cuantificar los mohos y levaduras en los alimentos, puesto que al
establecer la cuenta de estos microorganismos, permite su utilizacin como un indicador de
prcticas sanitarias inadecuadas durante la produccin y el almacenamiento de los productos, as
como el uso de materia prima inadecuada.
Los hongos, cuando hidrolizan la pectina (Sclerotinia) las frutas y verduras muestran
reblandecimientos. En los jugos y frutas envasados causan deterioro los hongos
termorresistentes. Otros hongos toleran elevadas concentraciones salinas en los alimentos (hasta
24 %), como en las aceitunas preparadas en salmueras. Algunas levaduras, como Saccharomyces
rouxii pueden desarrollarse aunque lentamente, en mieles con un mnimo de agua. Las levaduras
con frecuencia deterioran mayonesas, salsas procesadas, salchichas, jugos y vegetales envasados,
bebidas no alcohlicas, leche condensada, mieles, jarabes, yogurt y otros. Las levaduras toleran
bien el pH cido que no es soportado por la mayora de las bacterias, quedando sin competencia.
Otras levaduras utilizan los nitritos como fuente de nitrgeno , afectando los procesos de
curacin de las carnes.
Es importante la estimacin cuantitativa de hongos y levaduras, adems de la cualitativa.
Un mayor nmero en el conteo total indicar una mayor posibilidad de descomposicin del
alimento.

90

MATERIALES Y MTODOS
Mtodo de diluciones y vaciado en placa.
Cada equipo de alumnos puede trabajar un alimento diferente. Pueden incluir vegetales y jugos
de frutas envasados, frutas y vegetales frescos en descomposicin.
1. Hacer diluciones decimales del alimento, en condiciones de esterilidad, a partir de 10 ml
(lquido) o de 10 g del alimento (slido). Se muele (o se mezcla si es lquido) en 90 ml de
agua peptonada estril. Se tapa y se agita la botella con 25 movimientos, en un arco de 30
cm, completados en 7 segundos.
11. De la misma dilucin 1: 10 transfiera 1 ml a un tubo conteniendo 9 ml de agua
peptonada estril. De esta dilucin 1: 100 transferir 1 ml a otro tubo con 9 ml de caldo
peptonado y de este 1ml a otro tubo con 9 ml de caldo peptonado y de esta manera se
tienen la dilucin 1: 1000 y la dilucin 1: 10,000.
2. De cada dilucin, transfiera 1 ml a su correspondiente caja Petri estriles vacas. A todas las
cajas se les adiciona rpidamente medio papa-dextrosa-agar fundido, enfriado y acidificado
con cido tartrico a pH 3.5. En su lugar puede utilzarse el medio adicionado de antibiticos.
Homogeneizar cuidadosamente sin derramar el medio. Se mezcla cuidadosamente el medio
con la muestra, mediante 6 movimientos de derecha a izquierda, 6 en el sentido de las
manecillas del reloj, 6 en sentido contrario y 6 de atrs adelante, sobre una superficie lisa y
horizontal hasta lograr una completa incorporacin del inculo en el medio; cuidar que el
medio no moje la cubierta de las cajas. Dejar reposar y solidificar. Incubar una serie de
placas a temperatura ambiente durante 5 das. Otra serie a 35 C por 48 hs.
3. Contar las colonias de hongos filamentosos en las placas incubadas a temperatura ambiente,
cinco das. Note que los hongos filamentosos (mohos) desarrollan colonias ilimitadas de
aspecto algodonoso, aterciopelado, pulverulento, yesoso, etc. y muy coloridas.
4. Contar las colonias de levaduras en las placas incubadas a 35 C por 48 hs. Note que las
levaduras desarrollan colonias cremosas, limitadas, brillantes, generalmente blanquecinas,
muy similares a las colonias bacterianas.
5. Multiplicar el # de colonias por el factor de dilucin.
Reportar el nmero de hongos o de levaduras por gramo o por ml de muestra (UFC)
Para fines de esta Norma se entiende por:
1.- Colonias, agrupamiento de clulas en forma de masas visibles, sobre el agar de cultivo.
2.- Levaduras, son microorganismos cuya forma dominante de crecimiento es unicelular. Poseen
un ncleo y se multiplican por reproduccin sexual o asexual, por gemacin o por fisin
transversal. La reproduccin sexual cuando ocurre, es por medio de ascosporas contenidas en un
saco o asca.
3.- Mohos, grupo de hongos microscpicos; organismos pertenecientes al reino Fungi, que se
caracterizan por tener un cuerpo formado por estructura filamentosa con ramificaciones, que se
conocen con el nombre de hifas, el conjunto de hifas constituye el micelio, carecen de clorofila,
se alimentan por absorcin pudiendo propagarse por esporas flageladas o no, las paredes

91

celulares pueden ser de queratina, celulosa o manana. Crecen formando colonias en un medio
selectivo a 25 C.
RESULTADOS, DISCUSIN Y CONCLUSIONES
1. Determine el nmero de hongos filamentosos y de levaduras por gramo de alimento.
2. Explique el significado del nmero obtenido en cada caso, de acuerdo con el alimento.
3. Compare sus resultados con los obtenidos por los otros equipos, e igualmente explique los
resultados en cada alimento. Discuta los resultados, comparando con los datos de la literatura
y saque conclusiones.
Cuestionario
Investigue el nombre de cuatro hongos filamentosos y de dos levaduras que descompongan
frutas o verduras.

92

PRCTICA # 10

Pasteurizacin de la leche de vaca

NOM-091-SSA1-1994.
OBJETIVO DE LA PRCTICA
Conocimiento y desarrollo de la tcnica de pasteurizacin de la leche, comprendiendo las
disposiciones y especificaciones sanitarias establecidas por la Norma Oficial

INTRODUCCION
Pasteurizacin, proceso al cual es sometido el producto a una adecuada relacin de temperatura y
tiempo para destruir la flora bacteriana patgena y casi la totalidad de la
flora banal
La pasteurizacin es un proceso de calentamiento que resulta en la reduccin o eliminacin de
microorganismos que descomponen alimentos tales como cerveza, vino y vinagre, o en la
destruccin de patgenos en la leche. En la industria de lcteos el tiempo y la temperatura de
calentamiento estn designados para eliminar todos los patgenos, sin afectar la calidad nutritiva
ni el sabor de la leche. El tratamiento es suficientemente efectivo para matar las ms resistentes
de las bacterias patgenas no-esporuladas, como Mycobacterium tuberculosis y Coxiella
burnetii. Tambin mueren la mayora de los organismos no-patgenos. Los organismos que
sobreviven son formadores de esporas y los termoflicos / termodricos.
Se utilizan tres mtodos de pasteurizacin para la leche:
Baja teemperatura - largo tiempo (63.5 C por 30 min)
Alta temperatura corto tiempo (72 C por 15 segundos)
Ultra alta temperatura (130 C por 1 segundo)
Adems de eliminar patgenos, se obtiene un producto con un promedio de vida de
anaquel en refrigeracin de 7-10 das. As161mismo, la leche pasteurizada es til en la
manufactura de una gran variedad de produccctos lcteos.
MATERIALES Y MTODOS
1. Tome una alcuota de 1 ml de leche bronca, con una pipeta estril y haga diluciones
decimales seriadas en tubos conteniendo 9 ml de diluyente (ms 1 ml de muestra), hasta 1 x
10-3
2. Pipete alcuotas de 1 ml de cada dilucin en cajas de Petri estriles, por duplicado.
3. Aada a una cajad de cada dilucin, 15 ml de agar rojo bilis violeta y a otra caja agar-cuenta
en placa. Mezcle bien con la muestra en cada caso y deje solidificar.
4. Despus de solidificar las placas de violeta-rojo bilisaada 5 ml adicionales fundidos del
mismo medio agar rojo bilis violeta, para formar una seguna capa y deje solidificar.
5. Incube todas las placas a 32 oC por 24 hs.
6. Coloque tubos conteniendo 10 ml de leche bronca en un bao de agua a 63.5 oC. Coloque un
tubo control de muestra con un termmetro adentro. Cuando se alcancen ls los 63.5 oC se
empieza a contar el tiempo de pasteurizacin de media hora y enseguida retire los tubos del
bao.
93

7. Despus de la pasteurizacin haga diluciones de uno de los tubos, hasta 1 x 10-2 y repita el
procedimiento anterior para sembrar las muestras en agar rojo bilis violeta y en agar-cuentaen-placa. Incube a 32 oC por 24 hs.
8. Examine todas las placas y compare las de leche bronca con las de pasteurizada. Haga conteo
de colonias.
9. Exaamine las colonais tpicas de coliformes en medio rojo bilis violeta
10. Compare sus resultados con los estndares de la tabla #1:

Producto
Leche bronca
Leche pasteurizada
Grado A

Tabla #1. Lmite de bacterias para leche bronca,

pasteurizada y grado A
Lmite normal
Lmite anormal
50 a 100 coliformes / ml
200, 000 a 400, 000 CFU / ml
menos de 10 coliformes / ml
30,000 UFC/ml mesfilos
menos de 5 coliformes / ml
15,000 UFC/ml mesfilos

ESPECIFICACIONES LMITE MXIMO

Mesoflicos aerobios
UFC/ml 30 000
Organismos Coliformes totales
UFC/ml en planta 10
Organismos Coliformes totales
UFC/ml en punto de venta 20
Salmonella spp7* en 25 ml
Ausente
Staphylococcus aureus8* en 25 ml
Ausente
Listeria monocytogenes9* en 25 ml Negativo
ETIQUETADO
La etiqueta de los productos objeto de esta Norma, adems de cumplir con lo
establecido en el Reglamento y la Norma Oficial Mexicana correspondiente, debe
sujetarse a lo siguiente:
Debe figurar:
La fecha de caducidad, sealando con letra o nmero el da, mes y ao.
El contenido de vitamina "A" de acuerdo a lo establecido en el punto 6.7.
Las leyendas "Mantngase en Refrigeracin" o "Consrvese en Refrigeracin".
ENVASE Y EMBALAJE
Envase
Los productos objeto de esta Norma se deben envasar en recipientes tipo sanitario,
elaborados con materiales inocuos y resistentes a las distintas etapas del proceso,
de tal manera que no reaccionen con el producto o alteren las caractersticas
fsicas, qumicas y sensoriales.
Embalaje
Se debe usar material resistente que ofrezca la proteccin adecuada a los envases
para impedir su deterioro exterior, a la vez que facilite su manipulacin,
almacenamiento y distribucin.
RESULTADOS, DISCUSIN Y CONCLUSIONES
Diagrama

94

95

PRCTICA # 11

Recuento de Staphylococcus aureus en alimentos

NOM-115-SSA1-1994
OBJETIVO DE LA PRCTICA
Aplicar el mtodo de conteo de Staphylococcus aureus establecido por la Norma Oficial
Mexicana para alimentos nacionales o de importacin.
INTRODUCCION
El crecimiento de Staphylococcus aureus en alimentos tiene gran importancia por tratarse de
un microorganismo capaz de producir una poderosa enterotoxina que al ingerirse causa
intoxicaciones alimentarias.
Entre las razones para determinar el Staphylococcus aureus en alimentos estn:
Confirmar la presencia de este microorganismo como agente causal de una enfermedad
de origen alimentario.
Determinar si un alimento o ingrediente es fuente potencial de este microorganismo
enterotoxignico.
Demostrar la contaminacin postproceso la cual es usualmente debida a contacto humano
o con superficies inadecuadamente sanitizadas.
Los alimentos sujetos a contaminacin postproceso con tipos enterotoxignicos de
Staphylococcus aureus representan un riesgo por la ausencia de flora competitiva que
normalmente restringe el crecimiento del Staphylococcus aureus y la produccin de
enterotoxinas.
Este tipo de alimentos se vuelven ms peligrosos, si adems son sujetos a un inadecuado
manejo o son mantenidos a temperaturas de conservacin inapropiadas.
Los alimentos perecederos tales como: carnes crudas y procesadas, ensaladas, productos
de pastelera y productos de leche, son los ms comnmente asociados con intoxicacin
estafilocccica.
S. aureus requiere no menos de 8 hs para producir suficiente toxina en el alimento y causar los
sntomas, mismos que aparecen dentro de las 1-6 horas siguientes a la ingestin del alimento.
MATERIALES Y MTODOS
Mtodo de recuento en placa
Este mtodo permite hacer una estimacin del contenido de Staphylococcus aureus en alimentos
y se efecta directamente en placas de medio de cultivo selectivo y diferencial, con la
confirmacin mediante las pruebas de coagulasa y termonucleasa.
Este mtodo es adecuado para el anlisis de alimentos en los cuales se esperen ms de 100
clulas de Staphylococcus aureus por g.

Preparacin de la muestra
96

Se debe realizar de acuerdo a lo establecido en la NOM-110-SSA1-1994 "Preparacin y

Dilucin de Muestras de Alimentos para su Anlisis Microbiolgico".
Procedimiento
1. Utilizando diferentes pipetas de 1 ml para cada dilucin, depositar 0,1 ml sobre la
superficie de las placas de agar Baird-Parker.
2. Distribuir el inculo sobre la superficie del agar con varillas estriles de vidrio en ngulo
recto, utilizando una para cada dilucin.
3. Mantener las placas en su posicin hasta que el inculo sea absorbido por el agar.
4. Invertir las placas e incubar de 45 a 48 h a 35C..
5. Seleccionar las placas que tengan entre 15 y 150 colonias tpicas de Staphylococcus
aureus; si no es posible, seleccionar las placas de las diluciones ms altas no obstante tengan ms
de 150 colonias.
6. Cuando las placas tengan menos de 15 colonias tpicas tambin pueden ser utilizadas y al
informe se debe agregar la nota de "valor estimado".
7. Las colonias tpicas son negras, circulares, brillantes, convexas, lisas, de dimetro
de 1 a 2 mm y muestran una zona opaca y un halo claro alrededor de la colonia.
8. Seleccionar las colonias de acuerdo con el cuadro #1, para realizar las pruebas
de coagulasa y termonucleasa:
Cuadro # 1. Seleccin de las colonias en base al nmero
Nmero de colonias sospechosas
Nmero por probar
Menos de 50
3
51 a 100
5
101 a 150 o ms
7
9. Seleccionar el nmero de colonias y sembrar cada una en tubos con 0.5 ml de caldo de
infusin cerebro-corazn.
10. Incubar a 35C durante 24 h.
11. Inocular en la misma forma cepas conocidas de Staphylococcus aureus y
Staphylococcus epidermidis como testigos positivo y negativo.
12. Despus del perodo de incubacin pasar con una pipeta de 1 ml, 0,3 ml de cada
cultivo a otro tubo de 10 mm x 75 mm y conservarlo para la prueba de
termonucleasa. El resto del cultivo se usa para la prueba de coagulasa.
13. Prueba de coagulasa
13.1 Agregar a los 0,2 ml del cultivo anterior, 0,2 ml de plasma de conejo diluido
volumen a volumen con solucin salina estril.
13.2 Incubar en bao de agua de 35 a 37C y observar durante 6 h a intervalos de 1
hora; si no hay formacin de cogulo, observar a las 24 h. Considerar
positiva la prueba si hay formacin de cogulo.
14. Prueba de termonucleasa
14.1 Calentar durante 15 min, 0,3 ml de cultivo en caldo de infusin cerebrocorazn en bao de agua hirviendo.
14.2 Pasar una gota de cada cultivo por medio de una pipeta Pasteur a un orificio
del medio, incluye testigo
97

14.3 Incubar a 35C en cmara hmeda de 4 a 24 h.

14.4 La aparicin de un halo color rosa extendido de por lo menos 1 mm alrededor de
la perforacin se califica como positiva.
Clculo y expresin de resultados:
Hacer el clculo del contenido de microorganismos en el producto tomando en cuenta el nmero
de colonias totales, el nmero de colonias confirmadas, la dilucin y el volumen inoculado (0,1
ml).
Ejemplo 1:
Si la caja tiene 80 colonias en la dilucin 1:1000
Se toman 5 colonias para la prueba, de stas dan 4 positivas, el clculo es:
80 x 4 = 64 x 1000 x 10 = 640 000
Si las pruebas confirmativas resultan negativas en todas las colonias probadas, informar
como:
0 UFC/g en muestras directas
-10 UFC/g en muestras de dilucin 1:10
-100 UFC/g en muestras de dilucin 1:100
RESULTADOS, DISCUSIN Y CONCLUSIONES
En base al resultado del conteo de S. aureus en su alimento estudiado, cmo se interpretan estos
datos.
Discuta sus resultados con los de otros equipos para otros alimentos y obtenga conclusiones.
Cuestionario
Investigue los efectos de la enterotoxina de S. aureus al ser ingerida y comprelos con los de
enterotoxinas de otras bacterias.
Ejemplo, aunque con otras cantidades

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PRACTICA # 12
Determinacin de bacterias patgenas
en utensilios y manipuladores de alimentos
NOM-093-SSA1-1994
OBJETIVO DE LA PRCTICA
Aislar patgenos de utensilios y manipuladores de alimentos, de acuerdo con la Norma Oficial
Mexicana que establece las disposiciones sanitarias que deben cumplirse en la preparacin de
alimentos para ofrecer alimentos inocuos al consumidor.
INTRODUCCIN
El control sanitario en la preparacin de alimentos que se ofrecen en establecimientos fijos, es el
conjunto de acciones de orientacin, educacin, muestreo y verificacin que deben efectuarse
con el fin de contribuir a la proteccin de la salud del consumidor, mediante el establecimiento
de las disposiciones sanitarias que se deben cumplir tanto en la preparacin de alimentos, como
en el personal y los establecimientos, en los puntos crticos presentes durante su proceso; que
permitan reducir aquellos factores que influyen durante su preparacin en la transmisin de
enfermedades por alimentos (ETA).
La higiene personal y buena salud de los trabajadores que preparan o sirven los alimentos,
contribuyen a reducir las posibilidades de contaminacin del alimento. Las personas afectadas
con una enfermedad infecciosa que pueda ser transmitida a travs del alimento, o que sean
portadores de dichos patgenos, no debern trabajar donde se procesen y sirvan alimentos.
Para descartar a quienes manejan alimentos como portadores de infecciones, se aconseja
practicar anlisis peridicos de laboratorio, as como una exploracin fsica cuidadosa, al inicio
de actividades en las diferentes negociaciones. Sin embargo se ha descubierto que los programas
educativos para estas personas resultan mucho ms eficaces desde el punto de vista de salud
pblica, que los exmenes fsicos peridicos. Las personas que manejan alimentos no deben
realizar otros deberes que puedan contaminar sus manos, como manejar dinero, recoger platos
sucios, o limpiar superficies de trabajo y reas de servicio, etc. Los platos, charolas, tablas para
cortar, abrelatas, ollas, sartenes, cuchillos y cucharas y todos los utensilios en general utilizados
para preparar, servir y almacenar los alimentos deben estar limpios e higinicos. Es importante
sealar que las superficies que estn en contacto con los alimentos durante su procesamiento y/o
empaque no debern tener cantidades significativas de microorganismos y estar exentas de
patgenos.
En cualquier establecimiento donde se sirven alimentos o bebidas se deben seguir ciertas
normas de higiene, con el propsito de proteger la salud del consumidor. Los utensilios de cocina
deben ser tratados en forma conveniente para evitar que contengan un alto ndice de
microorganismos o contaminantes perjudiciales para la salud.
El nmero y tipos de bacterias encontradas en superficies de utensilios para comer y
beber, son indicadores de la eficiencia en los procesos de limpieza y desinfeccin, as como
tambin pueden indicar la contaminacin durante el almacenamiento o el manejo de los
alimentos. Algunas enferemedades como la difteria, escarlatina, infecciones de garganta o boca,

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as como fiebre tifoidea, disentera bacilar, etc. pueden ser transmitidas por utensilios
contaminados con microorganismos causantes de dichas enfermedades.
Los microorganimos patgenos buscados en los manipuladores de alimentos son:
Streptococcus pyogenes Gpo. A y Staphylococcus aureus en faringe; Salmonella y Shigella en
heces, as como Salmonella, Shigella, E. coli y Staphylococcus aureus en manos y uas.
MATERIALES Y MTODOS
Tcnicas para aislar bacterias patgenas en manipuladores de alimentos:
I.
Siembra de exudado farngeo para determinacin de Staphylococcus aureus y
Streptococcus Gpo A.
1. Obtenga una muestra de exudado farngeo de un manipulador de alimentos, con un
hisopo estril en la forma tradicional y deposite la muestra en una caja de agar sangre y
en otra de sal-manitol-agar. Enseguida extienda el inculo con el asa por estra cruzada.
Incube a 37 C por 24 hs.
2. Haga Gram de las colonias Beta hemolticas y proceda a la identificacin de S. aureus o
S. pyogenes, por medio de las pruebas bioqumicas especficas.
II. Coprocultivo para determinacin de Salmonella y Shigella a partir de heces.
1. Siembre una muestra de heces del manipulador de alimentos, por estra cruzada en
placas de medio SS y agar-verde brillante. Siembre un gramo de heces en un tubo
conteniendo 10 ml de tetrationato e incubar a 37 C por 24 hrs.
2. A partir del caldo de tetrationato sembrado con heces, siembre una placa de agar SS y
otra de verde brillante. Incbelas por 24 hrs a 37 C.
3. Observe la aparicin de colonias tpicas de Salmonella y Shigella en agar SS, de
incoloras a rosa plido, opacas, transparentes o trnslucidas. Algunas cepas producen
colonias con centro negro.
4. Haga las pruebas bioqumicas recomendadas para enterobacterias, e identifique las
bacterias aisladas.
III. Tcnicas para aislar Salmonela y Shigella de manos y uas
1. Utilizando un hisopo estril empapado en el medio de transporte (tioglicolato-no
nutritivo) se frota la palma de las manos, entre los dedos y las uas.
2. Se deposita la muestra en placas de SS y de EMB y enseguida se extiende el inculo
por estra cruzada.
3. Se incuban las placas a 35 oC por 24 hs.
4. En el medio SS, las salmonelas forman colonias pequeas, incoloras con el centro
negro y el medio circundante se vuelve rosa plido. Las shigelas forman colonias
translcidas, convexas, pequeas.
5. En el medio EMB se buscan colonias de enterobacterias como indicadoras de
contaminacin fecal en manos.
6. Las colonias sospechosas se resiembran en medios para pruebas bioqumicas. Se
comparan los resultados con las tablas para enterobacterias.
IV. Tcnicas para aislar las bacterias de superficies y utensilios de cocina

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1. Con un hisopo humedecido en medio de transporte (tioglicolato-no nutritivo) limpie

la superficie de una mesa, el suelo o paredes de una cocina o utensilios.
2. Descargue la muestra del hisopo en placas de SS y de EMB y se extiende el inculo
por estra cruzada.
3. Nuevamente las enterobacterias se resiembran en medios con bioqumicas para la
identificacin. Aqu tambin ser importante la identificacin de enterobacterias
en general como indicadoras de contaminacin fecal en las cocinas.
RESULTADOS, DISCUSIN Y CONCLUSIONES
1. Determine en cules muestras se aislaron salmonelas y/o shigelas, anotando detalladamente
los resultados del crecimiento en todos los medios.
2. Forme un tabla de resultados con las bioqumicas.
3. Explique el significado de las bacterias identificadas en cada muestra
4. Compare con los resultados de los otros equipos y explique, comparando con los datos de la
literatura y saque conclusiones.
Cuestionario
1. Investigue cules son las enfermedades que produce Salmonella en humanos y cul es la
ms comn.
2. Investigue cules son las enfermedades que produce Shigella en humanos y cul es la
ms comn. Cul es la especie mas comn en Mxico.

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