I .

E L

S U P L I C I O D E T N T A L O
H E B R A I N A C C E S I B L E

L A

LAS MOLCULAS DE LA VIDA

A travs de varios miles de millones de aos de evolucin, la

diversidad biolgica nos resulta apabullante y asombrosa. Cada
organismo vivo, desde un ser humano hasta una pequea planta, una
bacteria o una mosca, parece ser una invencin nica y diferente. Si
observamos con cuidado, sin embargo, detectamos muchos elementos
en comn. La clasificacin de los seres vivos en reinos, rdenes,
gneros, etc., obedece precisamente a esta clara nocin de que los
organismos vivos se parecen unos a otros. En el nivel molecular, los
seres
vivos
se
parecen
increblemente. Es de la combinacin
y concierto de interacciones de los
mismos tipos de molculas que un
ser vivo difiere de otro. Esto es
similar al caso de las computadoras
(especialmente los programas que
corren en ellas), que pueden
diferenciarse notablemente unas de
otras, a pesar de estar constituidas
por circuitos o instrucciones muy similares.
Las molculas de la vida surgieron hace quiz 3 4 mil millones de
aos. Sus caractersticas y sus interacciones fundamentales han sido
alteradas muy poco en todo este tiempo. La evolucin ha ocurrido
partiendo de lo que ya hay, con modificaciones paulatinas.
cidos nucleicos
El fenmeno de la herencia es discernible por cualquier observador, pero
su fundamento qumico-biolgico no fue siquiera sospechado hasta
pocas relativamente recientes.
Fue sino hasta los aos cuarenta que los investigadores estadunidenses
Avery, McLeod y McCarty sugirieron, cautelosamente, que el material
hereditario podra estar contenido en la sustancia llamada cido
nucleico. Durante los siguientes cinco aos, trabajando con sistemas de
Pgina 1

separacin y anlisis relativamente primitivos, los investigadores del

campo de la gentica bioqumica demostraron, de manera inequvoca,
que tal era el caso.
El multicitado descubrimiento de la estructura tridimensional del cido
desoxirribonucleico (ADN), realizado por Watson y Crick, y cuya
culminacin fue en 1953, merece siempre una mencin especial.
Este trabajo muestra varios conceptos que son piedra angular en la
investigacin biolgica moderna. En primer lugar, los experimentos
realizados se basaron en los adelantos de la fsica. Se utilizaron rayos X
y conceptualizaciones tericas para inferir, a partir de patrones de
manchas, la estructura de la muestra de ADN analizada (vase en el
captulo VI una descripcin ms extensa sobre la tcnica de
cristalografa de rayos X). En segundo lugar, se hace notar la conviccin
de que, de la forma tridimensional de las molculas biolgicas se
pueden obtener importantes ideas respecto a la funcin de las mismas.
En tercer lugar, se destaca la confianza de que hay elementos y
principios universalmente aplicables a todo ser vivo, cuando se hace el
anlisis a nivel molecular.
- Estructura y Replicacin del ADN

El cido desoxirribonucleico o ADN, est formado por dos cadenas.

Puede ser descrito como un polmero constituido por cuatro diferentes
monmeros. El esqueleto es igual en todos los casos: un azcar
(desoxirribosa) y un fosfato. Del esqueleto se desprenden las bases, que
pueden ser A (adenina), G (guanina), C (citosina) o T (timina). Cada una
de las cadenas integra una molcula, porque est unida por enlaces
fuertes (o covalentes), mostrados por medio de lneas continuas como
se muestra en la figura RI.la. La disposicin de las bases permite,
adems, que una cadena tenga afinidad por otra, siempre y cuando sta
corra en el sentido opuesto y su secuencia de bases haga que se
mantenga la complementariedad entre las bases (A frente a T y G frente
a C). Esta afinidad se debe a la formacin de enlaces dbiles (no
covalentes) llamados puentes de hidrgeno, que se muestran con lneas
punteadas en la figura antes mencionada. Estos enlaces se pueden
hacer y deshacer con relativa facilidad. Como puede apreciarse en la
figura RI.1b, esto significa que la informacin codificada en la secuencia
est duplicada: cada una de las hebras contiene toda la informacin. As,
cuando las cadenas se separan, cada una puede servir para regenerar la
cadena opuesta. Este proceso se llama replicacin, y explica de
Pgina 2

inmediato cmo la molcula de ADN es capaz de transmitir informacin

de padres a hijos.
La complementariedad de las bases constituyentes de los cidos
nucleicos permite almacenar y transferir informacin. A pesar de lo
anterior; por medio de un gran nmero de experimentos, que no
consistan en la purificacin de molculas de ADN especficas, ni su
caracterizacin o anlisis directo, se pudieron sentar las bases de su
funcionamiento fundamental. As pues, sustentndose en pruebas de
muchos tipos, se estableci lo que se ha dado en llamar "dogma central
de la biologa molecular"

- La expresin de la informacin gentica

La informacin contenida en la secuencia del ADN requiere convertirse

en forma y funcin. El ADN constituye las instrucciones, es decir; los
planos; son necesarios herramienta y materiales para ejecutar lo que
Pgina 3

dicen los planos. La maquinaria celular convierte la informacin

del ADN en protenas especficas, una protena por cada gene. As, un
gene no es ms que un segmento determinado dentro de alguna larga
molcula de ADN (como una cancin dentro de la cinta de un casete). La
informacin fluye del ADN hacia la protena, pasando por un
intermediario, el ARN(cido ribonucleico), muy similar al ADN, y con las
mismas propiedades de apareamiento que ste en el proceso
llamado transcripcin, en el cual se van agregando una por una las
bases del ARN, copiando la secuencia del ADN. Posteriormente, se
ensamblan las molculas de protena, haciendo corresponder un
aminocido por cada tres bases. Todo un conjunto de molculas y
organelos participa en este proceso de traduccin. Hay una
correspondencia inequvoca entre la secuencia del ADN y la de la
protena para la que codifica, dada por el cdigo gentico. Este cdigo
relaciona el idioma de cuatro letras de ADN, tomando grupos de tres en
tres, con el idioma de las protenas, constituido por 20 letras o
monmeros.

La complementariedad que pueden tener dos hebras de cido nucleico

se puede ilustrar si imaginamos una hebra con la siguiente secuencia: 5
CAGTGAATTCAATCGAT3
y
otra
con
la
secuencia
5
ATCGATTGAATTCACTG3 (los nmeros 5 y 3 marcan los extremos de
las hebras que corren en sentido anti paralelo, como se ilustra en el
recuadro I.1). Estas dos especies moleculares son complementarias, es
decir; si las colocamos una frente a otra, en sentido anti paralelo (tal y
como se encuentran en las molculas de ADN naturales), tenemos:
Pgina 4

5CAGTGAATTCAATCGAT3
3GTCACTTAAGTTAGCTA5

y observamos que frente a C (abajo de la C, en la representacin

mostrada), hay siempre G y viceversa, y frente a A, hay siempre T, y
viceversa.
Protenas

Las protenas son, pues, la herramienta de los genes, el brazo ejecutivo

de la maquinaria celular; todo lo que existe en la biosfera resulta, en
consecuencia, del trabajo concertado y regulado de las protenas,
dirigidas e interactuando con los genes y con el entorno.
Estas mquinas moleculares son capaces de llevar a cabo las ms
diversas funciones.
Las enzimas son protenas que merecen mencin especial. Dentro de
una clula viva existen miles de sustancias diferentes, que
potencialmente pueden sufrir transformaciones qumicas muy diversas.
De hecho, slo algunas de estas reacciones podran ocurrir en
condiciones suaves y a temperatura ambiente. La clula, sin embargo,
sufre una constante transformacin. Esto se debe al trabajo de las
enzimas. Su capacidad cataltica consiste en que, al interaccionar con
sus "molculas blanco", es decir; aquellas a las que van a modificar
(llamadas sustratos), facilitan transformaciones qumicas especficas, sin
alterarse ellas mismas en el proceso: una enzima cataliza o induce una
transformacin particular en miles de molculas de sustrato sobre las
que acta en forma sucesiva. As, de la accin concertada de las
enzimas resulta un proceso continuo de transformacin qumica, que es
el responsable de la aparicin de forma, funcin y adaptacin al medio.
SEPARACIN E IDENTIFICACIN DE LAS BIOMOLCULAS

Pgina 5

Hay
diversas
tcnicas
que
se
utilizan
rutinariamente en el ADN recombinante. Una de las
ms frecuentes es la electroforesis (figura RI.3A).
Esta tcnica se aplica para el anlisis de ADN y de
protenas y nos permite, en una de sus versiones,
separar estas molculas de acuerdo con su
tamao.

De manera anloga, en la cromatografa de

exclusin (figura RI.3B) se puede colocar en una
columna una suspensin o pasta de partculas con
agujeros microscpicos y hacer fluir una solucin
con las molculas a separar por esta columna. Las
molculas ms pequeas se irn introduciendo en
los orificios, lo cual retarda su movimiento. Las
molculas grandes, que no caben en todos los
agujeros, se retardarn menos. Si vamos colectando
el fluido al final de la columna, irn apareciendo las
molculas separadas: primero las ms grandes y al
final las ms pequeas.

Otro principio de gran importancia en los procesos de separacin es

explotar la diferente afinidad de unas molculas por otras. El
procedimiento consiste en fijar un material que se une fuertemente a
una protena a un soporte slido (por ejemplo, algo que se parezca a su
sustrato). Estas molculas que se unen a protenas, especficamente, se
denominan ligandos.
Al hacer pasar una solucin con una mezcla de protenas por una
columna que contenga este soporte, la protena que es de nuestro
inters se quedar adherida, mientras que las otras pasan de largo. S
Pgina 6

despus agregamos una solucin con abundante ligando libre, la

protena se despega de la columna, pues ahora el sitio de unin lo ocupa
el ligando que no est sujeto, y ya pura, se puede recuperar. Este
proceso se denomina cromatografa de afinidad (figura RI.3c).

I I .
L A

L A S L L A V E S D E L A B I B L I O T E C A D E
V I D A : L A N U E V A H E R R A M I E N T A D E
L A I N G E N I E R A G E N T I C A

ENZIMAS DE RESTRICCIN

Pgina 7

Muchos microorganismos producen enzimas que modifican y digieren o

rompen
el ADN.
Estos
sistemas,
llamados
de modificacinrestriccin, son anlogos a un sistema inmune, los cuales
probablemente evolucionaron como un mecanismo de proteccin de los
microorganismos contra infecciones virales. En efecto, las bacterias, por
ejemplo, son infectadas por virus, llamados bacterifagos, que inyectan
su propio ADN en la clula bacteriana para despus controlar su
maquinaria celular y redirigirla hacia la sntesis de sus propios
componentes, dando como resultado final la ruptura de la clula y la
liberacin de cientos o miles de nuevos virus. En algunas bacterias
el ADN propio est modificado en ciertas secuencias. Una enzima de
modificacin se desliza sobre la hebra de ADN, y cada vez que se topa
con su secuencia blanco, por ejemplo GAATTC, introduce un pequeo
grupo qumico en la adenina (A) central. Otra enzima, la enzima de
restriccin, tambin se desliza en la hebra de ADN, y si encuentra la
secuencia GAATTC, corta el ADN en esa posicin. La enzima, sin
embargo, no corta el ADN modificado, por lo que efectivamente es capaz
de degradar el ADN extrao que puede entrar a la clula, sin alterar
el ADN propio.
Otra interesante propiedad de las enzimas de restriccin es que, en
general, reconocen secuencias palindrmicas, es decir; secuencias que
son iguales si se leen en una direccin, o en la direccin contraria. Por
ejemplo:

5GAATTC3
3CTTAAG5
es una secuencia palindrmica. Cuando acta la enzima que reconoce y
corta esta secuencia, llamada EcoRI, genera segmentos de ADN con
extremos que se proyectan fuera de la doble cadena:

5G
3CTTAA

AATTC3
G5

Estos extremos se denominan cohesivos o pegajosos, porque tienden a

aparearse o hibridarse nuevamente. En realidad, cualquier extremo
de ADN generado por un corte con EcoRI puede hibridarse o aparearse
con otro extremo generado por la misma enzima.

Pgina 8

La separacin de los cidos nucleicos

Cuando se utiliza la electroforesis, es posible visualizar la accin de las

enzimas de restriccin. Si se colocan muestras que contienen ADN de
diversos tamaos en los pozos de un gel en forma de placa, y se aplica
corriente elctrica, la diferencia de velocidad de migracin de estas
molculas las distribuir, por separado, al cabo de un tiempo, dentro del
gel. Si despus se agrega una sustancia que se hace luminosa al
interaccionar con el ADN y baarse con luz ultravioleta, directamente se
puede observar el patrn de distribucin de las bandas constituidas por
las molculas de diversos tamaos, por medio del cual es factible
deducir sus respectivas dimensiones.
Al usar diferentes enzimas de restriccin, se generan diferentes
segmentos. Por ejemplo, si la secuencia reconocida por la enzima Sall
aparece en la molcula del ejemplo una vez, cortara el segmento en dos
partes. Si la secuencia reconocida por EcoRI, aparece dos veces,
generara tres pedazos. Al usar las dos enzimas simultneamente, se
produciran cuatro segmentos.

Los procedimientos bsicos del ADN recombinante

El producto de la digestin del ADN con endonucleasas de restriccin

est constituido por muchos fragmentos especficos, cuyos extremos son
compatibles o cohesivos unos con otros. Estos fragmentos se ligan
despus a un segmento especial de ADN, el vehculo de donacin
(usualmente un plsmido), que fue cortado con la misma enzima. Las
Pgina 9

molculas recombinantes resultantes contienen un ADN vehculo o

vector y un ADN pasajero, constituyendo una nueva molcula circular
continua.
Estas molculas se introducen a clulas bacterianas y se seleccionan por
medio de "genes marcadores" presentes en el vehculo de donacin.
Dentro de su secuencia de ADN los vehculos de donacin contienen
seales que inducen la replicacin del ADN, y otras que producen,
tpicamente, resistencia a algn antibitico. As, las clulas que reciben
una molcula recombinante la perpetan en su interior, y se pueden
detectar porque sta confiere a la clula la capacidad de sobrevivir en
presencia del antibitico.

Pgina 10

El ADN sinttico y sus aplicaciones

Para un qumico, la tarea de sintetizar molculas de ADN representa

varios retos. El objetivo es ensamblar secuencias definidas, a partir de
los cuatro nucletidos A, G, C y T. Muchos aos de trabajo, de varios
laboratorios, han culminado en los sintetizadores robticos que se usan
hoy en da, y con los que se producen miles de oligos para las ms
diversas aplicaciones.
Una vez resuelto el problema de enmascarar selectivamente los grupos
qumicos presentes en los nucletidos, se pueden hacer reaccionar
ordenadamente, para ir produciendo la secuencia. En la actualidad se
utiliza el mtodo en fase slida, en el que la cadena de ADN va
creciendo adherida a pequeas partculas de vidrio. En la sntesis
automatizada, una mquina, constituida por vlvulas y botellas
controladas por una computadora, va inyectando diversas soluciones al
reactor que contiene el vidrio. Cclicamente se activa el oligo, se le hace
reaccionar con la base siguiente y se lava.
Con esta tcnica se puede llegar; prcticamente, a oligos de hasta 50
100 nucletidos de longitud.
Entre las aplicaciones ms frecuentes y tiles de oligos sintticos se
encuentra la construccin de genes, que se logra hibridizando oligos
complementarios los cuales reconstruyen el ADN dplex con la
secuencia
diseada.
Otro
enfoque
de
gran
utilidad
se
denomina mutagnesis dirigida. En este caso, el oligo se usa para
alterar especficamente una pequea
regin dentro de un gene natural
clonado.

Pgina 11

Procedimiento
para
secuencia del ADN

obtener

la

En la figura se ilustra el mtodo enzimtico. A partir de un oligo marcado

se inicia una reaccin de replicacin in vitro. Esta reaccin procede
hasta encontrar un nucletido terminador, que no permite que la cadena
replicada siga creciendo. Se efectan cuatro reacciones, una para cada
base de ADN que contiene el nucletido terminador correspondiente, y
se termina con cuatro colecciones de fragmentos marcados, cada una
constituida por fragmentos que terminan en A, G, C o T,
respectivamente.
El anlisis del tamao de estos fragmentos, mediante electroforesis en
gel, revela de inmediato un patrn de bandas, que corresponde
directamente a la secuencia que se encuentra enfrente del oligo
iniciador.

Pgina 12

LA REACCIN EN CADENA DE POLIMERASA

La enzima ADNpolimerasa participa en la replicacin del ADN (recuadro

I.I). Para convertir una molcula de ADN de doble cadena en dos
molculas idnticas, la enzima requiere que las cadenas de la molcula
inicial se separen, para as tener un molde disponible. Adems, la
enzima requiere un segmento de ADN con un extremo libre, que sirve
para cebar o iniciar la reaccin de replicacin y los nucletidos
precursores. Si se colocan estos sustratos en un tubo de ensayo,
la ADN polimerasa puede incorporar uno por uno los nucletidos
correspondientes, es decir, frente a una A en el molde, adicionar T en la
cadena creciente; frente a G, C, etc. En realidad, ste concepto era
perfectamente conocido y aplicado desde mucho antes de que se
concibiera la tcnica de la PCR. Lo original de la idea de la concepcin
de Mullis fue pensar qu sucedera si se aplica este procedimiento en
ciclos sucesivos, en una reaccin en cadena. Los oligos sintticos, en
virtud de su propiedad de hibridacin de los cidos nucleicos, definen los
puntos de partida para el copiado de las cadenas de ADN. Si se colocan
dos oligos cuya secuencia define los extremos de un segmento
determinado de ADN, se hacen hibridar con las hebras del molde,
previamente
separadas,
y
se
someten
a
una
reaccin
con ADN polimerasa, de lo que resultarn dos molculas cuyos extremos
estn definidos por los oligos y que corren en sentido opuesto. Las
cadenas resultantes son complementarias entre si: existen ahora el
doble de molculas con la secuencia que demarcan los oligos.
Pgina 13

I I I .

A I S L A N D O G E N E S : C A S O S
V I D A R E A L

D E

L A

AISLAMIENTO DE GENES POR COMPLEMENTACIN

Los primeros genes microbianos fueron aislados mediante el principio de

la complementacin. Este procedimiento se fundamenta en el trabajo
previo de los genetistas que, desde mucho tiempo atrs, haban
caracterizado indirectamente a los genes. El trabajo clsico en gentica
microbiana implicaba el aislamiento y caracterizacin de bacterias
Pgina 14

mutantes, es decir, variantes que se generan espontneamente o por un

tratamiento qumico o fsico. Por ejemplo, una bacteria mutante puede
haber perdido la capacidad de alimentarse con cierta sustancia, digamos
el azcar galactosa. Esto significa que algn gene relacionado con el
proceso de asimilacin de la galactosa est alterado.
Primero se requiere crear un conjunto de clones que contengan
segmentos de un tamao adecuado. Lo que se hace es someter una
preparacin del ADN total de la bacteria en cuestin (de la cepa
silvestre que contiene el gene normal que nos interesa) a la accin de
alguna enzima de restriccin. La reaccin se controla para generar
segmentos de unos 5 a 10 mil pares de bases, cada uno capaz de
contener unos cuantos genes. Esta coleccin de fragmentos se liga a un
vector de clonacin (vase el recuadro II.2) y se introduce a clulas de la
cepa mutante (la que era incapaz de crecer en galactosa). Si colocamos
algunos miles de clulas as transformadas en una caja con medio
nutritivo (claro, donde el nutrimento sea galactosa), es probable que
crezca alguna de ellas: la que recibi el segmento que contena el gene
funcional; correspondiente al gene mutante. Este gene ya no es ms una
entelequia. Se encuentra en un segmento pequeo, insertado en un
plsmido del que se pueden preparar grandes cantidades. Este gene ha
sido aislado, o purificado.
AISLAMIENTO DE GENES USANDO ADN SINTTICO
Aislamiento de genes usando oligonucletdos sintticos

As como existen procedimientos para secuenciar el ADN, tambin los

hay para secuenciar protenas.
A partir de la secuencia de aminocidos de una protena, podemos
deducir la secuencia del ADN que la codifica, utilizando el cdigo
gentico (en realidad, slo de manera imperfecta, debido a que un
mismo aminocido puede ser codificado por ms de un triplete o codn).
En todo caso, en ciertas regiones favorables se puede esperar que la
secuencia deducida corresponda muy cercanamente a la original.

Pgina 15

AISLAMIENTO DE GENES UTILIZANDO ANTICUERPOS

Las protenas, en particular; cuando son extraas a un animal, inducen

en ste la produccin de anticuerpos. Estas molculas son, a su vez,
protenas con caractersticas muy interesantes. Baste decir; por el
momento, que los anticuerpos pueden ser usados como reactivos que
reconocen, en medio de mezclas complejas, las sustancias especficas
que indujeron su produccin.
El ADN de todos los organismos es similar, pero la manera como ste se
expresa para formar protenas especficas debe ser muy diferente; de
hecho, de la diferencia del control de la expresin de los genes deriva en
gran parte la diferencia entre unos organismos y otros.
AISLAMIENTO DE GENES UTILIZANDO SUS ARN MENSAJEROS

Forma de ARN mensajero. De hecho, si se purifica ARN mensajero del

oviducto de gallina, la mayor parte de esta preparacin estar
constituida por el mensajero que codifica para la ovoalbmina.
Es decir, que copie una hebra de ARN y la "transcriba", de manera
reversa hacia ADN. Esto es, en principio, posible: la informacin
(codificada en la secuencia) est en la molcula de ARN. Lo que se
requiere es una enzima que realice la copia, pero que acepte como
molde al ARN, y como nucletidos para incorporar a los del ADN.

Pgina 16

Usando una preparacin que contenga esta enzima, la transcriptasa

reversa,sobre
el ARN,
se
obtiene
el
llamado ADNc,
o ADN complementario.
Obtencin del ADN complementario
El procedimiento que permite obtener ADN a partir de ARNes de extrema
utilidad. La informacin que se encuentra en forma de ARN mensajero es
de una complejidad mucho menor a la que se encuentra en el ADN de
los cromosomas.
Se emplea por lo tanto una tcnica que utiliza una serie de reacciones
enzimticas, in vitro, para convertir el ARNmensajero en ADN de doble
cadena, listo para ser clonado. El principal componente para lograr este
procedimiento es la enzima llamada transcriptasa reversa. Esta enzima
es capaz de copiar un molde de ARN para fabricar ADN, agregando las
bases complementarias una por una, en un proceso similar a
la replicacin.
Un tratamiento alcalino o enzimtico permite eliminar el ARN que sirvi
como molde original y se forma luego una segunda hebra de ADN, con lo
que se completa la copia clonable.

Al comparar las donas de ADNc y de ADN genmico se observ que

stas no coincidan exactamente. El ADN genmico contena segmentos
adicionales de ADN, al interior del gene! Estos segmentos se
denominaron intrones

Pgina 17

Podemos comprender entonces

que la complejidad de un genoma
del ser humano es mucho mayor
que la de una bacteria o de una
levadura. Aislar genes humanos se
parece mucho ms a buscar una
aguja en un pajar.

Pgina 18