Nmero ms probable (NMP) de coliformes totales y fecales

Prueba presuntiva y confirmativa

ngela Ruiz, Anglica Quiroz, Anglica cotacio, Carlos maje
Estudiantes Del IV semestre de Ingeniera De Alimentos
Bacteriloga docente, Paola Andrea Garca Rincn
Universidad De La Amazonia Avd. Circunvalar, Barrio Porvenir, Florencia
Caquet Colombia
Microbiologa de alimentos
Septiembre 2014
---------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------FICHA TECNICA
Toma de MX

llegada al laboratorio

Fecha : 25/09/14

fecha : 26/09/14

Hora : 5:00 pm

hora: 11:00 am

Marca del producto

Sitio de toma
Remitente
Descripcin de la muestra
Tipo de empaque
Tcnica de anlisis
Medio de cultivo
Tiempo de incubacin
Temperatura C
Resultado obtenido
INTRODUCCIN
Existen diversos mtodos para cuantificar el
nmero de microorganismos presentes en
muestras lquidas y slidas. Dentro de las
tcnicas ms comunes se encuentra el recuento
directo por microscopia de fluorescencia, as
como los procedimientos basados en diluciones
en serie, haciendo crecer microorganismos en
medios de cultivo sintticos slidos o lquidos,
como el recuento en placa de Unidades
Formadoras de Colonias (UFC) o la estimacin
por el mtodo del Nmero Ms Probable
(NMP).
Segn El mtodo del nmero ms probable fue
descrito por McCrady en 1915 y actualmente
sigue siendo ampliamente utilizado. En un
principio este mtodo fue empleado para

Fama la calea,exterior galera central

Jose ramirez
Carne de res cruda 10gr, sin refrigeracin,no
almacenamiento (expuesta al medio ambiente)y
color rojo negrusco opaco.
Sin empaque OBS:colgada en ganchos
NMP de coliformes totales y fecales
Agar EMB y caldo brilla
24 a 48h
35C+/- 2
Presencia de coliformes
estimar el nmero de microorganismos en
muestras de alimentos y aguas. Sin embargo, se
ha demostrado que tambin puede ser aplicado
para la determinacin de microorganismos
aerobios y anaerobios en lodos, sedimentos
marinos y suelos contaminados, por tanto este
mtodo es aplicable para estimar el nmero de
microorganismos en muestras de suelo y agua,
tanto para bacterias aerobias como anaerobias.
(Guedea, 2011)
Esta prctica se realiz con el objetivo Detectar
bacterias coliformes en carne y saber si la
muestra trada es apta para el consumo humano.

MARCO TEORICO

Debido a que un gran nmero de enfermedades

son transmitidas por va fecal-oral utilizando
como vehculo los alimentos y el agua, es
necesario contar con microorganismos que
funcione como indicador de contaminacin
fecal. Estos deben de ser constantes, abundantes
y exclusivos de la materia fecal, deben tener una
sobrevivencia similar a la de los patgenos
intestinales y debe de ser capaces de
desarrollarse extraintestinalmente.
De acuerdo con Camacho y otros (2009) El
grupo coliforme es constante, abundante y casi
exclusivo de la materia fecal, sin embargo, las
caractersticas de sobrevivencia y la capacidad
para multiplicarse fuera del intestino tambin se
observan en aguas potables, por lo que el grupo
coliforme se utiliza como indicador de
contaminacin fecal en agua; conforme mayor
sea el nmero de coliformes en agua, mayor
ser la probabilidad de estar frente a una
contaminacin reciente.
Cuando los coliformes llegan a los alimentos,
no slo sobreviven, sino que se multiplican, por
lo que en los alimentos el grupo coliforme
adquiere un significado distinto al que recibe en
el agua. En productos alimenticios que han
recibido un tratamiento trmico (pasteurizacin,
horneado, coccin, etc.), se utilizan como
indicadores de malas prcticas sanitarias.
(Camacho, y otros, 2009)
Segn Camacho (2009) Los microorganismos
coliformes constituyen un grupo heterogneo
con hbitat primordialmente intestinal para la
mayora de las especies que involucra.
El grupo de bacterias coliformes totales
comprende todos los bacilos Gram-negativos
aerobios o anaerobios facultativos, no
esporulados, que fermentan la lactosa con
produccin de gas en un lapso mximo de 48 h.
a 35C 1 1C. Este grupo est conformado por
4 gneros principalmente: Enterobacter,
Escherichia,
Citrobacter
y
Klebsiella.
(Camacho, y otros, 2009)
El grupo de coliformes fecales, est constituido
por bacterias Gram-negativas capaces de
fermentar la lactosa con produccin de gas a las
48 h. de incubacin a 44.5 0.1C. Este grupo
no incluye una especie determinada, sin
embargo la ms prominente es Escherichia coli.
(Camacho, y otros, 2009)
La demostracin y el recuento de organismos
coliformes, puede realizarse
mediante el

empleo de medios de cultivo lquidos y slidos

con caractersticas Selectivas y diferenciales.
Escherichia coli
Es un bacilo corto Gram negativo que se
encuentra clasificado dentro de la familia
Enterobacteriaceae (bacterias entricas), existe
como comensal en el intestino delgado de
humanos y animales. Sin embargo, hay algunas
cepas de E. coli patgenas que provocan
enfermedades diarreicas. Estas E. coli se
clasifican con base en las caractersticas que
presentan sus factores de virulencia nicos, cada
grupo provoca la enfermedad por un mecanismo
diferente. Las propiedades de adherencia a las
clulas epiteliales de los intestinos grueso y
delgado son codificadas por genes situados en
plsmidos. De manera similar las toxinas son
mediadas por plsmidos o fagos.
Este grupo de bacterias se encuentra constituido
por
las
siguientes
cepas:
E.
coli
enterotoxignica
(ETEC),
E.
coli
enteropatgena
(EPEC),
E.
coli
enterohemorrgica
(EHEC),
E.
coli
enteroinvasiva (EIEC), E. coli enteroagregativa
(EAEC) E. coli enteroadherente difusa (DAEC).
Existen otras cepas que no han
sido
perfectamente caracterizadas; de las cepas
anteriores, las 4 primeras estn implicadas en
intoxicaciones causadas por el consumo de agua
y alimentos contaminados. (Camacho, y otros,
2009)
Escherichia coli enterotoxignica ETEC
Es reconocida como el agente causal de la
diarrea del viajero, la cual se caracteriza por
diarreas acuosas con o sin fiebre. Este tipo de
infecciones es muy frecuente en pases
subdesarrollados y afecta principalmente a los
nios.
Patognesis: El microorganismo es capaz de
producir dos tipos de toxina. Una toxina
termolbil de aproximadamente 89 kDa cuya
secuencia, antigenicidad y funcin es similar a
la toxina del clera, la otra toxina que produce
es termoestable y es de bajo peso molecular (4
kDa) y es capaz de resistir temperaturas de
ebullicin hasta por 30 minutos.
La infeccin puede ser adquirida por el
consumo de alimentos como vegetales frescos
(lechuga en ensaladas) y agua. La dosis
infectiva para adultos ha sido calculada en
aproximadamente

108

bacterias, por otra

parte en jvenes y ancianos la dosis infectiva

puede ser ms baja. (Camacho, y otros, 2009)

colon debido a que es capaz de evadir la lisis en

los fagolisosomas. (Camacho, y otros, 2009)

Escherichia coli enteropatgena ECEP. Es

causa importante de diarrea en los lactantes
particularmente en los pases en vas de
desarrollo. La ECEP se adhiere a las clulas de
la mucosa del intestino delgado. Sus factores de
virulencia favorecen la adhesin y en ocasiones
penetra a las clulas mucosas. La infeccin por
ECEP provoca diarrea acuosa generalmente
autolimitada aunque en ocasiones puede ser
crnica.

Escherichia coli enterohemorrgica EHEC

produce verotoxina, denominada as por su
efecto citotxico sobre las clulas Vero, una
lnea de clulas renales de monoverde africano.
Existen al menos dos variantes antignicas de la
toxina. La ECEH se ha asociado con colitis
hemorrgica, una variedad grave de diarrea; y
con el sndrome urmico hemoltico,
enfermedad capaz de producir insuficiencia
renal
aguda,
anemia
hemoltica
microangioptica y trombocitopenia. La
verotoxina tiene muchas propiedades similares a
la toxina shiga producida por algunas cepas de
Shigella dysenteriae tippo 1; De los serotipos de
E. coli que producen la verotoxina el ms
comn y el nico que puede identificarse en
muestras clnicas es el O157:H7. La E. coli
O157:H7 no emplea sorbitol y es negativa a la
prueba de MUG.

Patognesis. El microorganismo produce dos

protenas: la intimina que es codificada por el
gen eae y un factor de adherencia que es
codificado por un plsmido, ambas protenas
permite su unin a los enterocitos y la
destruccin de
las microvellosidades
intestinales.
Las
epidemias
causadas
por
este
microorganismo se deben al consumo de agua
contaminada y productos crnicos. En estudios
con voluntarios se encontr que la dosis
infectiva es de

10

microorganismos. La

diarrea por ECEP se ha vinculado con mltiples

serotipos especficos de E. coli los cuales
pueden ser identificados mediante la tipificacin
del antgeno O (somtico) y en ocasiones del
antgeno H (flagelar). (Camacho, y otros, 2009)
Escherichia coli enteroinvasiva EIEC.

La causa ms comn de esta infeccin es el

consumo de carne sin cocinar o poco cocinada,
particularmente carne picada procesada en
grandes cantidades. Los casos de colitis
hemorrgica y sus complicaciones asociadas
pueden prevenirse mediante la coccin completa
de la carne (Camacho, y otros, 2009)
En la siguiente tabla se resumen algunas
propiedades y sntomas causados por las cepas
de Escherichia coli antes descritas.

Este
microorganismo
se
encuentra
estrechamente relacionado con el gnero
Shigella, produce una enfermedad similar a la
shigelosis. La enfermedad se presenta
comnmente
en
nios
de
pases
subdesarrollados y en personas que viajan a
dichos lugares. La EIEC provoca la enfermedad
(diarrea disentrica invasiva) al invadir las
clulas epiteliales de la mucosa intestinal.
A pesar de que la dosis infectiva para Shigella
es de 10 a 100 microorganismos, en el caso de
EIEC la dosis infectiva es de aproximadamente
6

10

bacterias.

Algunas

caractersticas

importantes de este microorganismo que

permiten diferenciarlo de la cepa tpica de E.
coli son: No utiliza la lactosa como fuente de
carbono, no descarboxilan la lisina, es inmvil y
anaerogenicos.
La patogenicidad de este organismo se debe a su
capacidad para invadir y destruir el epitelio del

Fuente: (Camacho, y otros, 2009)

Nmero ms probable ( NMP) de bacterias;

tres tubos por cada dilucin

Fuente:
international
comisin
on
microbiological specifications for foods
2000.microoganismos de los alimentos 1.
Editorial
acribial.
Segunda
edicin.
Volumen1. Pg. 133-134.
MATERIALES Y MTODOS
Los materiales utilizados en la prctica fueron: 3
pipetas estriles, caja de Petri, Erlenmeyer, 9
tubos tapa rosca, mortero, asas recta y redonda,
carne. Bolsas ziploc, Agua peptonada.

Grupo 2

Grupo 3

Grupo 1

Los medios de cultivo utilizados fueron (caldo

brilla y agar, EMB ( Eosina Metil Blue)
Se prepar el sitio de trabajo con una previa
desinfeccin. Se procedi macerando la carne y
luego se prepararon tres disoluciones con
material macerado posteriormente se realizaron
las respectivas siembras de cada dilucin en
caldo Brilla y se incubo a 35C 2 por 24-48
horas.
A los tubos que presentaron turbidez y/o
formacin de gas se le realizo la prueba
confirmativa, Con un asa redonda, se tom una
asada de los tubos positivos se sembr por
aislamiento en una caja de Petri con Agar VRB
(Rojo Neutro, Bilis, Agar) y se encubo a 35C
2C por 24 horas.

RESULTADOS
PRUEBA PRESUNTIVA
Figura 1: tubos antes y despus de sembrados
en el caldo Brilla.

De los tubos sembrados en el caldo Brilla se

obtuvo los siguientes resultados
para
coliformes totales:
DILUCIONES
Grupos
1
2
3
Total

10

10

10

+
+
+
3

+
+
+
3

+
+
+
3

Para coliformes totales el triplete de valores

obtenido es: 3, 3,3 y consultando la tabla del
NMP nos da un valor mayor de 11.000
NMP de coliformes totales = 11.000/100 mL

.PRUEBA CONFIRMATIVA
MACROSCOPIA
Figura 2: macroscopia de los tubos positivos
sembrados en caldo brilla.

figura 4 :microscopia de lacaja de peri103

102

103
104

figura 5 :microscopia de lacaja de peri10

MICROSCOPIA (100 X)

DISCUSIN
En la prueba presuntiva todos los tubos dieron
positivos por que presentaron turbidez y
presencia de gas, obteniendo un ndice
del NMP para la muestra de carne
de
11.000 bacterias/100 mL.

figura 3 :microscopia de lacaja de peri10

Para realizar la prueba confirmativa se sembr

en agar EMB ( Eosina Metil Blue) luego de la
incubacin de por 24 horas se apreciaron
colonias de color verde metalico en los bordes
de las estra con puntos negros en la dilucin

102 y en la dilucin 103

104

(vase figura 2) se apreciaron colonias de color

marrn en forme de punticos en las estras. En
las microscopia de la dilucin
3

10

10

102

(vase figura 3, 4 y 5),

se aprecia bacilos gran negativos.

Segn Ramrez (2011) Las colonias de E. Coli

en agar E.M.B. (eosina y azul de metileno)
tienen 2 a 4 mm de dimetro, un centro grande
de color oscuro e incluso negro, y tienen brillo
verde metlico cuando se observan con luz
refleja. aunque hay otras bacterias que logran
producir este color muy tenue y escaso. Con
relacion a Ramrez (2011) y segn los resultados
obtenidos podemos decir que obtuvimos
colonias tpicas de E. Coli, pero para tener
seguridad de su especie se debi hacer ms
pruebas, porque hay otras bacterias que tienen
la capacidad de producir el mismo color, por lo
tanto podemos decir que son del genero
Escherichia.

2. cules son los componentes de los medios

EMB y VRB y cual es le funcionamiento de
cada uno de ellos ?
Rta:
Agar EMB
Frmula (en gramos por
litro)

Peptona

10.0

Lactosa

5.0

Sacarosa

5.0

Fosfato dipotsico

2.0

CONCLUSION
Podemos concluir con respectos a los objetivos
que la determinacin coliformes fecales y
totales pueden estar presentes en el agua como
en los alimentos ya que estos microrganismo se
pueden trasmitir por las haces fecales.
En la muestra de carne que se trabaj se
encontr bacterias del genero Escherichia por
tanto la carne est contaminada y no est apta
para el consumo humano.

Agar

13.5

Eosina

Instrucciones

Suspender 36 g del polvo

en un litro de agua
destilada. Reposar 5
minutos; mezclar,
calentando a ebullicin
durante 1 o 2 minutos
hasta su disolucin.
Esterilizar en autoclave a
no ms de 121C durante
15 minutos. Enfriar a
45C y distribuir agitando
suavemente.

0.4

Azul de metileno

0.065

pH final: 7.2 0.2

CUESTIONARIO:
1. Cul es el fundamento bioqumico de la
prueba triptonasa?
Rta: El indol es un compuesto que se genera
mediante
la
desaminacin
reductiva
del triptfano y esta reaccin es llevada a cabo
por algunas bacterias que poseen las enzimas
denominadas en su conjunto triptofanasas. Para
detectar la produccin de indol se utiliza el
medio Caldo triptfano y la lectura de la prueba
se realiza con el reactivo de Kovacs (alcohol
isoamilo, p-dimetilaminobenzaldehdo y cido
clorhdrico concentrado) con
el
que
el
indol producido reacciona
generando
una
coloracin rosa intensa.

Agar VRB
Frmula (en gramos por litro)

Instru
Extracto de levadura

3.0

Peptona

7.0

Sales biliares

1.5

Lactosa
Cloruro de sodio

10.0
5.0

Agar

15.0

Rojo neutro

0.03

Suspender 41,5 g del polv

destilada. Reposar 5 minu
a ebullicin 1 o 2 minutos
en placas. Una vez prepa
inmediato. NO AUTOCLAV

Cristal violeta

0.002
pH final: 7.4 0.2

3. Cul es la diferencia de entre coliformes

totales y fecales?
Rta:
coliformes totales
Comprende todos los
bacilos
Gramnegativos aerobios o
anaerobios
facultativos,
no
esporulados,
que
fermentan la lactosa
con produccin de gas
en un lapso mximo
de 48 h. a 35C 1
1C. Este grupo est
conformado por 4
gneros
principalmente:
Enterobacter,
Escherichia,
Citrobacter
y
Klebsiella.

coliformes fecales
Est constituido por
bacterias
Gramnegativas capaces de
fermentar la lactosa
con produccin de gas
a las 48 h. de
incubacin a 44.5
0.1C. Este grupo no
incluye una especie
determinada,
sin
embargo
la
ms
prominente
es
Escherichia coli

BIBLIOGRAFA

Camacho, A., Giles, M., Ortegn,

A., M, P., Serrano, B., &
Velzquez, O. (2009).
Mtodo para la
determinacin de bacterias
coliformes, coliformes
fecales y Escherichia coli
por la tcnica de diluciones
en tubo mltiple (Nmero
ms Probable o NMP).
Recuperado el 18 de 10 de
2014, de
http://depa.fquim.unam.mx/

amyd/archivero/TecnicBasic
as-Colif-tot-fecales-EcoliNMP_6529.pdf.
Guedea, R. M. (2011).
DETERMINACION DE
COLIFORMES TOTALES Y
FECALES. Recuperado el 18
de 10 de 2014, de
http://jfklsdgvegh.blogspot.c
om/2011/10/determinacionde-coliformes-totales-y.html.
Ramrez., A. R. (2011). Escherichia
coli. Recuperado el 18 de 10
de 2014, de
http://www.uv.mx/personal/s
bonilla/files/2011/06/escheri
chia-coli-i.pdf.