Академический Документы
Профессиональный Документы
Культура Документы
FACULTAD DE QUMICA
TESIS
Que como parte de los requisitos para obtener el grado de
MAESTRO EN CIENCIA y TECNOLOGIA DE ALIMENTOS
Presenta:
I.B.Q Amelia Ros Castro
Dirigido por:
Dr. Eduardo Castao Tostado
ii
RESUMEN
El cido lctico es utilizado en la industria alimentaria como acidulante,
conservador, saborizante y agente controlador de pH o inhibidor de deterioro
bacteriano. Puede ser producido por fermentacin de subproductos provenientes
de procesos alimenticios; entre los que destaca el suero lcteo debido a la gran
cantidad de lactosa que contiene, la cual es una buena fuente para el crecimiento
de Lactobacillus casei. La tecnologa de membranas de nanofiltracin ha
demostrado ventajas en el rea de la filtracin y separacin, puede ser aplicada
para separar, concentrar y purificar cidos orgnicos. Por otra parte, la modelacin
matemtica de procesos biolgicos es una herramienta que resulta muy til para
estudiar el comportamiento de un sistema. El objetivo de este trabajo fue
caracterizar la produccin y separacin de cido lctico a partir de la fermentacin
de suero lcteo mediante la tecnologa de membrana. Se estudiaron las mejores
condiciones de crecimiento para Lb. casei (ATCC334) usando diferentes
concentraciones de lactosa (20, 30, 40 50 g/L) en el suero lcteo suplementado y
diferentes porcentajes de inculo inicial (1, 5, 10, 20) en dos fases de crecimiento,
exponencial y estacionaria. Las fermentaciones para la produccin de cido lctico
se realizaron en un proceso tipo lote a diferente pH. Las mejores condiciones para
el crecimiento de Lb. casei fueron 50 g/L de sustrato con 1% de inculo en fase
estacionaria o 1% de inculo en fase exponencial, con estas condiciones se
alcanzaron alrededor de 9.3 log UFC/ml despus de 18 h. La fermentacin
realizada a pH de 6.0 logr la mayor productividad (2.08 g/L h) y la mayor cantidad
de biomasa y de cido lctico, 1.15 g/L y 25.010.27 g/L, respectivamente. Se
probaron dos membranas de nanofiltracin para la separacin de cido lctico (CK
y TFC-SR3) y su funcionamiento fue evaluado mediante la recuperacin de cido
lctico y lactosa en el permeado. La membrana CK tuvo una alta recuperacin de
ambos compuestos, lactosa (83.70%) y cido lctico (88.77%), por otro lado, la
membrana TFC-SR3 mostr una baja recuperacin de lactosa (4.11%) y un alto
porcentaje de cido lctico (75.07%). Se aplic un modelo matemtico propuesto
por Altiok et al. (2006) a los datos experimentales; dicho modelo no logr un buen
ajuste para la formacin de biomasa, formacin de producto y consumo de
sustrato, por ello fue necesario estudiar modelos adicionales. Los resultados
sugieren que el suero lcteo suplementado es un buen sustrato para el
crecimiento de Lb. casei y produccin de cido lctico y que la tecnologa de
nanofiltracin puede ser usada para concentrar y purificar el cido lctico.
iii
SUMMARY
The lactic acid is used in the food industry as an acidulant, preservative, flavoring
and pH buffering agent or inhibitor of bacterial spoilage. It can be produced by
fermentation from food processing industry wastes; among them, the milk whey is
stands out because its high quantity of lactose, which is an excellent source for
Lactobacillus casei growth. The nanofiltration membranes technology has
demonstrated advantages in the area of filtration and separation, it can be applied
in order to separate, concentrate and purify organic acids. On the other hand, the
mathematical modelling of biological processes is a useful tool for studying
systems behavior. The aim of this study was to characterize the lactic acid
production and separation by fermentation from milk whey using the membrane
technology. The best conditions for Lb. casei (ATCC334) growth were studied
using different concentrations of lactose in the supplemented milk whey (20, 30, 40
50 g/L) and different percentages of initial inoculum (1, 5, 10, 20) in two growth
stages, exponential and stationary. The fermentations for lactic acid were carried
out in batch processes at different pH. The best conditions for Lb. casei growth
were 50 g/L with 1% of inoculum in stationary stage or 1% of inoculum in
exponential stage, with these conditions 9.3 log (UFC/ml) were reached after 18 h.
The fermentation obtained at pH 6.0 attained the highest yield (2.08 g/L h) and the
highest quantities of biomass and lactic acid 1.15 g/L y 25.01 0.27 g/L
respectively. Two nanofiltration membranes (CK y TFC-SR3) were tested for lactic
acid separation and their performance was evaluated trough the lactic acid and
lactose recovered in the permeate. The CK membrane had a high recovery for
both, lactose (83.70%) and lactic acid (88.73%), otherwise, the TFC-SR3
membrane showed a low lactose recovery (4.11%) and a high lactic acid recovery
(75.07%). A mathematical model proposed by Altiok et al., (2006) was applied to
the experimental data, this model did not achieve a good fitting for the microbial
growth, product formation and substrate consumption, hence, the study of
additional models was necessary. The results suggest that supplemented milk
whey is a good substrate for Lb. casei growth and lactic acid production and that
membrane technology can be used for lactic acid concentration and purification.
(Key words: lactic acid, milk whey, Lb. casei, nanofitlration membrane.)
iv
DEDICATORIA
AGRADECIMIENTOS
Agradezco principalmente este logro a los seres que me han dado la vida, mis padres: Mara
de la Luz y Miguel. Quienes han estado dispuestos a dar todo por m. Ambos son el mayor
ejemplo de lucha y esfuerzo que pueda poseer. Gracias por todo, por apoyarme en mis
decisiones, compartir mis alegras y tristezas y por ser siempre un motivo de inspiracin para
mi vida. Tal vez no existen palabras que pueden definir lo que significan para m. LOS
AMO. Gracias por todo el amor, el apoyo y la confianza incondicional que siempre me han
tenido, este triunfo tambin es suyo.
Al Dr. Eduardo Castao, gracias por haberme aceptado como su alumna, por sus
enseanzas, por su buena asesora durante la realizacin de este proyecto a travs de estos
dos aos y por ayudarme a concluir mi trabajo de tesis satisfactoriamente.
Al Dr. Carlos Regalado y a la Dra. Blanca Garca, gracias por brindarme su apoyo, por
permitirme trabajar en sus laboratorios cuando lo requer y por sus siempre valiosas
aportaciones para la mejora de este trabajo.
A la Dra. Silvia Amaya, por todo el apoyo ofrecido y facilidades otorgadas a lo largo de
este periodo para llevar a cabo el trabajo experimental y ayudarme a hacer posible la
estancia de investigacin en el extranjero.
A la Dra. Sofa Arviz, por el soporte brindado en la parte microbiolgica del presente
proyecto y por su disposicin incondicional mostrado hacia este proyecto en todo momento.
A la Dra. Ana Bertha Cardador, por permitirme trabajar en su equipo de HPLC, el cual
fue de suma importancia para el anlisis de mis muestras.
Al Dr. Lech Ozimek, por haberme aceptado en su laboratorio de la Universidad de Alberta,
Canad y de esta forma, adems de permitirme concluir mi parte experimental, tuve la
oportunidad de vivir una gran experiencia de mucho aprendizaje acadmico, cultural y
personal.
A Juan Manuel, mil gracias por acompaarme durante esta importante etapa de mi vida, y
por estar siempre dispuesto a brindarme tu apoyo incondicional.
A mis amigos y compaeros de la maestra, generacin 2009-2011, gracias por haber
compartido esta inolvidable experiencia, los quiero
A todo el personal administrativo del posgrado, en verdad que son parte esencial para que la
elaboracin de un trabajo de tesis concluya apropiadamente.
A todos aquellos que se me ha olvido mencionar, pero que hicieron posible de alguna u otra
forma y que ayudaron para que la realizacin de este trabajo de investigacin se llevara a
cabo de manera satisfactoria, mil gracias. Finalmente hemos terminado.
NDICE GENERAL
RESUMEN
SUMMARY
iv
DEDICATORIA
AGRADECIMIENTOS
vi
NDICE GENERAL
vii
NDICE DE CUADROS
xi
NDICE DE FIGURAS
xii
1. INTRODUCCIN
2. ANTECEDENTES
2.1.1 Generalidades
2.1.2 Usos
2.2.1 Definicin
10
2.3.1 Generalidades
10
2.3.2 Metabolismo
10
14
14
15
vii
15
2.3.5.2 Micronutrientes
15
16
2.3.5.4 Temperatura
17
2.3.5.5 pH
17
18
2.4.1 Generalidades
18
19
19
19
20
20
20
2.5.1 Fundamentos
20
22
23
24
24
25
26
26
27
2.6.1 Generalidades
27
28
29
30
3. JUSTIFICACIN
34
4. OBJETIVOS
35
35
viii
35
5. MATERIALES Y MTODOS
36
36
5.1.1 Microorganismo
36
36
36
5.2 Mtodos
37
37
37
38
41
41
41
42
42
42
44
6. RESULTADOS Y DISCUSIN
45
45
52
53
61
64
71
6.6.1 Determinacin de mx y KS
71
ix
74
7. CONCLUSIONES
80
8. BIBLIOGRAFIA
81
ANEXO A
89
ANEXO B
91
ANEXO C
97
NDICE DE CUADROS
Cuadro
Pgina
16
27
32
40
60
71
71
74
xi
NDICE DE FIGURAS
Figura
Pgina
Molcula de lactosa.
12
13
22
39
39
Cintica de Monod.
43
10
46
47
11
48
12
13
14
49
15
48
50
16
50
xii
53
17
18
55
19
56
20
57
63
21
67
22
68
23
68
24
69
25
69
26
70
27
70
28
29
72
30
31
75
32
72
76
76
33
34
35
78
79
xiii
1. INTRODUCCIN
A travs de bioprocesos pueden obtenerse productos con un alto valor
comercial, como lo es el cido lctico, utilizado en las industria alimentaria como
acidulante, conservador, saborizante y agente controlador de pH, tambin tiene
aplicaciones en la industria farmacutica, textil, cosmtica y en la produccin de
polmeros biodegradables (Datta y Henry, 2006; Liu et al., 2010). En los ltimos
aos ha habido diversas investigaciones en el desarrollo de procesos para la
produccin de cido lctico con la finalidad de hacer posible un proceso ms
efectivo y econmico.
La conversin biolgica tiene un papel importante en el manejo de
subproductos industriales provenientes de procesos alimentarios ya que estos
subproductos contienen sustratos aprovechables para la generacin de productos
con valor agregado (Rojan et al., 2007). La disposicin de las grandes cantidades
de suero lcteo generado por las industrias queseras en todo el mundo representa
un problema debido a que el suero lcteo no debe ser drenado sin ningn
tratamiento debido a la gran cantidad de materia orgnica que contiene, en la que
destaca la lactosa, que es un sustrato altamente fermentable por los
microorganismos para la produccin de cido lctico (Ghaly y Kamal, 2004;
Schepers et al., 2006). El cido lctico puede ser obtenido a partir de la
fermentacin del suero lcteo por bacterias cido lcticas, como Lactobacillus
casei y el proceso puede ser realizado en fermentaciones tipo lote.
En la actualidad se estn buscando nuevas formas de separar el cido
lctico del caldo de fermentacin una vez terminada la etapa de fermentacin. Una
aplicacin novedosa, es el uso de un mdulo de membrana, por medio del cual es
posible separar el cido lctico. La tecnologa de membranas ha mostrado sus
ventajas en los campos de la separacin y filtracin y recientemente ha habido un
mayor inters hacia la separacin de los procesos de membrana porque son ms
eficientes en cuanto a capital y a costos cuando son comparados con los procesos
tradicionales de separacin.
que
resulta
muy
til
para
realizar
predicciones
sobre
el
2. ANTECEDENTES
2.1 cido Lctico
2.1.1 Generalidades
El cido lctico o cido 2-hidroxipropanoico (Figura 1), fue descubierto en
1780 por el qumico sueco Scheele, quien lo aisl de leche agria, fue reconocido
como producto de fermentacin por Blondeaur en 1847 y en 1881 Littlelon inicia la
fermentacin a escala industrial (Tong et al., 2004; Serna y Rodrguez, 2005).
2.1.2 Usos
El cido lctico es comnmente reconocido como uno de los cidos
orgnicos ms verstiles por un amplio uso en la industria farmacutica,
alimentaria y en la qumica (Diosady y Puzanov 2005; Li et al., 2009).
Tradicionalmente, el principal uso del cido lctico ha sido en aplicaciones
alimentarias, lo cual en Estados Unidos representa el 85% del total de la
demanda, y el resto es usado en aplicaciones no alimentarias. Como acidulante
para alimentos, el cido lctico tiene un sabor cido suave, en contraste con otros
cidos. Es no voltil y no tiene olor y es clasificado como GRAS para propsitos
generales de aditivos alimentarios por la FDA en Estados Unidos y por otras
agencias reguladoras de otros pases. Es un buen agente conservador para
vegetales. Es usado como acidulante, saborizante, agente controlador de pH o
como inhibidor de crecimiento microbiano en una amplia variedad de productos
procesados. Un alto porcentaje (>50%) del cido lctico usado en alimentos se
usa para producir agentes emulsificantes usados particularmente en la industria
del pan. Los agentes emulsificantes son steres de sales de lactato con largas
cadenas de cidos grasos (Datta y Henry, 2006; Rojan et al., 2009).
Algunos ejemplos de productos derivados del cido lctico que han tenido
una gran demanda en los ltimos aos, son: termoplsticos biodegradables (cido
polilctico), solventes verdes (etil, propil, butil) y qumicos oxigenados (glicol de
propileno). Por la presencia nica de un grupo hidroxilo y un cido carboxlico, el
cido lctico puede participar en una amplia variedad de reacciones qumicas
como esterificacin, condensacin, polimerizacin, reduccin y sustitucin y esto
contribuye a su gran potencial como plataforma qumica para todo un rango de
productos que tienen grandes usos en la produccin industrial (Pal et al., 2009;
Young-Jung y Ryu, 2009).
se
puede
producir
partir
de
diferentes
sustratos
Slidos Totales
Lactosa
Protenas
Calcio
Fsforo
Lactato
Cloruro
63-70
46-60
6-10
0.4-0.6
1-3
2
1.1
63-70
44-46
6-8
1.2-1.6
2-4.5
6.4
1.1
Leuconostoc,
Oenococcus,
Pediococcus,
Streptococcus,
Tetragenococcus,
Vagococcus
Aerococcus,
y
Weisella.
es un sistema de
11
12
13
depende
de
la
cepa,
algunas
presentan
un
metabolismo
14
debido
que
es un
constituyente
de
la
enzima
lactato
Concentracin de
% Inculo ( v/v),
Productividad
sustrato (g/L)
Etapa de
mxima de cido
crecimiento
lctico (g/L h)
20%, Fase
4.1
Hujanen y Linko
70 g de glucosa
(1996)
Exponencial
Bykkileci y Harsa
48 g de lactosa
(2004)
Altiok et al. (2006)
5%, Fase
1.7
Estacionaria
35.5 g de lactosa
12.5%,Fase
2.5
Estacionaria
Alonso et al. (2010)
21.5 g de lactosa,
10%, Fase
18.1 g de glucosa,
Exponencial
0.76
19.0 g de sacarosa
2.3.5.5 pH
La concentracin de iones hidrgeno es un parmetro importante que
tiene un fuerte efecto en la produccin de cidos orgnicos formados durante
procesos fermentativos debido a que cuando se acumulan en gran cantidad en el
caldo de fermentacin inhiben el crecimiento del microorganismo.
Para controlar el pH durante la fermentacin, agentes neutralizantes tales
como el carbonato de calcio, el carbonato de sodio y el hidrxido de sodio se
deben agregar en el medio de fermentacin. Entre estos agentes, el carbonato de
calcio ha sido ampliamente usado en investigaciones a nivel matraz y a nivel
biorreactor. El hidrxido de sodio as como el hidrxido de amonio tambin han
sido usados en investigaciones previas (Zhang et al., 2007; Qin et al., 2010). Se
ha mostrado que para una rpida y completa fermentacin, el intervalo de pH
ptimo para Lb. casei es 5.5-6.5. La fermentacin es fuertemente inhibida a pH
17
de
metabolitos
cambia
generalmente
como
resultado
del
19
21
Algunos requerimientos bsicos para las membranas son: alto flujo del
producto, una fuerza mecnica buena para soportar la estructura fsica y una
selectividad adecuada para las sustancias que se desean separar. Generalmente,
la alta selectividad est relacionada con las propiedades de la membrana, tales
como el tamao del poro o permeabilidad. La permeabilidad incrementa cuando
incrementa la densidad de los poros, y la resistencia de la membrana es
directamente proporcional a su grosor. Adems, una buena membrana debe de
tener un estrecho rango del tamao del poro y una alta porosidad (Chen et al.,
2009).
presin) o un potencial elctrico (Chen et al., 2009). Su espesor puede variar entre
menos de 100 nm a ms de 1 cm. La resistencia elctrica puede variar de varios
megaohms (M a una fraccin de un (Sastre et al., 2009).
membranas
ms
ampliamente
usadas
son
las
membranas
ser considerada con un paso de concentracin. Por otra parte puede constituir un
paso de purificacin en el caso de cidos orgnicos de bajo peso molecular. Se ha
mostrado, por ejemplo, que la nanofiltracin es un mtodo apropiado para el
procesamiento del caldo de fermentacin del acetato de sodio debido a su
capacidad para permitir el paso del acetato mientras se retienen los nutrientes,
como la glucosa, que pueden ser recirculados al caldo de fermentacin (Bouchoux
et al., 2005).
2.5.4.3 Ultrafiltracin (UF)
Las membranas de ultrafiltracin tienen en promedio un tamao de poro
mucho menor que las membrana de microfiltracin, son capaces de retener
componentes en el rango de 1-1000kDa de peso molecular, con tamaos de poros
de 0.001-0.1m y operan entre 10 y 100 psig de presin. Las especies de rechazo
tpicas incluyen azcares, biomolculas, polmeros y partculas coloidales (Chen et
al., 2009). Una aplicacin tpica de las membranas de ultrafiltracin es la filtracin
de macromolculas disueltas de una solucin como sucede en la concentracin
de protenas del suero lcteo. Dependiendo del tipo de protena a retener, son
usados MWCO de la membrana en el rango de 1kDa a 1000kDa. Con la
ultrafiltracin es posible llevar a cabo separaciones de protena-protena basadas
en el tamao y la carga, resultando una purificacin similar a la cromatografa
(Walstra et al., 2006).
2.5.4.4 Microfiltracin (MF)
Las membranas de microfiltracin tienen el tamao de poro ms grande
de la categora de membranas. Las aplicaciones ms comunes son la remocin de
clulas microbianas y la separacin de macromolculas. La microfiltracin puede
separar clulas microbianas para su subsecuente recirculacin a un biorreactor
para asegurar la alta concentracin de clulas y de esta manera lograr una
productividad alta. El tamao de poro de la membrana usado para este tipo de
separacin se encuentra normalmente en el rango de 0.1-5.0m alta y utiliza
presiones entre 10-25 psig. (Lee y Koros, 2004; Pal, et al., 2009).
26
Presin
(psig)
100-1500
1 nm
100-500
Ultrafiltracin
0.001-0.1m
10-100
Microfiltracin
0.1-5.0 m
10-25
Tipo de
membrana
smosis
Inversa
Nanofiltracin
Aplicaciones
Remocin de sales,
iones metlicos
Recuperacin de
cidos orgnicos,
azcares
Separacin de
macromolculas, tales
como protenas
Separacin de clulas
microbianas,
tratamiento de agua
residual
para predecir el
las predicciones
hechas por el modelo con los datos del sistema real. Si el modelo y el sistema
concuerdan, significa que las suposiciones hechas en la creacin del sistema son
razonables y se puede usar el modelo para realizar predicciones. Sin embargo, si
27
(3)
simple de la ecuacin de
(4)
(5)
2.6.4 Modelacin matemtica de produccin de cido lctico
Con relacin a la produccin de cido lctico, se han usado modelos
matemticos para predecir la influencia de los parmetros de operacin de la
fermentacin en la velocidad de crecimiento celular, en la concentracin de
clulas, en la velocidad de utilizacin de sustrato y velocidad de produccin de
cido lctico; dichos modelos pueden tomar en cuenta el efecto de la limitacin de
sustrato, la inhibicin por sustrato y la inhibicin por producto, as como tambin la
muerte celular en el crecimiento y metabolismo microbiano. El uso de estos
modelos puede guiar al desarrollo de mejores estrategias para la optimizacin de
los procesos de fermentacin (Tango y Ghaly, 1999) y la mayora de ellos han sido
desarrollado principalmente para sustratos puros, sin embargo, se han reportado
algunos estudios cinticos para sustratos como melaza, almidn, harina de trigo y
suero de queso para la produccin de cido lctico por fermentacin (Anjana y
Kumar, 2008).
30
(6)
(7)
(8)
31
) (
(9)
Xmx
Pmx
f
h
Datos experimentales
Datos experimentales
No reportado
No reportado
No aplica
No aplica
No aplica
No aplica
No reportado
mS
No reportado
mx
KS
32
33
3. JUSTIFICACIN
pretende
encontrar
un
modelo
matemtico
que
permita
predecir
34
4. OBJETIVOS
4.1 Objetivo general
Caracterizar el proceso de obtencin de cido lctico a partir de la
fermentacin de suero lcteo por Lactobacillus casei y su separacin utilizando la
tecnologa de membranas.
3. Evaluar la separacin del cido lctico del caldo de fermentacin por medio
de la tecnologa de membranas de nanofiltracin.
35
5. MATERIALES Y MTODOS
5.1 Material Biolgico
5.1.1 Microorganismo
Se emple una cepa de Lactobacillus casei (ATCC334) obtenida de la
Coleccin de Cultivos Tipo Americano. La cepa se conserv en caldo soya
tripticasena (Bioxon) adicionado de glicerol (15%) a -20C.
5.2 Mtodos
5.2.1 Evaluacin del nivel de inculo y concentracin de lactosa sobre el
desarrollo de Lb. casei
Las cinticas de crecimiento para Lb. casei se llevaron a cabo a partir de
diferentes concentraciones de lactosa en suero lcteo (20, 30, 40, 50 g/L) y de
diferentes porcentajes de inculo inicial (1, 5, 10, 20 v/v) en fase de crecimiento
exponencial y estacionaria, el experimento se realiz en un sistema de monitoreo
automtico Bioscreen. Se distribuyeron 270l del medio de cultivo a base de suero
lcteo con las diferentes concentraciones de lactosa en las placas del equipo y
enseguida se inocularon 30 l de las suspensiones con diferentes concentraciones
de la cepa activada y lavada, cada tratamiento se realiz por triplicado y se incluy
como control negativo (300l) de los medios sin inocular. El equipo fue
programado para realizar lecturas cada 20 min a 37C a 600 nm durante 48 h. La
densidad ptica registrada por el equipo se relacion con las UFC a partir de una
curva de calibracin realizada en el mismo equipo.
membranas de nanofiltracin en la
38
en donde:
C.L.P=Cantidad de lactosa en el permeado (concentracin * volumen).
C.L.A= Cantidad de lactosa en el flujo de alimentacin (concentracin * volumen).
en donde:
C.A.L.P= Cantidad de cido lctico en el permeado (concentracin x volumen).
C.A.L.A= Cantidad de cido lctico en el flujo de alimentacin (concentracin x
volumen).
Material de la
capa superior
Tipo de
Superficie
Tamao
de poro
(MWCO)
Presin
(psig)
Hidrofobicidad
TFC-SR3
Aleacin de
Globular
200
100-500
Baja
Rugosa
100-500
Alta
poliamida
CK
Acetato de
celulosa
40
ZORBAX
41
42
(14)
Una vez obtenidas las velocidades de crecimiento se aplico un ajuste no
lineal de la ecuacin de Monod (Figura 8) mediante el programa estadstico JMP
5.0.1 para obtener la estimacin de los paramtros.
43
44
6. RESULTADOS Y DISCUSIN
45
46
47
48
Figura 13. Log (UFC/ml) de crecimiento microbiano a las 20 h para los inculos
agregados en fase estacionaria en las diferentes concentraciones de sustrato.
49
Figura 14. Log (UFC/ml) de crecimiento microbiano a las 20 h para los inculos
agregados en fase exponencial en las diferentes concentraciones de sustrato.
50
51
52
Figura 16. Produccin de cido lctico a travs del tiempo a partir de las mejores
condiciones obtenidas para el crecimiento del microorganismo.
en el
54
55
56
57
58
contener lactosa, contiene gran cantidad de glucosa y fructosa, lo que provoca que
el microorganismo los asimile de manera distinta.
Cabe destacar que aunque la cantidad de cido actico como posible
subproducto formado durante la fermentacin del suero lcteo no fue medida en
esta investigacin, se ha reportado que el Lb. casei no es productor de cido
actico a partir de la fermentacin de suero lcteo en procesos tipo lote (Fajardo
et al., 2008).
Es importante mencionar que los resultados obtenidos para la condicin de
pH controlado a 6.5 no fueron los esperados, Bykkileci y Harsa en el 2004
reportaron que el Lb. casei tiene un rango de crecimiento ptimo de 5.5-6.5 por lo
que se esperaba una mayor produccin de cido lctico para el valor de pH de
6.5. La falta de crecimiento del microorganismo y de produccin de cido lctico
se atribuye a que la cantidad de CaCO3 agregada alcanz una concentracin
crtica lo que provoc el fenmeno de floculacin en el caldo de fermentacin que
se puede presentar a altas concentraciones de lactato de calcio; este fenmeno
causa que la masa se
Fermentacin con
pH controlado (6.5)
Fermentacin sin
control de pH
25.01
6.71
12.45
Productividad
(g/L h)
2.08
1.03
0.55
Biomasa (g/L)
1.15
0.99
1.08
Lactosa inicial
(g/L)
40.19
42.19
42.59
Lactosa final(g/L)
11.16
29.96
23.27
Y P/S (g/g)
0.84
0.54
0.64
Y P/X (g/g)
0.014
0.022
0.018
60
62
63
64
que la
presencia de grupos OH. Por lo anterior, se puede decir que los grupos OH de la
molcula de lactosa tiene una alta afinidad por el material hidroflico del que est
fabricada la membrana TFC-SR3 y por consecuencia hay una mayor retencin de
este compuesto, mientras que el cido lctico por su carcter menos hidroflico
tiene una menor afinidad por la membrana y por consecuente pasa con mayor
facilidad la membrana, obtenindose una mayor cantidad de este compuesto en el
permeado. Esto aunado a que el cido lctico tiene un tamao menor que el poro
de la membrana lo que permite tambin su paso a travs de la membrana. Por
otro lado, se piensa que la membrana CK por su carcter hidrofbico es incapaz
de retener ambos compuestos, a pesar de que el tamao de poro nominal
reportado por el proveedor sea de 0 MWCO.
67
68
69
70
Estimacin
Error estndar
Lmite inferior
Lmite superior
umx
KS
0.0285
6.7299
0.0024
3.2339
0.0240
0.9107
0.0349
15.7255
Estimacin
Error estndar
Lmite inferior
Lmite superior
umx
KS
0.0247
6.6866
0.0015
2.4345
0.0216
2.0245
0.0287
13.1832
71
Figura 28. Ajuste de los datos experimentales a la ecuacin de Monod con las
velocidades especficas obtenidas a partir de la ecuacin 13.
Figura 29. Ajuste de los datos experimentales a la ecuacin de Monod con las
velocidades especficas obtenidas a partir de la ecuacin 14.
72
73
Microorganismo
Sustrato
mx (h-1)
KS (g/L)
Altiok et al.
(2006)
Tango y Ghaly
(1999)
Fu y Mathews
(1999)
Kumar et al.
(1996)
Idris y Suzana
(2006)
Lb. casei
Suero lcteo
0.265
0.72
Lb. helveticus
Suero lcteo
0.25
0.90
Lb. plantarum
Lactosa
0.364
44.4
Lb. delbrueckii
Glucosa
0.0696
0.0967
Lb. delbrueckii
Residuo
lquido de
pia
Suero lcteo
0.0903
9.26
0.024
6.68
En el presente
trabajo
Lb. casei
74
1.2
Biomasa 6.0
1.1
1
0.9
0.8
0.7
-5
10
15
Tiempo
20
25
30
Figura 30. Perfil de la formacin de biomasa a travs del tiempo para la condicin
de pH controlado a 6.0.
75
45
Sustrato 6.0
40
35
30
25
20
15
10
-5
10
15
Tiempo
20
25
30
Figura 31. Perfil del consumo de sustrato a travs del tiempo para la condicin de
pH controlado a 6.0.
30
25
20
15
10
5
0
-5
10
15
Tiempo
20
25
30
Figura 32. Perfil de la produccin de cido lctico a travs del tiempo para la
condicin de pH controlado a 6.0.
76
Biomasa 6.0
1.1
1
0.9
0.8
0.7
-5
10 15
Tiempo
20
25
30
77
30
25
20
15
10
5
0
0.7
0.8
0.9
1
1.1
Biomasa 6.0
1.2
(19)
(20)
(21)
(22)
(23)
(24)
78
(25)
(26)
(27)
(28)
79
7. CONCLUSIONES
El suero lcteo suplementado mostr ser un buen sustrato para el
crecimiento de Lb. casei y para la obtencin de cido lctico por fermentacin.
Asimismo, el suero lcteo empleado como sustrato en bioprocesos constituye una
alternativa para su aprovechamiento como subproducto industrial y de esta
manera disminuir la contaminacin que se genera cuando es drenado sin algn
tratamiento previo por parte de las industrias queseras.
Es necesario mantener un control del pH ptimo para la bacteria durante
el proceso de fermentacin en la produccin de cido lctico para lograr altos
rendimientos de producto.
Para llevar a cabo la separacin de cido lctico es factible el uso de la
tecnologa de membranas de nanofiltracin, las cuales pueden servir como una
etapa de separacin, concentracin y purificacin de compuestos, no obstante es
necesario la aplicacin de procesos adicionales para la obtencin de un
compuesto con alta pureza.
En la seleccin de una membrana de nanofiltracin, adems del tamao
de poro se deben considerar otras caractersticas como son: el tipo de material
con que est fabricada la membrana, su afinidad por el compuesto a separar, la
carga o neutralidad de los compuestos a separar y la hidrofilicidad e hidrofobicidad
tanto de la membrana como de los compuestos a separar.
El modelo matemtico reportado previamente por Altiok et al. (2006) no
fue adecuado para modelar la formacin de biomasa, el consumo de sustrato y la
formacin de producto en nuestros datos.
La aplicacin de regresiones por polinomios en base al comportamiento
observado en los datos experimentales mostr tener un ajuste adecuado de los
datos. De la misma manera, es factible estudiar ecuaciones diferenciales con
funciones ms complejas que logren un buena modelacin de los datos.
80
8. BIBLIOGRAFIA
81
83
85
Rojan, J. P., Anisha, G. S., Nampoothiri, M. K. y Pandey, A. 2009. Direct lactic acid
fermentation: Focus on simultaneous saccharification and lactic acid production.
Biotechnology Advances. 27:145-152.
Rodrguez, A. C., Cabrera, Ll. A. I. y Valencia, F. J. I. 2003. Diseo y construccin de
medicin para un biorreactor prototipo. Revista Mexicana de Ingeniera Biomdica.
24:55-70
Ruz-Leza, H. A., Rodrguez, J. R. M., Rodrguez, H. R., Contreras, E. J. C. y Aguilar
C. N. 2007. Diseo de biorreactores para fermentacin slida. Revista Mexicana
de Ingeniera Qumica. 6:33-40.
Sastre, A. M., Pabby, A. K. y Rizvi, S. S. 2009. Handbook of Membrane Separations.
Chemical, Pharmaceutical, Food and Biotechnology Applications. CRC Press.
Saxena, A., Tripathi, B. P., Kumar, M. y Shahi, V. K. 2009. Membrane-based
techniques for the separation and purification of proteins: An overview. Advances
in Colloid and Interface Science.145:1-22.
Serna, C. L. y Rodrguez, S. A. 2005. Produccin Biotecnolgica de cido Lctico.
Ciencia y Tecnologa Alimentaria 5:54-65.
Servicio de Informacin Agropecuaria y Pesquera (SIAP). 2008. Boletn de Leche,
pp. 17-19.
Schepers, A. W., Thibault, J. y Lacroix, C. 2006. Continuous lactic acid production in
whey permeate/yeast extract medium with inmobilized Lactobacillus helveticus in a
two-stage process: Model and experiments. Enzyme and Microbial Technology.
38:324-337.
Shahbazi, A., Mims, M. R., Li, Y., Shirley, V., Ibrahim, S. A. y Morris, A. 2005. Lactic
acid production from cheese whey by inmobilized bacteria. Applied Biochemistry
and Technology. 121-124:529-540.
Sun, X., Wang, Q., Zhao, W., Ma, H. y Sakata, K. 2006. Extraction and purification of
lactic acid from fermentation broth by esterification and hydrolysis method.
Separation and Purification Technology. 49:43-48.
Tong, W.Y., Fu, X.Y., Lee, S.M., Yu, J., Liu J.W., Wei, D.Z y Koo Y.M. 2004.
Purification of L (+)-lactic acid from fermentation broth with paper sludge as
cellulosic feedstock using weak anion exchanger Amberlite IRA.92. Biochemical
Engineering Journal 18:89-96
Urribar, L., Vielma, A., Pez, G., Ferrer, J., Mrmol, Z. y Ramones, E. 2004.
Produccin de cido lctico a partir de suero de leche, utilizando Lactobacillus
helveticus en cultivo continuo. Revista Cientfica Universidad Zulia. 14:297-309.
87
Walstra, P., Wouters, J. T. M. y Geurts, T. J. 2006. Dairy science and technology. Ed.
Taylor & Francis Group.
Wang, X. L., Shang, W. J., Wang, D. X., Wu, L. y Tu, C.H. 2009. Characterization and
applications of nanofiltration membranes: State of the art. Desalination. 236:316326.
Weng, Y. H., Wei, H. J., Tsai, T. T., Y., Chen, W. H., Wei, T. Y., Hwang, W. S., Wang,
C. P. y Huang C. P. 2009. Separation of acetic acid from xylose by nanofiltration.
Separation and Purification. 67:95-102.
Xu, Z., Wang, Q., Wang P., Cheng G., Ji, Y. y Jiang, Z. 2007. Production of lactic acid
from soybean stalk hydrolysate with Lactobacillus sake and Lactobacillus casei.
Process Biochemistry. 42:89-92.
Yoo, I., Chang, H., Lee E., Chang Y. y Moon, S. 1996. Effect of pH on the production
of lactic acid and secondary products in batch cultures of Lactobacillus casei.
Journal of Microbiology and Biotechnology. 6: 482-486.
Yoon, K. Y., Woodams, E. E. y Hang, Y. D. 2004. Probiotication of tomato juice by
lactic acid bacteria. Journal of Microbiology. 42:315-318.
Yoon, K. Y., Woodams, E. E. y Hang Y. D. 2005. Fermentation of beet juice by
beneficial lactic acid bacteria. Lebensmittel - Wissenchaft und Technology. 38:7375.
Yu, S., Liu, M., Ma, M., Qi, M., L, Z. y Gao, C. 2010. Impacts of membrane
properties on reactive dye removal from dye/salt mixtures by asymmetric cellulose
acetate and composite polyamide nanofiltration membranes. Journal of Membrane
Science. 350: 83-91.
Young-Jung, W. y Ryu, H. W. 2009. Lactic acid production by Lactobacillus sp. RKY2
in a cell-recycle continuous fermentation using lignocellulosic hydrolyzates as
inexpensive raw materials. Bioresource Technology. 100:4262-4270.
Zhang, Z. Y., Jin, B. y Kelly J.M. 2007. Production of lactic acid from renewable
materials by Rhizopus fungi. Biochemical Engineering Journal. 35:251-263.
88
ANEXO A
3000000
2500000
2000000
y = 68062x + 24412
R = 0.9994
1500000
1000000
500000
0
0
10
20
30
40
50
LACTOSA (g/L)
1200000
1000000
800000
y = 32192x + 16326
R = 0.9994
600000
400000
200000
0
10
15
20
25
CIDO LCTICO (g/L)
30
35
89
1.4
BIOMASA (g/L)
1.2
1
0.8
y = 0.1832ln(x) + 1.0465
R = 0.9728
0.6
0.4
0.2
0
0
0.5
1.5
ABS 610 nm
90
ANEXO B
ANLISIS ESTADSTICO (EXPERIMENTOS)
Sustrato (g/L)
% Inculo
Fase
Log (UFC/ml)
al inicio
Log (UFC/ml)
despus de
20 h
20
30
40
50
20
30
40
50
20
30
40
50
20
30
40
50
20
30
40
50
20
30
40
50
20
30
40
50
20
30
40
50
1
1
1
1
5
5
5
5
10
10
10
10
20
20
20
20
1
1
1
1
5
5
5
5
10
10
10
10
20
20
20
20
E
E
E
E
E
E
E
E
E
E
E
E
E
E
E
E
L
L
L
L
L
L
L
L
L
L
L
L
L
L
L
L
7.54
7.48
7.49
7.44
8.10
8.10
8.04
8.05
8.55
8.47
8.48
8.37
8.72
8.66
8.75
8.6
7.08
6.98
6.99
7.07
7.88
7.80
7.79
7.88
8.00
7.83
7.80
7.80
8.51
8.48
8.36
8.41
9.27
9.38
9.39
9.42
9.17
9.24
9.28
9.33
9.26
9.28
9.44
9.34
9.36
9.38
9.43
9.47
9.09
9.11
9.33
9.30
8.99
9.17
8.75
8.95
9.36
9.32
9.52
9.43
9.47
9.49
9.58
9.74
91
Log
(UFC/mL)
ganados a
las 20 h
1.73
1.9
1.9
1.98
1.07
1.14
1.24
1.28
0.71
0.81
0.96
0.97
0.64
0.72
0.68
0.87
2.01
2.13
2.34
2.23
1.11
1.37
0.96
1.07
1.36
1.49
1.72
1.63
0.96
1.01
1.22
1.33
Model 22
Error
9
C. Total 31
7.3436250
0.1135625
7.4571875
0.333801
0.012618
26.4542
Prob > F
<.0001
Prueba de Efectos
Fuente
Sustrato
Inculo
Fase
Inculo*Sustrato
Sustrato*Fase
Fase*Inculo
GL
Suma de Cuadrados
F Ratio
Prob > F
3
3
1
9
3
3
0.2212625
5.5475625
0.8911125
0.1122625
0.0071625
0.5642625
5.8451
146.5509
70.6220
0.9886
0.1892
14.9062
0.0169
<.0001
<.0001
0.5067
0.9011
0.0008
Prueba de Tukey
Sustrato (g/L)
Alfa= 0.050
Nivel
50
40
30
20
Media CM
A
A
A
1.4200000
1.3775000
1.3212500
1.1987500
B
B
Inoculo (%)
Alfa=0.050
Nivel
1
10
5
20
Media CM
2.0275000
1.2062500
1.1550000
0.9287500
B
B
C
Fase
Alfa= 0.050
Nivel
E
L
Media CM
1.1625000
1.4962500
92
Inoculo (%)*Fase
Alfa=0.050
Nivel
L,1
E,1
L,10
E,5
L,20
L,5
E,10
E,20
Media CM
A
A
B
C
C D
C D
D E
E
2.1775000
1.8775000
1.5500000
1.1825000
1.1300000
1.1275000
0.8625000
0.7275000
93
F Ratio
153.5658
Prob > F
<.0001
Prueba de Efectos
Fuente
MEMBRANA
PRESIN
TIEMPO
GL Suma de Cuadrados
1
38071.107
1
176.475
2
54.237
F Ratio
610.5630
2.8302
0.4349
Prob > F
<.0001
0.1089
0.6536
Prueba de Tukey
MEMBRANA
Alfa=0.050
Nivel
Media CM
Acetato
A
83.773333
TFC-SR3
B
4.116667
Niveles no conectados por la misma letra son significativamente diferentes
PRESIN
Alfa=0.050
Nivel
Media CM
300
A
46.656667
150
A
41.233333
Niveles no conectados por la misma letra son significativamente diferentes
TIEMPO
Alpha=0.050
Nivel
Media CM
20
A
45.747500
40
A
44.020000
5
A
42.067500
Niveles no conectados por la misma letra son significativamente diferentes
94
F Ratio
21.5232
Prob > F
<.0001
Prueba de Efectos
Fuente
MEMBRANA
PRESIN
TIEMPO
GL Suma of Cuadrados
1
1114.6614
1
2.0184
2
67.0651
F Ratio
81.0684
0.1468
2.4388
Prob > F
<.0001
0.7059
0.1141
Prueba de Tukey
MEMBRANA
Alfa=0.050
Nivel
Media CM
Acetato
A
88.700000
TFC-SR3
B
75.070000
Niveles no conectados por la misma letra son significativamente diferentes
PRESIN
Alfa=0.050
Nivel
Media CM
300
A
82.175000
150
A
81.595000
Niveles no conectados por la misma letra son significativamente diferentes
TIEMPO
Alfa=0.050
Nivel
Media CM
20
A
83.712500
40
A
82.270000
5
A
79.672500
Niveles no conectados por la misma letra son significativamente diferentes
Flujo de permeado
(Prueba estadstica asociada a las Figura 26)
Anlisis de Varianza
Fuente
Modelo
Error
C. Total
F Ratio
10.2263
Prob > F
0.0171
Prueba de Efectos
Fuente
Membrana
Presin
GL Suma de Cuadrados
1
0.204800
1
28.125000
F Ratio
0.1479
20.3047
95
Prob > F
0.7164
0.0064
Prueba de Tukey
Membrana
Alfa=0.050
Nivel
Media CM
TFC-SR3
A
9.4225000
Acetato
A
9.1025000
Niveles no conectados por la misma letra son significativamente diferentes
Presin
Alfa=0.050
Nivel
Media CM
300
A
11.137500
150
B
7.387500
Niveles no conectados por la misma letra son significativamente diferentes
96
ANEXO C
Ajuste lineal de la formacin de biomasa
Biomasa 6.0 = 0.7190407 + 0.0180594*Tiempo
1.2
Biomasa 6.0
1.1
1
0.9
0.8
0.7
-5
10 15
Tiempo
20
25
30
Linear Fit
0.9643
0.0271
Media de la respuesta
0.9354
Observaciones
39
Anlisis de varianza
Fuente
GL
Suma de cuadrados
Cuadrado medio
F Ratio
Model
0.71229651
0.712297
950.07
Error
37
0.02771900
0.000749
Prob F
C. Total
38
0.74001552
<.0001
Parmetros estimados
Trmino
Estimado
Error Std
Intercepto
0.719047
0.00823
861
<.001
Tiempo
0.018054
0.00086
303
<.001
97
t Ratio
Prob>|t|
1.1
Grfico de regresin
cido Lctico 6.0
30
25
20
15
10
5
0
0.7
0.8
0.9
1
1.1
Biomasa 6.0
1.2
0.8699
3.2722
Media de la respuesta
9.5117
Observaciones
24
Anlisis de varianza
Fuente
Modelo
GL Suma of Cuadrados
Cuadrado medio
F Ratio
1435.9981
717.999
66.871
Error
21
225.4613
10.736
Prob>F
C. Total
23
1661.4594
<.0001
Parmetros estimados
Trmino
Estimado
Error std
Ratio
Prob>|t|
Intercepto
-43.12218
4.764516
-9.05
<.0001
Biomasa 6.0
55.263011
5.201147
0.63
<.0001
128.17341
39.54431
3.24
0.0039
98
Residuales
cido Lctico
6.0 Residual
10
5
0
-5
0
5 10 15 20 25 30
cido Lctico 6.0 Predicted
Sustrato 6.0
Leverage Residuals
Sustrato 6.0
Leverage Residuals
45
40
35
30
25
20
15
10
0
10 15 20 25
cido Lctico 6.0
Leverage, P<.0001
30
0.9678
1.8825
Media de la respuesta
26.333
Observaciones
24
99
Anlisis de varianza
Fuente
GL Suma de cuadrados
Modelo
Cuadrado de la media
F Ratio
1956.8712
652.290
183.91
Error
20
71.0211
3.551
Prob >F
C. Total
23
2027.8923
<.0001
Parmetros estimados
Trmino
Estimado
Error std
t Ratio
Prob>|t|
Intercepto
53.766158
6.614778
8.13
<.0001
-0.912724
0.187904
-4.86
<.0001
0.0210945
0.010778
1.96
0.0644
Biomasa 6.0
-22.12755
8.470908
-2.61
0.0167
Sustrato
6.0 Residual
Residuales
4
3
2
1
0
-1
-2
-3
-4
10 15 20 25 30 35 40 45
Sustrato 6.0 Predicted
100