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Gentica molecular bacteriana

Unidad 2. Transferencia de material gentico y seleccin bacteriana

Ingeniera en Biotecnologa
Noveno cuatrimestre

Gentica molecular bacteriana


Unidad 2. Transferencia de material gentico y seleccin
bacteriana

Clave

190930933

Universidad Abierta y a Distancia de Mxico

Gentica molecular bacteriana


Unidad 2. Transferencia de material gentico y seleccin bacteriana

Unidad 2. Transferencia de material gentico y seleccin bacteriana


Presentacin
Las bacterias ocupan una posicin nica en el mundo biolgico (Srivastava 2013). Sin ir
muy lejos podemos evidenciar su relevancia al revisar el microbioma humano
, donde por ejemplo, por cada centmetro cuadrado de superficie de la piel hay unas
10,000 bacterias, en la que existe una gran diversidad de especies. Para darnos una idea,
si utilizamos el ecosistema del suelo como analoga del ecosistema de la piel humana,
considerando que esta puede tener distintos nichos: "la axila podra ser tan diferente del
tronco como una selva tropical de un desierto" (Fredricks 2001).
Si deseas conocer ms acerca del Microbioma humano, revisa el siguiente recurso:
Crdenas Guzmn G (2012). El microbioma humano. Cmo ves?
167:10-14 Recuperado de
http://www.comoves.unam.mx/assets/revista/167/el-microbiomahumano.pdf

Pero cmo es qu se conoce la identidad y fisiologa de las bacterias si son tan


numerosas y diversas? El mtodo tradicional ha sido aislar o separar las bacterias de las
muestras biolgicas y cultivarlas en el laboratorio, siendo una labor lenta y costosa, ya
que se presenta complicada en trminos de determinar las condiciones ptimas de cultivo,
como temperatura y nutrientes. Se estima que de todas las bacterias que existen en el
planeta, slo se han cultivado menos del 1%. Afortunadamente, la tecnologa avanza a
pasos agigantados y la biologa molecular ha permitido el desarrollo de nuevas reas de
investigacin en este campo, como la metagenmica, donde a travs de utilizar tcnicas
similares a las que se utilizaron para descifrar el genoma humano, ahora se emplean para
la identificacin de las diferentes especies de bacterias en nuestro planeta (Crdenas
Guzmn, 2012).
Y para qu y por qu nos interesara conocer las diferentes especies bacterianas? Las
respuestas pueden ser muchas, desde el punto de vista de las ciencias de la salud,
definitivamente el identificar aquellas especies patgenas se puede relacionar
directamente con la bsqueda de medicamentos; algunos casos de bacterias claramente
identificadas han sido utilizadas como sistemas modelo de estudio que han permitido
comprender ms de la estructura celular, el metabolismo, relaciones estructura-funcin de
protenas, el crecimiento y reproduccin bacteriana (Srivastava 2013).
Para la biotecnologa, este conocimiento es indispensable, ya que esta disciplina pretende
estudiar, modificar y utilizar los sistemas biolgicos para un fin en especfico y mnimo se

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requiere la identificacin de la especie en cuestin. Ahora bien, es de nuestro inters este


estudio porque contribuye importantemente al quehacer de la biotecnologa, ya que
gracias al uso de las bacterias genticamente modificadas esta disciplina ha tenido una
gran influencia en la solucin de distintos problemas de la salud, de alimentos y
proteccin del ambiente.
En este sentido, la unidad 1 del curso proporcion las bases fundamentales de los
procesos moleculares que se expresan en las bacterias, en otras palabras se esboza el
flujo de la informacin gentica en los procariontes, ms ahora la tarea es desentraar, en
forma detallada los mecanismos de regulacin de la expresin gentica y cmo este
conocimiento puede contribuir al desempeo eficiente de la biotecnologa en cuanto al
desarrollo de bacterias genticamente modificadas (BGM).
Acorde a lo anterior, primeramente revisaremos las estrategias de transferencia de
material gentico que pueden manifestar las bacterias, para posteriormente identificar las
herramientas que nos permiten realizar su aislamiento.

Propsitos de la unidad

Identificar y relacionar las estrategias de transferencia de


material gentico y de seleccin bacteriana con objeto de
utilizarlas como herramientas en la generacin de bacterias
genticamente modificadas.

Competencia especfica

Relacionar estrategias moleculares de ingeniera gentica


mediante la descripcin de tcnicas de seleccin bacteriana y
gentica molecular para la produccin de BGM.

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Temario
2. Transferencia de material gentico y seleccin bacteriana
2.1. Sobrevivencia bacteriana: transferencia y recombinacin de ADN y resistencia
a drogas
2.1.1. Recombinacin
2.1.2. Transformacin
2.1.3. Conjugacin
2.1.4. Transduccin
2.1.5. Resistencia a drogas
2.2. Herramientas en la clonacin y expresin de genes para obtener bacterias
recombinantes
2.2.1. Los plsmidos como vectores de clonacin
2.2.2. Bacterifagos
2.2.3. Cepas bacterianas
2.2.4. Seleccin de bacterias recombinantes por resistencia a drogas

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2. Transferencia de material gentico y seleccin bacteriana


En la presente unidad 2, se revisarn dos aspectos fundamentales para poder determinar
y establecer en la prctica las utilidades y grandes ventajas que puede retribuir la gentica
molecular bacteriana al desarrollo de toda biotecnologa. Por ello, se revisar, conocer y
comprender la dinmica que opera en los mecanismos a travs de los cuales las
bacterias pueden transmitir su informacin gentica, particularmente es de inters poder
saber cmo molecularmente estos microorganismos son capaces de transmitir su
adaptabilidad a diferentes condiciones ambientales, evidenciando al menos
inmediatamente una aplicacin teraputica, pero cabe aclarar que pueden ser
microorganismos con un alto potencial para estudiar, modificar y utilizar en diferentes
campos. Por tanto, se abordar las bases moleculares, los elementos asociados y
algunos ejemplos de cada uno de los tres diferentes mecanismos de transferencia de la
informacin gentica bacteriana: transformacin, conjugacin y la transduccin.
Como primera incursin, se reconocer y fortalecer el concepto de la recombinacin
desde el punto de vista de la gentica bacteriana y cmo es un evento que ser comn
para los diferentes mecanismos de transferencia a discutir.
Asociado a lo anterior, adems de contar con todo este conocimiento previo que facilita a
la biotecnologa la eleccin del mejor sistema para poder transmitir la informacin
gentica de una forma dirigida, resulta crtico contar con un bagaje amplio en cuanto a las
herramientas tcnicas que pueden facilitar dicha transferencia de la informacin. Resulta
entonces comprensible, la necesidad de repasar diferentes tcnicas, estudiadas
previamente en la carrera, pero ahora especficamente enfocadas a su aplicacin en la
gentica bacteriana. Con objeto de alcanzar estos propsitos se identificar de aquellas
herramientas que pueden establecer y determinar la clonacin y expresin gnica, las que
resulten ser las ms adecuadas para la obtencin especfica de bacterias genticamente
modificadas (BGM).

2.1. Sobrevivencia bacteriana: transferencia y recombinacin de ADN y


resistencia a drogas
Los procariontes son microorganismos que sobresalen en cuanto a su fascinante
capacidad de adaptacin a diferentes condiciones ambientales. Con objeto de dilucidar
los mecanismos que pueden estar involucrados resulta fundamental conocer desde la
estructura de su material gentico hasta como fluye dicha informacin (Betancor et. al.,
2006) para entonces poder estudiar su regulacin y finalmente reconocer su utilidad
biotecnolgica.

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Por ejemplo, la capacidad infecciosa de una bacteria patgena reside en que contiene la
informacin gentica necesaria para colonizar, invadir y/o producir sustancias txicas
causantes de la enfermedad. Es importante puntualizar que dicha informacin se
transmite y se hereda a la siguiente generacin, por lo que resulta necesario conocer su
funcionamiento gentico. El hecho de que estos microorganismos sean de relativo fcil
manejo en el laboratorio, ha favorecido que podamos utilizarlas para sintetizar productos
tiles para distintos sectores (Betancor et. al. 2006).
Por ello, en esta unidad revisaremos las estrategias de transferencia que pueden
manifestar las bacterias con objeto de recombinar su material gentico y de este modo
adquirir cambios como la resistencia a ciertos antibiticos u otras drogas.

2.1.1. Recombinacin
La recombinacin es un proceso que combina elementos genticos contenidos en los
genomas de diferentes individuos, dando como resultado en algunos casos que se
adquiera una nueva funcin, como una mejor adaptacin a los cambios ambientales, lo
cual resulta ser un evento evolutivo de gran importancia, ya que implica una transferencia
de la informacin gentica que puede permitir a una especie adquirir una mejor capacidad
de adaptacin y por tanto, de sobrevivencia. En los procariontes, a diferencia de los
eucariontes, la recombinacin comprende una serie de mecanismos que son
independientes de su reproduccin sexual.
Un requisito comn de todas las formas de transferencia de genes entre bacterias,
exceptuando la transferencia de plsmidos (que pueden replicarse de forma
independiente), es que el fragmento de ADN, sujeto a ser transferido, debe ser insertado
en el cromosoma receptor, esto se logra a travs de la ruptura de ambas molculas de
ADN, su entrecruzamiento y su unin (Figura 1).

Figura 1. Recombinacin entre dos molculas de ADN lineal.

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Existen diferentes formas de recombinacin, donde la recombinacin homloga, se refiere


a que ambos fragmentos de ADN proceden del mismo tipo de especie o bien muy
cercana, es decir son muy similares, aunque no tienen que ser idnticos. Por su parte, en
la recombinacin heterloga, la fuentes del material gentico provienen de diferentes
especies puede observarse en la siguiente figura.

Figura 2. Recombinacin homloga y heterloga.

El evento que determin el surgimiento de lo que ahora conocemos como ingeniera


gentica o ADN recombinante sucedi en 1970 cuando Hamilton Smith y Daniel Nathans
descubrieron una enzima capaz de reconocer y cortar el ADN en secuencias especficas.

Las enzimas de restriccin, actoras determinantes durante la recombinacin


Muchos microorganismos producen enzimas que modifican y digieren o rompen ADN, los
cuales son llamados sistemas de modificacin-restriccin, y son anlogos a un sistema
inmune en cuanto a su funcin, es decir son protectores porque pueden inducir cambios
con objeto de lograr la sobrevivencia de la especie. En ciertas bacterias, el propio ADN
puede ser modificado en secuencias especficas a travs de una enzima de modificacin,
la cual puede cambiar una base por otra; por su parte, una enzima de restriccin solo
realiza un corte (digestin) cuando reconoce una secuencia en especfico. Las enzimas
de restriccin suelen identificar secuencias palindrmicas, que son iguales si se leen en
una direccin, o en la direccin contraria, como las palabras oso o ala.

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-5'CCCGGG3'- -5'TAACCG3'-3'GGGCCC5'- -5'GCCAAT3'Secuencias palindrmicas


En estas secuencias dependiendo de la posicin del corte, implica que queden extremos
con caractersticas particulares, por ejemplo en forma escalonada y se definen como
extremos cohesivos o pegajosos, porque pueden hibridar nuevamente (Figura 3). Si ahora
los extremos no quedan escalonados sino rectos, se denominan extremos romos y estos
no hibridan fcilmente (Figura 3):

Figura 3. Mecanismo de accin de las enzimas de restriccin.

Una vez que las enzimas ejercen su accin, se produce un conjunto definido de diferentes
segmentos, mismos que pueden visualizarse si se utiliza una electroforesis, ya que los
fragmentos pueden separarse por su peso molecular, en un proceso que es anlogo a la
separacin de protenas:

Ahora bien, si el fragmento de ADN producto de la digestin de una enzima de restriccin


de un organismo se asocia con otro segmento de ADN, generado por la misma enzima
pero de un organismo diferente, se puede obtener una molcula hbrida o una molcula
de ADN recombinante (Sobern 2009).

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Para que se renan las hebras cortadas, se requiere de la accin de otra enzima que es
la ADN ligasa, la cual cataliza la formacin del enlace fosfodister necesario para que se
unan las hebras del material gentico. Para que la recombinacin sea exitosa es requisito
que la nueva secuencia se transcriba y traduzca en una clula y que adems se replique.
La recombinacin sucede tanto en eucariontes como procariontes, e implica la generacin
de un nuevo genotipo como resultado del intercambio de material gentico entre
secuencias homlogas de ADN de dos orgenes diferentes.
Recombinacin gentica en bacterias
A diferencia de las clulas eucariontes, las bacterias slo tienen un nico cromosoma.

Por tanto, para que suceda la recombinacin, el cromosoma homlogo debe ser
transferido de una bacteria donadora a una receptora, si se considera que el cromosoma
donador debe ser homlogo con el receptor, entonces es de esperarse que ambas
bacterias pertenezcan a la misma especie o a especies muy relacionadas. Por tanto, la
recombinacin bacteriana sucede si y solo si sucede una transferencia del material
gentico, fragmento de ADN, de la bacteria donadora hacia una clula receptora y se
manifiesta porque dicho fragmento se puede transcribir, traducir y replicar en la clula
aceptor. Si no hay recombinacin, el fragmento de ADN de la bacteria donadora se
pierde, porque no se puede replicar de forma independiente.
Ahora bien, tambin puede suceder la recombinacin heterloga, la cual ha sido
ampliamente utilizada por la biotecnologa, donde hay muchos ejemplos de genes de
origen animal expresados en bacterias y plantas con la finalidad de obtener diversas
protenas recombinantes de gran inters en la industria farmacutica y alimentaria.
Por tanto, la recombinacin gentica bacteriana sucede cuando se transfieren fragmentos
de ADN de una clula donadora a una receptora, ahora es de nuestro inters conocer
dichos mecanismos de transferencia que tienen caractersticas, ventajas y desventajas
particulares, los cuales son: transformacin, conjugacin o transduccin.

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2.1.2. Transformacin
La transformacin es un proceso de recombinacin gnica mediante el cual las bacterias
pueden incorporar ADN exgeno o extrao, que puede provenir de otras bacterias y que
se encuentra libre en el medio (Figura 4).

Figura 4. Recombinacin bacteriana por transformacin.

No todas las bacterias pueden captar este ADN exgeno, cuando lo conservan en
forma estable e interaccionan con el mismo, se dice que son competentes. Esta
competencia depende de la presencia de un sistema de captacin de ADN especfico y
que se encuentra asociado a la membrana celular. Como ejemplos de bacterias
competentes se encuentran Haemophilus influenzae, Neisseria sp, Streptococcus
pneumoniae, etc. Aun cuando no todas las especies de bacterias pueden ser
competentes, esta se puede inducir en el laboratorio al generar alteraciones en la
membrana celular (Betancor et al. 2006).

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Dentro de las tcnicas comunes para inducir la competencia se encuentra la


electroporacin, que consiste en la aplicacin de un pulso elctrico. Tambin se puede
utilizar agentes qumicos como el cloruro de calcio, y el choque trmico es una
herramienta ampliamente utilizada. Es importante precisar que no en todas las clulas
procariontes se puede inducir la competencia y lo usual es probar ms de una tcnica
para alcanzarla.

2.1.3. Conjugacin
En la conjugacin, la transmisin de ADN se realiza directamente de una clula
bacteriana a otra. Los plsmidos son los elementos genticos que con mayor frecuencia
se transmiten a travs de este mecanismo. Esta capacidad de transferencia va a
depender de la presencia de plsmidos conjugativos que contienen los genes necesarios
para realizar dicho evento (Betancor et al. 2006).
Pero qu caractersticas presenta y cmo es que se puede favorecer la conjugacin?
Resulta que para que se d la transferencia de genes generalmente contenidos en un
plsmido, ya sea de una bacteria a otra bacteria, o bien de una interaccin bacteria-clula
hospedera, debe existir primeramente un contacto fsico entre ambos tipos celulares y
establecerse un puente de unin entre las superficies de ambos, para poder introducir y
recombinar el material gentico. Aun con todos los avances tecnolgicos alcanzados,
dichos eventos an no han sido del todo dilucidados, pero se tiene conocimiento muy
valioso de cmo pueden operar estos sistemas (Thanassi et al. 2012; Arutyunov y Frost
2013).
Acorde a lo anterior, el primer requisito es que se establezca una unin entre las bacterias
involucradas sujetas a ser modificadas genticamente:
1) Debe existir un acercamiento fsico entre ambos tipos celulares, lo cual se alcanza a
travs de organelos de superficie como el pili, el cual se localiza en la bacteria donante
del plsmido y uno de sus objetivos es identificar y promover el acercamiento a la clula
receptora.

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2) Una vez establecido el puente de comunicacin entre los dos tipos celulares, comienza
un flujo de material desde la bacteria hacia la clula receptora, donde los sistemas de
secrecin bacterianos, se encargan de producir y excretar diversas molculas que no solo
pueden favorecer el fortalecimiento del puente de unin, sino tambin la entrada de
factores de virulencia y el ADN candidato a ser insertado en el cromosoma de la clula
receptora. Hay que recordar que la recombinacin es exitosa si y solo si el fragmento de
ADN se transcribe, traduce y replica.

Transferencia de genes
Bacteria sensible al cido Nalidxico.
Bacteria donadora que acarrea el
Bacteria resistente al cido Nalidxico.
plsmido resistente a ampicilina
amp

Mezcla del cultivo

Agar selectivo que contiene


cido nalidxico y ampicilina

Bacteria receptora con mutacin cromosomal


resistente a cido nalidxico que contiene el
plsmido que confiere resistencia a ampicilina

Figura 5. Transferencia por conjugacin de un plsmido resistente. La cepa donadora es


sensible a cido nalidxico y acarrea un plsmido que confiere resistencia a ampicilina
(amp). La bacteria receptora es resistente a cido nalidxico, debido a una mutacin
cromosomal y es sensible a ampicilina. Despus de haber crecido en la mezcla de cultivo,
el plaqueo sobre agar conteniendo tanto ampicilina como cido nalidxico, selecciona
aquellos receptores que han recibido el plsmido (transconjugantes). El cromosoma
bacteriano es omitido para mejorar la claridad (Basado en Dale y Park, 2004).

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La Figura 5 ilustra un ejemplo de una estrategia experimental para llevar a cabo la


conjugacin, en breve, esta transferencia se obtiene por la mezcla de dos cepas, por
ejemplo cada una de ellas puede contener informacin gentica que les confiere
resistencia a algn antibitico, esta mezcla despus de un periodo de incubacin,
momento en el que sucede la conjugacin, se coloca sobre un medio que contenga
ambas sustancias ante las que presentan la resistencia, por tanto solo crecern las
bacterias que contenga genes de ambos progenitores. Por ejemplo, en los experimentos
mostrados en la Figura 5, una cepa (la donadora) lleva un plsmido que le confiere
resistencia a ampicilina, mientras que la segunda cepa no tiene el plsmido pero tiene una
mutacin cromosmica que la hace resistente a cido nalidxico. Despus de la
incubacin del cultivo mixto, una muestra es transferida dentro de un medio que contiene
ambos antibiticos. Ninguno de los progenitores puede crecer sobre este medio, por tanto
las colonias que se observen sern debido a la transferencia de una copia del plsmido
del donador a la clula receptora. Este evento tiene una elevada sensibilidad, ya que se
ha observado que basta con que 1 en 106 clulas receptoras haya obtenido una copia del
plsmido transferido, es suficiente para que se obtenga un crecimiento de la progenie en
el medio provisto por los dos antibiticos.
Entre las bacterias donde la conjugacin se presenta con mayor frecuencia, se
encuentran miembros de las Enterobacterias y las bacterias Gram negativas (como los
Vibrios y Pseudomonas). Varios gneros de bacterias Gram positivas poseen sistemas de
conjugacin razonablemente bien caracterizados. Estos sistemas caracterizados incluyen
las especias Streptomyces, que tienen importancia comercial como los mayores
productores de antibiticos; as como los estreptococos lcticos, que tambin tienen
importancia comercial por sus aplicaciones en varios aspectos de la industria lctea.
La significancia ms evidente de la conjugacin es que permite la transmisin de
plsmidos de un cultivo a otro. Considerando que la conjugacin no necesariamente est
confinada a miembros de la misma especie, esto provee una ruta para el flujo de
informacin gentica a travs de una amplia frontera taxonmica. Una consecuencia
prctica por ejemplificar, sera que los plsmidos que estn presentes en la flora intestinal
normal puede ser transferida a patgenos infectivos, los cuales pueden entonces volverse
resistentes a un amplio espectro de diferentes antibiticos (Dale y Park 2004).

MECANISMOS DE CONJUGACIN
Formacin de parejas de apareamiento
En la mayora de los casos, la incidencia de la conjugacin, depende de la presencia de
una cepa donadora que contenga un plsmido que contiene los genes requeridos para
promover la transferencia de ADN. En E. coli y otras bacterias Gram-negativas, las clulas

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donadoras acarrean apndices sobre la superficie celular (pilis). Los pilis, varan
considerablemente en estructura, por ejemplo, el pili especfico para el plsmido F es
largo, delgado y flexible, mientras que el pili para el plsmido RP4 es corto, grueso y
rgido. Los pilis hacen contacto con receptores sobre la superficie de la clulas, as forman
las parejas de apareamiento (Figura 6). El pili, por tanto, atrae la clula para un contacto
ntimo y hacer un canal o un poro por medio del cual el ADN pase del donador al receptor.
Pilis

Plsmido

Donador
Cromosoma
bacteriano

El pili hace contacto con el receptor


Receptor

Pareja de
apareamiento

Transconjugante

Copia del plsmido


transferido al receptor

Donador

Figura 6. Transferencia de ADN por conjugacin (Tomado de Dale y Park, 2004).

Interesantemente, este mecanismo tiene mucho en comn con el sistema de secrecin de


protenas, el cual es usado por algunas bacterias para entregar protenas txicas
directamente dentro de las clulas husped.

Por transferencia de ADN


La transferencia de ADN de un donador a un receptor (Figura 7) se inicia por una protena
que hace un corte sitio especfico en una hebra de ADN, conocido como el origen de
transferencia (oriT). Un plsmido que codifica para una helicasa desenreda el ADN del
plsmido y la hebra cortada es transferida al receptor comenzando por el extremo terminal

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5 generado por el corte. Al mismo tiempo, el extremo terminal libre 3 de la hebra cortada
es extendido para remplazar el ADN transferido, por un proceso conocido como
replicacin en crculo rodante el cual es anlogo a la replicacin de hebras simples de
plsmidos y bacterifagos. La protena cortadora permanece unida al extremo terminal 5
del ADN transferido. La sntesis de ADN en el receptor convierte la hebra en una molcula
de hebra doble.
Hay que hacer notar que este es un proceso de replicacin. As, si bien se ha
puntualizado la transferencia de plsmidos de una clula a otra, lo que realmente significa
es la transferencia de la copia de un plsmido. La cepa donadora todava tiene una
copia del plsmido y puede involucrarse en posteriores apareamientos con otros
receptores. Es tambin digno de mencin que, despus de la conjugacin, la clula
receptora tiene una copia del plsmido y puede transferir la copia a otra clula receptora.
Las consecuencias pueden ser la diseminacin de un plsmido a travs de una poblacin
mezclada.

Donador

Receptor

El plsmido es cortado
en un sitio especfico,
oriT

Pareja de
apareamiento

Sintesis de ADN en el
donador por extensin
del extremo terminal
3 de la hebra cortada

Hebra simple
transferida

ADN transferid
es copiado en la
clula receptora.

Figura 7. Mecanismo de transferencia por conjugacin de ADN plasmdico. Para mayor


claridad, solo el plsmido es mostrado (Basado de Dale y Park, 2004).

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Movilizacin y transferencia cromosomal


No todos los plsmidos son capaces de ser transferidos a otra clula, los plsmidos que
pueden hacerlo, como ya se haba comentado previamente, son conocidos como
plsmidos conjugativos. En algunos casos los plsmidos conjugativos son capaces de
promover la transferencia (movilizacin) de un segundo plsmido no conjugativo de la
misma clula donadora. Esto no sucede por casualidad y no todos los plsmidos no
conjugativos pueden ser movilizados.
La movilizacin involucra un gene mob, el cual codifica una nucleasa especfica, y el sitio
bom (=oriT, el origen de la transferencia), donde la nucleasa mob hace un corte en el
ADN. ColE1 tiene los genes para la transferencia de ADN, pero no trae consigo los genes
requeridos para la formacin de una pareja de apareamiento. La presencia de otro
plsmido (conjugativo) permite que el donador pueda formar una pareja de apareamiento
con la clula receptora y as puede usar su propia maquinaria para acarrear el ADN
transferido.
Algunos plsmidos pueden ser movilizados sin importar el gene mob, dicha movilizacin
depende sobre la habilidad de la nucleasa mob del plsmido conjugativo para reconocer
el sitio bom del plsmido a ser movilizado. Esto slo funciona si los dos plsmidos estn
estrechamente relacionados. Por otro lado, el sitio bom es esencial para la movilizacin.
Este es un factor importante durante la modificacin gentica promovida por la
conjugacin, la remocin del sitio bom de un vector plasmdico asegura que el plsmido
modificado no podr ser transferido a otras cepas bacterianas.
En la mayora de los casos, el ADN que es transferido de un donador a un receptor
consiste nicamente de una copia de un plsmido. Sin embargo, algunos tipos de
plsmidos pueden promover la transferencia del ADN cromosomal. El primero que fue
descubierto, y mejor conocido, es el plsmido F (fertilidad) de E. coli, pero sistemas
similares existen en otras especies, como en Pseudomonas aeruginosa. En algunos
casos, como se describe a continuacin, esto involucra la integracin del plsmido
conjugativo dentro del cromosoma donador (por tanto si el cromosoma es en efecto
transferido como parte del plsmido). Sin embargo, en muchos casos la transferencia
cromosomal ocurre sin ninguna asociacin estable con el plsmido, posible por un
mecanismo anlogo a movilizarse de un plsmido no conjugado.
Cuando un plsmido es transferido de una clula a otra por conjugacin, el plsmido
completo ha sido transferido. En contraste, la transferencia cromosmica no involucra una
copia intacta. Una razn para esto es el tiempo que es requerido para la transferencia. El
proceso es menos eficiente que la replicacin normal de ADN y la transferencia de todo el
cromosoma podra tomar 100 min (en E. coli). La pareja de apareamiento muy raramente
permanece junta por mucho tiempo. En contraste, un plsmido de unos 40 kb (kb = kilo

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bases, 1 kb = 1000 nucletidos) es equivalente al 1% del tamao del cromosoma, - as la


transferencia del plsmido podra esperarse que se complete en 1 min. La transferencia
incompleta del ADN cromosmico significa que esto no constituye un replicn intacto de la
clula receptora (Dale y Park, 2004).

El plsmido F
El plsmido fue descubierto originalmente durante intentos para demostrar el intercambio
gentico en E. coli por cultivos mezclados de dos o ms cultivos auxotrficos, por tanto se
cultivaban sobre medios mnimos para permitir que nicamente los recombinantes
crezcan. Fue mostrado muy pronto que los recombinantes eran todos derivados de una
cepa progenitora y que una sola va de transferencia de informacin era la que estaba
involucrada, por parte del donador (macho) al receptor (hembra). La cepa donadora
acarreaba el plsmido (F+) mientras que el receptor es F-. Una caracterstica de este
sistema que parece ser curioso al mismo tiempo es que la co-cultivacin de una cepa F+ y
una cepa F- resulta en que las hembras son convertidas en machos. Esto es debido a que
la transmisin del plsmido F, por s mismo, ocurre muy frecuentemente, en contraste a la
transferencia de marcadores cromosomales, los cuales son ineficientes ante un F+
donador.

Cepas Hfr
La utilidad de la conjugacin para el anlisis gentico fue enormemente incrementada por
el descubrimiento de las cepas donadoras en las cuales la transferencia de ADN
cromosomal ocurra ms comnmente. Estas cepas Hfr (High Frequency of
Recombination, por sus siglas en ingles que significa alta frecuencia de recombinacin)
surgen de la integracin del plsmido F dentro del cromosoma bacteriano. Una
caracterstica adicional de una cepa Hfr es que la transferencia cromosomal empieza de
un punto definido y procede en una direccin especfica. El origen de la transferencia est
determinada por un sitio de insercin del plsmido F y la direccin est gobernada por la
orientacin del plsmido insertado. Esto puede quedar aclarado remarcando la molcula
circular en la Figura 7 que contiene un plsmido F integrado al ADN cromosomal. La
transferencia es as iniciada del sitio oriT del plsmido integrado, pero que ahora resulta
en la transferencia de una copia del cromosoma bacteriano en vez de solamente el
plsmido. Un donador F+, en contraste, transfiere genes de una forma ms o menos
aleatoria, ya que la transferencia no se inicia desde un sitio definido en el cromosoma. La
combinacin de la transferencia parcial de ADN cromosmico con la transferencia
ordenada de los genes, hizo de la conjugacin una herramienta importante en el mapeo
de los cromosomas bacterianos.

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Unidad 2. Transferencia de material gentico y seleccin bacteriana

Integracin y la escisin de F: formacin de plsmido F


La integracin del plsmido F se produce por recombinacin entre una secuencia en el
plsmido y un sitio cromosmico. En la Figura 8a se muestra que ocurre adyacente al
opern de lactosa, pero puede ocurrir en un gran nmero de sitios. Despus de la
integracin, el plsmido F se encuentra en una forma lineal en el sitio de integracin
(Figura 8c). La integracin es reversible ya que la recombinacin entre los sitios en los
extremos del plsmido integrado dar lugar a su escisin del cromosoma como una
molcula circular independiente (Figura 8, pasos c-a). Sin embargo, es posible que para
esta escisin se produzca de forma, es decir, la recombinacin se produce en un sitio
diferente. Si esto sucede, el plsmido resultante habr incorporado una pequea cantidad
de ADN bacteriano. Esta forma se le conoce como una plsmido F (F-prima). Figura 8c-e
muestra la formacin de un plsmido Flac, donde el evento de recombinacin que lleva a
la escisin ha ocurrido en un sitio ms all del opern lac (lactosa), en lugar de entre los
sitios que flanquean el plsmido F integrado. El opern lac por lo tanto, se ha incorporado
en el plsmido (al mismo tiempo que genera una delecin en el cromosoma) y ser
transferido con el plsmido a una cepa receptora. Este es un mecanismo por el cual un
plsmido puede adquirir genes adicionales a partir de un cromosoma y transferirlos a otra
cepa o especie.
Antes de la llegada de la clonacin de genes, los plsmidos F fueron tiles en un buen
nmero de formas, incluyendo el aislamiento de genes especficos y su transferencia a
otras cepas husped. Esto permiti la creacin de diploides parciales, es decir, cepas con
una copia de un determinado gen en el plsmido adems de la copia cromosmica.

Conjugacin en otras bacterias


La descripcin anterior de la conjugacin se aplica principalmente a bacterias Gramnegativas tales como E. coli y Pseudomonas. Muchas de las especies Gram-positivas,
que van desde Streptomyces a Enterococcus, tambin poseen plsmidos que son
transmisibles por conjugacin y en muchos casos, el mecanismo de transferencia de ADN
es bastante similar a lo descrito anteriormente. Sin embargo, hay diferencias sustanciales
en los dems aspectos.

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lac

Escisin

Cromosoma

Integracin

d
Escisin aberrante

b
Delecion
de lac

c
Plsmido F

Figura 8. La integracin y la escisin del plsmido F. La integracin se produce mediante


recombinacin con un sitio cromosmico (a-c). Escisin exacta se produce por
recombinacin en el mismo sitio, pero la recombinacin con diferentes sitios
cromosmicos resulta en la incorporacin de ADN cromosmico adyacente (en este caso
el gene lac) dentro del plsmido (d, e), formando un plsmido F y causando una delecin
cromosmica (Dale y Park 2004).

En general, el nmero de genes necesarios para la transferencia por conjugacin es de


tan slo como cinco genes, y es mucho menor que en las bacterias Gram-negativas,
donde se necesitan 20 o ms genes. El nmero de plsmidos conjugativos en bacterias
Gram-positivos, por lo tanto, pueden ser considerablemente ms pequeo. Una de las
razones para un menor nmero de genes que se requieren es que parece que no hay
necesidad para producir un pili. Esta es probablemente, al menos en parte, un reflejo de la
arquitectura diferente de la pared celular en bacterias Gram-positivas que carecen de la
membrana exterior caracterstica de los Gram-negativos.
Un grupo de bacterias Gram-positivas, donde los sistemas de conjugacin han sido
estudiado en detalle son los enterococos, principalmente Enterococcus faecalis. Algunas
cepas de E. faecalis secretan pptidos difusibles que tienen una accin similar a las
feromonas que puede estimular la expresin de los genes de transferencia (tra) de un
plsmido especfico en una clula vecina. Hay que hacer notar que, de manera
sorprendente es la clula receptora la que produce las feromonas. La clula donante, que
lleva el plsmido, tiene un receptor plsmido codificado en la superficie celular al que se
une la feromona. Diferentes tipos de plsmidos codificado para diferentes tipos de
receptores y que son estimulados por diferentes feromonas. Sin embargo, el receptor

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produce una gama de feromonas y por lo tanto es capaz de aparearse con las clulas que
llevan plsmidos diferentes.
Despus de que la feromona se ha unido al receptor de la superficie celular, es
transportado al citoplasma por una protena de transporte especfica, donde interacciona
con una protena llamada TraA. Esta protena es un represor de los genes tra en el
plsmido y la unin del pptido alivia aquella represin, estimulando de este modo la
expresin de los genes tra. Un resultado es la formacin de productos de agregacin que
causan la formacin de un agregado de acoplamiento que contiene unidas las clulas
donantes y receptoras. Una consecuencia adicional de la expresin de los genes tra es la
estimulacin de los eventos necesarios para la transferencia del plsmido, que se produce
por un mecanismo similar al descrito anteriormente.
Una ventaja de este sistema es que las clulas que contienen el plsmido no expresan los
genes necesarios para la transferencia de plsmido a menos que exista un receptor
adecuado en las proximidades. Esto no slo reduce la carga metablica en la clula, sino
que tambin significa que no estn expresando antgenos de superficie (tales como pili
conjugativo) que podran ser reconocidas por el sistema inmune del husped.

Transposones conjugativos
E. faecalis tambin proporciona un ejemplo de una excepcin a la regla general de que la
conjugacin es mediada por plsmidos. Algunas cepas de E. faecalis contienen un
transposn conocido como Tn916. Los transposones no se cubren particularmente en
esta unidad, pero por el momento es suficiente saber que son elementos genticos
mviles que son capaces de moverse de un sitio a otro del ADN. Lo que diferencia a
Tn916 aparte de otros transposones es su capacidad de transferir de una clula a otra por
conjugacin.
Transposones conjugativos tales como Tn916 difieren de los plsmidos en que se replican
y heredan como parte del cromosoma. No hay forma estable de replicacin independiente
como la hay con un plsmido. Sin embargo, una inspeccin ms detallada del mtodo de
transferencia (Fig. 9) muestra que existe una similitud significativa a la transferencia de un
plsmido. En particular, Tn916 contiene un origen de transferencia (oriT) que es bastante
similar a la que se encuentra en muchos plsmidos. El primer paso en la transferencia es
la escisin del transposn a partir del cromosoma, usando enzimas transposncodificadas (Int y Xis) que estn relacionadas con los responsables de la integracin y la
escisin del bacterifago lambda. Produce una molcula circular que se asemeja a un
plsmido en todos menos un rasgo vital - que no tiene un origen de replicacin por lo que
es incapaz de ser copiados en la forma normal. Sin embargo, ya que tiene un sitio de oriT

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y lleva los genes tra necesarios para la transferencia conjugacional, es como puede ser
transferido a una clula receptora.
Al igual que con los sistemas de transferencia de plsmido descrito anteriormente, la
transferencia de Tn916 implica la sntesis de ADN de hebra sencilla iniciado en oriT y la
transferencia de la cadena desplazada al receptor. La nica hebra transferida a
continuacin, se circulariz y convierte a una forma circular de doble cadena que se
inserta aleatoriamente en el cromosoma receptor por la accin de la integrasa.
Una caracterstica adicional de Tn916 que vale la pena considerar es, si la transferencia
se produjo sin la escisin a partir del cromosoma entonces, se esperara que la
movilizacin del cromosoma ocurriera con la transferencia incompleta del transposn.
Transferencia comienza a partir de oriT y tendra que trabajar justo a la vuelta del
cromosoma antes de llegar al resto del transposn. Esto no parece suceder. La razn es
que el promotor para la expresin de los genes tra se encuentra hacia el extremo
izquierdo del transposn (en la Fig. 9) y se encuentra lejos de los genes tra. En la forma
lineal no se pueden expresar los genes tra. Sin embargo, cuando el transposn se
escinde del cromosoma y es circularizado, esto trae al promotor a la posicin y orientacin
correcta para la transcripcin de los genes tra. Por lo tanto, se expresan a partir del
intermediario circular, pero no de la forma lineal. Esto asegura que el sistema de
transferencia slo se activar despus de haberse producido la escisin.

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Escisin
Donador

Iniciacin
de la transferencia
a partir de oriT

Hebra sencilla
transferida y
circularizada
Sntesis de
la segunda
hebra
Receptor
Integracin

Figura 9. Transferencia del transposn conjugativo Tn916. El transposn se escinde del


cromosoma, usando las enzimas Int y Xis y posteriormente es circularizado. Esto permite
a los genes tra ser expresados a partir del promotor mostrado y la transferencia por
conjugacin se inicia a partir de oriT. En el receptor, el ADN transferido es circularizado, la
segunda hebra se hace y el transposn se integra en el cromosoma (Dale y Park 2004).

Tn916 es el prototipo de una familia de transposones conjugativos relacionados que son


especialmente extendido en cocos Gram-positivos, aunque los elementos relacionados
tambin se producen en bacterias Gram-negativas (por ejemplo, Bacteroides). Para
muchos de estos elementos, incluyendo Tn916, la transmisin conjugativa es promiscua
ya que se puede transferir a otras especies o gneros. Es de suponer, pues, que los
transposones conjugativos han jugado un papel importante en la difusin de material
gentico, incluidos los genes de resistencia a antibiticos en todo el reino bacteriano. En

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particular, muchos de estos transposones, incluyendo Tn916, llevan un gen de resistencia


a tetraciclina (tetM) que se encuentra en una amplia gama de especies bacterianas, lo
que sugiere que han desempeado un papel en la dispersin de este gen en particular.

2.1.4. Transduccin
Transduccin es la transferencia mediada por fagos de material gentico. El paso clave
en la transduccin es el envase de ADN en las cabezas de fagos durante el crecimiento
ltico del fago. Este proceso es normalmente altamente especfico para el ADN del fago.
Sin embargo, con algunos fagos, los errores pueden ocurrir en fragmentos de ADN
bacteriano (producido por la degradacin del cromosoma del husped mediada por fagos)
se empaquetan de vez en cuando por error conduciendo a partculas tipo fago que
contienen un segmento de genoma bacteriano (vase la Figura 10).
Estas partculas de transduccin son capaces de infectar una clula receptora, ya que la
informacin necesaria para la unin y la inyeccin de ADN se realiza por las protenas de
la partcula del fago, cualquiera que sea el cido nucleico que contenga. El segmento de
ADN transducido se puede inyectar en una nueva clula husped.
No todos los bacterifagos son capaces de llevar a cabo la transduccin. Los requisitos
bsicos de un fago transductor eficaz son que, la infeccin debera dar como resultado un
nivel apropiado de la degradacin del ADN cromosmico para formar fragmentos de
tamao adecuado en el momento adecuado para el envasado y que la especificidad del
proceso de envasado debe ser comparativamente baja.
En algunos casos, el ADN transducido es un plsmido bacteriano, en cuyo caso la
molcula de ADN inyectado es capaz de ser replicado y heredado. Ms comnmente el
ADN incorporado en la partcula de transduccin es un fragmento de ADN cromosmico
que ser incapaz de replicarse en la clula receptora. Para que sea replica y heredada,
debe ser incorporada en el cromosoma receptor (por recombinacin homloga), como es
el caso con otros mecanismos de transferencia de genes.
Este proceso se conoce como transduccin generalizada (en oposicin a la transduccin
especializada), ya que prcticamente cualquier gen tiene la misma probabilidad de ser
transducido.

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Bacteria donadora

Replicacin de ADN
Sntesis de partculas del fago

Infeccin ltica

Empaquetamiento del ADN


Dentro de las cabezas de los
fagos
Lisis
Partcula
transductora

Incorporacin del
ADN cromosomal

Infeccin del
receptor

Recombinacin con
el ADN del husped
Fragmento de ADN
transducido

Figura 10. Transduccin generalizada (Dale y Park, 2004).


Transduccin especializada
Algunos fagos (fagos atenuados) son capaces de establecer un estado conocido como
lisogenia, en la que se reprime la expresin de genes del fago y de replicacin del fago.
En muchos casos, el profago se inserta en el ADN bacteriano y se replica como parte del
cromosoma. Cuando empieza la lisogenia y el fago entra en el ciclo ltico, que se escinde
del cromosoma por recombinacin entre las secuencias en cada extremo del profago
integrado. Si este evento de recombinacin ocurre en el lugar equivocado, una regin
adyacente de ADN bacteriano se incorpora en el ADN del fago. Toda la progenie de este
fago contendr entonces este gen bacteriano que por lo tanto, ser transducido a una
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frecuencia muy alta (efectivamente 100 por ciento por partcula de fago) una vez que el
fago transductor ha sido aislado. Dado que el ADN transferido se limita a una regin muy
pequea del cromosoma, el fenmeno se conoce como transduccin especializada (o
restringida). Esto es muy similar a la formacin de plsmidos F' mencionados
anteriormente (vase la Figura 8). Al igual que con los plsmidos F', ahora es mucho ms
fcil aadir genes lambda ADN creando recombinantes in vitro.
Otro fago que se ha empleado de forma similar es el fago Mu que tiene la ventaja de
insertarse en mltiples sitios en el cromosoma por un mecanismo tipo transposn. Por lo
tanto, es mucho ms fcil para crear una amplia gama de fagos transductores
especializados con Mu que se puede utilizar tanto en el mapeo gentica y en
mutagnesis.

2.1.5. Resistencia a drogas


Durante los ltimos aos el pblico est cada vez ms alarmado por los nuevos datos
cientficos en los medios de comunicacin sobre la conexin entre el abuso drogas en la
medicina, la industria agroalimentaria y la agricultura, y la aparicin y propagacin de
bacterias resistentes a drogas. La resistencia de bacterias a drogas va en aumento. Ms
de 150 drogas antibacterianas estn disponibles, los cuales se clasifican en 20 diferentes
clases y 10 de estas clases tienen objetivos especficos de accin, incluyendo las paredes
y membranas celulares, cidos nucleicos y protenas y la sntesis de cido flico. Con un
menor nmero de nuevas drogas que llegan al mercado, el problema de resistencia a
drogas que ya estn en uso se ha convertido en una crisis de salud pblica. Un estudio
estima que los costos hospitalarios directos de la gestin de resistencia a drogas en los
Estados Unidos son de $ 100 a 10,000 millones de dlares al ao, y la Oficina de
Evaluacin de Tecnologas de Estados Unidos ha estimado que los costos hospitalarios
mnimos de 5 tipos de infeccin nosocomial (por ejemplo, infeccin de la herida quirrgica
y la neumona) debido a la resistencia a drogas fueron de $ 4500 millones de dlares por
ao.

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La resistencia microbiana a drogas va en aumento, en parte, debido al uso inadecuado de


los antibiticos en medicina, as como tambin a las prcticas inadecuadas de la industria
agrcola, donde la produccin animal intensiva implica dar a los animales de ganado
grandes cantidades de drogas (antibiticos) para promover el crecimiento y prevenir
infecciones. Estos usos promueven la seleccin de resistencia a antibiticos en
poblaciones bacterianas. Las bacterias resistentes de entornos agrcolas pueden ser
transmitidas a los seres humanos, en los que causan la enfermedad que no puede ser
atendida por los antibiticos convencionales que actualmente existen en el mercado.
Se necesitan dos condiciones para para desarrollar resistencia a drogas en bacterias. En
primer lugar, el organismo debe entrar en contacto con la droga. Entonces, la resistencia
contra el agente se debe desarrollar, junto con un mecanismo para transferir la resistencia
a la progenie o directamente a otros miembros de la misma especie.
Cada droga acta en un sitio especfico dentro de la clula bacteriana. Por ejemplo,
algunos se dirigen a las paredes celulares (por ejemplo, bacitracina, cefalosporinas y
penicilinas), otras tienen como blanco la membrana celular (por ejemplo, los ionforos y
polimixinas), componentes de las clulas responsables de la sntesis de protenas (por
ejemplo, aminoglicsidos, cloranfenicol y tetraciclina), ARN (por ejemplo, rifamicinas),
ADN (por ejemplo, cido nalidxico y quinolonas) o particulares vas bioqumicas tales
como la sntesis de cido flico (por ejemplo, metotrexato y sulfonamidas). Por lo tanto,
cuando surgen organismos resistentes, su resistencia es especfica a drogas particulares.
Las bacterias han desarrollado diversos mecanismos para transmitir rasgos de resistencia
a otros miembros de su propia especie y para otras especies. Rasgos genticos para la
resistencia a drogas se codifican en dos lugares en bacterias: los cromosomas y los
elementos extra-cromosmicos (plsmidos y transposones). Las mutaciones pueden
provocar que los genes cromosmicos que por lo general codifican para sensibilidad a las
drogas, comiencen a codificar resistencia; tales mutaciones se producen a razn de uno
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por milln a uno por mil millones de clulas. Los elementos extra-cromosmicos
(plsmidos y transposones) son piezas ms pequeas de ADN circular, cada uno
equivalente en tamao a aproximadamente 1% del cromosoma bacteriano. Los plsmidos
pueden ser no conjugativos o conjugativos; este ltimo puede moverse desde una
bacteria a otra.
El intercambio gentico es otro mecanismo por el cual los plsmidos resistentes a drogas
se pueden mover entre bacterias (Figuras 6, 7 y 9). Algunas bacterias son consideradas
como "promiscuas", porque una vez que han adquirido plsmidos resistentes a drogas,
realizan la transferencia de la resistencia tanto entre la misma especie como con otras
especies bacterianas con independencia del medio ambiente (es decir, si las drogas estn
presentes o no).
Transferencia inusual de secuencias de ADN resistentes a los antibiticos entre especies
bacterianas y entre los diferentes nichos ecolgicos (por ejemplo, entre los seres
humanos y rumiantes) se han documentado. Por ejemplo, en Staphylococcus aureus, una
bacteria gram-positiva, el gen cromosmico para la resistencia a la meticilina se origin
como un gen de -lactamasa estafiloccica y un segmento de un gen de unin a penicilina
procedentes de una bacteria donante desconocido, tal vez Escherichia coli, un gramo
bacteria-negativo.
En lo que se refiere a mecanismos de resistencia, algunas especies de bacterias son
intrnsecamente insensibles a ciertos antibiticos, mientras que otras son sensibles. La
sensibilidad tiene 3 requisitos: 1) un objetivo para la reaccin, 2) un mecanismo para el
transporte en la clula antes de la accin de los antibiticos y 3) la ausencia de enzimas
que podran inactivar o modificar el antibitico. Un cambio en cualquiera de estos
requisitos previos podra hacer que una bacteria se vuelva resistente a la droga o
antibiotico. Por ejemplo, una o ms mutaciones pueden ser adquiridas al cambiar el
objetivo de la accin, la captacin, el flujo de salida de extrusin de los antibiticos, o la
capacidad de la bacteria para inactivar o modificar el antibitico.
Los frmacos antimicrobianos utilizados para la terapia humana a menudo tienen
importantes similitudes estructurales a los que se usan para los animales, lo que lleva a la
posibilidad de problemas adicionales. Por ejemplo, la resistencia a la ormetoprim, un
medicamento veterinario, podra fomentar la resistencia a la trimetoprima, un compuesto
estructuralmente similar que se especifica para su uso en seres humanos.
Las bacterias resistentes a la estreptogramina, quinupristina y dalfopristina se han
encontrado en los pavos que se haban dado virginiamicina, pero no cualquiera de los
otros antibiticos, sin embargo, todos estos compuestos tienen una estructura similar.

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El uso de alimentos para animales suplementado con tilosina se ha traducido en el


desarrollo de resistentes cepas resistentes a eritromicina de estreptococos y
estafilococos, no slo en los animales, sino tambin en sus cuidadores.

2.2. Herramientas en la clonacin y expresin de genes para obtener


bacterias recombinantes
La gentica bacteriana est pasando por una fase interesante de su historia. Las nuevas
metodologas y comprensin concomitante de la biologa molecular han dado a los
cientficos nuevos conocimientos que hasta ahora es complicado estimar su impacto final.
La gentica bacteriana se est convirtiendo en una herramienta poderosa para el estudio
de sistemas genticos diferentes al de las mismas bacterias, as como desarrollo de
procesos aplicables a problemas especficos a nivel industrial, ecolgicos, farmacuticos,
u otros problemas especficos en desarrollo (por ejemplo, problemas de fermentacin y
problemas bioqumicos).
As, dentro de la gentica bacteriana hay varias herramientas, algunas de las cuales
sern abordadas en los presentes tpicos.

2.2.1. Los plsmidos como vectores de clonacin


La constitucin genmica de varias bacterias puede consistir en dos componentes, a
saber, el cromosoma que lleva los genes para todas las funciones esenciales y su
regulacin, y de una unidad cromosmica adicional pero autnoma denominado plsmido
que inicialmente se pens para llevar las funciones necesarias para su propia replicacin,
mantenimiento, y distribucin. Sin embargo, los plsmidos no deben ser considerados
molculas egostas o promiscuas ya que muchos de ellos se han descrito para transportar
genes que proporcionan funciones de ventaja selectiva. Por ejemplo, se pueden codificar
resistencia a varios agentes antimicrobianos, tales como antibiticos, metales pesados o
toxinas, o para la produccin de antibiticos, pigmentos, toxinas, H2S, y otros, o pueden
proporcionar capacidades catablicas inusuales, o dotar fertilidad, etc. Tambin pueden
inducir tumores de plantas, y otras respuestas simbiticas y patgenas en plantas y
animales, para nombrar unos pocos. Adems, un plsmido tambin puede llevar algunos
genes esenciales.
Los plsmidos han jugado un papel muy importante en la evolucin bacteriana ya que
clula que contuvo, en su momento, un plsmido puede haber tenido una ventaja
adaptativa sobre las bacterias libres de plsmidos. En los ltimos aos, su importancia se
ha incrementado enormemente debido a su aplicacin en la investigacin en ingeniera
gentica como un portador de ADN recombinante, y les ha trado reconocimiento

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generalizado. Una clula bacteriana puede o no llevar a un plsmido o puede llevar ms


de un tipo o de copias de un plsmido. Los plsmidos que a menudo han sido
comparados con los organismos vivos mediante la aplicacin de los mismos atributos que
se hace en busca de virus. Por lo tanto, un organismo'' es el elemento unidad de un linaje
continuo con una historia evolutiva individuo''. Esta definicin se ajusta muy bien sobre los
virus, plsmidos, y ciertos transposones, todos los cuales han sido considerados para
pertenecer a una familia de organismos primitivos. La caracterstica comn entre estas
unidades es su replicacin, el mantenimiento, y la difusin.
As, los plsmidos son molculas circulares de ADN de doble cadena que constituyen una
unidad de replicacin independiente del cromosoma, razn por la que pueden presentarse
en ms de una copia dentro de la clula bacteriana. Los plsmidos representan uno de los
principales agentes que contribuyen en la diseminacin de la resistencia antimicrobiana.
Contribuyen en la expansin de importantes determinantes de resistencia, promueven la
transferencia de genes horizontal entre especies no relacionadas, Curiosamente, los
plsmidos fueron identificados en cepas de bacterias no relacionadas que se aislaron de
reas geogrficamente muy separadas sin ningn problema epidemiolgico involucrado.
Los plsmidos provienen de familias de bacterias que prevalecen importantemente en
forma natural, normalmente poseen mltiples determinantes genticos que les confieren a
las bacterias la resistencia a mltiples clases de antibiticos. Pero adems contienen
factores de virulencia y sistemas adicionales que promueven su estabilidad y
mantenimiento en la bacteria hospedera en diferentes condiciones ambientales (Carattoli
2013).

La caractersticas transmitidas por los plsmidos que ha sido ms estudiada, es el de la


resistencia a los drogas (Figura 11). Muchas bacterias pueden volverse resistentes a
drogas por la adquisicin de un plsmido. Aunque no todas las resistencias a antibiticos
son transferidas por plsmidos como lo es la resistencia a algunos frmacos tales como el
cido nalidxico y la rifampicina (en ambos casos, la resistencia se produjo por la mutacin
del gen que codifica para la protena blanco en ambos casos). Los genes involucrados en
la resistencia a antibiticos son muchos y variados, que van desde enzimas llamadas beta
lactamasas codificadas en plsmidos que destruyen las penicilinas, hasta protenas de
membrana que reducen la acumulacin intracelular de tetraciclina. La capacidad de los
plsmidos para ser transferido de una bacteria a otra, a veces incluso entre especies muy

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diferentes, ha contribuido en gran medida a la amplia difusin de genes de resistencia a


antibiticos. Las bacterias pueden volverse resistentes a un nmero variado de
antibiticos, ya sea por la adquisicin de varios plsmidos independientes o mediante la
adquisicin de un nico plsmido con muchos determinantes de resistencia en l. Se cree
que los transposones han desempeado un papel importante en el desarrollo de
plsmidos con resistencia a drogas, mediante la circulacin, entre diferentes plsmidos,
de los genes responsables de la resistencia a drogas o directamente a partir del
cromosoma de un organismo resistente, copiado y transmitido, naturalmente, en un
plsmido.
Se debe apreciar que tambin se producen otros mecanismos de resistencia a drogas y
que tal resistencia no siempre es debido a plsmidos: de hecho muchas de las bacterias
que actualmente estn causando problemas en hospitales debido a infecciones cruzadas
son o bien intrnsecamente resistentes o deben su resistencia a drogas por genes
cromosmicos propios.

Figura 11. La resistencia a una droga es el resultado de una recombinacin exitosa

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Unidad 2. Transferencia de material gentico y seleccin bacteriana

2.2.2. Bacterifagos
Los bacterifagos (fagos o para abreviar) son simplemente los virus que infectan
bacterias. Ellos jugaron un papel central en el desarrollo de la biologa molecular,
especialmente en nuestra comprensin de la estructura del gen, la expresin y son
tambin importantes en el laboratorio y en la naturaleza como proveedores de medios por
los cuales los genes se pueden transferir de una bacteria a otra. Con el desarrollo de la
clonacin de genes, los fagos se llevaron en un papel adicional como vectores para la
clonacin de ADN.
En muchas de sus propiedades bsicas, los fagos son similares a otros virus. Ellos
contienen ARN o ADN encerrado en una capa de protena. El fago infecta mediante la
unin a un receptor especfico en la superficie de la bacteria y el cido nucleico entra en la
clula. Algunos de los genes del fago (los genes tempranos) se expresan casi de
inmediato, utilizando enzimas del husped pre existentes, en general, stos codifican para
las protenas necesarias para la replicacin del cido nucleico del fago. A continuacin, se
realizan varias copias del cido nucleico del fago, y la expresin de los genes tardos
comienza: estos genes son los que se necesitan para la produccin de la partcula del
fago. La naturaleza de la transicin desde la primera expresin del gen a la expresin
tarda del mismo vara entre diferentes fagos. Las partculas de fago se ensamblan y la
clula sufre lisis, liberando una serie de partculas de fago, cada uno de los cuales pueden
luego pasar a infectar otra clula bacteriana (vase la Figura 12).
Inyeccin del ADN del Fago

Infeccin

Replicacin del ADN


Sintsis de partculas
del fago

Lisis

Empaquetamiento
del ADN en las
cabezas del fago

Figura 12. Crecimiento ltico de bacterifagos (Dale y Park, 2004).

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Unidad 2. Transferencia de material gentico y seleccin bacteriana

Si un bacterifago infecta un cultivo lquido de bacterias, puede dar como resultado un


aclaramiento completo del medio. Por otro lado, si las bacterias estn esparcidas en la
superficie de una placa de agar, las partculas de fago liberadas de una clula infectada
individual slo ser capaces de infectar a bacterias vecinas que se traducir en un
aclaramiento localizado en las cercanas de la colonia bacteriana, misma que son
conocidas o referidas como placas. Esto nos permite determinar la concentracin de
partculas de bacterifago en una suspensin (esto recibe el ttulo de fago), usando la
suposicin de que el nmero de placas se corresponde con el nmero de partculas de
bacterifagos presentes en la muestra. Dado que la suposicin no siempre es vlida, los
resultados se expresan generalmente en trminos de Unidades Formadoras de Placa, o
UFP.
En la prctica, dichos ensayos son realizados generalmente con el cultivo bacteriano (las
clulas indicadoras) y el fago suspendido en agar blando que se vierte como una
sobrecapa en la parte superior de una placa de agar, en lugar de esparcirla en la
superficie. Esto le da a una placa de tres dimensiones, que es ms fcil de ver.
Algunos bacterifagos, tales como (lambda), no siempre entran en el ciclo ltico descrito
anteriormente. Estos fagos son llamados temperamentales y pueden establecer una
relacin ms o menos estable con la clula husped, conocido como lisogenia. En este
estado, casi todos los genes del fago estn completamente reprimidos, como es la
replicacin del cido nucleico, por lo que no se producen partculas de fago hasta que se
rompe el estado lisognico una vez ms. Los bacterifagos temperamentales por lo
general producen placas en una capa de agar utilizando un indicador bacteriano
adecuado ya que muchas de las clulas infectadas se lisan en lugar de convertirse
lisognicas. Sin embargo, como las clulas que entran en el estado lisognico seguirn
creciendo (y son ms resistentes a una posterior infeccin), las placas sern turbias en
lugar de las placas claras se observan con un fago virulento (por ejemplo, un fago que no
puede establecer lisogenia).
Muchos fagos se han caracterizado en mayor o menor medida, los principales ejemplos
son todos los virus que infectan a E. coli. Estos vienen en una variedad de formas y
tamaos como se muestra en la Figura 13, incluyendo estructuras simples y pequeas
como X174 y MS2 a estructuras ms complejas con cabezas y colas identificables
(lambda, T4) y estructuras filamentosos tales como M13.

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Gentica molecular bacteriana


Unidad 2. Transferencia de material gentico y seleccin bacteriana

Figura 13. Morfologa de algunos bacterifagos seleccionados. Hay que hacer notar que
la estructura filamentosa del fago M13 es muy larga y no puede ser tomada su
representacin en este esquema como representativa de su verdadero tamao (Dale y
Park, 2004).
La partcula de fago se compone de una molcula de cido nucleico contenido dentro de
una capa de protena. En los fagos ms simples, tales como MS2, la capa contiene un
nmero de copias de una sola protena importante que esencialmente polimeriza
espontneamente. La forma en que se asocian define tanto la forma como el tamao de la
partcula del fago. En principio, estructuras filamentosas tambin se pueden producir por
polimerizacin espontnea de subunidades proteicas, pero esto no es suficiente para
definir la longitud del filamento. Una forma comn de asegurar que se producen
filamentos de una longitud definida es utilizar una plantilla o molde, alrededor de la cual la
protena se polimeriza. Con fagos filamentosos tales como M13 el ADN del fago
proporciona la plantilla o molde.
El montaje de M13, donde las protenas de la cubierta del fago se polimerizan alrededor
del ADN, hace un marcado contraste con fagos ms grandes, tales como (lambda) y T4,
en donde el DNA se empaqueta en cabezas de fagos vacos pre formados y por lo tanto
el tamao de la cabeza del fago se define por las protenas de las que est compuesto. El
tamao y la complejidad de estas estructuras requiere un enfoque diferente para su
produccin, la polimerizacin espontnea sera demasiado ineficiente y las estructuras
son generalmente inestables hasta que estn completas. El ensamblaje de estos fagos se
dirige por lo tanto por la presencia temporal de un nmero de protenas adicionales, que
se eliminan antes de la maduracin final del fago (vase la Figura 14). Estos
componentes que ayudan con el montaje, pero no estn presentes en la partcula final se
denominan protenas de andamiaje.

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Gentica molecular bacteriana


Unidad 2. Transferencia de material gentico y seleccin bacteriana

Montaje del
andamio

Eliminacin del andamio

Subunidad
de la cpside
Ensamble

Estructura
madura

Figura 14. Montaje del andamiaje. Ensamble de fagos complejos con la asistencia de
protenas andamios. Estas se eliminan una vez ensamblado la estructura (Dale y Park
2004).
Los bacterifagos tambin difieren en la naturaleza de su contenido de cido nucleico.
Los fagos M13 y X174 contienen ADN circular de cadena sencilla, MS2 tiene un genoma
de ARN, mientras y las partculas del fago T4 contienen ADN de doble hebra.

2.2.3. Cepas bacterianas


Acorde a lo revisado, los procariontes modifican su expresin gentica acorde a las
condiciones ambientales, ya sea promoviendo o inhibiendo la sntesis de protenas. Estos
mecanismos determinan la variacin fenotpica, lo cual se manifiesta con cambios en el
fenotipo celular o de la poblacin procarionte. A su vez, tambin tienen mecanismos de
variacin genotpica, que sern igualmente traducidos en cambios fenotpicos, pero que
se basan en una modificacin de la informacin gentica contenida en la clula (Betancor
et. al. 2006).
La diversidad gentica en ltima instancia, puede explicar la variabilidad fenotpica en la
mayora de las bacterias, como la distribucin geogrfica, la especificidad de husped, de
patogenicidad o resistencia a los antibiticos, y la virulencia. Esto, nos lleva a la
generacin de variantes, la seleccin de variantes con propiedades deseables y el surtido
de caractersticas entre las cepas por intercambio gentico. Por ende, a la aplicacin de
programas de mejora de cepas de microorganismos comercialmente tiles, sobre todo
para aumentar la formacin de un producto deseado (Li, et.al. 2009).
Se definir, antes de proseguir, que es una cepa bacteriana. De acuerdo con la primera
edicin del Manual de Bergeys de Bacteriologa sistemtica, una cepa se compone de
los descendientes de un solo aislamiento en cultivo puro y por lo general se compone de
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Unidad 2. Transferencia de material gentico y seleccin bacteriana

una sucesin de cultivos que en ltima instancia son derivados de una sola colonia inicial
(Dijkshoorn et al. 2000).
As, dada esta definicin, podemos mencionar que hay cuatro tipos de bacterias, de las
cuales se obtienen cepas bacterianas de inters prctico para la actividad humana. Estos
tipos de bacterias son:
Staphylococcus aureus
El Staphylococcus aureus es una bacteria Gram positiva de forma esfrica que crece
entre los 10 y45C, con un pH de entre 4 y 9. Sin embargo, su temperatura ptima de
desarrollo est comprendida entre los 30 y 37C, y el rango ptimo de pH oscila entre 7 y
7,5.A pesar de no ser esporgenas, las bacterias estafilococos muestran una notable
resistencia a las condiciones ambientales desfavorables. Generalmente, se encuentra en
el agua, en la piel y en las mucosas. Cuando se introduce en nuestro organismo, puede
generar infecciones de distinta naturaleza.
Las infecciones provocadas por el Staphylococcus aureus, contradas en ambientes
hospitalarios, suelen estar causadas por estpites resistentes a las quimioterapias y, a
menudo, se manifiestan en forma epidmica. El brote de estas epidemias puede significar,
en determinadas salas, un evento de particular gravedad, que puede ocasionar serios
problemas profilcticos y teraputicos (Suzuki et. al. 2012, Rolo et. al. 2012).

Escherichia coli (E.coli)


Pertenece a la familia de las Enterobacteriaceae, microorganismos Gram negativos
ubiquitarios, que se encuentran en el suelo, el agua, la vegetacin y forman parte de la
flora intestinal de la mayor parte de los animales, incluido, el ser humano. Su cultivo es
muy sencillo y presenta una gran tolerancia de variacin de pH, con un valor ptimo de
7.5; la temperatura ideal de crecimiento es 37C. Esta bacteria es resistente al calor:
temperatura de encubado 45C.
El Escherichia coli es un husped habitual del organismo humano y representa la especie
predominante de la comunidad bacteriana facultativa que reside en el intestino grueso;
por ello, su presencia en un material determinado (por ejemplo, agua) puede considerarse
un indicio seguro de contaminacin fecal (Jafari et. al. 2012, Pobiega et. al. 2013).

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Pseudomonas aeruginosa
La Peudomonas aeruginosa es una bacteria Gram negativa, que crece a temperaturas
que oscilan entre los 4 y 42C. Sin embargo, no puede desarrollarse con un pH inferior a
4,5. Generalmente se le encuentra en el agua, el suelo y, como husped, en la piel y el
intestino. Su desarrollo se vea favorecido por cualquier tratamiento con medicamentos
antibacteriales, ya que su desarrollo se ve favorecido por cualquier antibitico. Al reducir
el resto de la poblacin microbiana, permite que la bacteria incremente su nmero; bajo
otras circunstancias, este incremento resultara imposible (Haynes 1951).

Enterococcus faecalis
Dentro de las especies de procariontes clasificadas como Gram positivas, los enterococos
representan una especie que suele estar presente de forma natural en la microbiota
intestinal de los animales, aunque tambin pueden estar presentes en las plantas e
insectos. Acorde a lo anterior suelen ser empleados como indicadores de contaminacin
fecal en el agua y en los alimentos. Las condiciones de crecimiento que las favorecen,
involucran temperaturas entre los 10o y los 45o, incluso pueden sobrevivir a 60o durante un
tiempo de 30 minutos; en medios con soluciones de NaCl al 6,5% y pH de 9,6.
Los enterococos son bacterias dotadas de un bajo poder patgeno pero poseen genes
que codifican la resistencia a algunos antibiticos y, por consiguiente, logran sobrevivir en
ambientes en los que stos son muy utilizados. De hecho, en los ltimos 15 aos, han
sido frecuentemente causa de infecciones hospitalarias (Jett et. al. 1994).
Las cepas bacterianas relacionadas con las bacterias relacionadas anteriormente se
presentan en la siguiente tabla:
Nombre de cepa

Nmero
Identificacin

Escherichia coli O157:H7

Sin nmero

Escherichia coli

ATCC 25922

Escherichia coli

ATCC 35218

Enterococcus faecalis

ATCC 29212

Enterococcus faecalis

ATCC 51299

Pseudomonas aeruginosa

ATCC 27853

Caracterstica
Bacilo gramnegativo
Enteropatgeno Grupo E. coli
Enterohemorrgico, ECEH. Cepa
No Toxignica
Bacilo gramnegativo, familia
Enterobacteriaceae
Bacilo gramnegativo
Familia Enterobacteriaceae
Coccea grampositiva
Coccea grampositiva, resistente a
vancomicina fenotipo Van B.
Bacilo gramnegativo, no

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Staphylococcus aureus

ATCC 25923

Staphylococcus aureus

ATCC BA 976

Staphylococcus aureus

ATCC BA 977

fermentador (BNF)
Coccea grampositiva, en racimo
Coccea grampostiva, negativa
resistencia inducible a clindamicina.
gen msrA
Coccea grampostiva, positiva
resistencia inducible a clindamicina.
gen ermA

* Las siglas ATCC significan American Type Culture Collection.

Como las cepas bacterianas suponen cada vez mayores retos para la salud humana,
incluyendo aumento de la virulencia y la transmisibilidad, la resistencia a mltiples
antibiticos, la expansin de los espectros de acogida, y la posibilidad de manipulacin
gentica para el bioterrorismo. Se han creado nuevas herramientas para la tipificacin de
cepas bacterianas o la identificacin de las bacterias a nivel de cepa, es particularmente
importante para el diagnstico, tratamiento y vigilancia epidemiolgica de las infecciones
bacterianas. Este es especialmente el caso para las bacterias que exhiben altos niveles
de resistencia a los antibiticos o la virulencia, y aquellos implicados en las infecciones
nosocomiales o pandemias.
As, durante las dos ltimas dcadas, los mtodos moleculares han reemplazado
progresivamente ensayos fenotpicos para describir cepas bacterianas. En teora, hay dos
sistemas de tipificacin distintos: fenotipificacin y genotipificacin. El fenotipo bacteriano
es determinado por la morfologa de las colonias en diversos medios de cultivo, pruebas
bioqumicas, serolgicas, patogenicidad y susceptibilidad a los antibiticos. Ms
recientemente, la genotipificacin, que se refiere a la discriminacin de las cepas
bacterianas en funcin de su contenido gentico, se ha convertido en la tipificacin
ampliamente utilizada para una cepa bacteriana debido a su alta resolucin. El perfil
gentico de una cepa dada generada por un mtodo de determinacin del genotipo
especfico puede ser tan nico como una huella dactilar. Por lo tanto, genotipificacin
tambin se conoce como huella de ADN.
Mtodos de caracterizacin de cepas bacterianas actuales pueden clasificarse en tres
categoras principales: patrn de bandas de ADN, secuenciacin de ADN, y los mtodos
basados en la hibridacin de ADN. Los mtodos basados en el patrn de bandas ADN
discriminan las cepas estudiadas sobre la base de las diferencias en el tamao de las
bandas de ADN (fragmentos) generados por la amplificacin de ADN genmico o
mediante la escisin de ADN utilizando enzimas de restriccin (ER).

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Unidad 2. Transferencia de material gentico y seleccin bacteriana

Los mtodos basados en la secuenciacin de ADN generan una secuencia original de


nucletidos y discrimina entre las cepas bacterianas directamente de polimorfismos en el
ADN. Los mtodos basados en la hibridacin de ADN se refiere principalmente a que el
estudios de microarreglos de ADN. En esta tcnica, las cepas bacterianas se discriminan
por el anlisis de la hibridacin de su ADN para sondas de secuencias conocidas.
Con la excepcin de la secuenciacin del genoma, la capacidad discriminatoria de
mtodos de genotipificacin es dependiente de la especie (Li et. al. 2009)

2.2.4. Seleccin de bacterias recombinantes por resistencia a drogas


Con objeto de identificar el xito de la recombinacin, resulta fundamental revisar el
concepto de seleccin, ya que cuando se trata de examinar una poblacin bacteriana
(ms de 108 clulas/mL promedio en un cultivo celular) no es factible realizar un anlisis
macroscpico, ya que en muchas ocasiones los cambios involucrados suelen ser a nivel
de una ruta metablica y resulta imposible distinguir un cambio fsico a simple vista en la
poblacin bacteriana. Por tanto, valorar el crecimiento en determinadas condiciones
nutrimentales o bien ambientales, resulta ser una excelente estrategia, ya que solo
aquellas clulas que hayan adquirido un nuevo fenotipo (una o ms caracterstica
observables) como resultado de la transferencia de ADN sern capaces de crecer y
dividirse en dichas condiciones. Ejemplos de agentes de seleccin utilizados para prevenir
el crecimiento de las clulas parenterales (aquellas que carecen de ADN recombinante)
son: antibiticos, bacterifagos y pueden requerir de factores de crecimiento (Birge 2006).
Ahora bien la eleccin de dichos agentes para la seleccin bacteriana va a depender del
sistema de expresin que se utilice, es decir, en el caso de un plsmido, el uso de un
antibitico determinado depender de que dicho vector de expresin tenga el gen que le
confiere la resistencia al antibitico (Figura 11).
A continuacin se presentan los pasos generales para determinar el xito del evento de
transferencia del material gentico a travs de valorar su transmisin a la progenie por su
resistencia a una droga que fue adquirida por la clula receptora, siendo el principio para
la obtencin de una bacteria genticamente modificada.

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Unidad 2. Transferencia de material gentico y seleccin bacteriana

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Unidad 2. Transferencia de material gentico y seleccin bacteriana

Actividad 1. Uso y manejo de GMO


Con la finalidad de confirmar el aprendizaje de los conceptos revisados, debers discutir
con tus compaeros(as) sobre el uso y manejo de los organismos genticamente
modificados. Plantears una postura y argumentars tu aportacin en funcin de la
lectura de un artculo previamente proporcionado.

1. Revisa detenidamente el siguiente artculo:


Comit de Biotecnologa de la Academia Mexicana de Ciencias (2007). Por un
uso responsable de los organismos genticamente modificados. Recuperado de:
http://www.ibt.unam.mx/computo/pdfs/por_un_uso_responsable_ogms.pdf
Si lo deseas, puedes descargarlo desde la pestaa de la unidad.

2. Ingresa al foro destinado a la actividad y elabora una aportacin que desarrolle


los siguientes puntos:
a) Asume una postura ante el uso y manejo de los GMO.
b) Justifica tu postura indicando:
i.
Por lo menos una ventaja o desventaja del uso y manejo de los GMO.
ii.
Un ejemplo o producto de GMO.
iii.
Una implicacin ambiental del uso y manejo del GMO o producto
GMO.
iv.
Una perspectiva de esta aplicacin.
3. Brinda un comentario a dos compaeros, tomando como base los puntos
solicitados.
4. No olvides ser claro y breve en tus participaciones, abarcando slo los aspectos
que realmente consideres relevantes.
*Recuerda que puedes descargar la rbrica general para actividades en el Foro en la
pestaa de la unidad.

Actividad 2. Transferencia de material gentico (Tarea)


Se revisaron trminos necesarios para la comprensin de los mecanismos de
transferencia de la informacin gentica, conceptos tericos esenciales para realizar
estrategias de biologa molecular y tecnologa recombinante.
Para demostrar que puedes describir los conceptos revisados, debers realizar la
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Unidad 2. Transferencia de material gentico y seleccin bacteriana

siguiente actividad:
1. Elabora un cuadro comparativo en el que describas las tres estrategias de
transferencia de material gentico donde incluyas las diferencias y similitudes
entre las mismas.
2. Compara las ventajas de cada tipo de mecanismo de recombinacin bacteriana
y describe un ejemplo en cada caso, puedes apoyarte en imgenes.
3. Guarda tu trabajo en un archivo de Power point y envalo a la seccin Tareas
con la siguiente nomenclatura: BGMB_U2_A2_XXYZ.
4. Espera la retroalimentacin de tu Facilitador(a), quien aportar elementos
importantes para perfeccionar tu trabajo.
* Consulta la rbrica de evaluacin para conocer los criterios con los cuales ser
calificado tu trabajo.

Autoevaluacin
Realiza el siguiente cuestionario de autoevaluacin para medir tu aprovechamiento de
los temas estudiados a lo largo de la unidad 2. Al finalizar, compara tus resultados.
Encontrars las respuestas correctas junto con los materiales de la asignatura.
1. La recombinacin de material gentico es un evento que promueve:
a)
b)
c)
d)

Mantener sin cambios a las clulas involucradas


La adquisicin de nuevas funciones
Conservar la misma informacin del ADN
La obtencin de nuevas protenas pero iguales genes

2. Mecanismo de transferencia que requiere clulas competentes:


a)
b)
c)
d)

Conjugacin
Transduccin
Replicacin
Transformacin

3. Los plsmidos suelen utilizar para su recombinacin:


a) Conjugacin
b) Transduccin
c) Replicacin
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Unidad 2. Transferencia de material gentico y seleccin bacteriana

d) Transformacin
4. Tipo de recombinacin en el que participan bacterifagos:
a)
b)
c)
d)

Conjugacin
Transduccin
Replicacin
Transformacin

5. Son los principales causales de la resistencia a drogas:


a)
b)
c)
d)

Bacterifagos
Plsmidos
Factores de virulencia
Todas las anteriores

6. Un vector de clonacin:
a)
b)
c)
d)

Es capaz de extraer un fragmento de ADN y replicarse


Inserta un plsmido y se puede replicar
Inserta un fragmento de ADN y es capaz de replicarse
Es capaz de modificar un fragmento de ADN

7. Cmo podras comprobar la obtencin de una bacteria recombinante?


a)
b)
c)
d)

Observando su genotipo
Midiendo su tamao
Valorando su resistencia a drogas
Todas las anteriores

8. La cepa bacteriana a utilizar en un evento de recombinacin debe ser de:


a)
b)
c)
d)

Requerimientos nutricionales especficos


La especie Bacillus
Difcil crecimiento
La especie Neisseria

9. Bacterifago es:
a) Un protozoario
b) Una levadura

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Unidad 2. Transferencia de material gentico y seleccin bacteriana

c) Una bacteria
d) Un virus
10. Elementos bsicos para obtener una BGM:
a)
b)
c)
d)

Bacteria, droga para su seleccin y ADN propio de la bacteria


Vector de clonacin, droga para su seleccin y virus
Droga para su seleccin, ADN extrao y vector de clonacin
Bacteria, ADN extrao y vector de clonacin

Evidencia de aprendizaje. Estrategia para obtener una BGM


Con la finalidad de integrar toda la informacin aprendida, desarrollars una estrategia
experimental para obtener una BGM, a partir de requerimientos particulares:

1. Selecciona y justifica el tipo de vector de clonacin y cepa bacteriana a utilizar.


2. Describe el mecanismo de transferencia del material gentico que estara
involucrado.
3. Indica y argumenta la droga a utilizar para su seleccin.
4. Descarga la rbrica de evaluacin para conocer los criterios con los que sers
evaluado.
5. Guarda tu documento con la nomenclatura BGMB_U2_EA_XXYZ y envalo a tu
Facilitador (a) mediante el Portafolio de evidencias para que lo revise y te
retroalimente.
* Recuerda que tu documento deber pesar menos de 4 MB.
** Slo debers enviar las respuestas de los requerimientos, puntual y suficientemente
planteadas.
Nota: no olvides realizar tu ejercicio de autorreflexin. Recuerda que tambin cuenta
para la calificacin final. Para ello, entra al foro donde tu Facilitador(a) ingresar las
preguntas a responder, y, posteriormente, ingresa a la herramienta destinada a esta
labor para subir tu participacin.

Cierre de unidad
En la presente unidad se revis bsicamente las bases moleculares que sustentan la
recombinacin bacteriana a travs de revisar detalladamente los mecanismos de
transferencia del material gentico.
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Unidad 2. Transferencia de material gentico y seleccin bacteriana

Los mecanismos de transferencia revisados fueron la transformacin, la conjugacin y la


transduccin, enfocndonos a definir el evento celular, detallar sus caractersticas
generales y en algunos casos, como la conjugacin, ejemplificar ms especificamente
algunos mecanismos. Lo anterior obedece a que una vez revisados dichos tpicos se
cuenta con el conocimiento bsico para poder comprender las bases moleculares que
operan para que las bacterias puedan tener una mejor adaptabilidad a diferentes
condiciones ambientales, en particular la resistencia a drogas. Si bien, lo anterior permite
comprender el significado biolgico y evolutivo de este evento, resulta adems, ser una
estrategia para el desempeo de la biotecnologa con objeto de generar organismos
genticamente modificados y que a travs de esta adquisicin de nuevo material gentico
pueda ser una herramienta para su aislamiento.
Por su parte y para complementar lo previamente sealado, se revisaron las herramientas
necesarias para promover la generacin de bacterias genticamente modificadas,
particularmente, los vectores de expresin, los criterios de seleccin bacteriana y la
resistencia a drogas como estrategia para su aislamiento adecuado.

Para saber ms
Si te interesa conocer ms de la relacin que guardamos con los procariontes te
recomiendo revisar la lectura del microbioma humano:
Crdenas Guzmn G (2012). El microbioma humano. Cmo ves? 167:10-14 Recuperado
de http://www.comoves.unam.mx/assets/revista/167/el-microbioma-humano.pdf
Sabas que existe una normatividad para el manejo de los organismos genticamente
modificados? puedes enterarte al respecto:
Ley de bioseguridad de organismos genticamente modificados. Recuperado de
http://www.diputados.gob.mx/LeyesBiblio/pdf/LBOGM.pdf
Debemos o no producir organismos genticamente modificados, conoce la opinin de la
Academia Mexicana de Ciencias:
Comit de Biotecnologa de la Academia Mexicana de Ciencias (2007). Por un uso
responsable de los organismos genticamente modificados. Recuperado de
http://www.ibt.unam.mx/computo/pdfs/por_un_uso_responsable_ogms.pdf

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Unidad 2. Transferencia de material gentico y seleccin bacteriana

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Unidad 2. Transferencia de material gentico y seleccin bacteriana

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