Generalmente considerado agradable y altamente demandada por los

consumidores, frutas altoandinos son comnmente comercializados frescos en

la misma regin donde se producen. Estas frutas tienen una vida til corta con
un rpido deterioro de sus propiedades en esta fase, lo que afecta su calidad.
Por lo tanto, es necesario disear estudios de los procesos fsicos, fisiolgicos y
bioqumicos que caracterizan su maduracin. En la regin andina, una amplia
gama de especies frutales con buen potencial agronmico han sido
identificados, incluyendo curuba redonda o gulupa (Passiflora edulis Sims)
(Lobo, 2000). La mayor parte de la produccin de esta especie en Colombia se
exporta (por lo general a los mercados europeos) que alcanza 2.250 t en 2012,
con un valor de US 9,75 millones dlar (Agronet, 2012).
Las enzimas pueden estar activos durante poscosecha y los cambios que
determinan pueden influir positiva o negativamente en las caractersticas
organolpticas de la fruta, por lo que es importante conocer las diferentes
reacciones que catalizan en los tejidos vegetales, con el fin de explotar sus
ventajas y evitar sus efectos indeseables (Toms-Barbern y Espn, 2001). Una
gran parte de la fraccin proteica de fruta sometida a los cambios en las
diferentes etapas de maduracin est constituido por enzimas (Belitz y Grosch,
1997; Abu-Goukh y Bashir, 2003), que determinan, entre otros procesos, la
susceptibilidad a la pre y deterioro manejo poscosecha . Dentro de la fruta, las
enzimas estn involucradas en reacciones anablicas y catablicas, actuando
slo de acuerdo con las necesidades celulares. Si las clulas se lesionan,
algunas enzimas se liberan de sus compartimentos y entran en contacto con el
sustrato correspondiente, resultando en diferentes reacciones que no son
siempre deseables (Brummell y Harpster, 2001). Las enzimas realizan
actividades especficas en diferentes etapas de desarrollo. Sin embargo,
cuando se utiliza la planta (o fruta) como alimento, todos los cambios
posteriores en el punto de consumo ptimo son indeseables y deben evitarse
durante la manipulacin y el almacenamiento (Haard, 1985).

Una de las enzimas que participan en las reacciones de maduracin de la fruta

es la a-amilasa (EC 3.2.1.1), que promueve la hidrlisis de enlaces glicosdicos
a-1-4 y un 1-6 de almidn, produciendo as oligosacridos, tales como maltosa
y glucosa. Este proceso tiene lugar incluso si la fruta se ha separado de la
planta en la etapa preclimatrica. Esto permite cosecha temprana (preclimaterio), que, cuando es seguido de almacenamiento en condiciones
controladas, impide que el fruto de la maduracin antes de su comercializacin
(Bowers, 1992; Granados, 1994; Garca y Pea, 1995; Seymour y Gross, 1996;
Willats et al., 2001; Arellano et al., 2005; Menndez et al, 2006)..

Pectinmetilesterasa (PME; EC 3.1.1.11) est relacionada con la degradacin de

las sustancias pcticas de la lamela media de las clulas. PME hidroliza los
metoxilo y carboxilo grupos de pectina, dando pectinas de bajo metoxilo. Este
proceso produce grupos carboxlicos libres (cido ctrico) que participan en la
regulacin del pH, de la pared celular equilibrio inico y otras actividades
enzimticas hidrolticas. Actividad PME no afecta ablandamiento durante la
maduracin, pero altera sustancialmente la integridad de la fruta durante el
procesamiento (Hagerman y Austin, 1986; Granados, 1994;. Willats et al, 2001;
Aponte y Guadarrama 2003, Menndez et al., 2006). Ms tarde, algunas otras
enzimas catalizan la hidrlisis de las cadenas de cido poligalacturnico, lo que
resulta en unidades individuales de cido D-galacturnico (Granados, 1994).
Datos genmicos han demostrado recientemente que la PME pertenecen a
grandes familias multigene cuyas estructuras primarias y cuaternaria se
conservan entre los taxones vegetales (Pelloux et al., 2007). Esta enzima es
inhibida por los cidos fenlicos y activado por el etileno, segn lo informado
por Arellano et al. (2005) despus de investigar su actividad en zapote negro
(Diospyros digyna Jacq).

Poligalacturonasa (PG; EC 3.2.1.15) hidroliza los enlaces glucosdicos de

poligalacturonidos desesterifica, azcares y cidos orgnicos que producen.
Junto con PME, PG constituye un sistema de enzima que provoca la
degradacin textura de la fruta y los resultados en la dureza del consumo
adecuado. Sin embargo, la actividad excesiva aumenta la concentracin de
cido galacturnico, que causa el ablandamiento notable y hace que la fruta
ms susceptible al ataque de patgenos (Bowers, 1992; Garca y Pea, 1995;
Menndez et al., 2006).

En presencia de oxgeno molecular, polifenol oxidasa (PPO; EC 1.10.3.1)

cataliza la oxidacin de compuestos fenlicos, no slo conducen a productos
que son responsables de pardeamiento enzimtico durante la cosecha,
poscosecha, procesamiento y almacenamiento, pero que determinan en gran
medida la calidad y valor econmico de las frutas y verduras, as. Moretones,
esquejes y otros daos planta mecnica de las paredes celulares permiten que
el oxgeno penetre y entre en contacto con las enzimas y sus sustratos, lo que
resulta en procesos de oscurecimiento o pardeamiento (Garca et al, 2006;..
Ayaz et al, 2008; Guerrero, 2009 ; Llorente, 2010; Oort, 2010). PPO es una
enzima unida a la membrana, la accin del etileno en la permeabilidad de la
membrana durante la maduracin puede promover la accin de la enzima
sobre compuestos fenlicos (Arellano et al, 2005;.. Castro et al, 2006). Llorente
(2010) afirma que este tipo de enzima no se ha asignado una ubicacin precisa
dentro de una ruta metablica y que su funcin biolgica no est claro todava.

Dada la importancia de las reacciones en las que estas enzimas tienen lugar y
sus efectos sobre la calidad de la fruta, el presente estudio tuvo como objetivo
identificar la actividad enzimtica en frutas gulupa durante la pre y
poscosecha, con el fin de contribuir a la gestin de los cultivos en estas etapas.

MATERIALES Y MTODOS

Ubicacin. El cultivo experimental fue plantado en La Selva del Centro de

Investigacin (Rionegro, Antioquia, Colombia), que pertenece a Corpoica
(67'49 '' N, 7524'49 '' W; 2.090 msnm, la temperatura promedio de 17 C;
precipitacin anual de 1917 mm; la humedad relativa media [RH], el 78%;
insolacin media, 1.726 horas / ao, y la evapotranspiracin promedio, 1.202
mm), que corresponde a una Montane Selva Baja (LM-rf).

El material biolgico. El ensayo se realiz en un rea experimental en 10

accesiones gulupa se plantaron al azar. Los materiales son parte del Banco de
Colombia Gen (administrado por Corpoica), que, despus de Amplified
Fragment Length Polimorphism (AFLP) y simple secuencia de repeticin (SSR) el
anlisis de marcadores moleculares, se inform a tener una baja variabilidad
gentica (Ortiz, 2010). Segn ngel et al. (2011), los frutos se obtuvieron de
flores homogamticos con y sin hercogamia, que fueron etiquetados con hilos
de colores, estas etapas estn tomando como da cero de la edad de la fruta.
Desde entonces, los registros de tiempo se marcaron como das despus de la
floracin (DAF). La cosecha se realiz a los 91 DAF segn lo establecido por
Franco et al. (2013).

Procedimiento experimental. Para todos los anlisis, se realizaron muestreos

destructivos cada siete das a partir de 49 a 112 DAF DAF, a excepcin de PPO,
que se determina a partir de 84 DAF en adelante. Para el anlisis post-cosecha,
se recogieron los frutos desde 91 DAF y monitoreadas cada siete das hasta los
21 das despus de la cosecha, coincidiendo con el 98, 105 y 112 DAF. Estos
registros se utilizaron para comparar la actividad enzimtica de las frutas y
fuera de la via. La unidad de muestreo consisti en 10 frutos que se haban

reunido al azar de los materiales plantados, formando muestras equilibradas de

forma independiente con respecto al tamao de la fruta. Ellos fueron
transportados en cajas de espuma de poliestireno que contienen hielo seco
(temperatura interna de 4 C). Las determinaciones se realizaron en el
laboratorio de Ciencias de la Alimentacin de la Universidad Nacional de
Colombia, Sede Medelln. Variables de poscosecha se evaluaron en el
Laboratorio de Poscosecha de Corpoica.

Jugo crudo se obtuvo mediante la reduccin de los frutos a travs de la zona

ecuatorial y tamizando la pulpa y las semillas. Todos los procedimientos se
realizaron en un recipiente que contiene hielo, a fin de obtener una
temperatura de aproximadamente 4 C. El jugo resultante se coloc en un
recipiente enfriado con hielo. Para la determinacin de la actividad enzimtica,
el jugo de frutas 10 se mezcl hasta homogeneidad completa, con la
consiguiente extraccin de tres muestras para su anlisis.

a-amilasa actividad. Extracto enzimtico se obtuvo por homogeneizacin de 5

g de pasta con 10 ml de una solucin tampn de citrato 0,05 M (pH 4,5, EDTA
13 mM, 10 mM 2-mercaptoetanol, y 1% de polivinilpirrolidona [w / v]). Por 40
minutos, la mezcla se centrifug a 4.000 rpm y 4 C en una centrfuga
LABNET Hermle Z366. El sobrenadante se utiliz para el anlisis de la
enzima. a-amilasa actividad se determin por el mtodo descrito por Bernfelds
(1955) con algunas modificaciones. 250 l de extracto de enzima se aadieron a
una solucin de almidn al 1% en tampn fosfato 0,02 M (pH 6,9) y se mantuvo
a 23 C durante 10 min. La reaccin se detuvo mediante la adicin de 500 l de
una solucin DNS 1% y la mezcla se llev a 90 C durante 5 min, despus de
lo cual se enfri en bao de hielo. La absorbancia a 540 nm fue ledo por medio
de un Thermo Scientific Genesis 20 espectrofotmetro UV-Vis. La actividad de
la a-amilasa se expres como mol min-1 de maltosa liberada por mg de
protena total en las condiciones del experimento.

Actividad PG. Extracto enzimtico se obtuvo por homogeneizacin de 5 g de

pasta con 10 ml de una solucin tampn de citrato 0,05 M (pH 4,5, EDTA 13
mM, 10 mM 2-mercaptoetanol y 1% de polivinilpirrolidona [w / v]). Por 40
minutos, la mezcla se centrifug a 4.000 rpm y 4 C en una centrfuga
LABNET Hermle Z366. El sobrenadante se utiliz para el anlisis de la
enzima. Siguiendo la metodologa por Nelson (1944), la actividad PG se
determin por medicin espectrofotomtrica (Miller, 1959) de los azcares
reductores generados despus de la accin de la enzima sobre el cido
poligalacturnico. 60 l de extracto de enzima se aadieron a 540 l de un 0,4%

(w / v) solucin de cido poligalacturnico en 0,05 M de tampn de acetato, pH

4,0. Esta mezcla se incub a 37 C durante 10 min y la reaccin se detuvo
mediante la adicin de 600 l de una solucin DNS 1%. La mezcla se llev a 90
C durante 5 min, despus de lo cual se enfri en bao de hielo. La absorbancia
a 540 nm fue ledo por medio de un Thermo Scientific Genesis 20
espectrofotmetro UV-Vis. Actividad PG se expres como mol min-1 de cido
galacturnico liberados por mg de protena total, en las condiciones del
experimento.

La actividad PME. Extracto enzimtico se obtuvo por homogeneizacin de 4,5 g

de pulpa con 15 ml de un 8,8% (w / v) solucin de NaCl. La mezcla se agit
vigorosamente durante 30 s y luego se centrifug a 4000 rpm y 4 C en una
centrfuga LABNET Hermle Z366 durante 40 min. El sobrenadante constituy
el extracto de enzima, que se ajust a pH 7,5 con 0,1 N NaOH. Actividad PME
se determin mediante la monitorizacin del cambio de pH producido por la
hidrlisis del enlace ster en la molcula de cido poligalacturnico travs de
azul de bromotimol (que absorbe a una longitud de onda de 620 nm) cambio
de color. Para la determinacin de la actividad enzimtica apropiada, 100 l de
extracto de enzima se aadieron a 200 l de una solucin de NaCl 0,15 M, 100 l
de 0,5% (w / v) azul de bromotimol y 1 ml de una solucin de pectina ctrica
0,25% (w / v ) ajustado a pH 7,5 con 0,1 N NaOH. Despus de tres minutos, la
diferencia en la absorbancia a 620 nm, que fue ledo por medio de un
espectrofotmetro Multiskan V1.2 Spectrum Thermo Scientific, expresa la
actividad enzimtica como dAb min-1 por mg de protena total, en las
condiciones del experimento (Hagerman y Austin, 1986).

Actividad de la PPO. Extracto enzimtico se obtuvo por homogeneizacin de 4 g

de pasta con 20 ml de una solucin tampn de fosfato 0,2 M (pH 7,0) que
contiene 0,4 g de polivinilpirrolidona (PVP). La mezcla se agit vigorosamente
durante 30 s y luego se centrifug a 400 rpm y 4 C en una centrfuga
LABNET Hermle Z366 durante 40 min. El sobrenadante constituy el extracto
enzimtico. Actividad de la PPO se determin basndose en el mtodo descrito
por Garca (2006), en el que una unidad de actividad se define como la
cantidad de enzima que produce un aumento de absorbancia de 0,001
unidades min-1 a 30 C. Un millar l de extracto de enzima se aadieron a 1480
l de una solucin de catecol 100 mM y 500 l de tampn de fosfato 0,2 M, pH
7,0. La mezcla se llev a 30 C durante 3 min, despus de lo cual la
absorbancia a 420 nm fue ledo por medio de un Thermo Scientific Genesis
20 espectrofotmetro UV-Vis durante 5 min. La actividad de PPO se expres
como UA min-1 por mg de protena total, en las condiciones del experimento.

La protena total. La protena total se midi por el mtodo de Bradford (1976),

que cuantifica la unin del colorante azul de Coomassie a una protena
desconocida y lo compara con una curva estndar preparada con diferentes
concentraciones de protena de albmina de suero (BSA).

El total de slidos solubles. Los slidos solubles totales se determinaron de

acuerdo con la Norma Tcnica Colombiana (Norma Tcnica Colombiana - NTC)
4624 por Icontec (1999), utilizando un refractmetro Milton Roy Company a
una temperatura de 20 C. La cuantificacin se realiz en cada uno de los 10
frutos recogidos en cada perodo de muestreo.

RESULTADOS Y DISCUSIN

a-amilasa actividad especfica. Un aumento de la actividad comenz el 63 DAF

y alcanz el registro ms alto en 70 DAF (Figura 1). Resultados similares fueron
reportados por Menndez et al. (2006), que estableci que el amarillo fruta de
la pasin (P. edulis var. Flavicarpa Degener) a-amilasa actividad era ms
intensa en la novena semana y luego disminuy.

Se encontr que la mayor actividad de esta enzima para ser asociado a los
slidos solubles en la concentracin de aumento (Figura 2), debido a que el
sustrato de esta enzima es el almidn (Shiomi et al., 1996; Menndez et al.,
2006). Al hidrolizado, almidn contribuye a la glucosa aumento, dando el fruto
gulupa un sabor dulce. Valores de postcosecha mostraron la misma tendencia
de los frutos en la vid, asegurando as el procesamiento de almidn por esta
enzima y, por consiguiente, una ptima calidad de la fruta.

Actividad especfica PME. Aumento y pico mximo de esta actividad (Figura 3)

coincidi con la observada para la a-amilasa, estando de acuerdo con un
informe previo de Aponte y Guadarrama (2005) y Menndez et al. (2006). Estos
autores determinaron que la actividad de esta enzima aumenta hacia la
madurez fisiolgica y luego disminuye en la cosecha (Figura 3). En el proceso
de maduracin de la fruta de la pasin, Aponte y Guadarrama (2003) y
Menndez et al. (2006) tambin observ que la actividad de esta enzima es

ms alta en la etapa de madurez comercial, con disminucin de la actividad

durante las etapas de maduracin ms.

Actividad PME no afecta ablandamiento durante la maduracin, pero altera

significativamente la integridad de la fruta durante su procesamiento
(Granados, 1994; Hagerman y Austin, 1986; Willats et al 2001;. Aponte y
Guadarrama 2003). PME prepara la fruta para la accin de otras enzimas que
catalizan la hidrlisis de las cadenas de cido poligalacturnico, la produccin
de unidades individuales de cido D-galacturnico (Granados, 1994). Durante
poscosecha, la actividad PME mostr una tendencia a disminuir, lo que
contrasta con la de otras frutas climatricas como zapote negro (Diospyros
digyna Jacq), donde este parmetro mostr un aumento que haca juego con
otros eventos metablicos tales como la produccin de etileno (Arellano et al .,
2005).

Actividad especfica PG. Como PME, esta enzima est asociada a la maduracin
de la fruta. PG mostr una baja actividad en 84 DAF, con un pico a los 91 DAF
(Figura 4), similar a un informe anterior en amarillo fruta de la pasin por
Menndez et al. (2006), que estos autores observaron a una edad diferente, sin
embargo. Esto fue probablemente debido a la diferente ubicacin geogrfica y
altitud de las zonas en las que se realizaron los experimentos. La coincidencia
entre el mximo pico de actividad PG y slidos solubles aumento contenido fue
muy claro en este estudio. Durante poscosecha, la actividad PG seguido una
tendencia ascendente hasta siete das despus de la cosecha, como se indica
por Aponte y Guadarrama (2005).

Actividad especfica PPO. Los valores encontrados en este estudio para la

actividad especfica de PPO en gulupa eran pequeos (Figura 5), coincidiendo
con las observadas por Falguera et al. (2011) en amarillo fruta de la pasin.
Estos registros mostraron un patrn creciente durante la maduracin y
poscosecha, en consonancia con las observaciones del Lobo (1995) en la
papaya (Carica papaya L.) y Dueas et al. (2008) en pitahaya (Acanthocereus
pitajaya sensu Croizat). En algunos casos esta enzima muestra una intensa
actividad despus del pico climatrico, produciendo problemas de
pardeamiento en frutas como la manzana (Malus domestica Borkh), para lo
cual se ha sugerido la aplicacin de tratamientos, como la radiacin
ultravioleta para inactivar el efecto negativo sobre el jugo (Falguera et al.,
2011). Tambin durante poscosecha, PPO mostr una tendencia creciente,
diferente de la observada en otras frutas como el banano Gros Michel, donde
Garca et al. (2006) encontraron que la actividad ms baja de esta enzima en

etapas avanzadas de la maduracin, lo que sugiere su degradacin con la

maduracin. Los valores observados indican que la accin PPO en compuestos
polifenlicos se reduce, lo que favorece el procesamiento de gulupa (Ayaz et al,
2008;. Guerrero, 2009; Llorente, 2010, de Oort, 2010).

CONCLUSIONES

Desde el punto de vista de la calidad de la fruta, la actividad de las enzimas aamilasa y PG en gulupa (Passiflora edulis Sims) es importante, ya que refuerza
aumentan los slidos solubles. La baja actividad de PPO garantiza el
procesamiento industrial de zumo de gulupa, probablemente con slo
pardeamiento enzimtico suave.