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Transcripcin de la ciclooxigenasa-2 est regulada por el virus del papiloma

humano 16 E6 y E7 oncoprotenas: evidencia de un intercambio


correpresor/Coactivator

Resumen
ciclooxigenasa (COX-2) se sobreexpresa en virus del papiloma humano (HPV)inducida por enfermedades, incluyendo cncer de cuello uterino. Aunque
oncoprotenas HPV E6 y E7 han sido vinculada causalmente a cervical
carcinognesis, se desconocen sus efectos sobre la expresin gnica de COX-2.
Aumento de los niveles de ARNm de la COX-2, las protenas y la sntesis de
prostaglandina E2 fueron detectado en HPV16 E6 y E7-expresando cncer
cervical clulas (CaSki y SiHa) en comparacin con una lnea de clulas de
cncer de cuello uterino no infectada (C33A). Oncoprotenas HPV16 E6 y E7
inducida por transcripcin de COX-2 mediante la activacin del receptor del
factor de crecimiento epidrmico (RFCE).Ras! va quinasa activada por
mitgeno protena. Curiosamente, HPV16 oncoprotenas estimulan sealizacin
de EGFR, en parte, al inducir la liberacin de amphiregulin, un ligando EGFR.
Los efectos inductivos de HPV16 E6 y E7 fueron mediados por atascamiento
mejorada de activador protena-1 para el AMP cclico (cAMP)-elemento
responsivo (59 / 53) del promotor COX2. Tambin se investig la contribucin
potencial de activacin y corepressors a HPV16 E6 y E7-mediada por la
induccin de COX2. Ensayos de inmunoprecipitacin de cromatina indicaron
que las oncoprotenas E6 y E7 inducida por la contratacin de fosforilada c-Jun,
c-Fos, UbcH5 y sensible al campo elemento vinculante protena protena /
p300 al promotor de COX-2. En contraste, E6 y E7 inhiben la Unin de la
histona deacetilasa receptor 3-nuclear correpresor (NCoR) complejo al
promotor de COX-2. Por otra parte, la sobreexpresin de NCoR haba bloqueado
E6 y E7-mediada por la estimulacin de la promotora de COX-2. Tomados en
conjunto, estos resultados indican que oncoprotenas HPV16 E6 y E7
estimularon la transcripcin de la COX-2 induciendo un intercambio
correpresor/coactivator. A nuestro conocimiento, este estudio tambin
proporciona la primera evidencia que NCoR puede funcionar como un represor
de la expresin gnica de COX-2.
--- La ciclooxigenasa (COX-2) se sobreexpresa en el virus del papiloma humano (VPH)
enfermedades inducidas, incluyendo el cncer cervical. Aunque el VPH E6 y E7
oncoprotenas han sido causalmente relacionado con la carcinognesis cervical, sus
efectos sobre la COX-2 de expresin gnica son desconocidos. Se detectaron niveles
aumentados de COX-2 mRNA, protena, y la prostaglandina E (2) la sntesis en HPV16
E6 y E7-expresin de clulas de cncer cervical (CaSki y SiHa) en comparacin con una
lnea celular de cncer cervical no infectada (C33A). HPV16 E6 y E7 oncoprotenas
inducidos COX-2 mediante la activacin de la transcripcin del receptor del factor de
crecimiento epidrmico (EGFR) -> Ras -> activada por mitgeno va de la protena

quinasa. Curiosamente, oncoprotenas HPV16 estimularon la sealizacin de EGFR, en


parte, mediante la induccin de la liberacin de anfirregulina, un ligando de EGFR. Los
efectos inductivos de HPV16 E6 y E7 fueron mediados por un aumento de unin de
activador de la protena-1 a la AMP (cAMP) elemento -responsive cclico (-59 / -53) del
promotor de la COX-2. La contribucin potencial de coactivadores y corepressors a
HPV16 E6 y E7 mediada por la induccin de Tambin se investig la COX-2. Ensayos de
inmunoprecipitacin de la cromatina indicaron que las oncoprotenas E6 y E7 induce el
reclutamiento de fosforilados c-jun, c-Fos, UBCh5, y-AMPc que responde de unin a
elemento de unin protena-protena / p300 con el promotor de la COX-2. En contraste,
E6 y E7 inhiben la unin de la histona desacetilasa corepressor receptor (NCoR)
complejo 3-nuclear al promotor de la COX-2. Por otra parte, la sobreexpresin de NCoR
bloqueado S6- y la estimulacin del promotor de la COX-2 E7-mediada. Tomados en
conjunto, estos resultados indican que HPV16 E6 y E7 oncoprotenas estimulados COX-2
mediante la induccin de la transcripcin de un intercambio corepressor / coactivador.
Hasta donde sabemos, este estudio tambin proporciona la primera evidencia de que
NCoR puede funcionar como un represor de la COX-2 de expresin gnica.

Introduccin
El Cncer Cervical es la segunda causa ms comn de muerte por cncer
entre las mujeres en todo el mundo y sigue siendo una causa importante de
mortalidad entre las mujeres en edad reproductiva en los pases en desarrollo
(1). En los Estados Unidos, f10, 000 mujeres son diagnosticadas con cncer
cervical cada ao (2). Durante los ltimos 20 aos, fuerte evidencia
epidemiolgica y experimental ha relacionado la infeccin con ciertos tipos de
alto riesgo del virus del papiloma humano (VPH) con el desarrollo de cncer de
cuello uterino (3). HPV16 representa f50% de todas las malignidades cervicales
(4). Los tipos de HPV de alto riesgo codifican dos oncoprotenas, E6 y E7, los
cuales estn involucrados en la transformacin celular (5). E6 y E7 estimulan la
proliferacin celular al interferir con la funcin de protenas reguladoras en las
clulas, incluyendo el tumor supresores p53 y Rb (6, 7). Adems de modulacin
de supresores tumorales, oncoprotenas HPV E6 y E7 tienen otros efectos que
contribuyen a la carcinognesis (8, 9). Recientemente, se han desarrollado
vacunas profilcticas para prevenir el cncer cervical causado por el VPH tipos
16 y 18 (10). Por desgracia, estas vacunas son poco probable que sea un
beneficio significativo a la gran cantidad de individuos con lesiones
establecidas que ya estn infectadas con el VPH oncognico. Una comprensin
detallada de los mecanismos que son moduladas por VPH E6 y E7
oncoprotenas podra fortalecer la justificacin para el uso de terapias dirigidas
a prevenir o tratar el cncer de cuello uterino en individuos infectados.
Cyclooxygenases (COX) cataliza el primer paso en la sntesis de
prostaglandinas (PG) del cido araquidnico. Existen dos isoformas de COX.
COX-1 se expresa constitutivamente en la mayora de los tejidos y parece
mediar varias funciones fisiolgicas (11). Por el contrario, COX-2 es

indetectable en los tejidos ms normales pero rpidamente es inducida por los


oncogenes, factores de crecimiento, citoquinas y promotores de tumor (12
15). Mltiples lneas de evidencia sugieren que la COX-2 tiene un papel
importante en la carcinognesis. COX-2 se sobreexpresa en las clulas
transformadas y en varias malignidades, incluyendo cncer de cuello uterino
(14, 16 19). En ratones transgnicos, la sobreexpresin de COX-2 condujo a
cambios neoplsicos en el pecho, piel y pncreas (20 22). Crecimiento y
formacin de tumores se redujeron en animales que fueron diseados para ser
deficientes de COX-2 (23-25) o tratados con un inhibidor selectivo COX-2 (16,
26 29). El tratamiento con celecoxib, un inhibidor selectivo COX-2, ha
demostrado eficacia en el tratamiento de los plipos colorrectales en seres
humanos (30, 31). Recientemente, celecoxib tambin fue encontrado para ser
activo en el tratamiento de mujeres con displasia cervical de alto grado (32).
Varios diversos mecanismos potencialmente pueden explicar el vnculo entre
COX-2 y malignidad. PGs COX-2 derivado pueden estimular la proliferacin
celular, promover la angiognesis, aumentar la invasividad e inhiben la
vigilancia inmunolgica y apoptosis (16, 33 37). Aunque COX-2 se
sobreexpresa en enfermedades inducidas por HPV, incluyendo los cnceres
cervicales y del pene (18, 19, 38, 39), es incierto si esto es una consecuencia
de la transformacin de clulas o un efecto directo de las oncoprotenas HPV
E6 y E7 en la transcripcin de la COX-2. Por lo tanto, el principal propsito del
actual estudio fue determinar si oncoprotenas HPV16 E6 y E7 inducen la
expresin gnica de COX-2. Mostramos que oncoprotenas HPV16 E6 y E7
estimularon la transcripcin de la COX-2 mediante la activacin del receptor del
factor de crecimiento epidrmico (RFCE).Ras! quinasa activada por mitgeno
(MAPK)! va activator protein-1 (AP-1). Lo importante, la sobreexpresin de
HPV16 E6 o E7 tambin caus disociacin de correpresor receptor nuclear
(NCoR) de la promotora de COX-2 en asociacin con el reclutamiento de cJun/c-Fos fosforilada y el coactivador AMP cclico (cAMP)-protena de unin a
protenas elemento responsivo obligatoria (CBP) / p300. A nuestro
conocimiento, este estudio proporciona la primera evidencia que NCoR puede
reprimir la expresin gnica de COX-2, un hallazgo que podra ayudar a explicar
por qu COX-2 normalmente no se expresa en el epitelio normal.

Figura 1. Oncoprotenas HPV16 E6 y E7 inducen la transcripcin de COX-2. A,


CaSki, SiHa y C33A las clulas se cultivaron en medio de cultivo durante 6 h.
Este medio fue sustituido luego por medio fresco que contiene 10 Amol/L sodio
Araquidonato. Treinta minutos ms tarde, el medio fue colectado para
determinar cantidades de PGE2. Produccin de PGE2 se determin mediante
inmunoensayo enzimtico. Columnas, es decir (n = 6); bares, SD *, P < 0.001,
en comparacin con las clulas C33A. B, protena lisada celular (500 Ag) fue

utilizado para immunoprecipitate COX-2 o h-actina de las clulas, tal como se


describe en materiales y mtodos. Immunoprecipitates fueron luego cargado
en gel de poliacrilamida-SDS 10%, electrophoresed y posteriormente
transferida a nitrocelulosa. El inmunoblot fue sondeado con anticuerpos
especficos para COX-2 o h-actina. C, ARN celular total fue aislado de las clulas
CaSki, SiHa y C33A. RNA (10 Ag) fue agregado para cada carril. La mancha fue
cruzado por hibridacin con sondas que reconocieron COX-2 mRNA y 18S rRNA.
D, ncleos fueron aislados de clulas CaSki, SiHa y C33A. La COX-2 y 18S rRNA
cDNAs fueron inmovilizados a membranas de nitrocelulosa y cruzado por
hibridacin con las transcripciones de RNA nacientes etiquetadas. E y F, se
analiz la expresin de COX-2 en C33A (E) o las clulas HEK293 (F) estable
expresando su vector solo o HPV E6 o E7. Protena lisada de clulas (100 Ag)
fue sometido a gel de SDS-poliacrilamida al 10%, electrophoresed y
posteriormente transferida a nitrocelulosa. El inmunoblot fue sondeado con
anticuerpos especficos para COX-2 o h-actina.

Materiales y mtodos
Materiales. DMEM, MEM (EMEM) del guila, RPMI 1640 y LipofectAMINE eran de
Invitrogen Corp. (Carlsbad, CA). Poly(deoxyinosinicdeoxycytidylic Acid) [poly(dIdC)], antisueros de factor de crecimiento de h-actina y derivado de las
plaquetas (PDGF), ratn normal IgG y o-nitrofenil-D-galactopiranosida eran de
Sigma-Aldrich Co. (St. Louis, MO). 2-Amino-3methoxyflavone (PD 98059),
600125 SP y AG1478 fueron de EMD Biosciences, Inc. (San Diego, CA).
Reactivos de inmunoensayo enzimtico para los ensayos de PGE2 eran de
Cayman Chemical Co. (Ann Arbor, MI). [P 32]CTP, UTP [P 32] y [P 32] ATP eran
de vida Perkin-Elmer y ciencias analticas (Wellesley, MA). Kits de cebado al
azar eran de biociencias aplicadas Roche (Indianapolis, IN). Membranas de
nitrocelulosa eran de Schleicher & Schuell Bioscience (Keene, NH). Reactivos
para el anlisis de luciferasa fueron de luminiscencia analtica (San Diego, CA).
El cDNA de 18S rRNA era de Ambion, Inc. (Austin, TX). Antisueros para COX-2,
fosforilada de COX-1, c-Fos, c-Jun, c-Jun, NCoR1, Histona deacetilasa 3 (HDAC3),
Transducina h-como 1 relacionados con protena (TBLR1), UbcH5 y CBP / p300
eran de Santa Cruz Biotechnology, Inc. (Santa Cruz, CA). Antisueros de EGFR,
fosforilada EGFR y kits para determinar actividades MAPK eran de Cell
Signaling Technology (Beverly, MA). Western Blot los reactivos de deteccin
[quimioluminiscencia mejorada (ECL)] fueron de Amersham Biosciences
(Piscataway, NJ). DNA plasmdico se prepar utilizando un kit de Promega Corp.
(Madison, WI). Oligonucletidos fueron sintetizados por Sigma
y Genosys Biotechnologies, Inc. (The Woodlands, TX). ARN interferente
pequeo (siRNA) a la protena verde fluorescente (GFP) y TBLR1 se obtuvo de
Dharmacon, Inc. (Lafayette, CO). Kits de cromatina (ChIP) de

inmunoprecipitacin ensayo fueron comprados del Norte (Lake Placid, NY).


Lneas celulares. Las clulas HEK293, SiHa, C33A y CaSki fueron obtenidas de
la American Type Culture Collection (Manassas, VA). Las clulas CaSki fueron
mantenidas en RPMI 1640 con HEPES de Amol/L 25 suplementado con 10% de
suero bovino fetal (FBS), piruvato de sodio 1% y 1% penicilina/estreptomicina.
Las clulas C33A y SiHa fueron cultivadas en EMEM con 2 mmol/L de Lglutamina y Earle equilibrada solucin salina ajustado para contener
bicarbonato de sodio 1,5 g/L y 0,1 mmol/L aminocidos no esenciales, piruvato
de sodio 1,0 mmol/L y 10% SFB. Las clulas HEK293 fueron cultivadas en
DMEM suplementado con 10% SFB. Oncoprotenas HPV16 E6 y E7 se
sobreexpresa en clulas HEK293 y lneas celulares C33A. Clones estable E6 y
E7 se seleccionaron mediante Higromicina. Anlisis de la transcripcin reversaPCR fue hecho para confirmar la expresin del transgn. Todas las clulas
fueron crecidas a 60% de confluencia en un incubador de CO2/agua saturada
de 5% en 37jC antes de ser colocado en el medio libre de suero durante 24 h.
Posteriormente, se realizan tratamientos en medio libre de suero. Produccin
de PGE2. Las clulas fueron plateadas en platos de seis pozos y crecidas hasta
confluencia de 60% en medio de crecimiento. La cantidad de PGE2 liberada por
las clulas se midi mediante inmunoensayo enzimtico. Produccin de PGE2
se normaliz a las concentraciones de protena. Western Blot. Lisados celulares
fueron preparados por el tratamiento de las clulas con tampn de lisis [150
mmol/L de NaCl, 100 mmol/LTris (pH 8.0), 1% Tween 20, 50 mmol/L
dietilditiocarbamato, 1 mmol/L de EDTA, 1 mmol/L phenylmethylsulfonyl
fluoruro, 10Ag/mL aprotinina, inhibidor de la tripsina 10Ag/mL, leupeptin
10Ag/mL]. Lysateswere ultrasonicada durante 20 s en hielo y se centrifug a
10.000 g durante 10 min a sedimento el material particulado. Se midi la
concentracin de protena del sobrenadante como se describi anteriormente
(17).
Protena (500 Ag) desde el sobrenadante fue preabsorbed con 20 AL normal de
cabra IgG y 20 de IgG de conejo en 4jC; 20 entonces se agregaron de la
protena G Plusagarose. La mezcla entonces se centrifug a 3.000 g durante 5
min en 4jC. El dibolo fue descartado. Antisuero de conejo (20 AL) COX-2 o hactina entonces fue agregado para el sobrenadante; la mezcla se incub luego
a 4jC en una plataforma oscilante para 1 h. protena A-agarosa (20 AL)
entonces fue agregado, y la mezcla se incub en una plataforma oscilante de
16 h a 4jC; la mezcla entonces se centrifug a 3.000 g durante 5 min en 4jC. El
sobrenadante fue desechado. Despus de lavar el sedimento cuatro veces con
tampn de ensayo de radioinmunoprecipitacin, el sedimento se resuspendi y
immunoblotting fue terminado. SDS-PAGE se realiz bajo condiciones en geles
de poliacrilamida de 10% de reduccin. Las protenas resueltas fueron
transferidas en hojas de nitrocelulosa. La membrana de nitrocelulosa fue luego
se incubaron con anticuerpos primarios. Se utiliz el anticuerpo secundario IgG
conjugado con peroxidasa de rbano. Las manchas blancas /negras probadas

con el sistema de deteccin de la mancha blanca /negra occidental ECL segn


las instrucciones del fabricante. Northern blotting. ARN celular total fue aislado
de monocapas de clulas usando un kit de aislamiento de RNA de Qiagen, Inc.
(Valencia, CA). ARN celular total (10 Ag) por lane fue electrophoresed en un gel
de agarosa al 1.2% que contienen formaldehdo y transferido a membranas de
nylon-apoyado. Despus de la coccin, las membranas fueron prehibridadas
durante la noche en una solucin que contiene 50% formamida, cloruro de
sodio 5 fosfato de sodio/EDTA tampn (SSPE), solucin de 5 Denhardt, 0.1%
SDS, y Ag/mL 100 monocatenario ADN de esperma de salmn y luego
hibridadas por 12 h a 42jC con sondas radiomarcado cDNA humano COX-2 y
18S rRNA. COX-2 y 18S rRNA sondas fueron etiquetadas con CTP [P 32] por
cebado al azar. Despus de hibridacin,
las membranas se lavaron dos veces por 20 min a temperatura ambiente en 2
PES y 0.1% SDS, dos veces por 20 min en la misma solucin en 55jC y dos
veces por 20 min en 0.1 PES y 0.1% SDS en 55jC. Lavadas las membranas
fueron sometidas luego a autorradiografa. Ensayo nuclear de la escorrenta.
Las clulas (2,5 105) fueron plateadas en cuatro platos T150 para cada
condicin. Las clulas se cultivaron en medio del crecimiento hasta f60%
confluentes. Los ncleos fueron aislados y almacenados en nitrgeno lquido.
Para el anlisis de la transcripcin, ncleos (1.0 107) se descongelan y se
incubaron en tampn de reaccin [10 mmol/L de Tris (pH 8), 5 mmol/L de
MgCl2, 0,3 mol/L de KCl] que contiene 100 ACi de Uridina 5-[a - 32P] trifosfato
y 1 mmol/L de sin etiqueta nucletidos.Despus de 30 min,
labelednascentRNAtranscriptswere aislado. El humano COX-2 y 18S rRNA
cDNAs fueron inmovilizados en nitrocelulosa y prehibridadas durante la noche
en tampn de hibridacin. Hibridacin se llev a cabo en el 42jC durante 24 h
utilizando igual cpm/mL de transcritos de RNA nacientes etiquetados para cada
grupo de tratamiento. Las membranas se lav dos veces con tampn SSC 2 por
1 h a 55jC y luego tratadas con 10 mg/mL de RNasa A en SSC 2 a 37jC durante
30 minutos, seca y autoradiographed. Plsmidos. Las construcciones de
promotor de COX-2 (1.432 / + 59, 327 / + 59, 220 / + 59, 124 / + 59, 52 / + 59,
KBM, ILM, CRM y ILM) fueron un regalo generoso de Dr. Tadashi Tanabe
(Instituto Nacional de investigaciones cardiovasculares, Osaka, Japn; Ref. 40).
HPV16 E6 y E7 vectores de expresin eran de Dr. Craig Woodworth
(Universidad de Clarkson, Potsdam, NY). El cDNA humano de COX-2 fue
generosamente proporcionado por el Dr. Stephen M. Prescott (Fundacin de
investigacin mdica de Oklahoma, Oklahoma City, OK). Vectores de expresin
quinasa regulada por seales extracelulares (ERK) fueron proporcionados por el
Dr. Melanie Cobb (Southwestern Medical Center, Dallas, TX). Los vectores de la
expresin de c-Jun NH2-terminal quinasa (JNK) fueron un regalo del Dr. Roger
Davis (Universidad de Massachusetts, Worcester, MA). Las construcciones de
Ras fueron regalos de Dr. Geoffrey Cooper (Universidad de Harvard, Cambridge,
MA). Los vectores de expresin para la Royal Air Force-1 y deficiencia de la

cinasa de la Royal Air Force-1 se obtuvieron del Dr. Ulf Rapp (Universidad de
Wurzburgo, Wurzburgo, Alemania). pSVbgal se obtuvo de Promega. Vectores de
la expresin de NCoR y SMRT eran de Open Biosystems, Inc. (Huntsville,
Alabama). Ensayos de transfeccin transitoria. Las clulas fueron sembradas a
una densidad de 5 104 por pozo en platos de seis pozos y crecidas hasta un
50% a 60% de confluencia. Para cada pocillo, 2 Ag de ADN plsmido se
introdujeron en las clulas usando 8 Ag LipofectAMINE segn las instrucciones
del fabricante. Despus de 7 h de incubacin, el medio fue reemplazado por
medio basal. Se midieron las actividades de luciferasa y h-galactosidasa en
extracto celular. Oligonucleotides.Oligonucleotidescontaining COX-2 promotor
sitios fueron sintetizados de la siguiente manera: CRE, 5AAACAGTCATTTCGTCACATGGGCTTG-3 (sentido) y 5CAAGCCCATGTGACGAAATGACTGTTT-3 (antisentido); mutante CRE, 5AAACAGTCATTTAATCACATGGGCTTG-3 (sentido) y 5CAAGCCCATGTGATTAAATGACTGTTT-3 (antisentido); factor nuclear-nB (NFnB),
5-AGGAGAGTGGGGACTACCCCCTCTG-3 (sentido) y 5AGAGGGGGTAGTCCCCACTCTCCT-3 (antisentido); y el factor nuclearinterleucina-6 (NF-IL-6), 5-CCCACCGGGCTTACGCAATT-3 (sentido) y 5AATTGCGTAAGCCCGGTGGG-3 (antisentido). Los oligonucletidos fueron
sintetizados por las biotecnologas Genosys. Ensayo de turno movilidad
electrofortica. Las clulas se cosecharon y se prepararon extractos nucleares.
Para atar los estudios, se utilizaron oligonucletidos que contiene elementos de
respuesta en el promotor de la COX-2. Los oligonucletidos complementarios se
recuecen en 20 mmol/L de Tris (pH 7,6), 50 mmol/L de NaCl, MgCl2 de 10
mmol/L y 1 mmol/L de TDT. El oligonucletido recocido se fosforila al final 5con quinasa de [g - 32P] ATP y T4 Polinucletido. La reaccin de unin fue
realizada por incubacin 5 Ag de
protena nuclear en 20 mmol/L de HEPES (pH 7,9), 10% de glicerol, albmina
de suero bovino de 300 Ag y 1 poly(dI-dC) Ag en un volumen final de 10 AL 10
min a 25jC. Los oligonucletidos marcados fue haba agregado a la mezcla de
reaccin y permiti a incubar un adicional 20 min a 25jC. Las muestras fueron
electrophoresed en gel de poliacrilamida nondenaturing 4%. El gel fue luego
secado y sometido a autorradiografa en 80jC. Ensayo de chIP. Ensayo de chIP
se realiz con un kit (norte) segn las instrucciones del fabricante. Las clulas
(1 106) fueron reticuladas en una solucin de formaldehdo 1% durante 10
minutos a 37jC. Las clulas fueron lisis en 200 buffer de SDS y sonicadas para
generar fragmentos de ADN de 200 a 1.000 bp. Despus de la centrifugacin
despejado el sobrenadante se diluy hasta 10 veces con ChIP de bfer y se
incubaron con 1.5 Ag del anticuerpo indicado en 4jC. Complejos inmunes se
precipit, lavados y eluidos como se recomienda. DNAprotein enlaces cruzados
fueron invertidas por calentamiento de la 65jC durante 4 h, y los fragmentos de
ADN fueron purificados y disuelto en agua AL 50. Cada muestra (10 AL) fue
utilizado como una plantilla para la amplificacin por PCR. Secuencias de

oligonucletidos de COX-2 para iniciadores PCR fueron 5AAAGCTATGTATGTATGTGCTGCAT-3 y 5-AACCGAGAGAACCTTCCTTTTTAT-3.


Este primer conjunto abarca el tramo de promotor de COX-2 de nucletido 7to
621, que incluye el sitio de unin de CRE. PCR se realiz en 94jC para 30 s,
60jC para 30 s y 72jC para 45 s de 30 ciclos. Los productos PCR generados a
partir de la plantilla ChIP fueron ordenados y se confirm la identidad de la
promotora de COX-2. Estadsticas. Se hicieron comparaciones entre grupos de
prueba t de Student. La diferencia entre los grupos de P < 0,05 fue considerado
significativo.
Resultados HPV16 E6 y E7 inducen la transcripcin de la COX-2. Inicialmente,
se compararon los niveles de produccin de PGE2 en dos HPV16-expresando
lneas celulares de cncer de cuello uterino (CaSki y SiHa) frente a una lnea de
clulas de cncer de cuello uterino no infectados con VPH (C33A; Ref. 41).
Como se muestra en la figura 1A, las lneas celulares tanto CaSki y SiHa
producen PGE2 ms que la lnea celular C33A. Para determinar si estas
diferencias en la biosntesis de PGE2 potencialmente reflejaban diferencias en
la expresin de COX-2, se realiz el anlisis de immunoblot. En consonancia
con las diferencias observadas en la produccin de PGE2, CaSki y SiHa lneas
celulares expresaron niveles ms elevados de la protena COX-2 que C33A las
clulas (Fig. 1B). Similarmente, los niveles de ARNm de la COX-2 fueron ms
altos en las clulas CaSki y menor en las clulas C33A (Fig. 1). Escurrimientos
nucleares se hicieron para comparar las tasas de la transcripcin de la COX-2
entre las lneas tres celulares. Las tasas de transcripcin de COX-2 fueron ms
altos en las clulas CaSki y menor en las clulas C33A (Fig. 1 D).
colectivamente, estos resultados sugieren la posibilidad que HPV16
oncoprotenas activan transcripcin de COX-2, llevando a niveles ms altos de
produccin de PGE2 en lneas celulares HPV16infected (CaSki y SiHa) que en la
lnea celular (C33A) que fue infectada por VPH. Para evaluar esta posibilidad,
investigamos si overexpressing HPV16 E6 o E7 inducida por COX-2.
Sobreexpresin de HPV16 E6 o E7 caus un marcado incremento en los niveles
de la COX-2 en ambos C33A (Fig. 1E) y las clulas HEK293 (Fig. 1F). Por el
contrario, los niveles de la COX-1 fueron afectados (datos no mostrados).
Definir el mecanismo de sealizacin mediante el cual HPV16 E6 y E7 inducen
COX-2. A continuacin intentamos definir la va de transduccin de seal por el
cual HPV16 E6 y E7 estimularon transcripcin de COX-2. Activacin de
receptores tirosina kinasas, incluyendo el EGFR, puede estimular la
transcripcin de la COX-2 (16, 17). Por lo tanto, investigamos si overexpressing
HPV16 E6 o E7 aument la actividad tirosina quinasa EGFR en las clulas C33A.
Overexpressing tampoco oncoprotena viral inducida EGFR, EGFR actividad
tirosina quinasa y la expresin de COX-2 (Fig. 2A-C). A continuacin se
realizaron experimentos para determinar si la activacin EGFR causal estuvo
vinculada a induccin de COX-2. AG1478, un inhibidor de la tirosincinasa EGFR,
suprimi la induccin de la COX-2 en las clulas C33A que sobreexpresa HPV16

E6 o E7 (Fig. 2D y E). Porque EGFR puede activarse mediante mecanismos


intracelulares o extracelulares, Investigamos si un anticuerpo en el sitio de
ligando EGFR suprimido HPV16 E6 y E7-mediada por la induccin de la COX-2.
Como se muestra en la Figura 2B y C, HPV16 E6 y E7-mediada por la induccin
de la COX-2 fue suprimida por este anticuerpo neutralizante. En contraste,
control anticuerpos (IgG y anti-PDGF) no suprimi los niveles de la COX-2. Lo
importante, EGFR puede activarse mediante varios ligandos diferentes. Con
esto en mente, se realizaron experimentos para identificar el ligando EGFR que
era responsable de HPV16 E6 y E7-mediada por la induccin de la COX-2. En
particular, un anticuerpo amphiregulin, un ligando EGFR, haba bloqueado
HPV16 E6 y E7-mediada por la induccin de la COX-2 (Fig. 2F). En este
contexto, observamos que amphiregulin lanzamiento fue aumentar f2-veces en
ambas lneas celulares HPV16 overexpressing E6 y E7 C33A (datos no
mostrados). Tambin se midieron los niveles de actividad tirosina quinasa EGFR
en clulas SiHa, CaSki y C33A. En consonancia con las diferencias observadas
en los niveles de la protena COX-2 (Fig. 1B), las lneas celulares CaSki y SiHa
expresaron niveles ms altos de EGFR y haba fosforilada EGFR que C33A las
clulas (Fig. 2). En mayor apoyo del papel para la activacin del EGFR
sealizacin conduccin expresin COX-2, el tratamiento con AG1478 (Fig. 2 H)
o los anticuerpos al EGFR o amphiregulin suprimieron los niveles de la COX-2
en clulas CaSki (Fig. 2I). Transfecciones llevaron a cabo para definir la va de
transduccin de seal corriente abajo de EGFR que era responsable de HPV16
E6 y E7-mediada por la induccin de la COX-2. Overexpressing Ras o Raf
estimul la actividad promotora de COX-2
(datos no mostrados). Overexpressing formas dominantes negativos de
quinasa Raf o Ras abrogado HPV16 E6 y E7-mediada por estimulacin de la
actividad promotora de COX-2 (Fig suplementarios. S1). Ras de sealizacin
puede alterar la expresin gnica mediante la activacin de las MAPKs distintas
(42). Por lo tanto, era importante, para investigar si el aumento de la actividad
MAPK contribuy a HPV16 E6 - y E7mediated la induccin de la COX-2.
Inicialmente, se compararon las actividades MAPK en las dos HPV16expresando cervical lneas celulares de cncer (CaSki y SiHa) frente a una lnea
de clulas de cncer de cuello uterino no infectada con VPH (C33A). En
consonancia con las diferencias observadas en la expresin de COX-2 (Fig. 1B)
y produccin de PGE2 (Fig. 1A), las lneas celulares CaSki y SiHa expresan
mayores niveles de actividad de ERK1/2 y JNK que C33A las clulas (Fig. 3A y
C). Enfoques farmacolgicos y genticos a continuacin fueron utilizados para
evaluar el vnculo entre la actividad MAPK y expresin de la COX-2 en clulas
HPV16 E6 - y E7expressing. En el primer experimento, utilizamos PD 98059, un
inhibidor especfico de la quinasa MAPK, que impide la activacin de ERK1/2.
Tratamiento con PD 98059 suprime la expresin COX-2 en las clulas CaSki (Fig.
3B); SP 600125, un inhibidor de JNK, tambin suprime los niveles de la COX-2
(Fig. 3D). Para profundizar ms sobre la importancia de las MAPK en la

mediacin de la induccin de la COX-2, se realizaron una serie de


transfecciones. En concordancia con los resultados farmacolgicos,
overexpressing dominantes negativos de ERK1 o JNK suprimi HPV16 E6 o E7mediada por la activacin de la promotora de COX-2 (Fig. 3E).

Figura 2. HPV16 E6 y E7-mediada por la induccin de la COX-2 es dependiente


de la activacin del EGFR. A, C33A las clulas fueron transfected estable con
vector vaco (V), HPV16 E6 (E6), o E7 de HPV16 (E7). Protena lisada de clulas
(500 Ag) fue objeto de inmunoprecipitacin con anticuerpos phosphotyrosine,
EGFR, o h-actina. Los immunoprecipitates fueron sometidos luego a Western
blotting. Las manchas blancas /negras probadas con los anticuerpos a
fosforilada EGFR (pEGFR), EGFR y h-actina. B y C, C33A las clulas transfected
estable con el vector vaco, HPV E6 (B), o VPH E7 (C) se cultivaron en medio
con o sin el tratamiento indicado anticuerpo (AC) para 12 h. D y E, C33A las
clulas transfected estable con HPV E6 (D) o HPV E7 (E) fueron tratadas con 0 a
500 nmol/L de AG1478 de 12 h. F, C33A las clulas transfectadas estable con
E6 VPH o HPV E7 se cultivaron en medio con anticuerpos amphiregulin (AR) o
IgG para 12 h. B a F, protenas lisado de clulas (100 Ag) fue sometido a gel de
SDS-poliacrilamida al 10%, electrophoresed y posteriormente transferida a
nitrocelulosa. Los immunoblots fueron sondeados secuencialmente con
anticuerpos especficos para COX-2 o h-actina. G, los niveles de fosforilada
EGFR y EGFR se compararon en clulas SiHa, CaSki y C33A. El anlisis de
Immunoblot se llev a cabo como se describi anteriormente. H, CaSki las
clulas fueron tratadas con 0 a 500 nmol/L de AG1478 de 12 h. Posteriormente,
protena lisada de clulas (500 Ag) fue objeto de inmunoprecipitacin con
anticuerpos de COX-2 o h-actina y los immunoprecipitates fueron sometidos a
Western blotting. Yo, CaSki las clulas se cultivaron en medio con o sin los
anticuerpos indicados para 12 h. Posteriormente, se realiz anlisis como (H).

Figura 3. Actividades de ERK1/2 y JNK son importantes para HPV16 E6 y E7mediada por la induccin de la expresin de COX-2. Se midieron las actividades
de ERK1/2 (A) y JNK (C). B, las clulas fueron tratadas con vehculo (carril 1)
CaSki o 100 Amol/L PD 98059 (carril 2) para 8 H.d., CaSki las clulas fueron
tratadas con vehculo (carril 1) o 1Amol/L SP 600125 (carril 2) para 8 h.B y D,
despus de los tratamientos indicados, 500 Ag de protena lisado celular fueron
immunoprecipitated con los anticuerpos a COX-2 o h-actina. Los
immunoprecipitates fueron luego cargan en un gel de poliacrilamida-SDS 10%,
electrophoresed y posteriormente transferida a nitrocelulosa. Immunoblots
fueron sondeados por separado para COX-2 y h-actina. E, C33A las clulas

fueron transfectadas con 0.9 Ag de una construccin de 5-regin sin traducir


de COX-2 humana ligada a la luciferasa (327 / + 59) y 0,2 Ag de pSVbgal. VPH
E6 y E7 del VPH, las clulas que recibieron 0.45 Ag de expresin vector HPV16
E6 o E7, respectivamente. VPH E6 + DN ERK1 y VPH E6 + DN JNK, clulas
recibi 0.45 Ag de expresin vectores para E6 HPV16 y formas dominantes
negativos ERK1 o JNK, respectivamente. E7 HPV + DN ERK1 y E7 HPV + DN
JNK, clulas recibi 0.45 Ag de expresin vectores para E7 de HPV16 y ERK1 o
JNK dominantes negativos, respectivamente. La cantidad total de ADN en cada
reaccin se mantuvo constante en 2 Ag utilizando el correspondiente vector de
expresin vaca. Veinticuatro horas despus de la transfeccin, las clulas eran
lisis y se midieron las actividades del reportero. Actividad de luciferasa
representa los datos que han sido normalizados para actividad h-galactosidasa.
Columnas, es decir (n = 6); bares, SD

Figura 4. Localizacin de la regin del promotor de COX-2 que media los


efectos de las oncoprotenas HPV16 E6 y E7. Un diagrama esquemtico del
promotor humano de COX-2. Las clulas C33A fueron transfectadas con 0.9 Ag
de una serie de creaciones humanas de promotor-luciferasa COX-2 (1.432 / +
59, 327 / + 59, 220 / + 59, 124 / + 59 y 52 / + 59). VPH E6 y E7 de HPV,
clulas que tambin recibieron 0.9 Ag de vector de expresin de oncoprotenas
HPV16 E6 y E7. B, C33A las clulas fueron transfectadas con 0.9 Ag de una
serie de COX-2 humana promotor-luciferasa (327 / + 59, KBM, ILM y CRM). KBM,
327 / + 59 construccin de promotor de COX-2 en el cual el sitio NF-nB fue
mutagenized; ILM, 327 / + 59 construccin de promotor de COX-2 en el cual el
sitio NF-IL-6 fue mutagenized; CRM, 327 / + 59 construccin de promotor de
COX-2 en el cual la CRE fue mutagenized. Columnas negras, las clulas que
tambin recibieron 0.9 Ag del vector de la expresin de E6 HPV16; columnas
grises, las clulas que tambin recibieron la oncoprotena E7 del HPV16. A y B,
todas las clulas recibieron 0.2 Ag de pSVbgal. La cantidad total de ADN en
cada reaccin se mantuvo constante en 2 Ag mediante el uso de vectores
vaca. Actividades de reportero se midieron en extracto celular 24 h despus de
transfeccin. Actividad de luciferasa representa los datos que han sido
normalizados para actividad h-galactosidasa. Columnas, es decir (n = 6);
barras, SD

VPH (C33A). En consonancia con las diferencias observadas en la expresin de


COX-2 (Fig. 1B) y produccin de PGE2 (Fig. 1A), las lneas celulares CaSki y SiHa
expresan mayores niveles de actividad de ERK1/2 y JNK que C33A las clulas

(Fig. 3A y C). Enfoques farmacolgicos y genticos a continuacin fueron


utilizados para evaluar el vnculo entre la actividad MAPK y expresin de la
COX-2 en clulas HPV16 E6 - y E7expressing. En el primer experimento,
utilizamos PD 98059, un inhibidor especfico de la quinasa MAPK, que impide la
activacin de ERK1/2. Tratamiento con PD 98059 suprime la expresin COX-2
en las clulas CaSki (Fig. 3B); SP 600125, un inhibidor de JNK, tambin suprime
los niveles de la COX-2 (Fig. 3D). Para profundizar ms sobre la importancia de
las MAPK en la mediacin de la induccin de la COX-2, se realizaron una serie
de transfecciones. En concordancia con los resultados farmacolgicos,
overexpressing dominantes negativos de ERK1 o JNK suprimi HPV16 E6 o E7mediada por la activacin de la promotora de COX-2 (Fig. 3E). El elemento
sensible al campamento, AP-1 y NCoR estn involucrados HPV16 E6 y E7mediada por la induccin de la transcripcin de la COX-2. Overexpressing
HPV16 E6 o E7 causada un significativo aumento en la actividad de promotor
de COX-2 con todo COX-2 promotor canceladura construcciones, excepto el 52 /
+ 59 construir (Fig. 4A), sugiriendo que el sitio CRE puede ser responsable de
mediar los efectos de las oncoprotenas. Para evaluar esta posibilidad, se
realizaron transfecciones utilizando construcciones de promotor de COX-2 en la
que distintos elementos haban sido mutados. Como se muestra en la Figura
4B, mutagenizing la CRE sitio caus una prdida de la sensibilidad a HPV16 E6
y E7. En contraste, mutando el NF-nB o NF-IL-6 sitios no tuvo efecto en HPV16
E6 o E7-mediada por la activacin del promotor de COX-2. A continuacin se
realizaron ensayos de turno movilidad electrofortica (EMSA) para identificar el
factor de transcripcin responsable de HPV16 E6 y E7-mediada por la induccin
de la COX-2. Overexpressing HPV16 E6 o E7 condujo a mayor atascamiento de
la protena nuclear al sitio CRE de la promotora de COX-2 (Fig suplementarios.
S2A). Este aumento de atar a la CRE de COX-2 fue competido por incubacin
extracto nuclear de clulas overexpressing HPV16 E6or E7 con un centesimal
exceso de sondas CRE o AP-1 sin etiquetar (Fig suplementarios. S2B y C).
Encuadernacin no fue competido cuando extractos nucleares se incubaron con
un centesimal exceso de etiqueta CEBP-a, NF-nB o mutante CRE sondas.
Supershifts llevaron a cabo para determinar la composicin de la protena de
unin a nuclear compleja que reconoci la CRE. Como se muestra en la Fig.
suplementaria. S2D y E, tanto fosforilada c-Jun y c-Fos estaban presentes en el
complejo de clulas overexpressing HPV16 E6 C33A. Fosforilada c-Jun y c-Fos
tambin estuvieron presentes en el complejo en clulas overexpressing HPV16
E7 C33A (datos no mostrados). En consonancia con las diferencias observadas
en la expresin de COX-2 (Fig. 1B) y transcripcin (Fig. 1D), altos niveles de
protenas nucleares de unin a la CRE de COX-2 fueron encontrados en clulas
CaSki y SiHa HPV16 infectados contra las clulas no infectadas C33A (Fig
suplementarios. S2F). Supershifts se realizaron usando la protena nuclear de
las clulas CaSki. En concordancia con los resultados en las clulas C33A
overexpressing E6 y E7 de HPV16, fosforilada c-Jun y c-Fos se identificaron en
el atascamiento complejo (Fig suplementarios. S2G). Para examinar ms lejos

el mecanismo por cual HPV16 E6 o E7 estimular la transcripcin de la COX-2, se


realizaron ensayos de ChIP. Complejos de protena-DNA fueron
immunoprecipitated con diversos anticuerpos y encuadernados fragmentos de
ADN fueron recuperados y sometidos a la PCR semicuantitativa con
oligonucletidos especficos para la promotora de COX-2. La Unin de
unphosphorylated c-Jun al promotor de COX-2 no fue alterada en las clulas
C33A que sobreexpresa HPV16 E6 o E7 (Fig. 5A). En contraste, la
sobreexpresin de HPV16 E6 o E7 condujo a aumento obligatorio de c-Fos y
CBP/p300, un coactivador de AP-1 mediada por transcripcin. Recientemente,
NCoR fue encontrada para servir como un punto de control que controla el
intercambio de seal dependiente de c-Jun / complejos correpresor de c-Jun/cFos/coactivator complejos (43). Por lo tanto, tambin se investig si la
sobreexpresin de HPV16 E6 o E7 modulada NCoR vinculante a la CRE de COX2. En particular, NCoR vinculante fue sobresedo en asociacin con aumento
obligatorio de c-Fos y CBP/p300 (Fig. 5A). En contraste, atascamiento del
mediador silenciamiento altamente relacionado del retinoico cido y la
hormona tiroidea receptor (SMRT) fue afectadas (datos no mostrados). Se
utiliz una estrategia similar para comparar clulas CaSki y SiHa, las lneas de
celulares de cncer cervical de dos HPV16expressing, con las clulas C33A, la
lnea celular de cncer de cuello uterino que es infectada por VPH. En
particular, los niveles ms altos de encuadernacin de c-Fos y CBP/p300 fueron
detectados en las clulas CaSki, con los niveles ms bajos de la Unin de cada
una de estas protenas que se encuentran en las clulas C33A (Fig. 5A). Se
observ el patrn opuesto de enlace para NCoR. Ms especficamente, el ms
alto nivel de enlace de NCoR fue encontrado en las clulas C33A y el menor
nivel de enlace en CaSki clulas (Fig. 5A). Consistentes con los efectos
represivos de NCoR, actividad promotora de COX-2 fue ms baja en las clulas
C33A y mayor en las clulas CaSki (Fig. 5B, una). En particular, overexpressing
NCoR pero no SMRT caus una reduccin marcada en actividad promotora de
COX-2 en CaSki clulas (Fig. 5B, b) y bloqueado HPV16 E6 y E7-mediada por la
activacin de la promotora de COX-2 en las clulas C33A (Fig. 5B, c y d).
Colectivamente, la mayor Unin de la AP-1 y CBP/p300 y atar reducido de NCoR
a la CRE de COX-2 en HPV16 E6 y E7-expresando cncer cervical lneas
celulares (CaSki y SiHa) frente a los no infectados C33A celular
linecorrespondedtothe differencesin COX-2 transcripcin (Fig.1D) y la actividad
promotora de COX-2 (Fig. 5B, un) que fueron observados. Estudios anteriores
de regulacin gnica dependiente AP 1 indican un papel esencial de la
fosforilacin de c-Jun NH2-terminal para el reclutamiento de TBLR1dependent
de la maquinaria proteoltica necesaria para NCoR y HDAC3 despido y
coactivator exchange (43, 44). Por lo tanto, investigamos si HDAC3 y TBLR1
fueron destinados a la promotora de COX-2. Como se muestra en la figura 5, a,
la sobreexpresin de oncoprotenas HPV16 E6 y E7 conducido a la prdida de
HDAC3 vinculante al promotor de COX-2. Por otro lado No en el enlace de
TBLR1 que el promotor de la COX-2 se observ diferencia en la sobreexpresin

de HPV16 oncoprotenas (Fig. 5, a). Sin embargo, TBLR1 fue encontrada para
ser funcionalmente importantes para la estimulacin mediada por la
oncoprotena HPV16 de transcripcin de COX-2 (Fig. 5, b y c). Ms
especficamente, siRNA a TBLR1 haba bloqueado HPV16 E6 y E7-mediada por
la induccin de la actividad promotora de COX-2. Seal-dependiente de la
fosforilacin de c-Jun tambin es conocida como causantes de reclutamiento
TBLR1-dependiente de la enzima ubiquitina-conjugadoras UbcH5, conduce a la
eliminacin proteoltica del complejo NCoR-HDAC3 (43, 44). Para determinar si
HPV16 mediada por la oncoprotena activacin de JNK result en reclutamiento
de c-Jun fosforilada y UbcH5 a la promotora de COX-2, se realizaron ensayos de
ChIP. Como se muestra en la figura 5, la sobreexpresin de HPV16 E6 y E7
condujo a enlace mejorada de c-Jun fosforilada y UbcH5 al promotor de COX-2.
Del mismo modo, atascamiento de c-Jun fosforilada y UbcH5 al promotor de
COX-2 fue realzada en HPV16 E6 - y E7-expresando las clulas CaSki y SiHa en
comparacin con la lnea de la clula infectada C33A (Fig. 5).
Discusin COX-2 se sobreexpresa en enfermedades relacionadas con el VPH,
incluyendo cncer de cuello uterino (18, 19, 38, 39). En el presente estudio,
mostramos que oncoprotenas HPV16 E6 y E7 indujo la expresin gnica de
COX-2. La induccin de la COX-2 por el HPV16 oncoprotenas fue mediada por la
activacin de la RFCE.Ras!MAPK.Va AP-1. Varias observaciones apoyan un
papel crtico para EGFR en HPV16 mediada por la oncoprotena induccin de
COX-2. La sobreexpresin de E6 o E7 en clulas C33A estimula la expresin y la
fosforilacin de EGFR mientras induccin de COX-2. Tratamiento con AG1478,
un inhibidor de la tirosincinasa EGFR o bloqueo del anticuerpo del sitio ligando
de EGFR haba abrogado HPV16 mediada por la oncoprotena induccin de
COX-2. Lo importante, tanto AG1478 como los anticuerpos neutralizantes
EGFR tambin los niveles de la COX-2 en clulas infectadas HPV16 CaSki
suprimidos. EGFR puede activarse a travs de mecanismos intracelulares o
extracelulares (45-47). El hecho de que un anticuerpo neutralizante EGFR
bloqueado HPV16 mediada por la oncoprotena induccin de COX-2 sugiere un
proceso extracelular. En consonancia con esta nocin, HPV16 oncoprotenas
estimulan la liberacin de amphiregulin, un ligando de la RFCE. Lo ms
importante, un anticuerpo amphiregulin bloquea la induccin de la COX-2 por el
HPV16 oncoprotenas en clulas C33A y suprime la expresin de COX-2 en
clulas CaSki. En particular, estos resultados son consistentes con la evidencia
anterior que la activacin de sealizacin de EGFR puede conducir COX-2
transcripcin y biosntesis de PG (16, 47). Se llevaron a cabo experimentos
adicionales para definir la va de transduccin de seal corriente abajo de EGFR
que mediada por la induccin de la COX-2. Consistente con estudios previos
(14, 17), la va Ras estuvo implicada. Dominantes negativos para Ras y Raf-1
bloquean HPV16 E6 y E7-mediada por la activacin de la promotora de COX-2.
Varias lneas de evidencia sugieren que HPV16 inducida COX-2 mediante la
activacin de JNK y MAPKs ERK. En primer lugar, las actividades de ERK1/2 y

JNK fueron superiores en HPV16 E6 - y E7-expresando las clulas de cncer de


cuello uterino (CaSki y SiHa) en comparacin con la lnea celular de cncer de
cuello uterino no infectada (C33A). En segundo lugar, inhibidores de la quinasa
MAPK y JNK suprimen los niveles de la COX-2 en clulas CaSki (Fig. 3B y D). En
tercer lugar, la sobreexpresin de dominantes negativos de ERK1 y JNK
suprimi la induccin de la actividad promotora de COX-2 por HPV16 E6 y E7
(Fig. 3E). Previamente, la activacin de JNK estuvo vinculada a mayor
transcripcin de EGFR (48). Es razonable especular, por lo tanto, que la mayor
actividad JNK contribuye a la sobreexpresin de COX-2 en clulas de cncer
cervical expresando E6 y E7 de HPV16 y EGFR. Tambin Divulgamos que la
induccin de la actividad promotora de COX-2 por oncoprotenas HPV16 E6 y E7
fue mediada a travs de una Unin AP-1 sitio ubicado 53 nucletidos aguas
arriba del sitio Inicio transcripcional (Fig. 4). EMSAs demostr mayor Unin de
fosforilada c-Jun y c-Fos, componentes del factor de transcripcin AP-1 del
complejo, a la CRE de la promotora de COX-2 en clulas de cncer de cuello
uterino HPV16 E6 - o E7expressing (Fig suplementarios. S2). Este resultado fue
confirmado por anlisis del ChIP (Fig. 5). La importancia funcional de la AP-1 se
estableci porque HPV16 E6 y E7-mediada por la activacin de la promotora de
COX-2 fue suprimida por mutagenizing la CRE (Fig. 4B). Colectivamente, estos
resultados son consistentes con la evidencia anterior que la estimulacin de las
MAPKs resulta en la induccin de AP-1 dependiente de la transcripcin de la
COX-2 (16, 17). Activacin y corepressors son importantes para AP-1 mediada
por regulacin de la transcripcin de genes (43). Previamente, el coactivador
CBP/p300 fue encontrado para ser muy importante para AP-1 mediada
induccin de la expresin de COX-2 (49, 50). En consonancia con esta nocin,
ChIPassays revel una mayor asociacin entre CBP/p300 y la promotora de
COX-2 en clulas oncoprotena-expresin HPV16 (Fig. 5). En condiciones
basales, el correpresor NCoR complejo se ha encontrado para imponer un
intercambio activo blockof de c-Jun de c-Jun/c-Fos heterodmeros (43). Esta
funcin de control de NCoR es relevada por complejos de NCoR-HDAC3 de
whichdirectsremovalof de seal-dependentphosphorylationofc-Jun, a travs de
la contratacin de un complexleadingtoproteosomedegradation(43) especfico
ubiquitinylation.En este estudio, se muestra por primera vez que NCoR acta
como un control transcripcional de AP-1 mediada por la estimulacin de la
transcripcin de la COX-2. Esta conclusin se basa en varios resultados. ChIP
los anlisis indicaron que las oncoprotenas E6 y E7 inhibicin la Unin de la
NCoRHDAC3 correpresor complejo mientras que induce el reclutamiento de
fosforilada c-Jun, c-Fos, UbcH5 y CBP/p300 al promotor de COX-2. Compatible
con NCoR funciona como un correpresor, se observ una relacin inversa entre
el grado de interaccin NCoR con el promotor de la COX-2 (Fig. 5) y los niveles
de transcripcin de COX-2 (Fig. 1). Se observaron altos niveles de interaccin
entre NCoR y el promotor de la COX-2 en la lnea celular de HPV16 infectados
C33A en el cual COX-2 transcripcin era insignificante. Sobreexpresin de

HPV16 E6 o E7 en clulas C33A condujo a una disminucin marcada en la


interaccin NCoR con el promotor de la COX-2 (Fig. 5A) y un aumento en la
expresin de COX-2 (Fig. 1E) recproco. Por otra parte, la interaccin entre NCoR
y el promotor de la COX-2 fue insignificante en las clulas infectadas HPV16
CaSki en que COX-2 transcripcin era robusto. La sobreexpresin de NCoR
tambin suprimi HPV16 E6 o E7-mediada por la activacin de la promotora de
COX-2 (Fig. 5B, c y d). El hallazgo que NCoR inhibe la expresin de COX-2 en
condiciones basales puede resultar muy importante para explicar por qu COX2 normalmente no se detecta en las clulas epiteliales normales. Adems de
proporcionar evidencia que NCoR inhibe la expresin de COX-2, este estudio
muestra por primera vez que HPV oncoprotenas modulan la funcin de la
correpresor NCoR. Nuestros resultados en combinacin con informes anteriores
(43, 44) sugieren fuertemente un modelo por el que la activacin de JNK
estimul la fosforilacin de c-Jun, provocando, a su vez, la degradacin y
ubiquitinacin mediada por UbcH5de la NCoR-HDAC3 correpresor complejo y
contratacin del complejo coactivator consistentes en fosforilada c-Jun-cFosCBP/p300 (Fig. 6). Por lo tanto, oncoprotenas HPV16 E6 y E7 estimulan COX2 transcripcin induciendo un intercambio correpresor/coactivator. Adems de
HPV16 E6 y E7, otros oncoprotenas VPH pueden tener efectos similares. Por
ejemplo, expresin E5 HPV puede causar un aumento dependiente de ligando
en la fosforilacin de EGFR (51, 52) y por lo tanto, puede tambin inducir la
transcripcin de COX-2. Los resultados de este estudio proporcionan otras ideas
potencialmente significativos. Hemos demostrado que oncoprotenas HPV16 E6
y E7 estimularon la transcripcin de la COX-2 mediante el EGFR.Ras!MAPK.Va
AP-1. Varios de estos efectos podra predecirse a apoyo sostenida infeccin con
el VPH. Por ejemplo, como se dijo anteriormente, COX-2 PGs derivadas
pueden estimular la proliferacin y la angiognesis la clula mientras que
inhibe la apoptosis e inmune vigilancia (16, 33, 34, 37). De hecho, el
tratamiento a corto plazo con el celecoxib inhibidor COX-2 produce una
disminucin en los marcadores de ambos la proliferacin celular y
angiognesis en pacientes con cncer cervical (53). Activacin del EGFR se
reconoce bien a promover la mitognesis y angiognesis (45). Varios
investigadores han demostrado importante diafona entre COX-2 y EGFR en
otros contextos (46, 47). Por lo tanto, la sobreexpresin de HPV16 E6 o E7
podra iniciar un ciclo de retroalimentacin positiva por el que la activacin del
EGFR resulta en expresin realzada de la COX-2 y mayor sntesis de PGs, lder,
a su vez, a un nuevo aumento en la actividad EGFR. Colectivamente, estos
cambios inducidos por la oncoprotena HPV16 podra predecirse para apoyar
una infeccin de HPV sostenida y promover la carcinognesis.

Figura 5. Transcripcin de la COX-2 est regulada por HPV16 E6 y E7


oncoprotenas mediante un intercambio correpresor/coactivator. Un ChIP se
realizaron los ensayos. Se realiz una comparacin entre las clulas C33A que
sobreexpresa vector HPV16 E6 y E7 de HPV16. Adicionalmente, se realizaron
comparaciones entre C33A, SiHa y CaSki lneas celulares de cncer.
Fragmentos de cromatina eran immunoprecipitated con los anticuerpos
indicados, y en la regin promotora de COX-2 fue amplificada por PCR.
Secuenciacin de ADN se llev a cabo, y el producto PCR fue confirmado para
ser el promotor de la COX-2. Hemos podido detectar el promotor de la COX-2 (7
a 621) cuando se utiliz IgG normal o anticuerpo fue omitido en el paso de
inmunoprecipitacin. B, a, C33A, SiHa y CaSki clulas fueron transfectadas con
0.9 Ag de COX-2 humana promotor-luciferasa (327 / + 59). b, clulas fueron
transfectadas con 0.9 CaSki Ag de COX-2 humana promotor-luciferasa (327 / +
59). Vector, clulas que tambin recibieron 0.9 Ag del vector; NCoR, las clulas
que tambin recibieron 0.9 Ag de vector de expresin para NCoR; SMRT,
clulas que tambin recibieron 0.9 Ag de expresin para SMRT. c, las clulas
C33A fueron transfectadas con 0.9 Ag de COX-2 humana promotor-luciferasa
(327 / + 59). Vector, las clulas que recibieron 0.9 Ag del vector solo; Vector +
VPH E6, clulas que recibieron 0.45 Ag de vector y 0.45 Ag de la expresin del
vector para HPV16 E6; NCoR + VPH E6, clulas que recibieron 0.45 Ag de
vector de expresin para NCoR y 0.45 Ag de la expresin del vector para
HPV16 E6. d, C33A las clulas fueron transfectadas con 0.9 Ag de COX-2
humana promotor-luciferasa (327 / + 59). Vector, las clulas que recibieron 0.9
Ag del vector vaco solo; Vector + E7 HPV, las clulas que recibieron 0.45 Ag de
vector y 0.45 Ag de la expresin del vector para HPV16 E7; NCoR + E7 de HPV,
las clulas que recibieron 0.45 Ag de vector de expresin para NCoR y 0.45 Ag
de la expresin del vector para E7 de HPV16. a d, todas las clulas recibieron
0.2 Ag ofpSVbgal. La cantidad total de ADN en cada reaccin se mantuvo
constante en 2 Ag mediante el uso de vectores vaca. Actividades de reportero
se midieron en extracto celular 24 h despus de transfeccin. Actividad de
luciferasa representa los datos que han sido normalizados para actividad hgalactosidasa. Columnas, es decir (n = 6); bares, SD. C, a, ChIP se realizaron
ensayos. Se realiz una comparacin entre las clulas C33A que sobreexpresa
vector HPV16 E6 y E7 de HPV16. Adicionalmente, se realizaron comparaciones
entre C33A, SiHa y CaSki lneas celulares de cncer. Fragmentos de cromatina
eran immunoprecipitated con los anticuerpos indicados, y en la regin
promotora de COX-2 fue amplificada por PCR. Secuenciacin de ADN se llev a
cabo, y el producto PCR fue confirmado para ser el promotor de la COX-2.
Hemos podido detectar el promotor de la COX-2 (7 a 621) cuando se utiliz IgG
normal o anticuerpo fue omitido en el paso de inmunoprecipitacin. b y c, C33A
las clulas fueron transfectadas con 0.9 Ag de COX-2 humana promotorluciferasa (327 / + 59). Vector, las clulas que recibieron 0.9 Ag del vector
vaca solo. las clulas b, HPV E6, que recibieron 0.45 Ag de vector y 0.45 Ag de
la expresin del vector para HPV16 E6; VPH E6 + siRNA GFP, clulas que

recibi 0.45 Ag del vector de la expresin de E6 HPV16 y 0.45 Ag de siRNA a


GFP; VPH E6 + siRNA TBLR1, clulas que recibi 0.45 Ag del vector de la
expresin de E6 HPV16 y 0.45 Ag de siRNA a TBLR1. las clulas c, E7 de HPV,
que recibieron 0.45 Ag de vector y 0.45 Ag de la expresin del vector para
HPV16 E7; E7 HPV + siRNA GFP, las clulas que recibieron 0.45 vector de
expresin Ag de E7 de HPV16 y 0.45 Ag de siRNA a GFP; E7 HPV + siRNA
TBLR1, las clulas que recibieron 0.45 vector de expresin Ag de E7 de HPV16
y 0.45 Ag de siRNA a TBLR1. b y c, todas las clulas recibieron 0.2 Ag
ofpSVbgal. Actividades de reportero se midieron en extracto celular 24 h
despus de transfeccin. Actividad de luciferasa representa los datos que han
sido normalizados para actividad h-galactosidasa. Columnas, es decir (n = 6);
bares, SD. D, Se realizaron ensayos de chIP. Se realiz una comparacin entre
las clulas C33A que sobreexpresa vector HPV16 E6 y E7 de HPV16.
Adicionalmente, se realizaron comparaciones entre C33A, SiHa y CaSki lneas
celulares de cncer. Fragmentos de cromatina eran immunoprecipitated con los
anticuerpos indicados, y en la regin promotora de COX-2 fue amplificada por
PCR. Secuenciacin de ADN se llev a cabo, y el producto PCR fue confirmado
para ser el promotor de la COX-2. Hemos podido detectar el promotor de la
COX-2 (7 a 621) cuando se utiliz IgG normal o anticuerpo fue omitido en el
paso de inmunoprecipitacin.
Figura 6. Esquema de va por la cual HPV16 oncoprotenas regulan la
expresin de COX-2. Oncoprotenas HPV16 E6 y E7 estimulan la produccin de
amphiregulin y as activan EGFR.Ras!Sealizacin MAPK. El resultado, a su vez,
la fosforilacin de c-Jun, conduciendo a la degradacin de TBLR1-dependiente
del NCoR/HDAC3 correpresor complejo y reclutamiento del coactivador
CBP/p300 y fosforilada heterodmero de c-Jun/c-Fos al promotor de COX-2. Este
correpresor / intercambio coactivator accionado por HPV oncoprotenas
conduce a mayor transcripcin de COX-2.