eterminacin de Coliformes Totales y Fecales.

Mtodo de recuento por dilucin en tubo: NMP

Enviado por mireya

1.

Introduccin

2.

Materiales

3.

Procedimiento

4.

Resultados

5.

Conclusiones

6.

Preguntas

7.

Referencias
PRCTICA N 05

Introduccin
Existen diversos mtodos para cuantificar el nmero de microorganismos presentes en
muestras lquidas y slidas. Dentro de las tcnicas ms comunes se encuentra el recuento
directo por microscopia de fluorescencia, as como los procedimientos basados en
diluciones en serie, haciendo crecer microorganismos en mediosde cultivo sintticos slidos
o lquidos, como el recuento en placa de Unidades Formadoras de Colonias
(UFC) o la estimacin por el mtodo del Nmero Ms Probable (NMP).
El mtodo del nmero ms probable fue descrito por McCrady en 1915 y actualmente sigue
siendo ampliamente utilizado. En un principio este mtodo fue empleado para estimar el
nmero de microorganismos en muestras de alimentos y aguas. Sin embargo, se ha
demostrado que tambin puede ser aplicado para la determinacin de microorganismos
aerobios y anaerobios en lodos, sedimentos marinos y suelos contaminados, por tanto este
mtodo es aplicable para estimar el nmero de microorganismos en muestras
de suelo y agua, tanto para bacterias aerobias como anaerobias.
Los Coliformes Fecales son un subgrupo de los Coliformes totales, capaces de fermentar la
lactosa a 44 C en vez de 37 C como lo hacen los totales.
Aproximadamente el 95% del grupo de los Coliformes presentes en heces estn formados
por Escherichia coli y ciertas especies de Klebsiella. Ya que los Coliformes Fecales se
encuentran casi exclusivamente en las heces de los animales de sangre caliente, se
considera que reflejan mejor la presencia de contaminacin fecal. stos ltimos se
denominan termotolerantes por su capacidad de soportar temperaturas ms elevadas. Esta
es la caracterstica que diferencia a Coliformes Totales y Fecales. La capacidad de los
Coliformes fecales de reproducirse fuera del intestino de los animales homeotrmicos es
favorecida por la existencia de condiciones adecuadas de materia orgnica, pH, humedad.

Desde hace mucho tiempo se han utilizado como indicador ideal de contaminacin fecal. Su
presencia se interpreta como una indicacin de que los organismos patgenos pueden estar
presentes y su ausencia indica que el agua o el alimento estudiado se hallan exentos de
organismos productores de enfermedades.

I. Objetivos:

Familiarizarse con los mtodos de recuento, especialmente con el de NMP.

Detectar bacterias coliformes totales y fecales.

Detectar si la muestra trada es apta para el consumo humano.

Materiales

Muestra: Leche

Medios de cultivo: Caldo Brilla (presuntivo), agar MacConkey, agar Endo, EMB, CB.

Caldo EC

Tubos de dilucin

Pipetas

Bombilla de aspiracin

Placas de Petri

Mechero Bunsen

Bao Mara

Estufa

Gradillas

Anzas microbiolgicas calibradas

Procedimiento

a. Mtodo para coliformes totales:

Preparamos diluciones hasta 10-3.

Sembramos dos, tres o cinco tubos por cada dilucin, segn sea el caso.

Los resultados se dan en por gr o mL

En el caso de agua se sigue de la otra forma:

Cuando se trate de aguas, los resultados se darn por 100 mL.

Luego, incubar a 35 C 1 por 24 h.

Realizar la 1ra lectura (determinar la presencia de gas). sta se observa en

las campanas.

Los tubos que no sean positivos se incuban por otras 24 h ms.

b. Mtodos para coliformes fecales:

Para coliformes fecales se utilizan dos mtodos:

o
o

En el Primer Mtodo se cogen los tubos positivos del caldo Lauril Sulfato
Triptosa y se lleva una asada al caldo EC utilizando una asa que tenga 3 mm de
dimetro.

Luego, estos tubos se incuban a 45.5 C 0.2, en bao Mara con agitacin
constante por 24 h.

Si hay gas a las 24 o 48 h. es positivo para coliformes fecales.

El Segundo Mtodo es la llamada prueba de Mackenzie.

En esta se usa el caldo Brila mas agua Peptonada.

Se parte del caldo MacConkey, los tubos positivos de la prueba de

coliformes totales se siembran en este caldo, si aqu vuelve a salir positivo se le
realizan las dos pruebas sgtes:

Slo se tomar esta prueba como positiva si los dos tubos (caldo
Brilla y caldo Peptonado) resultan positivos.

Al tubo con caldo peptonado se le agrega el reactivo de Kovacs para

hacer la prueba de Indol.

Para ver coliformes termorresistentes, de los tubos que hayan salido

positivos se siembra una asada en agar MacConkey y se aslan las colonias
caractersticas.

De los tubos positivos se los siembra en otros tubos en caldo EC con

campana de Durham.

Resultados

De los tubos sembrados en el caldo Brilla (prueba presuntiva), se

obtuvo los sgtes. resultados (a las 24 horas) para coliformes totales:

Para realizar la prueba confirmativa se sembr en agar MacConkey,

luego de la incubacin por 24 horas, se obtuvo los sgtes. resultados:

Por lo tanto, se puede decir que el resultado del nmero ms

probable es: 222.

Para este resultado las tabla de NMP con un lmite de confianza de

95% para la prueba de fermentacin utilizando 3 diluciones con dos repeticiones
(2 tubos), nos da un valor de >1100 bacterias/mL de leche.

Conclusiones

Los valores mnimos permisibles usados en Mxico, por ejemplo,

nos dan los sgtes. valores de referencia para diversos alimentos:
Especificaciones microbiolgicas establecidas para diversos alimentos.

*NOM-093-SSA1-1994 ; ** NOM-121-SSA1-1994; *** Lmites microbiolgicos de la

ICMSF (International Commission on Microbiological Specifications for Foods).

La muestra trada por nuestro grupo fue de leche cruda. Al hacer un

comparativo de nuestros resultados vemos, por ejemplo, que "La Norma
Venezolana para Lcteos" da como valores lmites los sgtes. valores:

Vemos que el lmite dado para Coliformes Totales en leche cruda

est dada en UFC/ml, entonces, comparando nuestra muestra de leche, trada de
un puesto lechero del sector Santa Rosa Chiclayo con las muestras dadas en el
cuadro, la podemos calificar como una leche DE TERCERA.

RESULTADOS COLIFORMES FECALES

Para la prueba de coliformes fecales se utiliz como mtodo la

prueba de Mackenzie, aunque, al no tener todos los medios necesarios, se hicieron
algunas modificaciones.

De los tubos positivos del Caldo Brilla si inocul, de cada uno, a

tubos con Caldo E-C.

Luego se incub los tubos a 44 C 0.1 por 24 h.

Pasado el tiempo se ley los resultados.

De los tubos positivos se pas a placas con agar MacConkey, estas se

incubaron por 24 h a 37 C (se debi pasar a dos tubos uno con caldo peptona y
otro con caldo Brilla).

Pasado el tiempo, se leen las placas y se realizan las pruebas

bioqumicas para las colonias lactosa positivas (L+).

RESULTADOS:

Como todos los tubos del caldo Brilla salieron positivos, se

sembraron en tubos con caldo EC (seis tubos).

Despus de la incubacin de los tubos con caldo EC se obtuvieron

los sgtes. resultados:

De los tubos positivos se sembr en agar MacConkey, de ellas todas

salieron lactosa positivas:

De las colonias lactosa positivas se escogi una y se le realiz las

sgtes. pruebas bioqumicas: IMViC + descarboxilacin de la lisina (LIA) + prueba
de fermentacin de carbohidratos (TSI).
Se obtuvieron los sgtes. resultados:

De los resultados obtenidos se puedo identificar a Klebsiella

azaenae.

Entonces, como Klebsiella pertenece al grupo de las coliformes

fecales, podemos decir que la muestra tratada (leche cruda) tenia presencia de
estas en un nmero de (resultado NMP 2-2-0):
NMP de coliformes fecales = 210 bacterias/ mL.

Algunas sp. del gnero Klebsiella junto con otras de los

gneros Citrobacter y Enterobarter se cree que son las causantes de enfermedades
gastrointestinales agudas y crnicas. Estos microorganismos pueden ser recolectados
de ambientes naturales tales como los bosques, el agua fresca as como tambin de
losproductos provenientes de la agricultura (vegetales) donde residen normalmente
como microflora.
Tambin pueden ser recolectados de las heces de individuos saludables que no
presentan sntomas de la enfermedad. Tambin pueden ser recolectadas a partir de
los productos lcteos, los mariscos crudos y los vegetales frescos y crudos. Estos
organismos al contaminar las aguas pueden estar presentes en el suelo usado para
la produccin de cultivos y en las aguas de pesca de mariscos; como resultado stos
pueden constituir un peligro para la salud.

Preguntas

Cules son los diferentes mtodos para coliformes totales?

Para el conteo de coliformes totales se tienen tres mtodos

principalmente.

El primero se basa en la tcnica del nmero ms probable (NMP),

utilizando caldo Lauril Sulfato Triptosa seguido de la confirmacin de los tubos
positivos de formacin de gas en caldo Lactosa Bilis Verde Brillante. La
incubacin es a 35 C.

El segundo mtodo emplea nicamente el caldo McConkey. La

incubacin es a 37 C.

El tercer mtodo usa el caldo Lactosa Bilis Verde Brillante a 35 37

C, seguido de confirmacin en agar Bilis Rojo-Violeta o en agar Endo.

Qu caractersticas tienen las colonias de coliformes en agar Endo y

en agar Eosina Azul de Metileno?

El medio Eosina Azul de Metileno (EMB) es un medio de plaqueo

diferencial que puede usarse en lugar del agar MacConkey en el aislamiento y
deteccin de Enterobacteriaceae o de bacilos coliformes de muestras con
bacterias mixtas. Los colorantes anilnicos (eosina y azul de metileno) inhiben a
las bacterias Gram positivas y a las Gram negativas exigentes. Se combinan para
formar un precipitado a pH cido y, de este modo, sirven tambin
como indicadores de la produccin de cido. Las colonias lactosa (+) dan colonias
de color violeta, las de E. coli presentan un caracterstico brillo verde metlico, las
de Enterobacter presentan un color violeta sin brillo metlico (ojo de buey). Las
colonias de Klebsiella son siempre mucosas, grande y ligeramente rosadas.

El medio Endo es un medio selectivo para demostracin de E.

coli fecal y coliformes en los ms diversos materiales. El sodio sulfito y la fucsina
inhiben a las bacterias Gram (+). E. coli y coliformes utilizan lactosa con
formacin de aldehdo y cido. Por otra parte, el aldehdo libera fucsina a partir
de la combinacin: fucsina sulfito, lo que da lugar a la coloracin roja de las
colonias. En este medio las colonias lactosa (+) presentan una coloracin roja,
p.ej. E. coli es de color rojo con brillo metlico estable. Enterobacter aerogenes y
otros presentan colonias rojas hasta rojizas, semiesfricas y mucosas.

Referencias

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de febrero de 2008
en http://www.ubu.es/investig/aulavirtual/trabajos_05/Analisis_microbiologico
_del_agua.pdf

ANALISIS MICROBIOLOGICOS (2004) Obtenido el 07 de febrero

de 2008 en http://www.ine.gob.mx/publicaciones/libros/509/analisis2.pdf

FACULTAD DE CIENCIAS BIOLOGICAS (1989). Medios de Cultivo

en Microbiologa: Manual de Laboratorio. Editora Tricelm S.A. 3 Edic. Lima.

FUENTES, A. F. y otros (2005). Calidad Sanitaria de Alimentos

Disponibles al Pblico de la Ciudad de Sonora, Mxico. Revista Salud
Pblica y Nutricin. Vol. 6 N 3. Obtenido el 01 de febrero de 2008 en
http://www.respyn.uanl.mx/index.html

L. ORTIZ, M. (2003) Material didctico de Microbiologa de

Alimentos: Recuento de enterobacterias. Obtenido el 01 de febrero de 2008 en
http://www2.uah.es/farmacia/programas/microbiologia/material_didactico_de
_microlimentos.htm

MICROBIOLOGIA APLICADA: Manual de Laboratorio (2006)

Coliformes totales y Fecales en agua de consumo humano. Obtenido el 07 de
febrero de 2008 en
http://www.ine.gob.mx/publicaciones/libros/509/analisis2.pdf

THATCHER, F. S. y D. S., CLARK (1993) Anlisis Microbiolgico de

los Alimentos. Edit. Acribia. Zaragoza.

VARGAS, T. (2005) Calidad de la Leche: Visin de

la Industria Lctea. Obtenido el 01 de febrero de 2008 en
http://www.avpa.ula.ve/docuPDFs/xcongreso/P297_CalidadLeche.pdf

TABLA NMERO MS PROBABLE PARA COMBINACIONES DE 2 TUBOS

Nmero de tubos positivos con el
inculo indicado

ndice NMP

<3,0

11

14

16

14

20

21

35

29

36

23

38

75

43

150

240

210

470

>1100

Adaptado de Ortiz, 2003 y Fuentes, 2005.

Autor:
Rmulo Aycachi Inga
ASIGNATURA : Microbiologa de los Alimentos I
DOCENTE :Dra. Graciela Albino Cornejo
CICLO :2007 - II
Enviado por:
Mireya

ESCUELA PROFESIONAL DE BIOLOGA

Lambayeque, 14 de febrero de 2008.

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Leer ms: http://www.monografias.com/trabajos89/determinacion-coliformes-totalesfecales/determinacion-coliformes-totales-fecales.shtml#ixzz3ayepLC1F