Академический Документы
Профессиональный Документы
Культура Документы
gel, debido a que las impurezas estn a concentraciones muy bajas para ser
detectadas. Adems, para un buen criterio de pureza deben considerarse distintos
pH, y/o distintos tampones.
Geles de poliacrilamida en condiciones denaturantes
En 1967, A. Shapiro, E. Vi|uela y J. Maizel mostraron que los pesos moleculares para
la mayor parte de las protenas se podan determinar midiendo la movilidad
electrofortica en geles de poliacrilamida que contienen un poderoso detergente de
carga negativa, dodecil sulfato de sodio (SDS). Esta tcnica fue perfeccionada dos aos
despus por K. Weber y M.Osborn.
A pH cercano al neutro, en 1% SDS y 0.1M beta- mercaptoetanol, la mayora de las
protenas, con varias cadenas que unen SDS se disocian; los puentes S-S se rompen
por el BMSH, la estructura secundaria se pierde; y los complejos que consisten de
subunidades proteicas ms SDS asumen una configuracin espiral al azar. Protenas
tratadas de esta forma se comportan como si tuviesen forma uniforme y una razn
idntica carga/masa. Esto es debido a que la cantidad de SDS unido por unidad de
peso de protena es constante: 1.4 g de SDS/g de protena.
La carga es entonces determinada por SDS unido y no por la carga intrnseca de los
aminocidos
Debido a que los espirales al azar de la protena, recubiertos con SDS tienen igual
razn carga a masa, uno puede esperar que la movilidad de cada molcula proteica
sea proporcional al nmero de enlaces peptdicos por molcula, esto es, la movilidad
sera proporcional al peso molecular. Sin embargo, el gel es un "cedazo molecular" a
travs del cual deben pasar las molculas. Cuanto ms pequea sea la molcula,
migrar ms rpidamente a travs del gel; por lo tanto la movilidad aumenta con
pesos moleculares decrecientes.
Weber y Osborn mostraron que si una serie de protenas de peso molecular conocido
se someten a electroforesis en un gel, ellas se separaran en bandas (ver Fig.1A,
pg.40), y que el grfico: distancia de migracin v/s logaritmo del peso molecular daba
una lnea recta (Fig. 1B, pg.40). Por lo tanto, si se somete a electroforesis una
protena de peso molecular desconocido con varias protenas de PM conocido o
estndares, el PM desconocido se puede calcular con una exactitud que varia entre el
5 - 10%.
El procedimiento de electroforesis en geles de poliacrilamida con SDS es una
herramienta poderosa para el anlisis de protenas debido a que se usa para separar
cualquier protena sin importar su solubilidad en solucin acuosa. Protenas de
membrana, componentes proteicos del citoesqueleto y protenas que forman parte de
agregados macromoleculares grandes pueden resolverse como especies separadas.
Finalmente, como se mencion anteriormente, debido a que el mtodo separa
polipptidos estrictamente de acuerdo al tamao, provee tambin informacin acerca
del peso molecular y la composicin de subunidades de cualquier complejo proteico.
BIBLIOGRAFIA
1. Chrambach,A. & Robbard.D. (1971) Science, 172, 440
2. Laemmli, U.K (1970) Nature (London) 277, 680-685
1.94
ml
1,5
ml
Persulfato 1%
0,159 ml
H20
2,4
ml
TEMED
12
ml
Total
ml
Gel espaciador
3,4%
Acril-Bis 45 - 1,2%
0,29 ml
1,0
ml
Persulfato 1%
0,4
ml
H20
2,3
ml
TEMED
ml
Total
ml
III. PROCEDIMIENTO
A. Limpiar las placas de vidrio con metanol.
B. Armar la placa con los espaciadores fijando con pinzas.
C. Agregar el volumen necesario de la mezcla del gel separador hasta una altura de
3/4 del alto de la placa.
D. Borrar el menisco, agregando suavemente por las paredes tampn 1,5M Tris-HCl
pH 8,8, 1,2% SDS diluido 1:4, o agua destilada.
E. Dejar gelificar por 20 minutos.
F. Eliminar tampn diluido y lavar la superficie con H20 destilada.
G. Preparar el gel espaciador.
H. Agregar volumen necesario sobre el gel separador. Colocar peineta de 8 10
surcos, evitando que queden burbujas de aire. Dejar gelificar por 20 minutos.
I.
Una vez gelificado el gel espaciador, retirar la peineta y el espaciador basal y
colocar las placas en la cmara electrofortica.
J.
Agregar el tampn de corrida al depsito inferior evitando atrapar aire en el
borde del gel.
IV. PREPARACION Y APLICACION DE LA MUESTRA
A. La cantidad de protenas sricas a aplicar es de 30 a 60 microgramos por surco.
B. Diluir las muestras con buffer muestra 1:5. Agregar b-mercaptoetanol 5% final y
hervir por 2 minutos.
C. Los volmenes recomendables a aplicar por surco son de 40-70 microlitros.
D. Aplicar las muestras con micropipeta adecuada y agregar nuevamente tampn de
corrida sobre las muestras y el depsito superior.
V. CORRIDA ELECTROFORETICA
A. Conectar los electrodos (polo + abajo).
B. Aplicar 10-15 mA hasta que el indicador del frente inico llegue a 1 cm del borde
del gel (ms o menos 2 horas).
VI. FIJACION Y TINCION
A. Transcurrido el tiempo de corrida, retirar los espaciadores y placas de vidrio y
sumergir el gel en solucin fijadora por 1 hora, luego trasladar a la solucin colorante
por 1 hora.
B. Cambiar a solucin decolorante hasta que las bandas se observen sobre el fondo
claro.
VII. DETERMINACIN DEL PESO MOLECULAR DE LA ALBUMINA
A. En forma paralela a las protenas sricas, someter a electroforesis albmina pura
ms otras protenas de peso molecular conocido. Mida las distintas distancias de
migracin y grafique log. peso molecular versus distancia. Por interpolacin determine
el peso molecular de la albmina srica.
A
Fig. 1 A.
Electroforesis de varias protenas en gel de poliacrilamida en
condiciones denaturantes. Las protenas son: 1. Miosina, 2. b-galactosidasa, 3.
Fosforilasa, 4. Sero-Albmina, y 5. Ovoalbmina,.
B.
Grafico semilogartmico de peso molecular versus distancia migrada, para
determinar peso molecular por electroforesis en geles de poliacrilamida en condiciones
denaturantes. Comparar datos del gel al 5 % con figura A.