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PRACTICA NO.

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DETERMINCIN DE AMINOACIDOS TERMINALES
CON GRUPO ALFA AMINO LIBRE. MTODO DE
SANGER.
INTRODUCCION.
La determinacin de la estructura primaria de una protena
suele denominarse secuenciacin Existen varias maneras de
determinar la secuencia de aminocidos, el primero en
lograr esto fue Frederick Sanger, quien diseo un mtodo
capaz de determinar la secuencia de los aminocidos en una
protena, el cual consiste en el marcaje del amino terminal a
travs del uso del 1-Fluoro-2,4-Dinitrobenceno (DNFB).
Este compuesto qumico color amarillo reacciona con los
grupos amino libres en condiciones ligeramente bsicas,
formando los dinitrofenil derivados (DNP-aa), tambin
reaccionara con los grupos imidazol, fenlicos y epsilon
amino; por lo que se dar una dinitrofenilacion en la cadena
lateral de la Tirosina, Histidina y Lisina.
Al hidrolizar el pptido o la protena ya dinitrofenilada, se
da una ruptura total de los enlaces peptdicos, lo que nos da
como resultado un hidrolizado que contendr aminocidos
libres y DNP derivados que se conservan intactos, ya que su
enlace es ms difcil de romper.
Los DNP de aminocidos terminales, a diferencia de los
dems DNP y de los aminocidos libres, son no polares por
lo que se pueden extraer muy fcilmente con un disolvente
no polar.
Estos DNP de aminos terminales son sometidos a una
cromatografa en capa fina o en papel Whatman; por lo que
se determina por comparacin con otros DNP derivados de
aminocidos, al amino terminal de la protena.
OBJETIVOS.
El alumno utilizara el mtodo de Sanger para identificar los
aminocidos que contienen el grupo alfa-amino terminal de
las cadenas de la molcula de hemoglobina.

Posteriormente se ajusto el PH debajo de


de HCL 3 N y de esta manera protonar
nitrgeno del amino terminal y proteger
para que al hidrolizar a la protena no
enlace.

Se realiz 3 extracciones de la suspensin amarilla


obtenida, a travs de una solucin de ter saturado con
sulfato ferroso (FeSO4) para eliminar la fraccin de DNFB
que no haba reaccionado ni con el aminocido
mencionado ni con el resto de grupos imidazol
susceptibles a dicho reactivo, que pudiesen estar presentes
en la cadena polipeptdica de la hemoglobina. En la fase
acuosa estaban contenidos el DNP-aa de inters y dems
derivados dinitrofenilados a causa de su alta polaridad en
tanto que en la fase orgnica, color caf, se colect el
DNFB sobrante y se extrajo.

Se coloco el tubo que contena a la protena en bao mara


y se agito para evaporar los residuos de ter que pudiesen
haber quedado.

Se aadieron 5 mL de HCl 6N al tubo que contena la


protena dinitrofenilada y se le someti a una presin en
autoclave durante 3 horas con la finalidad de realizar una
hidrlisis acida y fraccionar, mediante la ruptura del
enlace peptidico a cada uno de los aminocidos
constituyentes de la protena pero manteniendo estable la
interaccin entre el dinitrofenilo y el grupo amino.

Se repiti otra serie de extracciones con ter y FeSO 4 pero


esta vez, la fase extrada y desechada fue la acuosa, pues
contena derivados dinitrofenilados polares con carga y en
este punto del procedimiento el aminocido marcado ya
era no polar y se encontraba en la fase etrea, la cual se
recogi y colect en un vaso de precipitados y
posteriormente evaporar el ter.

Finalmente se preparo un cromatograma y se adiciono un


poco de etanol a nuestro vaso de precipitados, para
hidratar el DNP-aa

3 con 12 gotas
nuevamente el
al enlace C-N,
romper a este

RESULTADOS.
INTERPRETACION DE CADA PASO EFECTUADO
EN LA PREPARACION DEL DERIVADO
DINITROFENILADO.

Se disolvi la protena (hemoglobina) en 2.4mL de


bicarbonato de sodio al 4.2% con el fin de preparar
un medio de reaccin alcalino, para desprotonar al
grupo alfa-amino libre y as facilitar la reaccin con
el DNFB.

Despus de haber adicionado el DNFB se agito


vigorosamente durante 1 hora, y de este modo se
llevara a cabo la dinitrofenilacion, manteniendo un
PH entre 8 y 9 y con ellos formar un derivado
amarillo 2, 4- dinitrofenil aminocido (DNP-aa).

Imgenes del cromatograma obtenido durante la prctica.

Los resultados de los Rfs de la cromatografa obtenidos a partir de


la relacin que existe entre el frente del soluto y el frente del
disolvente fueron los siguientes.

MUESTRA
DNP- Glu
DNP-Val
DNP-Asp
DNP-Ala
DNP-Phe
DNFB
PROBLEMA 1ra Mancha
PROBLEMA 2da Mancha

RFs
( 24.5) / ( 32.3) = O.75
( 23.7) / ( 32.7) = O.72
( 25.2) / ( 33.1) = 0.76
( 21.5) / ( 33.3) = 0.64
( 20.5) / ( 33.0) = 0.62
( 17.3) / ( 33.0) = 0.52
( 19.1) / ( 32.6) = 0.58
( 23.9) / ( 32.4) = 0.73

Tabla 1. Relacin de frentes obtenidos a partir del


Cromatograma.
DISCUCIONES.
La molcula de hemoglobina est formada por cuatro
polipeptidicos o cadenas polipetidicas, dos cadenas alfa
y dos cadenas beta. Cada cadena alfa est constituida
por 141 aminocidos y la VALINA es el aminocido con
Grupo alfa amino terminal.

Analizando los resultados de los Rfs y comparando los


los valores de los 5 DNPs con el valor del Rf del problema,
podimos darnos cuenta que el valor de Rf de la VALINA es
el que ms se acerca al del problema, con esto podemos
decir entonces que la VALINA es el aminocido con grupo
alfa amino terminal de la protena de Hemoglobina,
ratificando as lo citado en la literatura.
CONCLUSIONES.
La VALINA es el aminocido con grupo alfa amino terminal
de la Hemoglobina.
BIBLIOGRAFIA.
Conn, Eric E. (2007). Bioqumica Fundamental. Limusa
Wiley. Mxico. Pgs. Consultadas: 69, 89, 90.
Pea Antonio (1988). Bioqumica. Limusa. Segunda
edicin. Pg. consultada: 427.