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104
CAPITULO 3
proteo mas
Investigacin en protenas y
Resumen
El progreso rpido en la secuenciacin gnica ha propiciado otro de los xitos
de la bioqumica, -el conocimiento del proteoma. El proteoma es el conjunto
completo de protenas expresadas e incluye la informacin sobre cmo se modifican, cmo funcionan y cmo interaccionan con otras molculas.
3.1 La purificacin de las protenas es un primer paso esencial para el
conocimiento de su funcin
Se pueden separar las protenas entre ellas y de otras molculas en base a caractersticas como solubilidad, tamao, carga y afinidad de unin. La electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida separa las cadenas de polipptido de las protenas en condiciones desnaturalizantes principalmente de acuerdo con su
masa. Las protenas tambin se pueden separar electroforticamente en base a
su carga neta por isolectroenfoque en gradiente de pH. La ultracentrifugacin
y la cromatografa de filtracin en gel separan las protenas de acuerdo con su
tamao, mientras que la cromatografa de intercambio inico las separa principalmente en base a su carga neta. La alta afinidad de muchas protenas por
grupos qumicos especficos se utiliza en la cromatografa de afinidad, en la que
las protenas se unen a columnas que contienen bolitas que llevan unidos covalentemente sustratos, inhibidores u otros grupos reconocidos especficamente.
La masa de una protena se puede determinar de forma precisa por medidas de
sedimentacin en el equilibrio.
3.2 Las secuencias de aminocidos de las protenas se pueden determinar
experimentalmente
Las secuencias de aminocidos son ricas en informacin relativa a la afinidad
de las protenas, sus relaciones evolutivas, y las enfermedades producidas por
las mutaciones. El conocimiento de una secuencia proporciona claves vlidas
sobre la conformacin y la funcin. La composicin en aminocidos de una
protena se puede averiguar hidrolizando la protena hasta sus aminocidos
constitutivos en HCl 6 N a 11 O C. Los aminocidos se pueden separar por
cromatografa de intercambio inico y cuantificar por su reaccin con ninhidrina o fluorescamina. Las secuencias de aminocidos se pueden determinar
mediante la degradacin de Edman, que libera uno a uno los aminocidos,
secuencialmente desde el extremo amino terminal del pptido. Las cadenas
polipeptdicas ms largas se fraccionan en otras ms cortas para su anlisis,
rompindolas especficamente con reactivos como el bromuro de ciangeno,
que rompen los enlaces peptdicos en el lado carboxlico de residuos de metionina, o el enzima tripsina, que corta en el lado carboxlico de los residuos de
lisina y arginina.
105
en protenas
Se pueden detectar y cuantificar protenas mediante anticuerpos altamente
especficos; los anticuerpos monoclonales son especialmente tiles porque son
homogneos. Los ensayos de inmunoabsorcin unida a enzimas y la transferencia Western de geles de SDS-poliacrilamida se usan con regularidad.
Tambin se pueden localizar las protenas dentro de las clulas mediante la
microscopa de inmunofluorescencia y la microscopa inmunoelectrnica.
Trminos clave
slida
Las cadenas de polipptidos se pueden sintetizar por mtodos en fase slida automatizados en los que el extremo carboxlico de la cadena creciente se une a un
soporte insoluble. El grupo carboxilo del arninocido entrante se activa con diciclohexilcarbodiimida y se une al grupo arnino de la cadena creciente. Los pptidos sintticos pueden servir como frmacos y cama antgenos para estimular la
formacin de anticuerpos especificas. Tambin pueden ser fuente de conocimiento de la relacin entre la secuencia de aminocidos y su conformacin.
3.6 La estructura tridimensional de las protenas se puede determinar por
Trminos clave
proteoma (p . 66)
ensayo (p. 67)
actividad especfica (p. 67)
homogenado (p. 67)
11
212
CAPTULO 7 La hemoglobina:
instantnea de una protena en accin
Un examen reciente de la secuencia del genoma humano ha puesto de manifiesto la existencia de dos globinas suplementarias. Ambas protenas son monomricas y son ms parecidas a la mioglobina que a la hemoglobina. La primera, la
neuroglobina, se expresa mayoritariamente en el cerebro y a niveles espectaculares
en la retina. Se cree que la neuroglobina puede desempear su funcin protegiendo los tejidos neuronales de la hipoxia (insuficiencia de oxgeno). La segunda, la
citoglobina, se expresa homogneamente por todo el cuerpo. Estudios estructurales y espectroscpicos indican que, tanto en la neuroglobina como en la citoglobina, las histidinas proximal y distal estn coordinadas con el tomo de hierro en la
forma desoxi; la histidina distal se desplaza al unirse el oxgeno. Las funciones de
estos miembros de la familia de las globinas se dilucidarn por completo en estudios venideros.
Resumen
y la hemoglobina unen el oxgeno a los tomos de
hierro del grupo hemo
La mioglobina es una protena estructurada principalmente en a-hlice que
tiene el hemo como grupo prosttico. El hemo est formado por la protoporfirina, un componente orgnico con cuatro anillos pirrlicos unidos, y un ion de
hierro en su centro en estado Fe 2 + . En la mioglobina, el ion de hierro est coordinado con la cadena lateral de un residuo de histidina. Uno de los tomos de
oxgeno del 0 2 se une a un centro de coordinacin libre del hierro. Debido a la
transferencia parcial de electrones desde el hierro al oxgeno, al unirse oxgeno
el hierro se desplaza al plano de la porfirina. La hemoglobina consiste en cuatro
cadenas polipeptdicas, dos cadenas a y dos 3. Cada una de estas cadenas es
similar a la mioglobina en su secuencia aminoacdica y se pliega en una estructura tridimensional parecida. El tetrmero de hemoglobina se describe mejor
como una pareja de dmeros a3.
7.1 La mioglobina
213
Apndice
la liberacin de oxgeno
Las propiedades de la hemoglobina para unirse al oxgeno estn muy afectadas
por el pH y por la presencia de dixido de carbono, un fenmeno conocido
como efecto Bohr. Ai aumc:ntar la concentracin de hidrogeniones -esto es, al
disminuir el pH- disminuye la afinidad de la hemoglobina por el oxgeno,
debido a la protonacin del amino terminal y ciertos residuos de histidina. Los
residuos protonados facilitan la estabilizacin del estado T. Concentraciones
elevadas de dixido de carbono tambin disminuyen la afinidad de la hemoglobina por el oxgeno por dos mecanismos. Primero, el dixido de carbono se
convierte en cido carbnico, que disminuye la afinidad de la hemoglobina por
oxgeno al bajar el pH dentro del hemate. Segundo, el dixido de carbono se
incorpora al amino terminal de la hemoglobina para formar carbamatos. Estos
grupos cargados negativamente estabilizan la desoxihemoglobina mediante
interacciones inicas. Debido a que los hidrogeniones y el dixido de carbono
se producen en tejidos de metabolismo rpido, el efecto Bohr ayuda a liberar
oxgeno en los sitios donde ms se necesita.
7.4 las mutaciones en los genes que codifican las subunidades de
247
Resumen
Resumen
Los enzimas son los catalizadores de los sistemas biolgicos y casi todos los
enzimas son protenas. Los enzimas son muy especficos y tienen gran poder
cataltico. Pueden aumentar las velocidades de reaccin por factores de 10 6 o
aun mayores. Muchos enzimas requieren cofactores para su actividad cataltica. Dichos cofactores pueden ser iones metlicos o coenzimas, pequeas molculas orgnicas derivadas de vitaminas.
8.2 La energa libre es una funcin termodinmica til para la
de transicin
Los enzimas actan como catalizadores disminuyendo la energa libre de activacin de las reacciones qumicas. Los enzimas aceleran las reacciones, ya que
proporcionan nuevas vas de reaccin en las que el estado de transicin (la
forma de mayor energa) tiene menor energa libre, y, por tanto, se forma ms
rpidamente que en las reacciones no catalizadas
La primera etapa en !a catlisis es la formacin de un complejo enzima-sustrato. Los sustratos se unen a los enzimas en la cavidad del centro activo, de la
que se elimina el agua al unirse el sustrato. La especificidad de las interacciones
enzima -sustrato provienen, fundamentalmente, de los puentes de hidrgeno
formados, que son direccionales, y de la configuracin del centro activo, que
rechaza las molculas que no presentan una forma suficientemente complementaria. El reconocimiento de los sustratos por los enzimas va acompaado
de cambios conformacionales de los centros activos, que facilitan la formacin
del estado de transicin.
8.4 El modelo de Michaelis-Menten explica las propiedades cinticas de
muchos enzimas
El modelo de Michaelis- Menten explica las propiedades cinticas de muchos
enzimas. En este modelo, un enzima (E) se combina con un sustrato (S) para
formar un complejo enzima-sustrato (ES), que puede proseguir hasta formar
un producto (P) o disociarse en E y S.
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248
CAPITULO 8
y cintica
Muchos enzimas ahora estn siendo estudiados in singulo, a nivel de una sola
molcula. Dichos estudios son importantes, ya que proporcionan una informacin que es muy difcil de obtener en estudios realizados con poblaciones de
molculas. Los mtodos de una sola molcula revelan una distribucin de las
caractersticas individuales del enzima, mientras que mediante la utilizacin de
mtodos de conjunto se obtiene un valor promedio.
ATP + NMP
ADP + NDP
249
Problemas
Clase
Tipo de reaccin
Ejemplo
1. Oxidorreductasas
Oxidacin-reduccin
Transferencia de grupo
Lactato deshidrogenasa
Nuclesido monofosfato
quinasa (NMP quinasa)
Quimotripsina
16
9
Fumarasa
17
30
2. Transferasas
3.
Hidrolasas
4. Liasas
S. Isomerasas
6. Ligasas
Captulo
16
Trminos clave
enzima (p. 220)
sustrato (p. 220)
cofactor (p. 221)
apoenzima (p. 221)
holoenzima (p. 221)
coenzima (p. 221)
grupo prosttico (p. 221)
energa libre (p. 222)
energa libre de activacin (p. 222)
estado de transicin (p. 225)
centro activo (p. 227)
Problemas
1. Razn de ser. Cules son las dos propiedades de los enzimas que
les convierten en catalizadores especialmente tiles?
8. Escalando montaas. Las protenas son inestables termodinmicamente. El t:I.G para la hidrlisis de las protenas es muy negativo,
aunque las protenas son muy estables. Explica esta aparente paradoja. Qu informacin proporciona respecto de la sntesis proteica?