La mutagense

I Dfinition : modification dune squence dADN.

Deux possibilits : mutagense dirige ou mutagense alatoire.

Mutagense dirige : je veux modifier la squence dADN un endroit donn

Mutagense alatoire : je ralise les mutations au hasard.

II Dans quel but fait-on de la mutagense quelques exemples?

1.

On ma donn un plasmide. Je veux cloner un fragment de restriction dans son polylinker (MCS),

entre les sites Nde1 et BamH1. Le problme, cest quil y a un autre site BamH1 dans le plasmide. Je veux
donc lliminer. Pour cela, je vais faire une mutagense dirige au niveau de cette squence.
2.

Je veux tudier chez la drosophile lensemble des gnes impliqus dans la synthse des pigments

responsables de la couleur des yeux. Je vais faire une mutagense alatoire (puisque je ne connais pas les
squences modifier) sur des ufs de drosophiles puis je rechercherais les drosophiles qui prsentent des
dfauts de pigmentation des yeux. Pour ces individus muts, je localiserais la mutation ce qui me permettra
didentifier la rgion mute et donc le gne impliqu dans la synthse des pigments responsables de la
couleur des yeux.
3.

Je veux tudier la fonction dun acide amin particulier de la protine X que je pense tre impliqu

dans linteraction de cette protine avec lADN. Je vais muter le codon qui correspond cet acide amin en
un autre codon (mutagense dirige) puis je produirais la protine mutante et comparerais la capacit
dinteraction avec lADN de la protine mutante par rapport la protine sauvage.
4.

Je veux tudier la fonction dun gne Y chez la levure. Je vais cloner ce gne dans un plasmide. Puis je

vais raliser une mutagense dirige au niveau de ce gne dans le plasmide. Pour la mutagense, je raliserai
soit une dltion de la squence codante, soit lintroduction dun codon stop en dbut de squence. Puis je
rintroduirais ce plasmide portant la squence mute du gne dans des levures. Cette squence mute
remplacera la squence codante du gne sauvage aprs recombinaison homologue. Janalyserai alors le
phnotype de la levure mute afin de voir quelle(s) fonction(s) a (ont) t perturbe(s).
5.

Jai dcouvert une enzyme dont la fonction est intressante pour des applications industrielles.

Cependant, cette enzyme nest pas assez stable. Je veux augmenter la stabilit de cette enzyme. Je vais
cloner son ADNc dans un vecteur dexpression, raliser une mutagense alatoire de sa squence, produire
les protines ainsi mutes et tudier leur stabilit. Je slectionnerai les enzymes mutantes prsentant les
mmes proprits enzymatiques que la protine sauvage tout en ayant une stabilit plus importante.
III La mutagense dirige.
Lorsqu'on veut changer une ou plusieurs bases dans une squence dADN, on peut partir soit d'un
ADN simple brin soit d'un ADN double brin.

III-a) A partir d'un ADN simple brin

Pour obtenir un ADN simple brin, on clone le gne muter dans un phage simple brin comme M13.
En effet, la phase rplicative tant double brin, on peut le manipuler comme un plasmide. Le clonage dans
les bactriophages de type M13 tant exprimentalement plus complexe raliser que les clonages dans les
plasmides, une alternative consiste utiliser un phagemide (origine de rplication simple brin M13 ou f1).
Pour obtenir lADN simple brin, on infecte une bactrie comportant ce plasmide avec des phages "helper"
qui produisent les enzymes ncessaires au dveloppement du phage (rplication, protines de l'enveloppe...).
Le phage helper tant dficient pour sa rplication, l'ADN du plasmide sera essentiellement empaquet.
Une fois que lon a produit notre plasmide contenant la squence modifier sous la forme simple brin, on va
procder la mutagense.
Technique de base : on hybride un oligonuclotide phosphoryl en 5', comportant la mutation dsire en son
centre. La polymrisation du brin manquant amorce par l'oligonuclotide est effectue l'aide d'une T4
DNA polymrase puis une ligation entre l'extrmit 5' de l'oligonuclotide et le brin nosynthtis est
ventuellement effectue avec la T4 DNA ligase. On est donc ce stade en prsence d'un hybride ADN
sauvage, ADN mut.

Plusieurs techniques ont t trouves pour liminer le brin sauvage une seule sera prsente ici :
Cette technique consiste prparer de l'ADN simple brin dans une
souche bactrienne dut-ung- (Kunkel, 1985).

Oligonuclotide mut

Ces souches dut sont dficientes en UTPase et contiennent beaucoup

d'UTP qui entre en comptition avec le TTP. Les souches ung

manquent d'uracyl N-glycosylase, enzyme qui normalement enlve

U
U

U
U

U
T4 DNA polymrase
4 dNTP
Ligase

l'uracile incorpor dans l'ADN. Ainsi, les souches dut , ungincorporent plusieurs uraciles dans lADN et donc dans le simple

brin. Lors de la synthse in vitro, l'UMP ne gne pas, il n'est ni

mutagne ni inhibiteur. Aprs hybridation de loligonuclotide et
polymrisation, on obtient donc un ADN hybride, un brin mut et un

Hybridation

U
U

ADN double brin

Le brin contenant de luracile
nest pas mut

Transformation

brin sauvage contenant de l'uracile. Si cet hybride est inject dans une
souche ung+, les uracyl N-glycosylases retirent les uraciles,
produisant des sites apuriniques. Ces sites bloquent la synthse
d'ADN et seul le brin mut se rplique. De plus, les sites apuriniques
sont coups et la DNA polymrase I rpare. Comme cette polymrase
a une activit 5'3' exonuclase, on obtient un dplacement de coupure (nick-translation) au cours duquel la
mutation est introduite dans le brin matrice.
On utilisera pour la polymrisation in vitro une ADN polymrase nayant pas dactivit 5'3'
exonuclase. En effet cette activit occasionne un "remplacement de brin" par digestion du brin

nosynthtis en commenant par l'oligonuclotide. Un tel remplacement rsulte en la perte de la mutation

introduite au dpart.

III-b) A partir d'un ADN double brin

Utilisation des techniques de PCR en prsence d'un oligonuclotide mut.
Mutagense par PCR
mthode avec 4 amorces

Une mthode utilise quatre oligonuclotides. On fait

Mutation
Pm2

P1

ADN
Pm1
PCR avec les
amorces Pm1 et P1

P2
PCR avec les
amorces Pm2 et P2

deux

amplifications spares, chacune avec un

oligonuclotide externe et un oligonuclotide portant la

mutation. Les deux fragments obtenus sparment sont
ensuite amplifis ensemble avec les deux amorces les
plus externes. On digre ensuite les deux extrmits par
des enzymes de restriction et on ligue dans le plasmide

PCR avec les

amorces P1 et P2

original.

R1

R2
Digestion avec des enzymes de restriction
et clonage.

Un des inconvnients de la technique de PCR en chane est d'accumuler les mutations au cours des cycles
damplification successifs. Une solution pour remdier ce problme est dutiliser deux oligonuclotides
complmentaires pour la raction de PCR. Dans ce cas seul le brin original sert de matrice (et il ne sagit
plus de PCR proprement parler). Ici les brins noforms ne peuvent pas servir de matrice de nouvelles
amplifications.

Dans cette technique on utilise deux oligonuclotides

P1

complmentaires. On obtient des molcules ayant des

P-1

extrmits cohsives en utilisant uniquement le vecteur

P1

PCR, 12-18 cycles

dorigine comme matrice. Ces molcules ne peuvent pas

P-1

servir de matrice aux amplifications suivantes, il ne sagit

donc pas proprement parler dune PCR. Comme les
molcules ont des extrmits cohsives, on peut avoir
circularisation.
Llimination de l'ADN parent peut se faire par deux
techniques. On peut digrer le produit de la polymrisation

Coupure par Dpn I

par lenzyme de restriction DpnI, seul l'ADN parental

mthyl sil a t purifi partir dune souche Dam+ sera
coup et les nicks seront rpars in vivo par la DNA
Transformation

polymrase I aprs transformation. Son activit 53

exonuclase permettra dintroduire la mutation dans le brin
parental suivant le principe de la nick translation.

Aprs quelques cycles, la population de molcules synthtises augmente et on peut avoir remplissage des
extrmits cohsives par la polymrase. Mais comme il ny a pas dtape de ligation, ces molcules ne
donnent pas de plasmide.
Cette mthode est actuellement la plus utilise car elle est la plus simple mettre en uvre.

Dans ces mthodes, il est prfrable d'utiliser une ADN polymrase thermostable qui n'a pas d'activit
terminale transfrase du fait de la prsence dune activit 35 exonuclase comme par exemple la pfu DNA
polymrase. Il est aussi prfrable dutiliser une polymrase qui na pas d'activit 5'3' exonuclase pour
viter les dplacements damorces.

III-c) Que modifie-t-on par mutagense dirige ?

L'oligonuclotide peut prsenter la substitution d'une base, mais il peut aussi prsenter une insertion
ou une dltion. La longueur de l'insertion (ou de la dltion) n'a pas d'importance, il faudra simplement
utiliser un oligonuclotide assez grand de telle sorte que les deux extrmits puissent s'hybrider sur la
matrice. Etant donn qu'on peut synthtiser des oligonuclotides jusqu' 120 pb, et qu'il faut entre 15 et 20
bases pour obtenir une hybridation spcifique (n4 > grandeur du gnome) une insertion sera actuellement
limite environ 80 bases. Par contre une dltion ne sera pas limite.
Seules les techniques utilisant l'limination des simples brins par filtration sur nitrocellulose seront vites,
l'hybride tant en effet partiellement simple brin au niveau de l'hybridation.

III-d) Comment dtecter les colonies portant les mutations des colonies portant un insert non mut ?
Quelle que soit la mthode, aprs la transformation on a deux sortes de colonies, celles qui portent la
mutation et celles qui correspondent la matrice. On peut trier les colonies en prparant lADN des
plasmides et en squenant la rgion mute. Toutefois afin de faire un minimum de squence on prfre
souvent faire un premier tri en utilisant les mthodes de dtection des mutations. Seule la mthode la plus
utilise sera prsente ici.

Les mutations peuvent tre dtectes par PCR en utilisant plusieurs amorces.
PCR oligonuclotide allle spcifique, PASA (PCR Amplification of Specific Alleles)
En PCR, la polymrase ne peut polymriser que si la dernire base en 3' est stabilise par des liaisons
hydrognes, si la dernire base est hybride. La plupart des polymrases ont une activit 3'-5'exonuclase,
mais certaines d'entre elles comme lADN polymrase Taq en est dpourvue. En prenant deux
oligonuclotides, un spcifique de la mutation (P) et un autre spcifique du tmoin (sauvage - AP) on peut
faire deux PCR l'aide d'un troisime oligonuclotide situ en 3' (en aval) environ 1 kb. On aura
amplification uniquement quavec un des deux couples (Sommer. 1992).

L'absence de bande ne signifie pas toujours l'absence d'hybridation en 3' mais peut rsulter d'un dfaut lors
de PCR, d'une erreur de manipulation. Un tmoin peut tre ajout, c'est un oligonuclotide qui hybride sur
tous les allles (connus) en amont de l'hybridation permettant de voir la mutation. On obtient donc deux
bandes, une bande haute permettant de voir si la polymrisation a bien eu lieu et une bande basse permettant
de voir la prsence ou non de la mutation, suivant l'oligonuclotide qui a t utilis.
amorces
discriminantes
amorce amont

ou
matrice
amorce aval

Oligos A et T

Oligos P et T

Exemple de PASA permettant de distinguer des individus mutants et sauvages

oligoP : oligonuclotide portant la mutation
oligo A : oligonuclotide ne portant pas la mutation
oligo T : oligonuclotide tmoin (amorce amont)
=> Les individus 2, 3 et 5 sont mutants

IV - La mutagense alatoire
La mutagense alatoire gnre des mutations n'importe o dans lADN. Les mutants sont ensuite
tris. On peut gnrer des mutants in vivo ou in vitro. Dans le premier cas, les cellules sont soumises
directement au traitement. Dans le deuxime cas, un plasmide portant le gne est prpar, modifi puis
rintroduit dans une nouvelle cellule.
On peut utiliser des produits qui modifient les bases appeles des agents mutagnes ou utiliser des enzymes.

IV-a) Utilisation d'agents mutagnes

De nombreuses molcules abment l'ADN et peuvent tre utilises pour effectuer de la mutagense.
- Dsamination des bases
La dsamination est une des modifications les
plus courantes de l'ADN. Les groupements amines de

NH
2

l'adnine, de la cytosine et de la guanine peuvent tre

retirs soit spontanment soit l'aide de nombreux

l'adnine

N
N

Adenine

produits chimiques.
Lorsque

est

dsamine,

on

NH
N

N
N

Hypoxantine

obtient

l'hypoxantine, lorsque la guanine est dsamine on obtient la xantine, et lorsque la cytosine est dsamine on
obtient l'uracile.
La dsamination des bases entrane des mutations car elle entrane simultanment des msappariements. Par
exemple, l'hypoxantine, provenant de l'adnosine s'apparie avec la cytosine au lieu de la thymine. De mme,
l'uracile provenant de la dsamination de la cytosine s'apparie avec l'adnine au lieu de la guanine.
Si la base reste modifie jusqu' la rplication, il y a mutation. Par exemple, si une adnine reste dsamine
durant la rplication, il y aura un C sur le brin nosynthtis la place du T. Dans les rplications suivantes,
on aura un G la place du A et en fait, on aura une transition AT vers GC.

Plusieurs molcules peuvent tre utilises pour dsaminer les bases de l'ADN :
- l'hydroxylamine dsamine la cytosine et donc est responsable de transition GC vers AT. Comme
l'hydroxylamine ne rentre pas dans les cellules, cette molcule ne peut tre utilise qu'in vitro.
- le bisulfite de sodium dsamine les cytosines mais l'ADN doit tre simple brin.
- l'acide nitreux dsamine la cytosine, l'adnine et la guanine. Il peut causer des transitions AT vers GC
comme des transitions GC vers AT. De plus il est peu spcifique et peut aussi causer des dltions.

- Alkylation
Les agents alkylants ajoutent des groupes alkyls (CH3, CH3CH2....) aux bases. On peut citer lthyle
mthane sulfonate (EMS) ou la nitrosoguanine. Les atomes les plus ractifs sont le N7 de la guanine, le N3
de l'adnine ou le O6 de la guanine. Cette alkylation n'est souvent pas reconnue par les systmes de
rparation et entrane une diffrence d'appariement.

- Irradiation UV
L'ADN absorbe 260 nm du fait des doubles
liaisons conjugues prsentes sur les bases. Les
photons absorbs augmentent l'nergie des bases et

UV

les doubles liaisons peuvent ragir avec d'autres

atomes prsents proximit. L'altration la plus

souvent rencontre est la formation de dimre de

pyrimidine entre deux bases conscutives.

Les modifications des bases sont rpares et il ny a gnralement pas de mutation. Cependant, si la
rplication a lieu avant la rparation, la base modifie peut servir de matrice une base diffrente et ainsi
occasionner une mutation.

IV-b) Utilisation d'enzymes

error prone PCR (Vartamian et al. 1996)
On peut utilise les erreurs faites par une polymrase dpourvue d'activit 3'5' exonuclase encore
appele activit de correction. LADN polymrase Taq est une de ces enzymes. On clone ensuite le fragment
de PCR dans un plasmide. Deux mthodes peuvent tre utilises pour augmenter le nombre de mutations :
-

1. utilisation d'un milieu ractionnel favorable aux erreurs tel que la forte concentration en ions

manganse (500 M)
-

2. Utilisation dun biais dans la concentration en dNTP. On utilise dans ce dernier cas la relativement

bonne stabilit du msappariement G:T, et on met dans la solution une forte concentration en dTTP (1 mM)
et une faible concentration en dCTP (1 M). Linconvnient de cette deuxime mthode est que lefficacit
de la raction de PCR est diminue ce qui rend difficile le clonage des produits de la mutagense.

Ces mutagenses ne peuvent se faire que si on dispose dun crible facile mettre en uvre pour cribler la
banque et trouver les mutations intressantes. Par exemple, si on cherche une meilleure rsistance un
antibiotique ou si on regarde une meilleure mtabolisation dun substrat dont le produit est chromogne.

Utilisation danalogue de base

Une autre solution est deffectuer une amplification par PCR laide danalogue de nuclotides tel que le 5triphosphate of 6-(2-deoxy- -D-ribofuranosyl)-3,4-dihy dro-8H-pyrimido-[4,5-C] [1,2]oxazin-7-one qui est
efficacement incorpor lors de la polymrisation soit la place du TTP soit la place du dCTP. Cette
mthode permet de contrler le nombre de mutation en contrlant la proportion danalogue (Zaccolo et al.,
1996).