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INFORME
OBJETIVO:
Realizar la extraccin y purificacin parcial de la invertasa de
Saccharomyces cerevisae.
RESULTADOS y CLCULOS:
a) Extraccin
1.- Elaborar un cuadro comparativo de la actividad enzimtica en el sobrenadante
y el paquete celular durante la extraccin.
Clculo de la actividad enzimtica:
*F.D. para c/muestra = 100
Act .enzim tica volum trica=
[ glucosa ]
|problema|
=[ glucosa ] =
x Con . glucosa x F . D. /t reacci n
|est| ndar
t reacci n
0.105
mol
x 2000
x 100
0.08
L
mol
Act .enzim tica volum trica Ssp=
=26250
10 min
L min
A continuacin se calcula la actividad enzimtica real, en la que se resta
la actividad enzimtica de la muestra control:
Act .enzim tica real Ssp= Act . enzim tica SspAct . enzim tica Ssc
mol
mol
=26250
L min
L min
Muestra
Ssp (1)
Ssp (2)
Ssc (1)
Scp (1)
Scp (2)
Scc (1)
Psp (1)
Psp (2)
Psc (1)
Pcp (1)
Pcp (2)
Pcc (1)
Estndar
glucosa
2mM (1)
Estndar
glucosa
2mM (1)
Blanco (1)
A540n
m
0.105
0.105
0
0.22
0.23
0
0.28
0.28
0.02
0.25
0.23
0.04
Extraccin
Act.
Promedi
enzimtica
o
(mol /L
min)
0.105
26250
0.22
55000
0.28
70000
0.02
5000
0.24
60000
0.04
10000
0.08
2000
26250
55000
65000
40000
0.08
0.08
0
PsPc
6500040000
x 100=
=38.46
Ps
65000
b) Purificacin:
Cuadro 2. Comparacin de actividad enzimtica del extracto crudo
problema e invertasa problema durante la purificacin.
Purificacin
Muest
ra
ECP
IP
SP
ECC
IC
SC
EG
2mM
Nmero
Abs
540nm
1
2
1
2
1
2
1
1
1
1
2
0.270
0.250
0.300
0.310
0
0
0
0
0
0.100
0.098
Promed
io
[Act. enz.
vol.]
M/L min
0.260
52, 525.25
0.305
61, 616.16
0
0
0
0
0
0
0.099
2,000
Donde:
ECP extracto crudo problema
IP invertasa problema
SP sobrenadante problema
ECC extracto crudo control
IC invertasa control
SC sobrenadante control
EG estndar de glucosa
Primero se procede a calcular la actividad enzimtica volumtrica de la
purificacin, sabiendo que la concentracin del estndar de glucosa es
de 2,000 M, el F.D. de 100 y el tiempo de 10 min, con las siguientes
frmulas:
Ejemplo para Extracto Crudo Problema (ECP):
1)
[ Glucosa ] =
|problema|
x Con . glucosa x F . D . [ ] M / L
|est| ndar
[ Glucosa ] =
0.260
x 2,000 x 100=525,252.53 M /L
0.099
2)
[ glucosa ]
t reacci n
| |
[Glucosa] [ ] M 1
M
[ ]
t reaccin
L min
Lmin
525,252.53
M
=52,525.25[]
10
Lmin
Numer
o
Abs
500nm
1
2
1
2
1
2
1
2
0.34
0.37
0.28
0.30
0.13
0.135
0.55
0.53
Promedio
mg/L
Act. enz.
esp.
M/min*mg
prot.
0.355
6, 574.07
7.894
0.29
2, 685.19
22.95
0.133
1,231.48
0.54
500
-------
Donde:
EA estndar albmina
*Las abreviaturas de cada muestra se especifican debajo del Cuadro 2.
[ Protena ] =
|problema|
x Con. albmina x F . D . [ ] mg/ L
|est| ndar
[ Protena ] =
0.355
x 500 x 20=6, 574.07 mg / L
0.54
Act . volumetrica
M
L
M
[]
[]
[Proteina ]
Lmin mg prot
min mg prot .
52,525.25
=7.894
6,654.07
61, 616.16
=22.95
2, 685.19
0
=0
1,231.48
eficiencia de recuperacion=
eficiencia de recuperacion=
22.950
100=1 00
22.95
Grado de purificacionrelativo=
22.95
=2.907
7.894
DISCUSIN DE RESULTADOS:
En la presente prctica se determin la actividad de la enzima invertasa,
la cual es liberada de la pared celular de la levadura Saccharomyces
cerevisae mediante la adicin de cistena, aminocido que ayuda a
remover dicha enzima. La invertasa es una enzima que cataliza la
hidrlisis de sacarosa en glucosa y fructosa, productos de reaccin
conocidos como azcares invertidos por ser levorrotatorios mientras
que el sustrato sacarosa es dextrorrotatorio, de ah su nombre comn de
invertasa. Dicho esto, la forma en que se evala su actividad
enzimtica experimentalmente es mediante la determinacin de la
concentracin de glucosa y el desarrollo de color de los reactivos
posteriormente ledos espectrofotomtricamente.
La actividad de la invertasa es medida tanto en los sobrenadantes como
en los paquetes celulares, las cuales se expresan en el Cuadro 1. Ahora,
comparando los datos de la tabla de Sobrenadante problema con
cistena (Scp) y Sobrenadante problema sin cistena (Ssp), se comprueba
que el resultado fue acorde con lo esperado: la cistena ayuda a mejorar
el tiempo de extraccin de la enzima, por sta razn la actividad
enzimtica result mayor para el primer caso con cistena. Caso
contrario para los paquetes celulares, en los cuales la actividad
enzimtica result mayor para el Paquete problema sin cistena (Pcp)
que para el Paquete problema con cistena (Psp), esto es as ya que el
paquete celular sin cistena representa al microorganismo con la pared
celular intacta conteniendo en su interior a la enzima objeto de estudio,
invertasa. Complementariamente, al analizar y comparar los valores de
actividad enzimtica del sobrenadante problema con cistena (Scp) y el
paquete celular problema sin cistena (Psp), el Psp result con una
actividad mayor que el Scp, por lo cual, podemos decir que la extraccin
de la invertasa no se realiz en su totalidad, o dicho de otra manera, si
el paquete celular sin cistena tena su pared celular intacta entonces la
enzima an se encontraba adherida completamente a ella, por lo cual su
actividad enzimtica debera forzosamente ser mayor a la del paquete
celular con cistena (invertasa residual) y a la del sobrenadante con
cistena (invertasa liberada), lo que efectivamente ocurri. El orden de
actividad enzimtica de manera ascendente debera ser el siguiente:
1. Paquete celular sin cistena contiene a la invertasa en su
totalidad
2. Sobrenadante con cistena contiene a la invertasa liberada
3. Paquete celular con cistena contiene a la invertasa que no logr
ser extrada de la pared celular
4. Sobrenadante sin cistena no debera contener invertasa
Por otra parte, en el punto nmero 2, se reporta el resultado del
porcentaje de liberacin de la enzima en el paquete celular, el cual nos
indica la cantidad en por ciento de enzima invertasa que fue liberada de
la pared celular, la cual fue casi del 40% con un valor especfico del
38.46 %. Durante esta etapa experimental, solo cerca del 40% de la
invertasa total pudo ser extrada quedando liberada en el sobrenadante
con cistena, mientras que el 60% restante queda en la matriz
extracelular.
Para la purificacin de la enzima, se hizo empleo del sobrenadante con
cistena durante la extraccin, catalogndolo como extracto crudo, el
cual fue tratado con etanol para precipitar a la protena enzimtica. Este
precipitado se disolvi con regulador Tris-HCl y se le determin la
actividad de invertasa y la concentracin de protena tanto al
precipitado disuelto como al sobrenadante de ste. Los resultados de la
actividad de invertasa expresan como actividad especfica enzimtica el
cual nos da un indicativo de la pureza de la enzima. Como estndar para
la medicin de este parmetro se emplea a la albmina como protena.
En el Cuadro 2 se presentan las actividades enzimticas volumtricas,
las cuales resultaron mayores para la prueba de Invertasa que para el
Extracto Crudo, resultando favorable esta tendencia ya que aunque el
Extracto Crudo presentaba a la enzima invertasa, no se encontraba
purificada ni concentrada como en el precipitado de Invertasa. Para el
Sobrenadante es lgico obtener resultados de nula actividad enzimtica
despus de la purificacin.
En el Cuadro 3 se comparan las actividades especficas enzimticas
(grado de pureza) tanto para el Extracto Crudo, que se compone de la
enzima invertasa liberada despus de la extraccin; la Invertasa, que es
CONCLUSIONES: