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Divergencia de la permeabilidad intestinal y mucosa inmunolgico expresin

gnica en dos condiciones asociadas al gluten: la enfermedad celaca y la


sensibilidad al gluten
Abstracto
Fondo
La enfermedad celiaca (EC) es una enteropata autoinmune desencadenada por la ingestin de
gluten. Las personas sensibles al gluten (GS) no pueden tolerar el gluten y pueden desarrollar
sntomas gastrointestinales similares a las de CD, pero el cuadro clnico general es generalmente
menos grave y no se acompaa de la concurrencia de autoanticuerpos transglutaminasa tisular o
comorbilidades autoinmunes. Mediante el estudio y la comparacin de la expresin de la mucosa
de los genes asociados con la funcin de la barrera intestinal, as como la inmunidad innata y
adaptativa en CD en comparacin con GS, hemos tratado de comprender mejor las similitudes y
diferencias entre estos dos trastornos gluten asociada.
Mtodos
CD, GS y, individuos sin gluten tolerante sanos se inscribieron en este estudio. La permeabilidad
intestinal se evalu usando una sonda de lactulosa y manitol, y las muestras de biopsia de la
mucosa se recogieron para estudiar la expresin de genes implicados en la funcin de barrera y la
inmunidad.
Resultados
A diferencia de CD, GS no se asocia con aumento de la permeabilidad intestinal. De hecho, esto se
redujo significativamente en GS en comparacin con los controles ( P = 0,0308), en paralelo con el
aumento significativamente la expresin de claudina (CLDN) 4 ( P = 0,0286). Relativa a los
controles, los marcadores de inmunidad adaptativa interleucina (IL) -6 ( P = 0,0124) e IL-21 ( P =
0,0572) se expresaron en niveles ms altos en CD, pero no en GS, mientras que la expresin del
receptor Toll-like marcador de la inmunidad innata (TLR) 2 se increment en GS, pero no en CD
(P = 0,0295). Por ltimo, la expresin del marcador de clulas FOXP3 T-regulador se redujo
significativamente en GS respecto a los controles ( P = 0,0325) y los pacientes con EC ( P = 0,0293).
Conclusiones
Este estudio muestra que los dos trastornos gluten asociada, CD y GS, diferentes entidades
clnicas, y contribuye a la caracterizacin de GS como una condicin asociada a la activacin
inducida por el gluten prevalente de respuestas innatas, en lugar de adaptacin, inmunes en
ausencia de cambios detectables en la funcin de barrera de la mucosa.

Fondo
El gluten es el componente de protena
estructural del trigo granos, centeno y
cebada, que son la base para una variedad
de productos de harinas de trigo y derivados
de alimentos consumidos en todo el
mundo. Posiblemente, la introduccin de
granos que contienen gluten, que se produjo
hace unos 10.000 aos con la llegada de la
agricultura, representaba un "error de la

evolucin" que cre las condiciones para las


enfermedades humanas relacionadas con la
exposicin al gluten, el ms conocido de los
cuales estn mediadas por el sistema inmune
adaptativo: alergia al trigo y la enfermedad
celaca (EC). En ambas condiciones, la
reaccin al gluten est mediada por la
activacin de clulas T en la mucosa
gastrointestinal. Sin embargo, en la alergia al
trigo,
es
la
reticulacin
de
la
inmunoglobulina E (IgE) por secuencias de

repeticin en pptidos de gluten (por


ejemplo, Ser-Gln-Gln-Gln (Gln) Pro-Pro-Phe)
que desencadena la liberacin de
mediadores qumicos, tales como histamina,
desde los basfilos y mastocitos[ 1 ]. En
contraste, CD, que afecta aproximadamente
al 1% de la poblacin general, es un
trastorno autoinmune, como anunciado por
la apreciacin de los marcadores serolgicos
especficos, transglutaminasa anti tejido
(tTG)
autoanticuerpos
sricos
ms
notablemente,
por
la
enteropata
autoinmune que caracteriza a esta condicin
y por comorbilidades autoinmunes.
Adems de CD y alergia al trigo, hay casos de
reacciones de gluten en la que estn
implicados mecanismos ni alrgicas ni
autoinmunes. Estos se definen generalmente
como la sensibilidad al gluten (GS)[ 2 5 ]. Algunas personas que sufren de angustia
cuando el consumo de productos que
contienen gluten y muestran mejoras cuando
se sigue una dieta libre de gluten pueden
tener GS en lugar de CD. GS pacientes no
pueden tolerar el gluten y desarrollar una
reaccin adversa al consumo de gluten que
normalmente, y de manera diferente desde
el CD, no conduce a dao del intestino
delgado. Mientras
que
los
sntomas
gastrointestinales en GS pueden parecerse a
los asociados con CD, el cuadro clnico
general suele ser menos grave y no se
acompaa
de
la
concurrencia
de
autoanticuerpos
tTG
o
enfermedad
autoinmune. Por lo general, el diagnstico se
hace por exclusin, y una dieta de
eliminacin y "desafo abierto" (es decir, la
reintroduccin supervisado de los alimentos
que contienen gluten) se utilizan con mayor
frecuencia para evaluar si la salud del
paciente mejora con la eliminacin o
reduccin de gluten de la dieta.
Un nmero de in vitro estudios han
confirmado la citotoxicidad de antgeno
principal de gluten, gliadina. La gliadina ha
actividad aglutinante, reduce el contenido de
F-actina, inhibe el crecimiento celular, induce
la apoptosis, altera el equilibrio redox y

causa una reorganizacin del citoesqueleto a


travs de la va de la zonulina y la prdida de
la unin estrecha (TJ) competencia en la
mucosa gastrointestinal[ 6 - 9 ]. La diversidad
de condiciones inducidas por el gluten est
en lnea con la idea de que el sistema
inmunolgico reacciona y ofertas con el
factor ambiental desencadenante, la
gliadina, de maneras distintas. En el presente
estudio, hemos tratado de obtener
conocimiento inicial sobre la funcin de
barrera intestinal y la respuesta inmune al
gluten en pacientes con GS.En concreto, se
mostraron interesados en entender en qu
medida las vas inmune innata y adaptativa
se activan en la SG en comparacin con el
CD. Para alcanzar estos objetivos, nos fijamos
en la expresin de la mucosa de los genes
asociados con la funcin de barrera intestinal
y parmetros inmunes conocidas o implcitas
ser regulados de manera aberrante en
CD. Los resultados proporcionan la primera
documentacin actualizada de genes y las
vas posiblemente implicados en la
patognesis de la GS, y, al mismo tiempo,
contribuyen a mejorar nuestra comprensin
de los procesos que conducen a CD y otros
fenmenos autoinmunes.

Mtodos
Definicin de GS
Pacientes GS se definen como aquellos
pacientes en los que (diabetes tipo 1,
enfermedades inflamatorias del intestino y
CD, la alergia al trigo y otras enfermedades
clnicamente
superpuestasHelicobacter
pylori infeccin) se han descartado y cuyos
sntomas fueron provocados por la
exposicin al gluten y aliviado por la retirada
del gluten. Todos los pacientes incluidos
fueron sometidos a una estimulacin con
gluten realizado por aproximadamente 4
meses bajo la supervisin clnica. Al final del

desafo, los pacientes fueron sometidos a


pruebas serolgicas de deteccin de CD,
antgeno leucocitario humano (HLA) DQ2 /
DQ8 escribir y una endoscopia digestiva alta
con biopsia duodenal. Una vez que se
realizaron las endoscopias, los pacientes se
vuelven a colocar en una dieta libre de
gluten y sus sntomas controlados a travs
del tiempo. GS se consideraron los pacientes
con serologa negativa autoanticuerpos
(anticuerpos antiendomisio inmunoglobulina
A (IgA-EMA) y tTG-IgA), la mucosa normal
(Marsh etapa 0) o aumento de los linfocitos
intraepiteliales (Marsh etapa 1) y la mejora
de los sntomas a los pocos das de la
aplicacin de la dieta. Para evitar cualquier
posible sesgo de seleccin y para demostrar
que estos pacientes son diferentes de los
pacientes con EC, hemos elegido para
inscribir a todos los pacientes el
cumplimiento de la definicin descrita
anteriormente de la sensibilidad al gluten.
Sujetos
Se obtuvo el consentimiento de todos los
sujetos inscritos despus se explic la
naturaleza de la investigacin y de acuerdo
con el protocolo aprobado por la Junta de
Revisin Institucional de la Universidad de
Npoles. Un total de 26 GS pacientes
diagnosticados segn los criterios antes
mencionados
se
inscribieron. En
comparacin, 42 pacientes con EC activa
fueron reclutados de acuerdo con los
criterios modificados 2004 de la Sociedad
Europea de Gastroenterologa Peditrica,
Hepatologa y Nutricin (ESPGHAN)[ 10 ]. Por
ltimo, 39 sujetos de control fueron
matriculados entre individuos sometidos a
endoscopia
digestiva
alta
para
la
dispepsia. Limitamos nuestro grupo control a

los individuos que tenan exclusivamente


sntomas disppticos y sin inflamacin
subyacente como lo demuestra la tasa de
sedimentacin de eritrocitos normales, la
protena C reactiva y la evaluacin
mucoprotena. Estos sujetos no tienen CD o
GS y se denomina en lo sucesivo como
controles disppticos (DC).
Asunto caractersticas se resumen en la
Tabla 1 .
Para
cada
conjunto
de
experimentos, un subgrupo representativo
de CD, GS y DC se analizaron sobre la base
del consentimiento de los sujetos para
participar en la totalidad o parte de los
estudios propuestos y sobre acuerdos de
transferencia de material entre las
instituciones que participan en este
proyecto. Al menos seis biopsias duodenales
fueron recogidos para la evaluacin
histolgica y la expresin gnica. No se
observ ningn sesgo de seleccin basado en
el sexo, la edad o tipo de sntomas.
Determinacin
intestinal

de

la

permeabilidad

In vivo la permeabilidad se determin por


medio de la lactulosa / manitol (LA / MA) de
prueba
como
se
describi
previamente[ 11 ]. La deteccin y la medicin
de las dos sondas de azcar en la orina se
realiz por cromatografa de intercambio
aninico de alto rendimiento acoplada con
deteccin amperomtrica pulsada, que
permite la cuantificacin directa de los
hidratos de carbono no derivados en un
modelo de Dionex DX-500 con un bucle de
muestra de GP40 y mdulo de bomba de
gradiente de 50 l. Las muestras se cargaron
en CarboPac PA-100 columnas de guardia y
se eluy con un gradiente de NaOH-NaAc
(Dionex, Sunnyvale, CA, EE.UU.).

Tabla 1
Caractersticas clnicas y de laboratorio del estudio de sujetos

Histologa e inmunohistoqumica
biopsias yeyunales

de

Serial secciones (4 m) se prepararon a partir,


biopsias incluidas en parafina fijado en
formol duodenales. Las muestras de biopsia
se organizaron por la histologa de acuerdo a
la clasificacin de Marsh [ 12 , 13 ]. La
inmunotincin para identificar los linfocitos
intraepiteliales (IEL) se realiz como se
describe en otra parte[ 14 ]. Secciones fijadas
con acetona (5 micras) se tieron con

anticuerpos monoclonales para CD3 (1: 200;


Dako, Miln, Italia) y receptor de clulas T
(TCR) (1:50; Thermo Scientific, Rockford,
IL, EE.UU.), utilizando el protocolo de
peroxidasa-antiperoxidasa. Las
secciones
fueron finalmente se tieron con
hematoxilina de Mayer (Sigma-Aldrich, St.
Louis, MO, EE.UU.). Densidad de IEL se
calcul como el porcentaje de los enterocitos
(ECs). Todas
las
diapositivas
fueron
analizadas por dos observadores que
desconocan estos procedimientos.

Determinacin de la expresin gnica de la


mucosa
Intestinal la expresin gnica se midi
mediante reaccin en cadena de la
polimerasa en tiempo real (qPCR) ensayo
cuantitativo
como
se
describi
previamente [ 15 ]. Biopsias
intestinales
pequeos de sujetos participantes fueron
homogeneizados y el ARN total fue extrado
por medio de reactivo Trizol (Invitrogen,
Grand Island, NY, EE.UU.). Los cebadores y
sondas para qPCR de transcripciones
especficas y de la 18S genes como un control
de limpieza fueron adquiridos de Applied
Biosystems (Foster City, CA, EE.UU.). qPCR se
realiz utilizando el protocolo TaqMan y el
Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR
System. Las condiciones de amplificacin
fueron las siguientes: 50 C durante 2
minutos y 95 C durante 10 minutos,
seguido de 50 ciclos a 95 C durante 15
segundos y 60 C durante 1 minuto. Los
datos se calcularon como el cambio en el
ciclo umbral ( CT ) del gen de inters
para 18S y se expresan como porcentajes
de 18S (es decir, 2 -CT 100).
El anlisis estadstico
Se analizaron todos los datos y se
representan utilizando la versin 5.0 del
software Prisma (GraphPad Software, La
Jolla, CA, EE.UU.). La mayor parte de las
variables examinadas en este estudio
parecan estar dispuestos en una distribucin
no normal, sesgada positivamente, por lo
que
la
estadstica
paramtrica
convencionales engaosa. Por lo tanto, los
datos son descritos por las medianas y
rangos intercuartil (IQRs), y el grado de
variabilidad entre los grupos se determin
utilizando el algoritmo no paramtrico de

Kruskal-Wallis. A dos colas de MannWhitney U test fue utilizado (UTH) para las
comparaciones por pares. El nivel de
significacin se fij en P <0,05.
Resultados
Caractersticas clnicas y de laboratorio de
los sujetos GS
Los pacientes que cumplan los criterios
diagnsticos GS (vase la seccin Mtodos)
sntomas experimentados superposicin de
las presentadas por los pacientes con EC (ver
Tabla 1 ), pero sus sntomas desaparecieron
a los pocos das despus de la aplicacin de
la dieta libre de gluten, y se quedaron sin
sntomas durante todo el perodo de
seguimiento (hasta 4 aos). Curiosamente, el
48% de los pacientes eran GS anticuerpo
anti-gliadina (AGA) -positivo, y el 57%
eran HLA-DQ2-positivo y / o HLA-DQ8 positivo. Cincuenta y seis por ciento de los
pacientes GS AGA-positivas eran HLA-DQ2 positivo y / o HLA-DQ8 -positivo, mientras
que el 44% restante eran HLA -negativos, lo
que sugiere que la produccin de AGA no se
asoci con un HLA-DQ2 y -restringido / o
presentacin HLA-DQ8 restringido.
La permeabilidad intestinal
Mientras
que
el
CD
se
asocia
consistentemente con alteracin de la
funcin barrera de la mucosa y el aumento
de la permeabilidad intestinal pequeo, no
se sabe si los pacientes con GS presentan
alteraciones similares. Para abordar esta
cuestin, la relacin urinaria LA / MA se
determin en los tres grupos de estudio. El
ratio LA / MA, y por lo tanto pequea
permeabilidad
intestinal,
vari
significativamente entre los tres grupos ( P =
0,0113, prueba de Kruskal-Wallis). En

particular, fue significativamente mayor en


los pacientes con EC en comparacin con los
pacientes SG ( P = 0,0138; UTH). Una
diferencia similar entre los pacientes con EC
y DC slo aproximada significacin ( P =

0,0950). Curiosamente, la relacin / MA LA


en pacientes GS tambin se redujo
significativamente en relacin con DC ( P =
0,0308)
(Figura1 ).

Figura 1:

Reduccin de la permeabilidad intestinal en (GS) de los pacientes sensibles al gluten . La permeabilidad del
intestino delgado se probaron mediante la medicin de la cantidad urinaria acumulada 5-horas de lactulosa
(LA) (porcentaje de ingerido), manitol (MA) y la relacin-LA-a MA como se describe en (ver Mtodos). Cajas
representan las medianas y rangos intercuartil, con bigotes representan el rango de determinaciones
independientes en 13 GS pacientes, 11 celacos enfermedad (CD) de los pacientes, y 14 controles disppticos
(DC) (ver seccin permeabilidad intestinal del texto, pginas 8-9) . * P <0,05 con respecto a CC y P <0,05 con
respecto a (Mann-Whitney CD U test).

Figura 1 muestra que el aumento de la


permeabilidad intestinal en pacientes de CD,
con respecto a DC, se atribuye a un aumento
significativo de la concentracin urinaria de
lactulosa ( P = 0,0400), sin cambios
significativos en los ttulos de manitol ( P =
0,4937; no significativo). Dado que la
recuperacin urinaria de lactulosa refleja su
transporte exclusiva a travs de la ruta
paracelular, mientras que el manitol es un
marcador de la va transcelular[ 11 ], esto
confirma que los cambios en la relacin / MA
LA observados en CD reflejan el aumento de
la permeabilidad paracelular. Del mismo

modo, la relacin / MA LA reducida en


pacientes GS relativos a CD y DC pareca
estar determinada exclusivamente por la
reduccin de los ttulos de lactulosa, un
hallazgo de nuevo en lnea con la
participacin de procesos que regulan el
paso macromolecular a travs de la ruta
paracelular. En concreto, la mediana del
porcentaje de lactulosa urinaria en GS fue
significativamente menor que en CD ( P =
0,0049), mientras que la diferencia entre GS
y DC no fue significativa ( P = 0,1817; no
significativo).

Expresin del
protenas TJ

intestino

delgado

de

Para entender si los cambios en la


permeabilidad intestinal observada en CD y
GS estn asociados con la expresin alterada
de genes que codifican para componentes
clave TJ, la expresin de claudins (CLDN),
protena TJ (TJP) -1 (tambin conocido como
zonula occludens-1) y ocludina (OCLN) se
determin en tejidos intestinales obtenidas
por endoscopia digestiva alta. Las biopsias se
procesaron
inmediatamente
para
la
extraccin de ARNm, y los niveles de
transcripcin
de
los
genes CLDN1 , CLDN2 , CLDN3 , CLDN4 , TJP1
y OCLN se midieron por qPCR. Como se

muestra en la figura2 , CLDN4 se expres en


niveles significativamente ms altos en GS
que en CD ( P = 0,0286), mientras que una
diferencia similar con DC casi alcanz
significacin ( P = 0,0565).Niveles similares
de CLDN4 se detectaron en las biopsias de
DC
y
CD
(P=
0,7279;
no
significativo). Asimismo, no se observaron
diferencias significativas entre los tres grupos
en los niveles de mRNA de CLDN1 o CLDN2 o
los otros genes relacionados con TJexaminados (no mostrados). Aunque esto
podra ser debido al limitado nmero de
casos estudiados, es poco probable que la
inclusin de una muestra ms amplia podra
compensar el alto nivel de variabilidad y
asimetra encontrado dentro de cada grupo.

Figura 2:

La expresin relativa de unin estrecha (TJ) -relacionados genes en la mucosa de los pacientes sensibles al
gluten (GS) frente a los pacientes con enfermedad celaca (EC) . La expresin de los genes indicados
codifican para componentes del complejo TJ se midi por ensayo de reaccin en cadena de la polimerasa
cuantitativa de ARN extrado de muestras pequeas bioptic intestinales (ver Mtodos). Cajas representan la
mediana (relacin intercuartil), y los bigotes representan el rango de los niveles de ARN relativos, expresados
como un porcentaje de un 18S limpieza de genes en 24 pacientes GS, 31 pacientes con EC y 24 controles
disppticos. * P <0,05 con respecto a (Mann-Whitney CD U test).

Linfocitos intraepiteliales
Los pacientes GS reclutados en este estudio
no presentaron fenmenos autoinmunes
pertinentes
y
serologa
autoinmune
(Tabla 1 ). Adems, en este grupo de
pacientes, no detectamos una asociacin
clara con el haplotipo complejo mayor de
histocompatibilidad (MHC), tan ampliamente
documentado en pacientes con EC. Estos
hallazgos clnicos nos llevaron a plantear la
hiptesis de que el sistema inmune
adaptativo puede no ser tan crticamente
involucradas en GS como en el CD (o en la
alergia al trigo). Para fundamentar este
argumento, nuestros criterios de valoracin
incluidos los marcadores de la respuesta
inmune adaptativa e innatas en la mucosa
del intestino delgado de estos temas. En una
primera serie de observaciones, se compar
el nmero de LIE en GS frente a los pacientes
con EC. Como se inform recientemente por
nuestro grupo[ 15 ], la histologa revel una
normal a ligeramente inflamada mucosa
(Marsh etapa 0 o 1) en pacientes GS,
mientras que todos los pacientes con EC

mostraron atrofia vellosa parcial o subtotal


con hiperplasia de las criptas de acuerdo con
los criterios ESPGHAN[ 10 ]. Los resultados
de inmunohistoqumica CD3 se resumen en
la figura3 . El nmero de CD3 + IELs variaron
considerablemente entre los tres grupos
(P <0,0001; la prueba de KruskalWallis). Como era de esperar, los pacientes
con EC tenan un nmero aumentado de
clulas CD3 + IEL relativa a DC ( P<0,0001;
UTH). CD3 + IELs fueron significativamente
ms numerosos en pacientes GS que en DC
(P <0,0001), pero significativamente menos
que en CD (P = 0,0012). Cabe destacar, sin
embargo, todos menos cuatro pacientes GS
tenan nmeros de IEL por encima del rango
aceptado actualmente de la normalidad (30
/ 100 CE), lo que sugiere un nivel intermedio,
pero patogeneticamente significativa, la
participacin del sistema inmune adaptativo
en esta condicin. Por otro lado, el nmero
de TCR IELs fue consistentemente elevada
en CD (> 3,4 / 100 ECs), mientras que los
nmeros en GS y DC fueron similares (datos
no
mostrados).

Figura 3:
Reduccin
del
nmero
de
linfocitos
intraepiteliales (LIE) en pacientes sensibles al
gluten (GS) frente a los pacientes con enfermedad
celaca
(EC). Pequeas
muestras
bioptic
intestinales se tieron para el marcador de clulas
T CD3 en inmunohistoqumica, y CD3 + clulas se
enumeran como se indica en Mtodos. Cajas
representan la mediana (rango intercuartil), con
bigotes representan el rango de nmeros de IEL
con relacin a 100 enterocitos en las mismas
muestras en 16 GS, 11 CD y 12 controles
disppticos (DC). *** P <0,0005 respecto al
DC; P <0,0005 en relacin con (Mann-Whitney
CD U test).

La expresin de la mucosa de citocinas


relacionadas con la inmunidad adaptativa
Un nmero de estudios han documentado el
aumento gluten-dependiente en la expresin
sistmica y de la mucosa de citoquinas
asociada con las respuestas de adaptacin
Th1 y Th17 en CD [ 16 - 19 ]. Recientemente
hemos demostrado que la firma de
citoquinas Th17, IL-17A, se expresa en
niveles significativamente ms altos en la
mucosa intestinal de pacientes con EC pero
no GS pacientes[ 15 ]. Tambin hemos
demostrado que la gliadina induce
monocitos circulantes para producir la
citoquina-Th17 activo, IL-23, un efecto
mediado por la expresin concomitante de
IL-1 y IL-6[ 17 , 20 ]. Para extender estas
observaciones y para definir an ms el
papel de la inmunidad adaptativa en GS,
mRNA extrado a partir de pequeas biopsias
del intestino delgado fue sometida a qPCR
para la expresin de la pleiotrpica, Th17
activador de citoquina interleuquina (IL) -6,
la citocina Th1 interfern (IFN) -, e IL-21,
una citocina Th1 involucrado tanto en la
diferenciacin de las clulas Th17 y en el
mantenimiento de las respuestas Th1 en
curso[ 21].
Como se muestra en la figura 4 , los
pacientes de CD como un grupo expresaron
Figura 4:

mayores niveles de transcripciones de IL-6


(IL6), IFN- ( IFNg ) y IL-21 (IL21) en relacin
con DC. Sin embargo, debido a un alto grado
de variabilidad entre los donantes CD y
debido a un efecto de subgrupos ya
documentado en nuestro informe anterior
sobre IL-17A[ 15 ], slo la diferencia en la
expresin de IL-6 fue estadsticamente
significativa ( P = 0,0124), mientras que las
diferencias
en IFNg los
niveles
de
transcripcin
y
IL21
aproximadas
significacin ( P = 0,0700 y P = 0,0572,
respectivamente). Los niveles de IL6, IFNG , y
transcripciones de IL21 en muestras de
pacientes GS no difirieron significativamente
de los de DC o CD, a excepcin de una
reduccin
significativa
en IFNg niveles
relativos de CD ( P = 0,0222). IFNG era el
nico gen de citoquina probado que
mostraron un importante grado de
variabilidad entre los tres grupos ( P <0,0428;
la prueba de Kruskal-Wallis). As, en lnea con
su papel en la diferenciacin de clulas Th17,
IL-6 se expresa en un aumento significativo
de los niveles en mucosa CD, pero no en GS
mucosa. Una expresin concomitante
reducido de IFN- en GS con relacin al CD
apoya la nocin de una participacin de nivel
inferior del sistema inmune adaptativo en
esta condicin.
Pacientes
mayores
niveles
de
transcripciones para citocinas efectoras en
la mucosa de pacientes con enfermedad
celiaca (EC), pero no por sensibilidad al
gluten (GS) . La expresin de los genes
indicados se midi por ensayo de reaccin
en cadena de la polimerasa cuantitativa
(ver Mtodos). Cajas representan la
mediana (rango intercuartil) y bigotes
representan el rango de los niveles de ARN
relativos a un 18Slimpieza de genes en 13
GS, 19 CD y 11 controles disppticos
(DC). * P <0,05 con respecto a (MannWhitney DC U test).

Expresin del intestino delgado de los


receptores tipo Toll
Se ha informado de que la expresin de Tolllike receptor 1 ( TLR1 ), TLR2 y TLR4 se
incrementa en la mucosa del intestino
delgado de pacientes con EC, apoyando la
idea de que los fenmenos inmune innato
puede preceder a y / o acompaar a la
progresin de la CD y otras condiciones
autoinmunes[ 22 - 24 ]. Para
evaluar
preliminarmente la participacin de la
inmunidad innata en GS, comparamos la
expresin de estas molculas en biopsias

frescas de los tres grupos de estudio. Como


se ilustra en la figura5 , la expresin
de TLR1 y TLR2 , pero no TLR4 , mRNA fue
mayor en los pacientes con EC que en DC,
pero ninguna de estas diferencias alcanzaron
significacin. En contraste, en relacin a DC,
los pacientes con GS present niveles
significativamente
ms
altos
de TLR2 transcripciones
(P=
0,0295),
mientras que los niveles de transcripcin
de TLR1 y TLR4 en GS fueron generalmente
mayores sin alcanzar significacin ( P =
0,0932 y P = 0,1274, respectivamente).

Figura 5:

El aumento de los niveles de transcritos para los receptores de reconocimiento de patrones en la mucosa
de pacientes sensibles al gluten (GS), pero los pacientes con enfermedad no celaca (CD). La expresin de
los genes indicados codifican para receptores Toll-like TLR1, TLR2 y TLR4 se midi por ensayo de reaccin en
cadena de la polimerasa cuantitativa (ver Mtodos). Cajas representan la mediana (rango intercuartil) y
bigotes representan el rango de los niveles de ARN relativos a un 18S limpieza de genes en 8 GS, 12 CD y 5
controles disppticos (DC). * P <0,05 con respecto a (Mann-Whitney DC U test).

Expresin de la mucosa de los genes


reguladores T-clulas asociadas
Para evaluar preliminarmente si una
diferencia en funcin reguladora inmune
puede dar cuenta de la participacin
diferencial del sistema adaptativo en CD

frente a los pacientes GS, que mide la


expresin del ARNm de dos de las clulas T
reguladoras (Treg) molculas de firma, caja
forkhead P3 (FOXP3) y transformar el factor
de crecimiento 1 (TGFB1), en pequeas
muestras de biopsia intestinal. En contraste
con los informes anteriores[ 25 , 26 ], los

niveles de expresin tanto de FOXP3 y TGFB1


en pacientes con EC no difieren
significativamente de los de CC ( P = 0,8868
y P = 0,1535, respectivamente). En cuanto a
TGFB1, no parece haber una tendencia hacia
menores, en lugar de ms alta, niveles de
expresin
en
pacientes
con
EC
(Figura6 ). Este fenmeno fue ms acentuado
en los pacientes GS, en los que la expresin
de FOXP3 y TGFB1 fue, significativamente
para FOXP3, reducido con respecto al DC
(P=
0,0325
yP=
0,0710,
respectivamente). Reduccin de FOXP3 en
GS represent una variacin significativa

entre los grupos ( P <0,0250, prueba de


Kruskal-Wallis) y tambin fue significativo en
relacin con CD ( P = 0,0293), mientras que
no se observ ninguna diferencia significativa
en la expresin TGFB1 en GS frente a los
pacientes con EC ( P = 0,7832). Estos
hallazgos, bastante opuestos a nuestra
hiptesis de partida, pero tal vez en
consonancia con los informes anteriores en
CD y otras condiciones[ 27 , 28 ], puede
sugerir un nivel reducido de activacin y / o
la contratacin de las clulas Treg en el GS
mucosa del intestino delgado en relacin al
gluten
tolerantes
controles.

Figura 6:

Los niveles reducidos de transcritos de genes de regulacin inmune en la mucosa de pacientes sensibles al
gluten (GS), pero los pacientes de la enfermedad no celaca (CD) . La expresin de los genes indicados se
midi por ensayo de reaccin en cadena de la polimerasa cuantitativa (ver Mtodos). Cajas representan la
mediana (rango intercuartil) y bigotes representan el rango de los niveles de ARN relativos a un 18S limpieza
de genes en 19 GS, 12 CD y 8 controles disppticos (DC). * P <0,05 con respecto a (Mann-Whitney DC U test).

Discusin
CD, una enteropata autoinmune, los
resultados de una respuesta inmune
inapropiada mediada por clulas T
adaptativa contra gliadina se ingiere. En los
ltimos aos, sin embargo, se ha hecho

evidente que la "clsica" CD representa la


punta del iceberg de una carga global de la
enfermedad[ 4 , 29 ]. Un
problema
emergente es la caracterizacin clnica de un
grupo de pacientes de gluten reactivo, que
representa aproximadamente el 10% de la
poblacin en general, se presentan con

sntomas similares a los CD, pero con


serologa negativa CD y la histopatologa.Al
igual que en el CD, estos pacientes, aqu y en
otros lugares a que se refiere como GS[ 15 ],
la experiencia de dificultad al comer
productos que contengan gluten y muestran
una mejora cuando se sigue una dieta sin
gluten. A diferencia de los CD, sin embargo,
en GS las reacciones adversas que se
desarrollan mientras que el consumo de
gluten no son seguidos por la aparicin de
autoanticuerpos y por la persistencia de
daos en el intestino delgado. Los sntomas
en GS pueden parecerse a algunos de los
sntomas gastrointestinales que se asocian
con el CD o alergia al trigo, pero las pruebas
diagnsticas objetivas para esta condicin se
encuentran actualmente desaparecidos. Por
lo tanto, un diagnstico de GS se hace
comnmente por exclusin.
En s misma, la ausencia de autoanticuerpos
y lesiones intestinales no descarta la
toxicidad intrnseca de gluten, cuya ingesta,
incluso en individuos no-CD, se ha asociado
con el dao a otros tejidos, rganos y
sistemas adems el intestino [ 6 , 30 , 31 ]. En
el presente estudio, hemos tratado de
identificar funcionales, morfolgicas y
parmetros inmunolgicos para ayudar a
diferenciar GS de CD y comprender de forma
preliminar su fisiopatologa. Presentamos
aqu por primera vez pruebas de las
respuestas de la mucosa intestinal
diferenciales al gluten en estas dos
condiciones.
Hemos demostrado que una normal a la
histologa leve en GS es paralela a una
funcin de barrera conservado. De hecho, la
permeabilidad intestinal pequea, cuando se
prueba con una sonda de azcar doble LA /

MA, fue significativamente menor en GS que


en los pacientes de CD o incluso
DC. Aumento de la permeabilidad intestinal
se piensa que es un cambio biolgico
temprana que precede a la aparicin de
varias enfermedades autoinmunes[ 32 34 ]. La prdida de la funcin de barrera
intestinal trae consigo un pasaje aberrante
continua de antgenos a travs del epitelio
intestinal. Esto puede causar un cambio de la
tolerancia a la inmunidad, por lo tanto, lo
que representa un aumento del riesgo de
enfermedades autoinmunes y alrgicas en
individuos cuyo otro gentica determinantes,
MHC y no-MHC, dan lugar a no apropiado
procesamiento
y
presentacin
de
antgenos. En el epitelio intestinal, la
permeabilidad paracelular est regulada por
protenas TJ intercelulares. Como se muestra
recientemente, Cldns son componentes
integrales TJ que son crticos para el
mantenimiento de adhesin clula-clula en
monocapas epiteliales [ 35 -37 ]. El balance
global de especies CLDN expresado en un
tipo de clula ayuda especial, para definir las
caractersticas de su TJ. Por ejemplo, CLDN1
y CLDN4 se postulan a disminuir, mientras
que CLDN2 se postula para aumentar TJ
dependiente de la permeabilidad[ 35 ]. En
lnea con esta nocin, y con la apreciacin de
la reduccin de la permeabilidad intestinal
pequea en pacientes GS, hemos
demostrado aqu que la mucosa GS expresa
niveles significativamente ms altos de las
transcripciones de CLDN4 relativa a CD o
DC. En contraste, otros CLDN genes y otros
genes asociados con la funcin TJ medido en
este estudio no parecen expresarse de
manera diferente en el GS o CD mucosa en
comparacin con los controles. En conjunto,
estos resultados sugieren que las
caractersticas
clnicas
y
serolgicas

diferentes entre los pacientes GS y CD estn


asociados con marcadas diferencias en la
funcin de barrera de la mucosa y con
aparentes diferencias en la expresin
de CLDN4 , que codifica para un componente
crtico TJ[ 38 ]. Se requieren ms estudios
para comparar la distribucin y montaje de
esta y otras protenas TJ en estas
condiciones.
Los pacientes con GS no presentan
autoinmune significativos o comorbilidades
alrgicas, y, como tambin hemos mostrado
aqu, la serologa para autoanticuerpos
comunes, incluyendo anti-tTG IgA, es
negativo. Curiosamente, AGA IgA e IgG
fueron positivos en casi el 50% de los
casos. De manera similar, ms altos que los
ttulos esperados de los OPA, los signos y
sntomas asociados con la sensibilidad al
gluten no-CD, tambin se han reportado para
la esquizofrenia[ 39 ] y los trastornos del
espectro autista[ 40 ]. Mientras que en CD
hay una fuerte asociacin gentica con la
clase
II
MHC
haplotipo,
con
aproximadamente 95% de los pacientes
portadores de HLA-DQ2 y el restante 5% en
libros HLA-DQ8 , hemos demostrado que
slo alrededor del 50% de los pacientes con
GS carry HLA -DQ2 y / o HLA-DQ8 , un
porcentaje ligeramente ms alta que en la
poblacin
general. Esto
sugiere
una
reduccin del nivel de implicacin de la
respuesta
inmune
adaptativa
MHCdependientes de GS respecto a CD. Adems,
hemos demostrado que la mucosa GS
contiene nmeros de CD3 aument + IELs, a
pesar de que estos nmeros fueron
significativamente inferiores a los de los
pacientes con EC activos en el contexto de la
arquitectura
de
las
vellosidades
relativamente
conservadas,
que

corresponden a los 0 y 1 etapas de la


clasificacin de Marsh. Esto est en
consonancia con una participacin ms
limitada del sistema inmune adaptativo en
GS y puede explicar por qu esta condicin
no se acompaa de fenmenos autoinmunes
significativos.
En CD, una respuesta adaptativa se ha
demostrado que ser desencadenada por los
pptidos del gluten tTG-desamidadas unidos
a DQ2 o DQ8. Esto implica el reclutamiento y
la activacin de la mucosa Th1 y Th17 clones
y la produccin de citoquinas Th1 y Th17asociado, a saber, IFN- y la IL-17A, que
contribuyen a perturbar la funcin de
barrera y el inicio de dao tisular[ 16 , 18 21 ,41 ]. En un informe anterior, se
demostr que las transcripciones de IL-17A
se expresan en niveles significativamente
ms altos en la mucosa del intestino delgado
de al menos un subgrupo de pacientes con
EC, pero no en pacientes GS[ 15 ]. En este
estudio, hemos ampliado este hallazgo y
demostrar que la firma de citoquinas Th1,
IFN-, tambin se expresa en niveles
significativamente ms bajos en la mucosa
GS frente a CD. Adems, en CD, pero no en
GS, se observ una mejora de forma
significativa la expresin de IL-6, una
citoquina pleiotrpica que es conocido por
promover la diferenciacin y funcin de las
clulas Th17, as como una tendencia similar
en la expresin de IL-21, coherente con su
papel establecido en la patofisiologa de las
clulas Th1 y Th17.
Estos resultados podran indicar que GS es
una condicin inflamatoria principalmente
apoyado
por
mecanismos
inmunes
innatas. Entre estos, TLRs representan una
familia de evolutivamente conservados

receptores capaces de detectar la invasin


microbiana a travs de reconocimiento de
patrones y mediar una respuesta
inflamatoria rpida que puede o no puede
progresar en una respuesta adaptativa
dependiente
de
antgeno. Diferentes
combinaciones de los TLR se expresan en
clulas hematopoyticas y clulas no
hematopoyticas tales como clulas
epiteliales intestinales[ 42 - 44 ]. En este
estudio, hemos observado que la pequea
expresin intestino de TLR2, y en menor
medida TLR1 pero no TLR4, se incrementa en
pacientes GS. En la ausencia de marcadores
de la inmunidad adaptativa, como hemos
visto, esto sugiere un papel predominante
del sistema inmune innato en la patognesis
de la GS.
En conjunto, estos resultados apoyan la idea
de que la participacin frecuente de innata
frente a vas inmunitarias adaptativas puede
ayudar a explicar las diferencias clnicas y
serolgicas en GS frente a los pacientes con
EC. Reduccin de la funcin de las clulas
Treg, y especficamente de las clulas Treg
"adaptativo", se ha propuesto para tener en
cuenta la prdida de la homeostasis inmune
y el desarrollo de respuestas autoinmunes en
CD y condiciones relacionadas[ 26 ]. Se
podra inferir, entonces, que Treg podra
prevenir eficazmente la progresin de esta
respuesta en pacientes GS. Una expresin de
la mucosa significativamente reducida del
marcador distintivo Treg, FOXP3, como se
aprecia en pacientes GS en este estudio, por
lo tanto, es sorprendente y contrario a la
intuicin,
a
la
luz
de
estas
consideraciones. Sin embargo, al menos tan
sorprendente, en varios estudios FOXP3 y
otras molculas expresadas-Treg, tales como
TGFB1, se han encontrado para ser

upregulated en la sangre perifrica y la


mucosa intestinal de los pacientes con
condiciones de CD y relacionados, por
ejemplo,
la
diabetes
tipo
1[ 28 , 45 ].Hallazgos anlogos han sido
reportados en otras condiciones asociadas
con la amplia participacin de la inmunidad
adaptativa, tales como la alergia y el asma,
dando lugar a la especulacin de que una
expansin y / o la movilizacin
compensatorio de Treg pueden tener lugar
de forma concomitante con la acumulacin
de
una
respuesta
efectora
adaptativo[ 46 ]. Paradjicamente, entonces,
si esta suposicin es cierta, una expresin
reducida de marcadores Treg en GS podra
interpretarse en el contexto de una
activacin general reducida de adaptacin
relativa inmunidad a CD. Aunque obviamente
se necesitan ms estudios para dilucidar esta
cuestin, una mejor comprensin de la
funcin de Treg en CD y afecciones
relacionadas ayudar a caracterizar el posible
papel patognico de la reduccin de la
activacin y / o contratacin de Treg en GS.
Conclusiones
Los resultados de este estudio sugieren que
la CD y GS son entidades clnicas distintas
causadas por diferentes respuestas de la
mucosa intestinal al gluten. CD resulta de un
complejo, y an por determinar, interaccin
de aumento de la permeabilidad intestinal,
dao de la mucosa, los factores ambientales,
adems de gluten, y la predisposicin
gentica, que implica tanto MHC y genes noMHC. Las lesiones intestinales tpicos en CD
se piensa que es mediado por las rutas
efectoras
inmunes
innatas
y
adaptativas. Nuestros hallazgos sugieren
que, de una manera diferente, GS se asocia

con la activacin frecuente de una respuesta


inmune innata. Aunque los mecanismos
responsables de la prdida de la funcin de
barrera intestinal en CD se han delineado en
parte,
todava
no
se
entienden
completamente los factores responsables de
la prdida de la tolerancia al gluten y el
desarrollo de autoinmunidad en esta
condicin. Creemos que este estudio podra
contribuir a la caracterizacin clnica de GS
como una condicin asociada a la activacin
inducida por el gluten prevalente de la
inmunidad innata en ausencia de cambios
detectables en la funcin barrera de la
mucosa, y que proporciona pistas adicionales
a la definicin del complejo gluten inducida
por los cambios en la regulacin TJ y
procesos
inmunolgicos
subyacentes
patognesis de CD. Doble ciego, controlados
con placebo son necesarios para consolidar
an ms la definicin de los pacientes GS y la
bsqueda de biomarcadores especficos para
un diagnstico adecuado.
Abreviaturas
AGA:
anticuerpos
anti-gliadina; CD:
enfermedad celaca; CLDN: claudina; DC:
controles
de
dispepsia; CE:
enterocito; Anticuerpos
antiendomisio;:
EMA FOXP3: P3 cuadro forkhead; GS: la
sensibilidad
al
gluten; IEL:
linfocitos
intraepiteliales; IFN:
interfern; IL:
interleucina; LA:
lactulosa;MA:
manitol; MHC:
complejo
mayor
de
histocompatibilidad; OCLN:
oclusin; PCR:
reaccin en cadena de la polimerasa; TGF:
factor de crecimiento transformante; Th: T
auxiliares; TJ:
unin
estrecha; TLR:
receptores Toll-like; Treg: las clulas T
reguladoras; tTG: la transglutaminasa tisular.

Conflicto de intereses
AF es accionista del ALBA Therapeutics
(Baltimore, MD, EE.UU.). AS, KML, VC, MC,
MTG, MD, RS, GM, CT, AP, MIR, PE, FF, MC,
GR y LDM no tienen intereses en
competencia para declarar.
Autores de las contribuciones
AS, GM y AF concibe el estudio. AF apoy el
estudio. AS, KML, VC, MTG, GM, MC, LDM y
AF contribuyeron al diseo del estudio. AS y
KL llevan a cabo la mayor parte de los
estudios de gentica molecular. MC llev a
cabo el ensayo molecular de las vas de los
receptores de tipo Toll.MD, CT y GR
participaron en los estudios de alineamiento
de secuencias. RS y FF llevado a cabo
ensayos de inmunohistoqumica; MIR y PE
participaron en el reclutamiento de los
pacientes y llevaron a cabo los
procedimientos de endoscopia. AS, KML, VC
y AF estaban involucrados en el anlisis e
interpretacin de los datos. AS, KML, VC, GM
y AF redact el manuscrito. AS, KML, VC, MD,
CT, MC, GR, LDM y AF revisado crticamente
el manuscrito. Todos los autores dieron su
aprobacin final de la versin del manuscrito
que se publicar.