III.

MATERIALES Y METODOS
3.1.

Lugar de ejecucin

La prctica se desarroll en el Laboratorio de Microbiologa de la Universidad

Nacional Agraria de la Selva.

3.2.
3.3.
3.4.

Materiales de laboratorio
Placa Petri
Tubos de ensayo
Probetas
Aza de siembra
Embudos
Papel filtro
Matraz
Balanza
Tubitos de Durham
Cuenta colonias
Reactivos
Caldo peptona
Medio Plate Count
Caldo Lactosa Bilis Verde Brillante (Brilla)
Caldo E. coli
Agar EMB
Caldo Tetrationato
Caldo Cistina - Selenito
Agar Samonella Shigella (SS)
Metodologa
3.4.1. Numeracin

de

Microorganismos

Aerobios

Viales:
-

De la cuarta dilucin (10 -4) sacamos 1 ml y sembramos en

una placa Petri vaca.

Adicionamos 10 20 ml de agar Plate Count.
Cuando se ha solidificado se lleva a encubar a 37 C por 24
48 horas.

3.4.2. Enumeracin de microorganismos coliformes

totales y coliformes termotolerantes (mtodo
nmero ms probable)
-

Para la enumeracin de coliformes totales:

Recogemos 250 ml de muestra de agua de la quebrada el

Aquila.
Sacamos 10 ml de muestra y lo echamos en un matraz con
90ml de caldo peptona, sera la primera dilucin (10

-1

) y

rotulamos.
Para la segunda dilucin (10 -2) del matraz sacamos 1 ml de

muestra y lo echamos en un tubo de ensayo y rotulamos.

Para la tercera dilucin (10 -3), sacamos de la segunda dilucin

1 ml y lo echamos en un tubo de ensayo y rotulamos.

Para la cuarta dilucin (10 -4), sacamos de la tercera dilucin 1

ml y lo echamos en un tubo de ensayo y rotulamos.

Para realizar la prueba presuntiva preparamos 9 tubos de
ensayo cada uno con 9 ml de Caldo Lactosa Bilis Verde

Brillante (Brilla)
De la segunda disolucin echamos 1 ml en los 3 primeros
tubos con el Caldo Lactosa Bilis Verde Brillante (Brilla), luego

metemos tubitos de Durham invertidos.

De la tercera disolucin echamos 1 ml en los 3 siguientes
tubos con el Caldo Lactosa Bilis Verde Brillante (Brilla), luego

metemos tubitos de Durham invertidos.

De la cuarta disolucin echamos 1 ml en los 3 primeros tubos
con el Caldo Lactosa Bilis Verde Brillante (Brilla), luego

metemos tubitos de Durham invertidos.

Los 9 tubos se lleve a encubar a 35 C 37 C por 24 48

horas.
Se verifica la produccin de gas en los DURHAM cada 24

horas.
Segn los resultados observados se determina el ndice de
NMP de la tabla y se calcula el NMP por 100 ml con la
frmula:
NMP Indice NMP ( tabla ) difucion intermedia
=
100 ml
100

Para enumerar los coliformes termotolerantes se repite los

pasos ya mencionados, solo con la diferencia de que se usa el

caldo E. coli y se encuba a 44.5 C por 24 48 horas.

La prueba completa se hace de los tubos positivos de la
prueba

de

coliformes termotolerantes,

estos

tubos

se

siembran por estras en un medio solido EMB.

3.4.3. Determinacin de Salmonella
-

Para la prueba presuntiva, de la muestra de agua sacamos 25

ml y lo echamos en un matraz que tiene 225 ml de caldo

peptona e incubar a 37 C por 24 48 horas.

Para la prueba de enriquecimiento selectivo, del caldo peptona
sacamos 10 ml y lo echamos en un matraz que contiene caldo
tetrationato con yodo metlico, despus otros 10 ml en un
matraz que contiene caldo cistina selenito y los dos

matraces lo encubamos a 44.5 C por 24 48 horas.

Para la prueba de seleccin, sembrar con anza por estras en
placas Petri con agar Samonella Shigella (SS) o con Agar

Verde Brillante con Rojo Fenol (VBRF).

Para la prueba bioqumica las colonias sospechosas de las
placas Petri sembrar en agar TSI y en agar LIA.
3.4.4. Enumeracin de fungi (mohos y levaduras)

Sacamos 1 ml de la cuarta dilucin (10 -4), en una placa vaca

y aadimos agar Saburound glucosodo 4 % mas antibitico
ceftrioxona de 1 gramo e incubar a temperatura ambiente de 3

5 das.
Despus contar las colonias y aplicar la formula.