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1 (2002): 1-10
Artculo resea
INTRODUCCIN
El anlisis de la regulacin de los genes en clulas
de animales es una de los temas centrales de la Biologa Molecular actual. Por esta y otras razones, los procedimientos para introducir genes manipulados en dichas clulas, donde la regulacin pueda ser ensayada, han sido objeto de intensa investigacin. Ha habido una gran diversidad de enfoques de las mismas
como son: la microinyeccin directa de ADN en el ncleo de los oocitos de anfibios, en huevos fertilizados
contrndose una a la cual puede ser obtenida la mayor eficiencia de transfeccin (9). Se ha descubierto
que este precipitado es txico a las clulas, por lo cual
es necesario determinar el tiempo ptimo de exposicin al mismo (9, 34) y por lo general, los cultivos primarios celulares tienden a ser ms sensibles a este
(9).
Aparentemente los grnulos de ADN-fosfato de
calcio son fagocitados por las clulas, por lo que la
eficiencia de transfeccin de las mismas depende de
la superficie de exposicin al mismo; en aquellos cultivos que no han alcanzado la confluencia, esta superficie es mucho mayor que en aquellos confluentes y la
propiedad de la monocapa celular est determinada
por el nmero de clulas depositadas, por la composicin del medio de cultivo utilizado y por el tiempo del
cultivo (34).
Lo anteriormente expuesto avala la necesidad de
establecer las condiciones experimentales que aseguren una mayor eficiencia de transfeccin, entre estos parmetros se encuentran la concentracin de clulas, suero fetal bovino, y ADN plasmdico, as como
el tiempo de exposicin al precipitado (28).
Una vez transfectada la clula, una pequea porcin del ADN se integra establemente en el genoma
nuclear de la clula receptora. El precipitado del fosfato
de calcio proporciona un mtodo general para introducir cualquier ADN en clulas Eucariotidas. Puede ser
aplicado a una cantidad relativamente grande de clulas en placa de cultivo, pero est limitado por la proporcin variable y frecuentemente muy baja (1-2%) de
clulas que toman ADN exgeno. Solo una subfraccin
de estas clulas sern transfectadas establemente.
Aunque tampoco se ha esclarecido el mecanismo
por el cual los liposomas, con lpidos neutros o
catinicos, permiten la penetracin del ADN a las clulas, la aplicacin de este mtodo ha facilitado estudios de asociacin entre la glicoprotena CD4 de la
membrana plasmtica y la protena Tirosina kinasa
asociada a la misma, el ensamblaje de virus y la
interaccin entre la glicoprotena 160 del VIH y la CD4.
La seleccin de una mezcla particular de Liposomas
depende de la lnea celular que va a ser transfectada.
Comercialmente existen dos mezclas de liposomas:
la Lipofectina y TransfectACE, que son efectivos en
un amplio rango de lneas celulares, y aunque este
ltimo es menos costoso, puede no ser tan efectivo en
todos los tipos celulares como el primero (66). Para la
optimizacin de este mtodo se debe tener en cuenta
la concentracin total de lpidos y ADN y el tiempo de
incubacin, ya que a menudo pequeas cantidades de
Rev. Salud Anim. Vol. 24 No. 1 (2002)
ales de poliadenilacin y terminacin de la transcripcin para asegurar la finalizacin adecuada del ARN
mensajero expresado (23, 24).
Frecuentemente en estos vectores se utilizan como
promotores virales aquellos procedentes del virus
SV40, los cuales permiten la expresin en un amplio
rango de clulas, pero tiene las caractersticas de ser
un promotor dbil, o sea, que a partir de l solo pueden obtenerse bajos niveles de protena recombinantes
en clulas transfectadas (23).
El promotor ms utilizado procede de
citomegalovirus (CMV) debido a que este induce niveles de expresin muy elevados en un amplio rango de
tipos celulares (12). Ambos promotores incluyen secuencias estimuladoras de la expresin, lo cual hace
que el nivel de expresin sea aun superior a aquellos
que contengan promotores sin estas secuencias. A
continuacin se sita una secuencia denominada intrn
A que es utilizada para incrementar los niveles de expresin (4).
En la actualidad ha sido comn la utilizacin de otros
vectores virales, por su capacidad de infectar un amplio rango de clulas y aceptar un amplio rango de
regiones forneas. Dentro de estos se encuentran los
poxvirus, que incorporan el gen en una regin no esencial de su genoma (3); baculovirus, que infectan clulas de insecto (62); los retrovirus que pueden expresar
de forma permanente un gen forneo en las clulas
(20); y los adenovirus con sus verstiles aplicaciones,
son generados con una mnima manipulacin
enzimtica usando recombinacin homloga en bacterias y en clulas eucariticas (30); entre otros.
Poxvirus como vectores de expresin.
Los poxvirus comprenden una amplia familia de virus ADN que se transcribe y replica en el citoplasma
celular de su hospedero (36). Como uno de los primeros virus manipulados genticamente dentro de esta
familia, con vistas a su utilizacin como vector viral,
podemos citar el virus vacunal o virus vaccinia, modelo representativo de la misma. Su estudio durante la
dcada de los aos 80 permiti conocer sus ventajas
como vector de expresin, ya que presenta un genoma
lineal ADN de doble cadena, que codifica un sistema
completo para el metabolismo de cidos nucleicos, entre los que se incluyen las enzimas necesarias para la
transcripcin y replicacin de su genoma viral (51),
adems de la estabilidad de sus preparaciones, fcil
almacenamiento, barata produccin y su bien definida
biologa molecular (18; 19).
Debido al riesgo que ofrece el virus vaccinia de infeccin al hombre, por su amplio rango de hospederos
y la potencialidad que tiene de causar efectos secundarios o enfermedades en otros animales, se hizo necesario construir poxvirus recombinantes hospederos
especficos (44).
Uno de los candidatos ms ampliamente utilizados
es el virus de la viruela aviar. Se caracteriza por ser un
virus largo de doble cadena de ADN que se replica en
el citoplasma de las clulas infectadas (11; 13; 36; 69)
y ha sido ampliamente utilizado como portador
heterlogo, debido a sus caractersticas de ser hospedero especfico limitado a especies aviares, as se evita el riesgo de efectos secundarios en otro animales y
el hombre (36). Adems, presenta varias regiones no
esenciales para la formacin de partculas infectivas
(3, 5, 8, 50) y la capacidad de aceptar fragmentos
forneos de ADN (15; 31; 36; 68), brindan la posibilidad de obtencin de vacunas multivalentes para aves
de corral (32; 55; 67) as como para especies no aviares
(37, 42, 69) y humanos (33, 64).
En los ltimos aos se ha desarrollado la caracterizacin molecular de las cepas de Viruela Aviar, con el
objetivo de contar con un conocimiento ms profundo
de las cepas utilizadas con estos fines, ya que se requiere conocer la secuencia del fragmento de ADN que
va a ser usado como sitio apropiado para la creacin
de recombinantes (43, 50).
Desde el punto de vista de su utilizacin como
vectores de expresin, los poxvirus presentan algunas caractersticas sobresalientes, tales como su enorme capacidad para incorporar genes heterlogos (al
menos 25 kpb) sin perder infectividad, su estabilidad
genmica y capacidad para replicar en un amplio rango de tipos celulares (45; 51; 58). Adems presentan
un sitio de transcripcin propio que puede sintetizar
ARN mensajero funcional con su respectivo sistema
de transcripcin, son capaces de perder gran parte de
la informacin (genes no esenciales) sin que afecte su
replicacin in vitro y sintetizar los productos de los
genes forneos insertados procesados y glicosilados
de forma que se presenten las protenas en su configuracin nativa.
Estos virus involucran la recombinacin ADN homlogo sitio-especfico para insertar los genes forneos
en el genoma del virus vector, y a travs de este mtodo de recombinacin gentica se producen hasta un
50% de recombinacin en la descendencia (61).
Todas estas caractersticas han resultado de gran
utilidad para el desarrollo de sistemas de expresin
basados en el uso de los poxvirus.
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El empleo de poxvirus como vacunas vivas fue descrito hace ms de 15 aos (44) y, desde entonces, se
han utilizado ampliamente para el desarrollo de vacunas contra diferentes tipos de enfermedades. Uno de
los mejores ejemplos que sigue siendo utilizado actualmente, est representado por la vacuna
recombinante basada en el virus vaccinia recombinante
que expresa la glicoprotena del virus de la rabia (52).
La utilizacin de otros miembros de la familia
Poxviridae como vectores virales, presenta la ventaja
adicional de proteger contra la enfermedad provocada
por el propio vector, tal como ocurre en el caso de
poxvirus aviares recombinantes que protegen a los
pollos contra una infeccin experimental con estirpes
virulentas (47).
Los poxvirus aviares han sido utilizados para la
generacin de vacunas recombinantes aviares, como
es el caso de la generacin de virus recombinantes de
la viruela aviar que inserta en su genoma genes procedentes de otros virus entre los que se encuentran:
Newcastle (32, 49), Gumboro (31), Influenza (60) y
Marek (39; 55); y permite obtener cepas bivalentes de
importancia para la generacin de vacunas aviares (32;
41; 68). Adems han sido utilizados en el desarrollo
de vacunas recombinantes contra coccidiosis (63) y
se han obtenido muy buenos resultados en la induccin de respuesta inmune, tanto humoral como celular, de ratones inmunizados con el virus recombinante
de la viruela aviar que expresa la protena E2 del virus
de la diarrea viral bovina (BVDV) (42), lo que pone de
manifiesto la amplia utilidad de este virus como vector
de expresin.
REFERENCIAS
1. Alam, J. y Cook, J.L. (1990): Reporter Genes:
Application to the Study of Mammalian Gene
Transcription. Analitycal Biochemistry. 188. 245254.
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