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Rev. Salud Anim. Vol. 24 No.

1 (2002): 1-10

Artculo resea

EXPRESIN DE GENES RECOMBINANTES EN CLULAS DE


MAMFEROS
Marln Gonzlez y Laura Coroas
Grupo Biologa Molecular. Direccin Microbiologa. Centro Nacional de Sanidad Agropecuaria (CENSA),
Apartado 10, San Jos de las Lajas, La Habana, Cuba
RESUMEN: Las mayores contribuciones de la investigacin del ADN recombinante han estado
indudablemente dentro de la propia biologa molecular, y en combinacin con otras tcnicas, ha hecho
posible potencialmente el anlisis estructural detallado de cualquier gen, tanto de organismos eucariotas
como procariotas. La relacin de la estructura de los genes con la regulacin de la expresin y la funcin
de las protenas que codifican, puede ser analizada reintroduciendo las secuencias manipuladas en clulas
vivas. Con la utilizacin de esta estrategia bsica, el progreso en muchos campos de la biologa molecular
es muy rpido y continuar siendo una aplicacin mayoritaria de la tecnologa del ADN recombinante
durante muchos aos futuros.
(Palabras clave: ADN recombinante; expresin)

EXPRESSION OF RECOMBINANT GENES IN MAMMALIAN CELLS


ABSTRACT: The greatest contributions of recombinant DNA research has been in molecular biology itself,
and in combination with other techniques, it has made potentially possible the structural analysis in details
of any gene including eukaryote and prokaryote organisms. The relationship between gene structure with
the regulation of the expression and encoded protein functions could be analyzed inserting again the
manipulated sequences in living cells. Using this strategy, the progress in several fields of molecular
biology is very fast and it will be the majority application of the recombinant DNA technology for a long
time in the future.
(Key words: recombinant DNA; expression)

INTRODUCCIN
El anlisis de la regulacin de los genes en clulas
de animales es una de los temas centrales de la Biologa Molecular actual. Por esta y otras razones, los procedimientos para introducir genes manipulados en dichas clulas, donde la regulacin pueda ser ensayada, han sido objeto de intensa investigacin. Ha habido una gran diversidad de enfoques de las mismas
como son: la microinyeccin directa de ADN en el ncleo de los oocitos de anfibios, en huevos fertilizados

de Xenopus, en ratn o en embriones jvenes de


Drosophila, as como mtodos para introducir ADN
exgeno en cultivos celulares de mamferos (34).
La expresin de genes heterlogos o recombinantes
en clulas de mamferos ha surgido como una herramienta esencial para el estudio de mltiples aspectos de
las clulas eucariotas. El desarrollo de mtodos de
transfeccin de genes, basados en vectores altamente
eficientes, ha facilitado el desarrollo de investigaciones
con posibilidades ilimitadas en el uso de productos
proteicos derivados de cultivos celulares de mamferos.

Se han desarrollado un gran nmero de vectores


de expresin, algunos de ellos son ms apropiados
para la introduccin y anlisis de genes de forma
transiente, mientras que otros son mejores para la
expresin estable y continua de ADN heterlogos en
las clulas.
De igual forma, los mtodos de transfeccin pueden ser categorizados de los ms efectivos por el corto perodo del anlisis de la expresin y los ms apropiados para seleccionar lneas celulares que expresen de forma estable. La identificacin de los productos recombinantes se ha desarrollado desde las pruebas radiactivas hasta las tcnicas inmunolgicas y
luminiscentes.
Transfeccin celular
El desarrollo de mtodos de sobreexpresin de protenas en sistemas heterlogos ha tenido una gran repercusin en la evolucin reciente de la biologa
molecular.
Si bien los sistemas de expresin bacterianos aportan ventajas importantes, entre las que se encuentran
su facilidad de utilizacin y los elevados niveles de
expresin que se obtienen, tambin es preciso indicar
que presentan desventajas que se deben tener en consideracin. Entre estas ltimas se pueden destacar los
problemas en el plegamiento de algunas protenas, as
como alteraciones en el procesamiento proteoltico,
glicosilacin, secrecin, ensamblaje de subunidades,
etctera. Por todas estas razones se han desarrollado
sistemas de expresin eucariticos que permiten obtener niveles adecuados de protenas heterlogas (17).
Ha sido conocida durante muchos aos la capacidad de las clulas de mamferos para tomar ADN
exgenamente y para expresar los genes incluidos en
ese ADN. El procedimiento mediante el cual se introduce un ADN forneo en una clula eucaritica se ha
denominado transfeccin celular.
Existen dos tipos de transfecciones que son utilizadas rutinariamente en sistemas de mamferos: las
transientes y las estables o permanentes. En una expresin transiente pueden ser analizadas la transcripcin o la replicacin de genes transfectados entre 1 y
4 das despus de la introduccin del ADN, generalmente cosechando las clulas transfectadas; mientras
que en la expresin estable o permanente, es til en
los experimentos donde se requiere la formacin de
lneas celulares que contengan genes que se integren
en el ADN cromosomal (34).

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Szybalska y Szybalski (59) fueron los primeros que


describieron la transferencia mediada por ADN.
Transfectaron clulas humanas mutantes deficientes
de hipoxantina guanina fosforribosil transferasa
(HGPR-) a HGPR+ al utilizar ADN total nuclear humano, no clonado, como fuente del gen tipo silvestre.
Desde esa fecha a la actualidad, esta metodologa ha
hecho posible realizar el anlisis de secuencias de ADN
de Eucariotes, lo que ha posibilitado descubrir a nivel
molecular los mecanismos de regulacin de la expresin gnica. Por otra parte, en la actualidad muchas
protenas recombinantes necesitan ser producidas en
clulas eucariticas, debido a modificaciones
postransduccionales que presentan y que slo en este
tipo de clula puede ser posible.
Como primera fase de estos experimentos se realiza el clonaje del gen de inters en una bacteria, frecuentemente E.coli, para lo cual se utilizan vectores
diseados para la expresin en clulas eucariticas,
que incluyan promotores virales o eucariticos (7, 16).
La transfeccin celular es de importancia para el
estudio de la funcin de genes virales a travs de la
generacin de mutantes virales (7), adems es un paso
necesario para la generacin de virus recombinantes
que incorporen en su genoma genes forneos para la
generacin de vacunas virales recombinantes.
Debido a la importancia de esta metodologa se
hace necesario establecer las condiciones experimentales que permitan obtener el mayor nmero de clulas transfectadas.
Existen cuatro tcnicas para introducir ADN en clulas eucariotas:
- Transfeccin con Fosfato de Calcio (17).
- Transfeccin con DEAE dextrano (17) (25).
- Transfeccin mediada por Liposomas (9, 6).
- Electroporacin (68).
Cada una de estos procedimientos tiene su propio
espectro de ventajas y desventajas, incluyendo eficiencia, citotoxicidad, complejidad tcnica y equipamiento
requeridos en su aplicacin.
Los primeros dos mtodos consisten en la unin
del ADN a la superficie celular. El ADN es endocitado
por un mecanismo no conocido. Los parmetros para
la transfeccin de clulas por estas tcnicas varan para
cada tipo de clula y por tanto necesitan ser
optimizados cuidadosamente.

De acuerdo al objetivo final del experimento puede


ser seleccionada la tcnica de transfeccin, por ejemplo, si se quiere expresar una protena de forma transitoria es frecuente utilizar la tcnica de la formacin
del complejo de ADN-DEAE dextrano. El mecanismo
por el cual tiene lugar la introduccin del ADN en clulas de mamferos con el uso de esta tcnica es poco
conocido. Convencionalmente se asume que el complejo que contiene tanto el ADN con el DEAE-dextrano,
se adhiere a la superficie de la clula y de alguna forma entra por endocitosis. Lopata et al. (40) modificaron el protocolo tradicional por adicin de un shock
adicional con dimetilsulfxido o glicerol a las clulas,
demostrando que tanto la concentracin de DEAEdextrano como la de ADN y la duracin de la
transfeccin son las variables crticas que deben ser
optimizadas para cada tipo de clula.
El DEAE-dextrano es muy txico a la clula y despus de este procedimiento, la misma pierde la capacidad de multiplicacin (17). Sin embargo, si se quiere
obtener una lnea celular que exprese la protena de
inters de forma continua (expresin estable) o un virus manipulado genticamente a travs de estos procedimientos, es necesario utilizar las otras tcnicas,
tales como formacin del coprecipitado de ADN-fosfato
de Calcio (17), complejo ADN-liposomas (9) o la introduccin del ADN a travs de la utilizacin de un campo elctrico (electroporacin) (68).
De estos ltimos procedimientos, la formacin del
coprecipitado de ADN-fosfato de Calcio, requiere
reactivos ms baratos y de uso frecuente, adems de
un equipamiento tradicional para un laboratorio dedicado al trabajo con lneas celulares, a diferencia del
procedimiento de electroporacin, que s requiere de
un equipamiento especial o del de utilizacin de
liposomas catinicos que utiliza reactivos muy caros
para su realizacin (6).
El procedimiento de formacin del coprecipitado de
ADN-fosfato de Calcio es menos reproducible por su
dependencia de varios factores, como son concentracin de clulas, concentracin de ADN plasmdico,
tiempo de exposicin y composicin de los medios de
cultivo a utilizar, los cuales necesitan ser optimizados
segn el tipo de clula a utilizar. El xito de la transferencia de ADN en estos experimentos depende de la
formacin de un coprecipitado del ADN con el fosfato
de calcio que es insoluble y debe formarse bajo condiciones estrictas de pH, se recomienda un rango muy
estrecho de variabilidad del mismo (pH=7.00 a
pH=7.12) cuando se prepara la mezcla de transfeccin
(9). Se conoce que este precipitado depende en gran
medida de la concentracin de ADN en la mezcla, en-

contrndose una a la cual puede ser obtenida la mayor eficiencia de transfeccin (9). Se ha descubierto
que este precipitado es txico a las clulas, por lo cual
es necesario determinar el tiempo ptimo de exposicin al mismo (9, 34) y por lo general, los cultivos primarios celulares tienden a ser ms sensibles a este
(9).
Aparentemente los grnulos de ADN-fosfato de
calcio son fagocitados por las clulas, por lo que la
eficiencia de transfeccin de las mismas depende de
la superficie de exposicin al mismo; en aquellos cultivos que no han alcanzado la confluencia, esta superficie es mucho mayor que en aquellos confluentes y la
propiedad de la monocapa celular est determinada
por el nmero de clulas depositadas, por la composicin del medio de cultivo utilizado y por el tiempo del
cultivo (34).
Lo anteriormente expuesto avala la necesidad de
establecer las condiciones experimentales que aseguren una mayor eficiencia de transfeccin, entre estos parmetros se encuentran la concentracin de clulas, suero fetal bovino, y ADN plasmdico, as como
el tiempo de exposicin al precipitado (28).
Una vez transfectada la clula, una pequea porcin del ADN se integra establemente en el genoma
nuclear de la clula receptora. El precipitado del fosfato
de calcio proporciona un mtodo general para introducir cualquier ADN en clulas Eucariotidas. Puede ser
aplicado a una cantidad relativamente grande de clulas en placa de cultivo, pero est limitado por la proporcin variable y frecuentemente muy baja (1-2%) de
clulas que toman ADN exgeno. Solo una subfraccin
de estas clulas sern transfectadas establemente.
Aunque tampoco se ha esclarecido el mecanismo
por el cual los liposomas, con lpidos neutros o
catinicos, permiten la penetracin del ADN a las clulas, la aplicacin de este mtodo ha facilitado estudios de asociacin entre la glicoprotena CD4 de la
membrana plasmtica y la protena Tirosina kinasa
asociada a la misma, el ensamblaje de virus y la
interaccin entre la glicoprotena 160 del VIH y la CD4.
La seleccin de una mezcla particular de Liposomas
depende de la lnea celular que va a ser transfectada.
Comercialmente existen dos mezclas de liposomas:
la Lipofectina y TransfectACE, que son efectivos en
un amplio rango de lneas celulares, y aunque este
ltimo es menos costoso, puede no ser tan efectivo en
todos los tipos celulares como el primero (66). Para la
optimizacin de este mtodo se debe tener en cuenta
la concentracin total de lpidos y ADN y el tiempo de
incubacin, ya que a menudo pequeas cantidades de
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ADN son suficientes para promover altas frecuencias


de transfecciones, y por otra parte, altas concentraciones de ADN o liposomas pueden ser txicas.
El mtodo de electroporacin, por su parte, da como
resultado una elevada frecuencia de clulas
transfectadas con una buena eficiencia de expresin
transciente de los genes, por esta razn su uso se ha
ido incrementando. La diferencia fundamental entre la
Electroporacin y el resto de los mtodos, consiste en
que se puede regular la cantidad de ADN que se integra a la clula. En este caso la membrana de la clula
es sometida a un alto voltaje, dando como resultado la
formacin de poros, que permite la entrada o salida de
las macromolculas y la recuperacin de la membrana ocurre de forma natural.
Los parmetros a tener en cuenta para lograr una
electroporacin eficiente son la amplitud y longitud del
pulso elctrico, el ltimo estar determinado por la
capacidad de la fuente de voltaje. Esta tcnica ha sido
generalizada a todos los tipos celulares con efectividad (34).
Para la realizacin de los diferentes mtodos de
transfecciones es necesario contar con ADN de alto
grado de pureza, lo cual puede ser logrado a travs de
la purificacin de los vectores en gradientes de cloruro
de cesio (38), precipitacin con polietielenglicol (48) o
purificaciones al utilizar juegos comerciales basados
en el uso de resinas (14).
Genes Reporteros.
La va ms simple para optimizar los parmetros
de transfeccin es usando un gen reportero. Este permite optimizar la eficiencia de la transfeccin y medir
indirectamente la actividad del promotor, de manera
que no es necesario analizar los niveles de ARN y la
estructura del ARN producido a partir del gen
transfectado.
Los genes reporteros codifican para protenas que
poseen una actividad enzimtica nica, o que son fcilmente distinguibles en una mezcla de protenas intra
o extracelulares. Los ms utilizados son: el gen que
codifica para la -galactosidasa (LacZ) (65), el gen
que codifica la cloranfenicol acetil transferasa (CAT)
(29), y el gen bacteriano que codifica para la guanosina
fosforibosil transferasa (GPT) (19).
Estos genes reporteros son utilizados para probar
elementos promotores funcionales, para lo cual el posible promotor es primeramente ligado a la regin
codificante de un gen reportero para generar un gen,
en el cual los elementos regulatorios en estudio controlan la expresin del mismo. Para comprobar la exisRev. Salud Anim. Vol. 24 No. 1 (2002)

tencia de elementos estimuladores funcionales (los


cuales por definicin pueden aumentar la transcripcin
cuando son localizadas antes o despus y en una orientacin relativa al promotor) el ADN puede ser ligado
antes o despus de un gen reportero. La capacidad
transcripcional del ADN testado es estimada
cuantitativamente por la actividad in vitro del producto
del gen reportero (1) en el medio de cultivo o en extractos derivados de tejidos o clulas; o es determinada cualitativamente por tincin histoqumica de la clula intacta. Aunque la actividad o cantidad del producto del gen reportero es una medida indirecta de las
propiedades transcripcionales del ADN testado, generalmente la actividad del gen reportero es directamente proporcional a la actividad transcripcional (24).
La -Galactosidasa como gen reportero.
En el genoma de E. coli, en el opern de utilizacin
de la lactosa, se encuentra el gen LacZ el cual codifica
la -galactosidasa, enzima utilizada para la degradacin de la lactosa en glucosa y galactosa; esta enzima
presenta un peso molecular de 125 KDa.
Este gen se ha utilizado frecuentemente en los trabajos de biologa molecular, para la identificacin de
clones recombinantes de E .coli (1, 38), identificacin
de virus recombinantes (49) y para la optimizacin de
las transfecciones celulares (28; 56).
La -Galactosidasa es un control interno muy til
para normalizar la variabilidad en la actividad de la protena reportera debido a la eficiencia de transfeccin o
preparacin de extractos celulares (23).
Su presencia es determinada a travs de un ensayo fotomtrico muy simple basado en la hidrlisis
enzimtica del sustrato ONPG (o-Nitrofenil-B-DGalactopiranosido) por la -galactosidasa, la que origina un cambio de coloracin desde incoloro hacia un
color amarillo, cuya intensidad puede ser valorada a
una densidad ptica de 420nm. La actividad bgalactosidasa puede ser determinada en extractos libres de clulas, obtenido por el lisado de las mismas
en presencia de NP-40 (29).
La actividad de la -galactosidasa tambin puede
ser monitoreada histoqumicamente por descomposicin del sustrato X-gal (5-Bromo-4-Cloro-3-indolil BD
Galactopiranosido). Este sustrato es hidrolizado a un
indol el cual se oxida a un indonil que forma un complejo derivado del azul-ndigo (24).
Algunas clulas de mamfero poseen galactosidasa endgena, que es predominantemente
lisosomal y activa a pH bajos. Una tincin positiva falsa puede ser minimizada por tincin a pH entre 7,5-8.

Las reacciones controles, que consisten en clulas no


transfectadas o aparentemente transfectadas, deben
ser ejecutadas. Si la tincin es debido a un falso positivo y persiste an ajustando pH, se debe usar un anticuerpo anti -Gal de E. coli, el cual puede ser usado
para distinguir la enzima celular de la procariota (1).
Cultivos paralelos de clulas transfectadas pueden
ser teidos, de igual forma, al usar X-gal y visualizados
para determinar la eficiencia de la transfeccin y la especificidad o preferencia de las clulas a la infeccin,
y cuantitativamente evaluado usando ONPG para determinar el nivel de expresin del promotor. Se puede
realizar una comparacin directa entre el nmero de
clulas transfectadas y la intensidad del promotor. Esta
va de entrada puede ser usada para la identificacin
de clulas especficas que expresen la construccin
promotor-gen LacZ dentro de una poblacin
heterognea de clulas primarias (1).
La cloranfenicol acetil transferasa (CAT) como gen
reportero.
La enzima bacteriana cloranfenicol acetil
transferasa cataliza la transferencia del grupo acyl del
acetil CoA (o cualquiera de los cofactores de AcilCoA)
a cloranfenicol. Las formas aceltiladas y no acetiladas
poseen diferentes solubilidades en solventes orgnicos, por lo que pueden ser distinguibles por
cromatografa de capa fina de slica gel (TCL), es este
el mtodo ms frecuente para la evaluacin de la actividad CAT (1,57).
El gen que codifica para esta enzima no ha sido
encontrado en eucariota, por lo que no existe actividad endgena en las clulas normales de mamfero.
Esta caracterstica, unido a la facilidad y sensibilidad
del ensayo por la actividad CAT, han hecho de este
gen uno de los ms ampliamente utilizados para estudios de expresin de genes de mamferos. Este gen
fue adaptado por primera vez por Gorman et al. (29),
fusionado al vector SV40.
Vectores de expresin
La gran mayora de los plsmidos utilizados como
vectores comparten las mismas caractersticas que los
vectores que se emplean para realizar experimentos
de expresin transitoria con lneas celulares in vivo.
Esto incluye: (a) un origen de replicacin para obtener altos rendimientos del plsmido en clulas de E.
coli; (b) un gen de resistencia a antibitico para realizar la seleccin en E.coli (generalmente ampicillina);
(c) un lugar mltiple de clonaje donde insertar el cDNA;
(d) un promotor-potenciador fuerte; as como (e) se-

ales de poliadenilacin y terminacin de la transcripcin para asegurar la finalizacin adecuada del ARN
mensajero expresado (23, 24).
Frecuentemente en estos vectores se utilizan como
promotores virales aquellos procedentes del virus
SV40, los cuales permiten la expresin en un amplio
rango de clulas, pero tiene las caractersticas de ser
un promotor dbil, o sea, que a partir de l solo pueden obtenerse bajos niveles de protena recombinantes
en clulas transfectadas (23).
El promotor ms utilizado procede de
citomegalovirus (CMV) debido a que este induce niveles de expresin muy elevados en un amplio rango de
tipos celulares (12). Ambos promotores incluyen secuencias estimuladoras de la expresin, lo cual hace
que el nivel de expresin sea aun superior a aquellos
que contengan promotores sin estas secuencias. A
continuacin se sita una secuencia denominada intrn
A que es utilizada para incrementar los niveles de expresin (4).
En la actualidad ha sido comn la utilizacin de otros
vectores virales, por su capacidad de infectar un amplio rango de clulas y aceptar un amplio rango de
regiones forneas. Dentro de estos se encuentran los
poxvirus, que incorporan el gen en una regin no esencial de su genoma (3); baculovirus, que infectan clulas de insecto (62); los retrovirus que pueden expresar
de forma permanente un gen forneo en las clulas
(20); y los adenovirus con sus verstiles aplicaciones,
son generados con una mnima manipulacin
enzimtica usando recombinacin homloga en bacterias y en clulas eucariticas (30); entre otros.
Poxvirus como vectores de expresin.
Los poxvirus comprenden una amplia familia de virus ADN que se transcribe y replica en el citoplasma
celular de su hospedero (36). Como uno de los primeros virus manipulados genticamente dentro de esta
familia, con vistas a su utilizacin como vector viral,
podemos citar el virus vacunal o virus vaccinia, modelo representativo de la misma. Su estudio durante la
dcada de los aos 80 permiti conocer sus ventajas
como vector de expresin, ya que presenta un genoma
lineal ADN de doble cadena, que codifica un sistema
completo para el metabolismo de cidos nucleicos, entre los que se incluyen las enzimas necesarias para la
transcripcin y replicacin de su genoma viral (51),
adems de la estabilidad de sus preparaciones, fcil
almacenamiento, barata produccin y su bien definida
biologa molecular (18; 19).

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Debido al riesgo que ofrece el virus vaccinia de infeccin al hombre, por su amplio rango de hospederos
y la potencialidad que tiene de causar efectos secundarios o enfermedades en otros animales, se hizo necesario construir poxvirus recombinantes hospederos
especficos (44).
Uno de los candidatos ms ampliamente utilizados
es el virus de la viruela aviar. Se caracteriza por ser un
virus largo de doble cadena de ADN que se replica en
el citoplasma de las clulas infectadas (11; 13; 36; 69)
y ha sido ampliamente utilizado como portador
heterlogo, debido a sus caractersticas de ser hospedero especfico limitado a especies aviares, as se evita el riesgo de efectos secundarios en otro animales y
el hombre (36). Adems, presenta varias regiones no
esenciales para la formacin de partculas infectivas
(3, 5, 8, 50) y la capacidad de aceptar fragmentos
forneos de ADN (15; 31; 36; 68), brindan la posibilidad de obtencin de vacunas multivalentes para aves
de corral (32; 55; 67) as como para especies no aviares
(37, 42, 69) y humanos (33, 64).
En los ltimos aos se ha desarrollado la caracterizacin molecular de las cepas de Viruela Aviar, con el
objetivo de contar con un conocimiento ms profundo
de las cepas utilizadas con estos fines, ya que se requiere conocer la secuencia del fragmento de ADN que
va a ser usado como sitio apropiado para la creacin
de recombinantes (43, 50).
Desde el punto de vista de su utilizacin como
vectores de expresin, los poxvirus presentan algunas caractersticas sobresalientes, tales como su enorme capacidad para incorporar genes heterlogos (al
menos 25 kpb) sin perder infectividad, su estabilidad
genmica y capacidad para replicar en un amplio rango de tipos celulares (45; 51; 58). Adems presentan
un sitio de transcripcin propio que puede sintetizar
ARN mensajero funcional con su respectivo sistema
de transcripcin, son capaces de perder gran parte de
la informacin (genes no esenciales) sin que afecte su
replicacin in vitro y sintetizar los productos de los
genes forneos insertados procesados y glicosilados
de forma que se presenten las protenas en su configuracin nativa.
Estos virus involucran la recombinacin ADN homlogo sitio-especfico para insertar los genes forneos
en el genoma del virus vector, y a travs de este mtodo de recombinacin gentica se producen hasta un
50% de recombinacin en la descendencia (61).
Todas estas caractersticas han resultado de gran
utilidad para el desarrollo de sistemas de expresin
basados en el uso de los poxvirus.
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La metodologa para la obtencin de virus vaccinia


recombinantes se fundamenta en la recombinacin
entre un plsmido que contiene promotores procedentes de poxvirus, el gen de inters clonado bajo el control de este promotor en el sitio de clonaje diseado en
el plsmido y un marcador de seleccin (19), todos
ellos insertados en un gen viral no esencial para la
multiplicacin, clonado en un plsmido bacteriano. En
las clulas infectadas con el virus, mediante
transfeccin se introduce este plsmido, el cual a travs de sus secuencias homlogas recombina con el
genoma viral y de esta forma el gen a expresar, pasa a
formar parte del virus, obtenindose un recombinante
viral de expresin estable. En estos sistemas se puede adems realizar ensayos de expresin transitoria
de genes (19).
Estos sistemas de expresin han ido perfeccionndose de manera creciente, actualmente se estn utilizando mayoritariamente los sistemas virales hbridos
en los que se encuentran elementos bacterianos y
virales de regulacin, debido a que se ofrecen mejores resultados en el control de la expresin de los genes
(46). De esta forma, se han insertado en el genoma
viral elementos de distinto origen, tales como el gen 1
del bacterifago T7 que codifica para la ARN
polimerasa (27, 9), la secuencia 5 no traducida del
virus de la encefalomiocarditis situada a continuacin
del promotor de la polimerasa del bacterifago T7 (21),
as como componentes del opern lactosa de E. coli
que controlan directamente la citada polimerasa, y
provoca, de esta forma, que la transcripcin del gen
de inters quedara bloqueada en ausencia de un inductor (IPTG) (53; 2).
Aplicaciones y perspectivas de los poxvirus
recombinantes.
Los poxvirus han sido utilizados como vectores para
la produccin de vacunas recombinantes vivas. Este
inters viene mediado, adems de por las caractersticas descritas anteriormente, por su gran eficacia para
dirigir determinantes antignicos al sistema inmunitario
del hospedero y producir, a veces tras una nica inmunizacin, la induccin de una respuesta inmune (22).
Por todo ello, estos vectores suponen un sistema
de vacunacin seguro para los potenciales receptores. As, animales de experimentacin inoculados con
virus recombinantes que expresaban protenas
heterlogas, quedaron protegidos frente a una gran
cantidad de patgenos de diferentes orgenes, esta
proteccin est relacionada con la estimulacin del sistema inmune, tanto a nivel humoral como celular (10;
26; 35; 46; 54).

El empleo de poxvirus como vacunas vivas fue descrito hace ms de 15 aos (44) y, desde entonces, se
han utilizado ampliamente para el desarrollo de vacunas contra diferentes tipos de enfermedades. Uno de
los mejores ejemplos que sigue siendo utilizado actualmente, est representado por la vacuna
recombinante basada en el virus vaccinia recombinante
que expresa la glicoprotena del virus de la rabia (52).
La utilizacin de otros miembros de la familia
Poxviridae como vectores virales, presenta la ventaja
adicional de proteger contra la enfermedad provocada
por el propio vector, tal como ocurre en el caso de
poxvirus aviares recombinantes que protegen a los
pollos contra una infeccin experimental con estirpes
virulentas (47).
Los poxvirus aviares han sido utilizados para la
generacin de vacunas recombinantes aviares, como
es el caso de la generacin de virus recombinantes de
la viruela aviar que inserta en su genoma genes procedentes de otros virus entre los que se encuentran:
Newcastle (32, 49), Gumboro (31), Influenza (60) y
Marek (39; 55); y permite obtener cepas bivalentes de
importancia para la generacin de vacunas aviares (32;
41; 68). Adems han sido utilizados en el desarrollo
de vacunas recombinantes contra coccidiosis (63) y
se han obtenido muy buenos resultados en la induccin de respuesta inmune, tanto humoral como celular, de ratones inmunizados con el virus recombinante
de la viruela aviar que expresa la protena E2 del virus
de la diarrea viral bovina (BVDV) (42), lo que pone de
manifiesto la amplia utilidad de este virus como vector
de expresin.

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(Recibido 7-11-2000; Aceptado 22-12-2000)