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E.A.P. Biotecnologa
MARCO TERICO:
Definicin, estructura y propiedades de los polihidroxialcanoatos
Los PHA son polmeros de cidos hidroxialcanoicos que algunas bacterias,
arqueas y microalgas acumulan intracelularmente como material de reserva,
para usarlo posteriormente como fuente de carbono y energa.
La poli-
merizacin
enzimas
de
los
cidos
hidroxialcanoicos,
por
accin
de
E.A.P. Biotecnologa
METODOLOGA:
ELABORACIN Y DISEO DE MEDIOS DE CULTIVO:
Se realizaran tres medios:
g/L
7.0
g/15ml
0.105
3.5
0.0525
1.0
1.4
20
0.015
0.021
0.3
E.A.P. Biotecnologa
Pesar
Diluir
Calentar
Agitar
Colocar
Reposar
1 hora
Reposar
Inclinar
E.A.P. Biotecnologa
Desinfectar
Colocar
Someter
Extraer
Flamear
Llevar
Arrastrar
Incubar
1 a 2 horas
E.A.P. Biotecnologa
g/L
1.0
1.0
1.0
1.4
g/50ml
0.05
0.05
0.05
0.07
40
* 0.6 0.48g / g
50
de
fermentacin
(105
mL de
medio),
entonces
la
E.A.P. Biotecnologa
K2HPO4
Extracto de levadura
Peptona
Aforar
Aforar
15 ml
Agua destilada
10 ml
Agua destilada
Esterilizar
Todo
lo anterior en autoclave por 15 min
E.A.P. Biotecnologa
Mantenimiento
Formacin de producto
Empleamos:
Ralstonia eutropha
Biomasa = 1.5gr/L
Aerbico
Nutriente limitante : Nitrgeno
Mantenimiento = 0
Producto = 0
Exceso = 50%
Elemento
C
N
Mg
S
K
P
Fe
Elemento
Nutriente
Nutriente
Glucosa
(NH4)2SO4
MgSO4.7H2O
(NH4)2SO4
KH2PO4
KH2PO4
FeSO4
Elemento
Elemento en
Nutriente %
40
%E.C
50 %
14%
0,5%
1%
1%
3%
0.2%
Yx/s
So
So
Glucosa
en clula %
50 %
1.5/0.48=3.13
3.13*1.5= 4.695
(NH4)2SO4
14%
21.21
21.21/14 * 1 = 1.52
1.5/1.52= 0.99
0.99*1 = 0.99
MgSO4.7H2O
0,5%
9.87
9.87/0.5* 1 =19.74
1.5/19.74= 0.08
0.08*1.5= 0.12
(NH4)2SO4
1%
24.24
24.24/1 * 1 = 24.24
1.5/24.24=0.06
0.06*1.5= 0.04
KH2PO4
1%
28.69
28.69/1 * 1 = 28.69
1.5/28.69= 0.05
0.05*1.5= 0.075
P
Fe
K2HPO4
FeSO4
3%
0.2%
17.77
36,76
17.77/3* 1 = 5.92
36.76/0.2 * 1 = 183.8
1.5/5.92= 0.25
1.5/183.8=0.008
0.25*1.5= 0.375
0.008*1.5 = 0.012
Mg
Composicin
K2HPO4
(NH4)2SO4
Glucosa
MgSO4.7H2O
(NH4)2SO4
KH2PO4
FeSO4
EDTA
Esterilizar a 121 C por 15min.
g/L
0.375
0.99
4.695
0.12
0.04
0.075
0.012
20
g/150ml
0.05625
0.1485
0.70425
0.018
0.006
sales
EDTA + K2HPO4Otras
+ (NH4)2SO4
0.01125
0.0018
3
Aforar
25 ml Agua destilada
Aforar
100m
E.A.P. Biotecnologa
Esterilizar
Todo
lo anterior en autoclave por 15 min
1mL/L medio
- 10 mM de FeSO4.7H2O en 1M HCl
- MT (minerales trazas)
g/L
1.47
E.A.P. Biotecnologa
1.98
2.38
1.70
2.90
Espectrofotmetro
10 Tubos de ensayo
Gradilla
Equipo de Bao Mara
Balanza
Agitador
Hielo en cubos
Biker
Fiola
cido 3,5-dinitrosaliclico
Tartrato sdico potsico
Hidrxido sdico
de agua destilada)
Diluir hasta 1000 ml con agua destilada.
El reactivo debe guardarse en bote oscuro (color topacio), siendo
estable durante varias semanas.
10
E.A.P. Biotecnologa
[
]
1
.
8
1
.
4
1
0
.
8
0
.
4
0
.
1
0
.
0
8
0
.
0
4
0
.
0
1
0
.
0
0
8
Soluci
n
madre
Ab
sa
540
nm
Agu
a
0.9
0.1
0.7
0.3
0.5
0.5
0.4
0.6
0.2
0.8
0.05
0,95
0.04
0.96
0.02
0.98
0.005
0.99
5
0.004
0.99
6
E.A.P. Biotecnologa
Cuadro:
AADIR
1 ml
MEZCLAR
MUE(1ml)yDNS(1ml)
CALENTAR
En cada tubo de
ensayo.
En cada
tubo.
En bao mara
hasta ebullicin.
T: 5min
Agua en hielo
ENFRIAR
Agua destilada
Tiempo:
3min
AADIR
10ml
LEER
Absorbancia a
540 nm
Elaboracin De Capachos:
CONFECCI
N
DESECAR
Los capachos en la
estufa
T= 2 horas
DESECAR
En la campana de
gauss
T= 30 min
PESAR
En la balanza
analtica.
Densidad ptica:
1 Del volumen extrado se procede a leerlo por espectrometra a 640nm
(con un blanco de AGUA).
2 Centrifugar durante 15 min.
3 Desechar el sobrenadante y luego agregar agua destilada hasta
completar los 5ml.
4 Volver a centrifugar por 15 min.
5 Desechar nuevamente el sobrenadante y colocar lo restante en los
capachos.
6 Colocar los capachos en la estufa a 80C por 24 horas.
7 Finalmente pesar los capachos.
5ml
Cultivo
AGREGAR
En 10 tubos
CENTRIFUGAR
10 tubos a 15 min
BOTAR
El sobredanante
E.A.P. Biotecnologa
5 ml
Agua
AGREGAR
Al tubo
REPETIR
CENTRIFUGAR
2 veces
1 ml
AGREGAR
A cada tubo
Agua
AGITAR
Hasta disolver el pellet
REPETIR
2 veces
INCUBAR
Realizar diluciones al 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:9, 1:10 (3ml)
E.A.P. Biotecnologa
concentracion
de biomasa
( Lg )= gramos
mililitros de medio
Medio y agua
La disolucin en
10 tubos
Leer
A 640 nm
E.A.P. Biotecnologa
E.A.P. Biotecnologa
capacho
Repetir esa operacin
Realizar la curva de calibracin
E.A.P. Biotecnologa
0.4
0.2
0
0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 1.6 1.8
Absorbancia
concentracin,
x: absorbancia.
15 ml (10 %)
Medio de
mantencin
(15ml)
Fermentacin (150
ml)
C 1. V 1=C 2.V 2
0.0336(15)=Xo(150)
Xo=0,00336
E.A.P. Biotecnologa
Abs
orba
ncia
0.55
89
0.36
12
0.31
79
0.25
64
0.14
78
0.06
18
Conc
entra
cin
de
gluco
sa
(g/L)
1.8
1.2
0.8
0.5
0.2
RESULTADOS:
I.
SUSTRATO
a. Curva de calibrado de glucosa
E.A.P. Biotecnologa
0.5
0.4
Absorvancia
0.3
0.2
0.1
0
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.2
1.4
1.6
1.8
Con
el uso de la ecuacin de recta de la curva de calibrado de glucosa
obtenemos la concentracin de glucosa,
10
E.A.P. Biotecnologa
a
b
s
UNIVERSIDAD
or
b
a
n
ci
b.
a
0.
1
5
2
9
0.
1
4
7
3
0.
1
3
2
2
0.
1
c.
3
4
0.
1
1 Tie
8
8
0.
0
1
2
1
1
4
0. 2
1
2 3
9
4 4
0.
1 5
2
6 6
1
0. 7
1
1
8
0
1
0. 9
1
11
1
5
4
0.
1
Lecturas de absorbancia
Se realiz la lectura en el
espectrofotmetro a una
disolucin de 1:12
Curva de DNS
Absor
bancia
12.152
9
12.147
3
12.132
2
12.134
12.118
8
12.121
4
12.129
4
12.126
1
12.110
1
12.115
4
12.120
Conce
ntraci
n (g/L)
3.7717
6016
3.7700
2192
3.7653
3488
3.7658
936
3.7611
7552
3.7619
8256
3.7644
6576
3.7634
4144
3.7584
7504
3.7601
2016
3.7616
E.A.P. Biotecnologa
7216
concentracion (g/L)
3.76
3.76
3.75
0
9 10
d. Cintica de crecimiento
12
E.A.P. Biotecnologa
13
bi
o
m
UNIVERSIDAD
a
s
a
(
g
/
L
)
9
.
9
2
E
0
6
0
.
0
0
0
0
5
4
7
2
0
.
0
0
0
0
5
1
9
2
0
.
0
0
0
0
5
1
3
6
0
.
0
0
0
0
5
0
2
4
0
conce
ntraci
n (g/L)
3.7717
6016
3.7700
2192
3.7653
3488
3.7658
936
3.7611
7552
E.A.P. Biotecnologa
3.7619
glucosa
1.5
1
0.5
0
0
9 10
14
E.A.P. Biotecnologa
DENSIDAD
OPTICA
D
Ab
i
sor
l
ba
u
nci
c
a
i
n
1
0,0
:
334
0
1
1
0,0
:
302
0
2
1
0,0
:
226
0
PESO
3
CON
N1
0,0
BIOM
:
191
ASA
0
4
1
0,0
:
18
0
0,380
15
8
1
0,0
:
135
0
6
0,439
1
0,0
2:
3
126
0
7
1
0,0
:
088
0
0,384
38
8
1
0,0
:
097
0
9
1
0,0
:
087
15
1
0
BIOMASA
PESOS SECO
PESO
SIN
BIOMA
SA
0,38
0,4389
0,3842
B
I
O
M
A
S
A
0
,
0
0
0
8
0
,
0
0
0
4
0
,
0
0
0
CONCEN
TRACION
(g/L)
0,00016
0,00016
0,00012
E.A.P. Biotecnologa
CONCEN
ab
D
TRACIO
so
6
N (g/L)
rv
0,433
0,4328
0
an
6
,
ci
0
a
0
0,0334
0,
0
1:
00
8
01
0,354
0,3537
0
6
1
,
0,0302
0,
000
1:
001
06
0,0226
40,
0,403
0,4029
000
1:
2
,
01
02
0,0191
0
8E
0
1:
305
0,018
8E
1:
05
0,0135
6E
1:
05
8E-05
8E-05
6E-05
Como
sacamos 5 ml para hallar el peso seco entonces para hallar la
concentracin se tiene: g de peso seco/ 5ml
16
E.A.P. Biotecnologa
f(x) = 0.01x - 0
R = 0.96
absorvancia
Linear (absorvancia)
0
0
0
0
0
0.01
0.02
0.02
0.03
0.03
0.04
I.
CINTICA DE FERMENTACIN
17
DENSIDAD
OPTICA
E.A.P. Biotecnologa
T
i
e
m
p
o
18
1
0
ab
sor
va
nci
a
0,0
10
7
0,0
18
7
0,0
18
2
0,0
18
1
0,0
17
9
0,0
18
5
0,0
28
1
0,0
20
9
0,0
18
7
0,0
21
8
E.A.P. Biotecnologa
DENSIDAD PTICA
0.03
0.03
0.02
DENSIDAD OPTICA
0.02
0.01
0.01
0
0
10
Se calcula
la concentracion a partir de la formula de la ecuacion de la recta de la
19
E.A.P. Biotecnologa
T
i
e
m
p
o
20
ab
sor
ba
nci
a
0,0
10
7
0,0
18
7
0,0
18
2
0,0
18
1
0,0
17
9
0,0
18
5
0,0
28
1
0,0
20
9
0,0
18
7
bio
ma
sa
(g/
L)
9,9
2E06
0,0
00
05
47
2
0,0
00
05
19
2
0,0
00
05
13
6
0,0
00
05
02
4
0,0
00
05
36
0,0
00
10
73
6
0,0
00
06
70
4
0,0
00
05
47
2
E.A.P. Biotecnologa
1
0
0,0
21
8
0,0
00
07
20
8
Densidad Opstica
Fementacion
0
0
0
0
0
21
E.A.P. Biotecnologa
22
E.A.P. Biotecnologa
23
CONCENTRACION DE mx
E.A.P. Biotecnologa
24
L
bio
n(
mas
X/
UNIVERSIDAD NACIONAL DEL SANTA
Tie
a
X
(g/L)
0)
9,92
0
0
E-06
1,
7
0
7
6
7
6
0,00
3
0054
5
2
72
2
1,
6
5
5
1
51
0,00
1
0051
5
3
92
1
1,
6
4
4
3
0
6
0,00
7
0051
3
4
36
8
1,
6
2
2
2
5
8
0,00
6
0050
0
5
24
1
1,
6
8
6
9
9
6
0,00
1
0053
4
6
6
7
0,00
2,
7
0107
3
36
8
1
E.A.P. Biotecnologa
Ln(X/X0)
3
2.5
2
Ln(X/X0)
1.5
1
0.5
0
0
10
25
0,0
00
05
02
4
0,0
00
05
36
0,0
00
10
73
6
6
7
1,6
22
25
86
01
1,6
86
99
61
47
2,3
81
63
47
52
E.A.P. Biotecnologa
DETERMINACION DE mx
3
2.5
f(x) = 0.38x + 1.14
R = 0.81
2
1.5
Linear ()
1
0.5
0
5
DETERMINACION DE
= Ln(x) /t
= 0,968579885
RENDIMIENTO
26
E.A.P. Biotecnologa
YX/S = 0,006161776
TIEMPO DE DUPLICACIN
td = 1,825512722
27
E.A.P. Biotecnologa
DISCUSIN:
fotografas.
28
E.A.P. Biotecnologa
CONCLUSIN:
BIBLIOGRAFA:
Spiekermann, P., Rehm, B., Kalscheuer, R., Baumeister, D. and Steinbuchel
A. (1999). A sensitive, viable-colony staining method using Nile red for
direct screening of bacteria that accumulate polyhydroxyalkanoic acids and
other lipid storage compounds. Arch Microbiol 171 (2): pp. 7380)
29
E.A.P. Biotecnologa
Shahhosseini, S. Simulation and optimization of PHB production in fedbatch culture of Ralstonia eutropha.(2004) Process Biochemistry 39, 963969.
ANEXOS:
CALCULOS DEL MEDIO:
Elemento en nutriente:
carbono: P.M = 12
GLUCOSA = C6H1206
180 gr de glucosa
100% de E.N
72 gr de carbono
x % de E.N
x=
72100
180
x = 40 %
30
Nitrgeno : P.M = 14
28 gr de nitrgeno
x=
100% de E.C
x % de E.C
28100
132
x =1.21%
24.3 gr de magnesio
x=
x % de E.C
24.3100
246.3
100% de E.C
x = 9.87%
Azufre : P.M = 32
32 gr de azufre
x=
100% de E.C
x % de E.C
32100
132
x = 24.24%
Potasio : P.M = 39
100% de E.C
x % de E.C
31
E.A.P. Biotecnologa
39100
135.9
x = 28.69%
100% de E.C
30.9 gr de fosforo
x % de E.C
x=
30.9100
173.9
x =17.77%
55.8 gr de hierro
100% de E.C
x % de E.C
x=
55.8100
151.8
x= 36.76%
32
E.A.P. Biotecnologa
33
E.A.P. Biotecnologa