Manual da Oficina Prtica de Gentica,

Genoma e Biotecnologia
Todos os direitos reservados ao DNA Goes to School, Inc. 2004

www.odnavaiaescola.org

Contedo deste mdulo

1-Introduo ao diagnstico
molecular
2-Anemia Falciforme
3-A molcula de hemoglobina
4-Tcnicas moleculares
5-Extrao de DNA de sangue
6-Reao em Cadeia da Polimerase
7-Anlise com enzimas de restrio
8-Eletroforese em gel de agarose
9-Protocolo
10-Debate sobre questes ticas do
diagnstico molecular

Diagnstico Molecular
de Anemia Falciforme
1-Introduo anlise molecular

A prtica de diagnstico de doenas genticas atravs da anlise

de DNA tem se tornado frequente nos ltimos 15 anos, graas aos
avanos na pesquisa molecular. A transferncia das tcnicas
desenvolvidas dentro do ambiente do laboratrio de pesquisa para o
consultrio mdico tem progredido substancialmente e hoje muitas
doenas genticas, tanto as hereditrias como fibrose cstica, quanto
as no hereditrias, como leucemia mielide crnica , podem ser
diagnsticadas atravs da anlise molecular. O diagnstico molecular
uma poderosa ferramenta capaz de proporcionar informaes
fundamentais sobre a condio do paciente e seu prognstico, podendo tambm em muitos
casos auxilar o mdico na escolha do melhor tratamento para o paciente. Alm disso, em muitos
casos, o diagnstico molecular pode indicar quais indivduos so portadores de um determinado
alelo mutante, mesmo que o indivduo em questo no apresente qualquer sintoma. As sndromes
genticas recessivas ligadas ao cromossomo X so um bom exemplo de sndromes onde a me,
geralmente assintomtica, apresenta 50% de chance de gerar um filho homem acometido pela
doena em questo. Nestes casos a anlise molecular pode indicar se a mulher em questo
de fato portadora, auxiliando no somente o mdico, mas tambm o indivduo testado e sua
famlia quanto aos riscos de se gerar um indivduo afetado. Com esta informao nas mos a
famlia pode buscar alternativas, como por exemplo a fertilizao in vitro e posterior seleo de
embries femininos, ou mesmo a realizao de exames moleculares a partir de uma clula
embrionria antes do implante no tero. Neste caso, deseja-se testar se o embrio possui a
mutao em questo. Com o resultado, a famlia decide se deseja ou no dar seguimento ao
processo de implantao do embrio.
No entanto, preciso mencionar que existe tambm muito debate em torno da questo do
diagnstico molecular de doenas genticas hereditrias, e por diversas razes. A anlise gentica
pode expor uma pr-condio antes dsconhecida ao indivduo, podendo ter srias implicaes
psicolgicas para o mesmo. Alm disso, h situaes onde nem todos os indivduos de uma
mesma famlia tm a mesma posio em relao anlise gentica e a realizao do teste
gentico em um indivduo pode expor todo o resto da famlia. H ainda casos onde a deciso da
realizao de um diagnstico gentico est sob responsabilidade dos pais, e no do indivduo
em questo.
A maioria das doenas genticas hereditrias ainda no possui tratamento e por isso muitos
indivduos argumentam que no h sentido em se buscar uma informao que poder apenas
trazer danos psicolgicos ao indivduo, no sendo de nenhuma forma til para o tratamento do
paciente. Alm disso, em muitos pases j existe a preocupao de que este tipo de informao
possa ser usada por seguradoras de sade na hora de negar cobertura ao indivduo sob a alegao
de que se trata de condio mdica pr-existente. Mas h quem diga que o diagnstico molecular
pode ajudar o indivduo a tomar certas decises pessoais, como constituir ou no famlia, ter
filhos, fazer seguro de vida, etc. Este tipo de debate especialmente visto em casos de doenas
genticas de manifestao tardia como, por exemplo, a Doena de Huntington.

A anlise molecular pode ser realizada atravs de diferentes tcnicas, que so definidas
a partir de caractersticas moleculares especficas da doena em questo tais como
ocorrncia e frequncia de mutaes em determinadas populaes, localizao da
mutao, caractersticas especficas do gene em questo, tipo de mutao (mutao
pontual, grandes delees, inseres, etc), entre outras. Nesta oficina ns realizaremos o
diagnstico molecular da anemia falciforme atravs da anlise molecular de indivduos
normais, heterozigotos e homozigotos para a mutao HbS no gene da beta-globina.

Para saber mais

sobre doenas
genticas, visite o
Dolan DNA
Learning Center
do Cold Spring
Harbor Laboratory
na URL http://
www.ygyh.org/

2-Anemia Falciforme
A Anemia Falciforme faz parte de um grupo de doenas genticas recessivas hereditrias
chamadas de hemoglobinopatias. As hemoglobinopatias podem consistir de variaes
estruturais na hemoglobina, ou de talassemias. Estas doenas podem apresentar alta
incidncia em regies endmicas de malria e so especficas de acordo com a regio e
populao em estudo. Deste modo, o conhecimento sobre a origem tnica do paciente
pode ser de grande valia na anlise gentica de indivduos acometidos por algum tipo de
hemoglobinopatia. Das hemoglobinopatias de variao estrutural, a de maior significado
clnico a chamada Hemoglobina S (HbS), que apresenta altas incidncias na frica, Arbia
Saudita e ndia. Devido aos grandes deslocamentos e migraes de populaes humanas
nestes ltimos 500 anos, atualmente encontra-se indivduos afetados por diferentes formas
de hemoglobinopatias no mundo inteiro. Nos Estados Unidos, por exemplo, 10% da populao
negra potadora do alelo HbS.
Os indivduos portadores de dois alelos HbS (homozigotos) so acometidos de Anemia
Falciforme. A Anemia Falciforme caracterizada por anemia crnica e episdios de dor
severa. Estes sintomas so consequncia de uma alterao estrutural especfica na mlecula
de hemoglobina S. A hemoglobina S possu um formato de foice que impede que a mesma
circule livremente pelos capilares, podendo haver interrupo de fluxo sanguneo e morte
tissular. J os indivduos heterozogitos levam uma vida normal embora suas hemcias tenham
uma meia-vida mais curta.

3-Hemoglobina

Figura 1:
Hemoglobina com
as quatro cadeias
peptdicas.

A hemoglobina uma protena

levemente esfrica composta por quatro
subunidades: duas alfa, com 141 resduos de
aminocidos cada uma, e duas beta com
146 resduos. A cadeia alfa codificada pelo
gene alfa-globina enquanto a cadeia beta
codificada pelo gene beta-globina. O
gene que codifica a cadeia beta (betaglobina) est localizado na regio
cromossmica 11p15.5 enquanto que o
gene que codifica a cadeia alfa (alfaglobina) est localizado na 16p13.
Cada uma das cadeias da hemoglobina
possui em seu interior um radical heme que
contm um tomo de ferro (Fig 1). A
hemoglobina nada mais que um
carregador do tomo de ferro, que por ser
altamente reativo, deve ficar fortemente
ligado protena quando a mesma circula
pelo sangue. Esta ligao feita atravs do radical heme (Fig 2). graas alta reatividade do
ferro e grande afinidade pelo oxignio que o mesmo pode ser transportado para todos os
tecidos do corpo. Deste modo, a capacidade de circulao da hemoglobina fundamental
para que o oxignio ligado ao tomo de ferro seja levado a todas as partes do corpo,
incorporando-se em vrias reaes celulares e participando da produo de energia oxidativa

que ocorre na mitocndria. Em ltimo caso, a capacidade de circulao da hemoglobina depende,

em grande parte, de sua forma.
A forma que uma protena adota , antes de tudo, determinada pela chamada estrutura primria
da protena, que nada mais que sua sequncia de aminocidos. A partir da estrutura primria, a
protena ir se desdobrar, naturalmente, em sua forma secundria, terciria e no caso da hemoglobina,
quartenria. As formas secundria e terciria dizem respeito a configurao tri-dimensional adotada
pela protena enquanto a forma quartenriaa, que no est presente em todas as protenas, diz
respeito a forma como diferentes peptdeos esto arrumados na formao de um nico complexo
proteco, como no caso da hemoglobina.
O que difere a hemoglobina normal da hemoglobina S a sequncia primria de cada uma,
que determinada pela sequncia de DNA. Enquanto na hemoglobina normal h o cido glutmico
ocupando a sexta posio da seqncia, na hemoglobina S a valina que ocupa esta posio.
Esta troca consequncia da substituio de um nico nucleotdeo na sequncia de DNA . Ao invs
do nucleotdeo adenina na posio 20 da cadeia de DNA, na sequncia anormal encontra-se o
nucleotdeo timina (Fig. 3). Esta simples mudana afeta a sequncia de cdons (GAG vira GTG),
alterando a sequncia de aminocidos (cido glutmico vira valina alterando ento a forma tridimensional da protena (Fig. 4). A alterao conformacional ocorre porque o grupo radical da valina
no possui carga eltrica, enquanto que o cido glutmico possui carga negativa quando num
ambiente de pH 7,4 (esse valor de pH o fisiolgico e nesse valor o grupo carboxila perde um
hidrognio) e encontra-se na face externa da molcula. Assim a substituio do resduo de cido
glutmico por valina cria um ponto hidrofbico de ligao na superfcie externa da cadeia beta,
alterando a conformao final da protena.
A regio do cromossomo 11 onde o gene da beta globina est localizado contm vrios outros
genes relacionados sendo a regio denominada de regio cluster da beta globina. Nesta regio h
vrios polimorfismos, que podem envolver mais de um gene. Cada um dos padres de polimorfismo
chamado de hapltipo e certos hapltipos so encontrados nos cromossomos que carregam a
hemoglobina mutante (Hb S) e parecem estar associados com a severidade clnica da doena.
Hapltipo e alelo podem ser vistos como termos equivalentes. No entanto, enquanto o termo
alelo usado para designar uma das formas especficas de um gene especfico, o termo hapltipo
usado quando se analisa um segmento de DNA que no necessariamente se limita a apenas um
gene, podendo se estender por mais que um gene ou ainda ser apenas uma regio do genoma
que no codifica genes.
No homem existem 7 cadeias diferentes de hemoglobina que se associam durante o
desenvolvimento para produzir 7 hemoglobinas diferentes. Cada uma dessas cadeias codificada
por um gene independente.

Figura 3:

Sequencias de
DNA das cadeias
normal e mutada
do gene da betaglobina
Figura 2: Radical hemo com o
tomo de ferro no centro.

4-Doenas Genticas e Tcnicas Moleculares

Vrias tcnicas j existem para a realizao do diagnstico molecular. Como
dito anteriormente, a tcnica escolhida depende largamente das propriedades
moleculares da alterao gentica. De modo geral, todas as tcnicas tm como
princpio bsico o isolamento do gene (ou regio) do genoma onde localiza-se a
alterao que se quer analisar. Para a realizao do diagnstico molecular essencial
que se conhea que gene, ou genes, so responsveis pela ocorrncia da doena.
Atualmente j existe um grande nmero de genes associados doenas, e com a
finalizao do sequenciamento do genoma humana este nmero aumenta a cada
dia. Muitas doenas genticas podem ser causadas por mais de um defeito gentico,
como no caso da fibrose cstica onde mais de 500 mutaes no gene conhecido
como CFTR j foram descritas. Neste caso o diagnstico molecular pode ser facilitado
quando se conhece a mutao especifica da famlia. Quando no se conhece a
mutao que se est buscando (por exemplo, uma famlia com um nico caso de
fibrose cstica e sem antecedentes) todo o gene CFTR deve ser investigado. Alm
disso, h defeitos genticos causados pela alterao de um nico nucleotdeo
(chamadas de mutao pontual), como no caso da Anemia Falciforme, e outros
causados por delees de fragmentos maiores na sequncia de DNA, como no caso
da Distrofia Muscular de Duchenne. H ainda as doenas genticas causadas por
uma expanso de nucleotdeos repetidos, como no caso da Doena de Huntington,
Sndrome do X-frgil, Distrofia Miotnica, entre outras. As mutaes pontuais podem
muitas vezes ser detectadas atravs de enzimas de restrio, que reconhecem o local
especfico onde est a mutao. A mutao falciforme, por exemplo, pode ser
identificada atravs da mudana no padro eletrofortico da hemoglobina, ou
atravs da presena ou ausncia do stio de clivagem da enzima de restrio no
gene da beta globina. A mutao associada anemia falciforme causada pela
substituio de uma adenina por uma timina em uma seqncia reconhecida pela
enzima Mst II ou sua isosquimera Dde I. (veja a seguir). Nesta oficina iremos realizar o
diagnstico molecular de Anemia Falciforme atravs da tcnica de PCR e posterior
anlise por enzimas de restrio de DNA extrado de sangue.

5-Extrao
sangue

de

DNA

de

O isolamento de DNA humano pode ser

realizado a partir de diferentes amostras, tais
como sangue ou smen desidratado, ossos,
bulbo capilar, saliva, clulas da pele, esfregao
anal, vaginal e bucal, tecidos derivados de
bipsias ou cirurgias, tecidos mumificados,
congelados, ou de lquido amnitico. Alm
disso, possvel coletar DNA de pontas de
cigarro, tampa de caneta mordida, chiclete,
pentes, slos, envelopes, entre outros. Estes
ltimos so especialmente teis na anlise
molecular forense.
O processo de extrao de DNA
compreende basicamente trs etapas; (a)
quebra da membrana celular para que o
ncleo seja liberado, (b) quebra da membrana
do ncleo para liberao do DNA (fig 4) e (c)
isolamento do DNA atravs de precipitao
em soluo com lcool e sal. O sal neutraliza

Fig 4: Em organismos eucariotos, o DNA se

encontra no ncleo da clula.

a carga negativa do DNA permitindo que as vrias molculas de DNA presentes na

soluo possam se agregar e formar um precipitado visvel em etanol, j que o DNA no
soluvel em etanol.
Estas etapas podem ser feitas com o uso de detergentes, temperatura, processos
mecnicos ou processos enzimticos. Atualmente j existe uma gama de kits comerciais
para a extrao de DNA dos mais variados tecidos. No caso particular da extrao
de DNA de sangue, necessrio que todo o grupamento heme presente nas molculas
de hemoglobinas sejam removidos, j que o ferro, por ser altamente reativo, interefere
nas reaes enzimticas realizadas em seguida.

6-Reao em Cadeia da Polimerase

O princpio bsico da PCR est na capacidade de, a partir de quantidades mnimas de
DNA, multiplicar uma determinada seqncia, de modo que esta se torne majoritria na amostra.
Numa reao de PCR, o fragmento de DNA que desejamos multiplicar (ou amplificar)
chamado de fragmento alvo ou DNA molde e constitu um pedao do gene que se
pretende estudar (em nosso caso o gene da beta-globina). Alm do DNA molde h
tambm os oligonucleotdeos (tambm chamados de primers) que nada mais so do
que pequenos fragmentos de DNA complementares s extremidades da regio que se
pretende amplificar.
A tcnica de PCR tem provocado grande impacto nas principais reas da
biotecnologia: mapeamento gnico, diagnstico molecular, clonagem, seqenciamento
de DNA e deteco da expresso gnica. Atualmente, a PCR utilizada para o
diagnstico de doenas genticas, bem como na deteco de material gentico
presente em pequenas quantidades na amostra em anlise. Como exemplo, temos a
deteco e identificao de material gentico de vrus como o HIV (vrus da AIDS) e HPV
(Papiloma vrus), assim como a deteco de organismos genticamente modificados

Kary Mullis
A tcnica de
PCR foi criada em
1985 pelo Dr. Kary
Mullis, nos Estados
Unidos. Esta tcnica
uma das grandes
responsveis por
todo o avano na
rea de biomedicina
destes ltimos 15
anos.

em produtos alimentcios.
O mtodo pelo qual a PCR funciona descrito em seguida: dois pequenos
fragmentos de DNA, tipicamente de 20 pares de bases, so sintetizados em laboratrio.
Esses so os primers, que so complementares a
cada uma das extremidades da seqncia de
DNA de interesse, sempre na direo 5' > 3' (veja
figura 5 ). Num tubo de reao so adicionados
os primers, os nucleotdeos livres (adenina,
guanina, timina e citosina), amostras de DNA que
se quer analisar (DNA molde) e uma enzima
especial resistente ao calor chamada Taq DNA
polimerase, que promove a sntese de DNA. A
mistura aquecida a 95C, causando a
separao das duas fitas de DNA. Em seguida, a
mistura esfriada at 550C ou 650C, temperatura
na qual os primers se ligam s regies
complementares das fitas de DNA que esto
separadas. Neste momento, dentro do tubo de
reao, todo o DNA est na forma de fita
simples, menos as duas pequenas regies nas
quais os primers de 20 pares de bases se ligaram
nos dois lados da seqncia de DNA de interesse.
A temperatura ento elevada a 72C, e a Taq

Fig 5: O que define a direo de cada uma das

fitas o local de ligao entre o grupo fosfato
com o anel de desoxirribose. Se a ligao ocorre
no carbono 3, dizemos que a fita est na direo
3-5; se a ligao ocorre no carbono 5, dizemos
que a fita est na direo 5-3.

DNA polimerase comea a sintetizar um novo DNA, comeando nas regies em dupla
fita, local onde cada um dos primers se ligou ao DNA molde. A Taq ir promover a
sntese de DNA somente a partir da regio em dupla fita. A sntese ocorre em uma taxa
de aproximadamente 20 nucleotdeos/segundo, e em cerca de 30 segundos a 1 minuto
uma nova cpia do fragmento que se quer analisar sintetizada. A reao agora
novamente aquecida a 95C, causando uma nova separao de todo DNA em fitas
simples. Ao final do primeiro ciclo h duas fitas da molcula original de DNA, mais duas
cpias da regio de interesse. A temperatura novamente reduzida, e agora os primers
iro se ligar aos 4 stios nas novas duas cpias e tambm na molcula original de DNA.
A temperatura do ciclo novamente elevada a 72C e as 4 fitas individuais so copiadas
em 8.

Fig 6: Esquema da PCR.

Esses ciclos so repetidos geralmente 30 vezes, num aparelho chamado

termociclador. Ao final dos ciclos de amplificao existem, aproximadamente, 1 milho
de cpias do segmento de DNA de interesse para cada molcula molde originria da
amostra inicial. assim que podemos selecionar um fragmento especfico dentro de
todo o genoma. Veja a figura 6 para entender melhor a tcnica de PCR.

7-Anlise com Enzimas de Restrio

Endonucleases, tambm chamadas enzimas de restrio, so protenas
bacterianas que cortam em fragmentos a longa mol-cula linear de DNA. As enzimas de
restrio so as principais ferramentas da tecnologia do DNA recombinante. Uma enzima
de restrio reconhece uma seqncia especfica de nucleotdeos, como AGCT, cortando
o DNA nos locais onde esta combinao de letras ocorrer (fig 8). Essas enzimas so
isoladas de bactrias e nomeadas com uma seqncia de trs ou quatro le-tras seguidas
por um nmero romano. Por exemplo, EcoRI uma enzima de restrio isolada da
Escherichia coli.
Parece peculiar que uma enzima como EcoRI possa existir. Por que uma bactria produziria
uma enzima que cliva o DNA numa seqncia especfica de nucleotdeos? A funo destas
enzimas, descoberta nos anos 60 e 70, a de destruir bacterifagos ou vrus que invadem
a bactria. Uma vez cortados, os vrus se tornam inofensivos. As bactrias se protegem
de suas prprias enzimas de restrio atravs da modificao qumica de seu DNA aps
a sn-tese. Esta modificao consiste na adio de um radical metil em nucleotdeos
especficos ao longo da fita de DNA. Esse processo chamado de metilao. Uma vez
metilados, os nucleotdeos esto protegidos de serem digeridos pela enzima de restrio.
Sendo assim, as enzimas de restrio so capazes de distinguir o DNA exgeno (do vrus)
de seu prprio DNA.
A digesto de DNA por enzimas de restrio um processo simples. Basta colocar
o DNA em contato com a enzima a uma temperatura ideal (geralmente 37C) e a enzima
inicia o processo de digesto imediatamente, cortando o DNA em diversos pedacinhos.
O nmero de pedacinhos produzido estabelecido pelo nmero de stios de restrio

A primeira enzima de
restrio foi isolada
em 1968 por Werner
Arber, Hamilton O.
Smith, e Daniel
Nathans quando
trabalhavam na
Johns Hopkins
University, nos
Estados Unidos. Em
1978 os trs
receberam juntos o
prmio Nobel. Para
saber mais sobre essa
importante
descoberta, visite o
Nobel e-museum no
link
http://www.nobel.se/
medicine/laureates/
1978/

W. A r b e r

Fig 8: Diferentes enzimas reconhecem diferentes stios de restrio

D. Nathans

H.O. Smith

reconhecido pela enzima utilizada. A enzima EcoRI, por exemplo, corta o DNA toda vez
que encontra a seqncia G/AATTC, enquanto a enzima DdeI corta o DNA somente no
hexanucleotdeo C/TNAG (N = a qualquer um dos quatros desoxinucleotdeos).Se um
stio especfico de restrio ocorre em mais do que um local na molcula de DNA, o DNA
ser cortado em diferentes locais resultando em muitos fragmentos de diferentes tamanhos
dependendo da localizao do stio na molcula de DNA. Ex: um polinucleotdeo
contendo 4 stios resultar em 5 fragmentos de DNA. Estes diferentes fragmentos sero

Beta-globina normal. A enzima DdeI corta a sequncia nas posies 27, 40, 62,
107, 287, 488, 576

Beta-globina mutada. A enzima DdeI corta a sequncia nas posies 27,

40, 62, 107, 488, 576

separados de acordo com o tamanho atravs da tcnica de eletroforese em gel de agarose

(veja a seguir).
Em seguida esto as sequncias de DNA normal e mutante do gene da betaglobina que iremos amplificar por PCR. Em azul esto os stios de restrio reconhecidos
pela enzima DdeI, em amarelo esto as sequncias dos primers e em vermelho o
nucleotdeo trocado. Repare que a presena da mutao destri um dos stios de restrio.
Deste modo, a digesto com DdeI ir produzir diferentes tamanhos de fragmentos de
restrio de acordo com a presena ou ausncia da mutao.

8- Tcnica de eletroforese de DNA

Os fragmentos gerados atravs da digesto por enzimas de restrio podem ser analisados
atravs da tcnica de eletroforese de agarose. Eletroforese a tcnica pela qual fragmentos de
DNA de diferentes tamanhos so separados. O DNA carregado em um poo do gel (que tem
aspecto de gelatina) e este submetido a um campo eltrico. O DNA ir se mover na direo do
plo positivo, uma vez que a molcula de DNA negativa devido presena de grupamentos
de fosfato.
Durante a corrida eletrofortica, os fragmentos de menor tamanho correm mais
rapidamente que os fragmentos maiores e, deste modo, a posio relativa dos fragmentos no
gel depende dos tamanhos dos mesmos. Aps a corrida eletrofortica, o gel deve ser tratado
com um corante especfico para que se possa observar os fragmentos de DNA.

9- Protocolo

Gel de
agarose
corado com
brometo de
etdio

O processo de
polimerizao de
gel de agarose
semelhante quele
que ocorre quando
fazemos gelatina.

Extrao de DNA
Lise celular
1. Adicione 100L de sangue em um tubo de 1,5 mL contendo 300 L da soluo RBC (Lysis
Solution).
2. Misture por inverso e incube por 10 minutos em temperatura ambiente. Inverta novamente
pelo menos uma vez durante a incubao.
3. Centrifugue por 20 segundos a 13000 rpm.
4. Remova o sobrenadante com a pipeta sem pipetar o precipitado branco (leuccito)
deixando um volume residual de cerca de 10 L.
5. Agite vigorosamente no agitador de tubos (vortex) por 20 segundos para homogenizar a
soluo com o extrato celular.
6. Adicione 100 L da soluo de lise celular (Cell lysis solution) e ressuspenda pipetando
para cima e para baixo. Se houver a presena de clulas agregadas incube a 370C at
a soluo se tornar homognea.
Precipitao protica
1- Deixe a amostra resfriar at atingir a temperatura ambiente.
2- Adicione 34 L da soluo de precipitao (DNA Precipitation Solution) de protena ao
lisado celular.
3- Agite vigorosamente no agitador de tubos (vortex) por 20 segundos para homogenizar a
soluo com o extrato celular.
4- Centrifuge a 13000 rpm por 3 minutos. As protenas precipitadas formam um precipitado
escuro. Se isso no aconteceu, repita o passo 3 e incube no gelo por 5 minutos e ento
repita o passo 4.

Diferentes tampes
tm sido
recomendados
para a eletroforese
de DNA. Os mais
usados so TAE
(Tris-acetatoEDTA) eTBE (Trisborato-EDTA). Os
fragmentos de DNA
migram
ligeiramente
diferentes nestes
dois tampes
devido a diferenas
na fora inica dos
dois tampes.

Precipitao do DNA
1- Tranfira o sobrenadante contendo o DNA (sem pipetar o precipitado de protena) para
um tubo de 1,5 mL contendo 100 L de isopropanol a 100%. Inverta o tubo gentilmente
50 vezes.
3- Centrifuge a 13000 rpm por 2 minutos, o DNA torna-se visvel como um pequeno precipitado
branco.
4- Descarte o sobrenadante por inverso e adicione etanol 70%.
5- Centrifuge a 13000 rpm por 2 minutos. Cuidadosamente descarte o etanol. Cuidado nesse
passo porque o precipitado (DNA) por ser descartado junto com o etanol.
6- Deixe a tampa aberta e inverta o tubo sobre um papel absorvente durante uns 15 minutos
ou at a completa evaporao do etanol.
Hidratao do DNA
1- Adicione 33 L da soluo para a hidratao do DNA (DNA Hydratation Solution).
2- Incube a soluo a 420C por 10 minutos.
3- Transfira a soluo contendo o DNA hidratado para o gelo.

Reao em cadeia da polimerase (PCR)

Protocolo para amplificao:
Adicionar a um tubo de 200 mL contendo mix de PCR:
22 mL de gua Milli-Q autoclavada e esperar misturar com a reao.
Manter o tubo em banho de gelo e adicionar:
2 mL do DNA extrado anteriormente (aprox. 100 ng).
1 mL de soluo contendo 10 pmoles do Mix (oligonucleotdeo)
Dar um pulso na microcentrfuga e adicionar 3mL de leo mineral
Colocar os tubos no termociclador e iniciar a amplificao utilizando o seguinte programa:
Ciclo trmico para amplificao
Desnaturao inicial de 5 min a 95 0C
35 ciclos de: 40 seg a 940C, 40 seg a 600C e 40 seg a 720C.
Digesto com enzima de restrio
1- Retire os micro tubos do PCR e mantenha-os no gelo.
2- Adicione a mistura contendo o tampo da enzima, a enzima, BSA e a gua abaixo da
camada de leo. Para isso, voc ter que introduzir a ponteira at o fim do tubo,
atravessando completamente a camada de leo, antes de liberar o lquido de dentro da
ponteira
25 mL de DNA amplificado (100 ng/mL)
3mL de tampo da enzima 10X
1 mL da enzima Dde I (10 U)
0,3 mL de BSA
1mL de H2O Milli-Q autoclavada
30mL

10

3- Feche o tubo e misture os reagentes dando um pulso na

microcentrfuga, ou batendo o fundo do tubo sobre a
bancada.
4- Coloque o tubo no banho-maria ou no termociclador a 370C
e incube por 1 hora e 30 minutos.
5- Analise a digesto correndo todo o volume da amostra em
gel de agarose 2,5 %.

Eletroforese em gel de agarose e visualizao dos fragmentos de

DNA
O preparo do gel depende da concentrao desejada e do volume
da bandeja. Por exemplo, se o volume da bandeja de 100 mL e voc
deseja preparar um gel a 2.5%. Isso significa que voc ter que adicionar
2.5g em 100 mL. Lembre-se de que o gel sempre deve ser preparado em
tampo nunca em gua.Veja ao lado a figura mostrando as etapas na
preparao do gel na bandeja.
Por conveno, os gis so interpretados da esquerda para a direita,
com os poos orientados para cima e as amostras so aplicadas no poo
da esquerda para a direita. O DNA das amostras ficar separado no gel de
acordo com o tamanho, sendo que os menores migraram mais enquanto
que os maiores migraram menos.
Tampo para eletroforese TAE (1X)
TAE (Tris-acetato-EDTA). Para preparar o TAE 1X. Basta diluir a soluo tampo
50X para um volume final igual a 100 mL.
C1.V1=C2.V2
C1 a concentrao inicial, nesse exemplo igual a 50X.
V1 o volume a ser retirado da soluo inicial, nesse exemplo igual a X.
C2 a concentrao desejada, nesse exemplo igual a 1X.
V2 volume final desejado, nesse exemplo igual a 100.
Substituindo na equao acima.
50. V1=1. 100, portanto, V1 = 2 mL. Assim, basta pegar 2mL da soluo
50X, adicionar em uma proveta e completar com gua destilada para um
volume final igual a 100 mL.
1- Aps o tempo estabelecido remova os tubos da incubao a 370C
e mantenha-os em banho de gelo.
2- Usando uma ponteira para cada tubo introduza a ponteira at o
final do tubo e pipete 20 L, tomando o cuidado para no pipetar o
leo.
3- Transfira o sobrenadante para um tubo de 1,5 mL contendo 5 L do
corante de aplicao. Misture as duas solues pipetando para cima
e para baixo cuidadosamente.
4- Usando uma ponteira para cada tubo aplique as amostras no gel a
2,5% preparado previamente na seguinte ordem:
Poo 1: 2 L DNA marcador;
Poo 2: 20 L amostra
Poo 3: 20 L amostra
Poo 4: 20 L amostra
5- Certifique-se que a amostra correr para o plo positivo (eletrodo
vermelho) e ligue a fonte de acordo com as instrues do instrutor.

Etapas
na preparao do gel na
bandeja.

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6- Quando o corante azul atingir 1/3 do gel (aproximadamente 1 hora) desligue a fonte.
Visualizao dos fragmentos de DNA:
1- Aps desligar a fonte, retire cuidadosamente o gel da cuba e transfira-o para
um recipiente limpo com cuidado para no quebr-lo.
2- Coloque o lado azul do papelote contendo azul de metileno voltado para a
face do gel.
3- Passe os dedos sobre o gel de modo firme, mas sem quebr-lo, vrias vezes.
4- Coloque algum peso, por exemplo, um bquer vazio sobre o papelote azul.
5- Aguarde 15 minutos.
6- Remova o papelote azul e coloque o gel em um recipiente contendo um pouco de
gua destilada.
7- Troque a gua at que as bandas fiquem visveis.
8- Registre e anlise os resultados.
Questes:
1- Desenhe o perfil eletrofortico visualizado no seu gel.
2- Compare o tamanho dos fragmentos do gene da beta globina das amostras analisadas.
2- Qual o diagnstico de cada um dos indivduos testados?

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10-Debate sobre questes ticas do diagnstico molecular

Sabe-se que aproximadamente 5 a 10% das mulheres afetadas por cncer de mama
apresentam a forma hereditria desta doena. J se sabe que pelo menos dois genes podem
estar envolvidos neste tipo de cncer. Estas genes so BRCA 1 e BRCA 2. Mulheres com mutaes
em um destes dois genes tem maiores chances de desenvolver cncer de mama em algum
momento da vida. No entanto, 90% dos casos de cncer de mama so espordicos.
No momento ainda no existe cura defeinitiva para o cncer de mama, embora a
remoo do seio ou parte do mesmo, assim como tratamentos especficos podem reduzir os
riscos de ocorrnciada doena. Mulheres que possuem familiares com cncer de mama ou de
ovrio apresentam uma maior probabilidade de terem alteraes genticas. Estas mulheres tm
sido encorajadas a realizarem mamografias e o auto-exame da mama desde jovens. Muitos
mdicos e cientistas acreditam que quanto mais cedo o cncer for detectado, maiores so as
possibilidades de tratamento assim como as chances de sobrevivncia do paciente. No entanto,
estes procedimentos, incluindo o monitoramento por mamografias, ainda esto em discusso na
comunidade cientfica quanto eficcia em reduzir a taxa de mortalidade.
Vrios laboratrios j realizaram o teste gentico para estes genes. O teste realizado a
partir de uma amostra de sangue, podendo tambm se utilizar outras fontes de material. A principal
tcnica utilizada a PCR e vrias regies destes dois genes so analisadas para possveis mutaes.
O resultado geralmente leva uma ou duas semanas e mantido sob sigilo.
Imagine agora a seguinte situao:
Luciana e Carla so amigas de escola e se conhecem desde a infncia. Um dia, lendo
o jornal local, as duas adolescentes notaram um anncio de uma clnica mdica que oferecia,
de graa, o teste gentico para detecao de mutaes nos genes BRCA 1 e BRCA 2.
Luciana ficou impressionada com o anncio e seu desejo foi o de ligar na mesma hora se
oferecendo para a realizao do teste. Luciana acredita que fatalmente ter cncer de mama,
assim como sua me, e a possibilidade de ela tambm transmitir esta caractersticas para seus
filhos lhe incomoda constantemente. Luciana deseja saber se possui ou no mutaes para
estes genes. A me de Luciana foi diagnosticada aos 43 anos e aps mais de um ano realizando
tratamento com quimioterapia, faleceu.
J Carla tem outra posio em relao realizao do teste. A me de Carla tambm
teve cncer de mama. Felizmente o cncer no se alastrou e a me de Carla est em remisso
por vrios anos. A me de Carla foi diagnosticada com 47 anos de idade.
Carla no favorvel a realizao do teste por vrios motivos. Primeiro, ela escutou de
um amigo que as pessoas que so positivas para mutaes genticas que esto associadas a
doenas, como no caso dos genes BRCA 1 e BRCA 2, podem ter grande dificuldade em obter
um seguro de sado em algum momento de suas vidas porque as seguradoras podem se recusar
a cobrir uma pessoa que elas considerem sob risco. Alm disso, a presena da mutao pode
ser considerada pelas seguradoras como condio pr-existente. Carla tambm no v sentido
em realizar um teste gentcio para uma doena que ainda no possui cura. Para Carla, no h
muito o que fazer com uma informao destas e deste modo o melhor no saber.
Um outro ponto que Carla levanta que um resultado negativo de um teste gentico
realizado com estes genes no significa necessariamente que a pessoa no ter cncer de
mama, uma vez que 90% dos casos de cncer de mama ainda so os casos espordicos que
no parecem ter nenhum precedente familiar.
J Luciana insiste que a obteno desta informao ser para ela de grande importncia
porque poder ajud-la a tomar importantes decises relacionadas casamento e procriao.
Alm disso, Luciana acredita que esta informao deve ser compartilhada com o homem com
quem ela venha a se casar. Para ela, no revelar tal situao para seu potencial companheiro
ser como guardar um segredo. Outro ponto para Luciana que se ela no tiver a mutao ela
acredita que ficar mais tranquila e se sentir mais disposta e aberta a se envolver em
relacionamentos que possam resultar em compromissos mais srios. Luciana sente que tem a
obrigao de checar tal possibilidade e que no faz-lo ser um ato de irresponsabilidade.
Qual sua opinio em relao a estas questes?

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