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Unidad didctica 3:

Pruebas pre-transfusionales y
administracin de la transfusin
DUE. Ana Mateo
Banc de Sang i Teixits. Reus
DUE. Elisabeth Verdaguer
Banc de Sang i Teixits. Badalona
DUE. Sara Vilanova
Banc de Sang i Teixits. Lleida

Mster para enfermera en transfusin sangunea y terapia celular y tisular


Mdulo 3

Sumario

1. Introduccin
2. Objetivos
3. Solicitud transfusional y muestras de sangre
3.1 Criterios de aceptacin de la solicitud
transfusional
3.2 Muestras de sangre
4. Pruebas

pre-transfusionales:

componente

receptor
4.1 Identificacin positiva del receptor y de la
muestra de sangre
4.2 Revisin de los registros del servicio de
transfusiones
4.3 Determinacin del grupo ABO y Rh (D)
4.4 Estudio de la discrepancia sero-hemtica
4.5 Resolucin de las discrepancias ABO
4.6 Resolucin de las discrepancias debidas a la
ausencia de antgenos esperados
4.7 Resolucin de discrepancias debidas a
reacciones inesperadas con anti-A y anti-B
4.8 Resolucin

de

las

discrepancias

por

reacciones sricas inesperadas


5 La prueba cruzada y la investigacin de anticuerpos
irregulares
5.1 Grupo ABO y Rh
5.2 Prueba cruzada
5.3 Escrutinio de anticuerpos
5.4 Identificacin anticuerpos irregulares
6 Reacciones de sensibilizacin, aglutinacin y prueba
de la antiglobulina humana
6.1 Reaccin antgeno-anticuerpo en

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Mdulo 3

inmunohematologa
6.2 Teora del potencial Zeta
6.3 Factores que influyen en la sensibilizacin
de los hemates
6.4 Factores que influyen sobre la aglutinacin
de los hemates
6.5 Utilidad de la prueba directa e indirecta de
la anti-globulina humana
7 Soluciones potenciadoras de la unin antgenoanticuerpo
8 Bibliografa

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Mdulo 3

1. Introduccin
La transfusin es generalmente un procedimiento beneficioso para el paciente.
Pero algunas veces los hemates del donante y a veces los del receptor tienen
una destruccin acelerada. La mayora de reacciones transfusionales hemolticas
se originan por errores en la identificacin del paciente o de la muestra, pero a
veces la hemolisis es provocada por anticuerpos irregulares que se encuentran
en el suero del receptor. Los efectos nocivos fueron observados desde los
principios de la primera transfusin, realizada en el siglo XVII por Jean-Baptiste
Denis.
Actualmente hay una gran variedad de pruebas pre-transfusionales que mejoran
la seguridad y la eficacia transfusional. Realizar les pruebas pre-transfusionals
correctamente asegura que se administren los productos sanguneos ABO
compatibles con el receptor y que se detecten la mayora de anticuerpos
irregulares clnicamente significativos. As podemos seleccionar para cada
receptor los componentes sanguneos ms adecuados y que estos una vez
transfundidos tengan una superviencia aceptable y
destruccin clnicamente significativa de los

no se produzca una

hemates del paciente. As la

transfusin ser lo ms segura posible y habr un mnimo riesgo para el


receptor.

2. Objetivos

Despus de revisar esta Unidad, el alumno tendra que ser capaz de llevar a cabo
las siguientes tareas:

Conocer las pruebas pre-transfusionales que se realizan para que la


transfusin de componentes sanguneos sea lo ms segura posible para
el receptor.

Definir las caractersticas, aplicacin y metodologa de los grupos


sanguneos.

Conocer las discrepancias que nos pueden aparecer a la hora de


determinar la tipificacin del grupo sanguneo de un paciente o
receptor.

Interpretar la prueba cruzada siendo sta la prueba bsica de


compatibilidad pre-transfusional.

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3. Solicitud transfusional y muestras de sangre

3.1 Criterios de aceptacin de la solicitud transfusional


La indicacin de una transfusin es un tratamiento personalizado, por lo tanto
hay que tener presente diferentes factores del paciente: la edad, la enfermedad
de base,

el motivo actual de la transfusin, antecedentes inmuno-

hematolgicos

(transfusin

previa,

trasplantes,

embarazos,

abortos),

antecedentes clnicos, estado inmune del paciente, la sintomatologa que


presenta y los resultados analticos. Con todos los datos del receptor se tiene
que valorar el riesgo/beneficio que la transfusin comporta para el paciente ya
que los componentes sanguneos suponen un riesgo, aunque pequeo, para el
receptor.
La administracin de sangre y de sus componentes ser siempre bajo
prescripcin mdica y siempre que sea posible, el mdico que la indique
obtendr la conformidad del paciente, despus de haberle explicado los riesgos
y beneficios de sta teraputica, as como las posibles alternativas.

La solicitud de transfusin tendr que contener toda la informacin necesaria


para identificar el centro hospitalario, el receptor y el mdico que la ha indicado
as como las razones mdicas que justifican la peticin. Tambin tendrn que
constar con claridad los componentes pedidos y el grado de urgencia de la
solicitud.

Requisitos de la solicitud de transfusin

Identificacin del centro solicitante:


o Nombre del centro donde est ingresado el receptor.
Identificacin del receptor:
o Nombre y apellidos
Fecha de nacimiento/edad.
o Sexo
o Nmero de historia clnica
o Diagnstico
o Servicio que solicita la transfusin.

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o Localizacin del enfermo.


o Peso en caso de neonatos y en peticione de plaquetas o plasma
Identificacin del producto solicitado
o Tipo de producto
o Nmero de unidades
o Volumen
o Caractersticas especiales del componente (irradiado, lavado...)
o Autotransfusin
Identificacin del tipo de solicitud
o Inmediata: sin pruebas de compatibilidad
o Urgente
o Durante el da
o Reserva operatoria
o Reserva no operatoria
Identificacin del historial transfusional
o Antecedentes transfusionales del paciente
o Reacciones transfusionales anteriores
o Embarazos, abortos
o Trasplantes
Identificacin de la persona que extrae la muestra pretransfusional
o Nombre y apellidos
o Firma o identificacin inequvoca.
o Fecha de extraccin
Identificacin del mdico que hace la solicitud
o Nombre y apellidos
o Nmero de colegiado
o firma o identificacin inequvoca
o fecha y hora de la solicitud
o Identificacin del responsable de la aceptacin de la solicitud
o Identificacin
o Fecha y hora de la recepcin de la solicitud.

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Solo deberan aceptarse las solicitudes transfusionales que fueran legibles y que
estuvieran correctamente cumplimentadas. Las solicitudes parcialmente o
defectuosamente cumplimentadas o con muestras insuficientes

no sern

admitidas, excepto las que sean sin pruebas de compatibilidad (inmediatas).

El banco de sangre o el servicio de transfusiones siempre ha que tener un


registro de todas las solicitudes transfusionales recepcionadas.

Modelo de solicitud transfusional

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Esquema de recepcion de solicitud transfusional

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3.2. Muestras de sangre

3.2.1. Identificacin del paciente

Cuando se realice una extraccin de sangre se tiene que identificar siempre


al paciente de manera positiva preguntndole (si est consciente y
orientado) el nombre y los apellidos. Si el paciente no est consciente u
orientado compararemos la informacin de la solicitud de transfusin e
identificaremos al paciente con la informacin de su pulsera identificativa,
con la informacin que nos den los acompaantes, con la informacin que
nos proporcione DUI de la planta o la informacin de la historia clnica del
paciente. No se debe extraer nunca una muestra si la identificacin de la
solicitud no coincide con la identificacin del paciente.

3.2.2. Identificacin inmediata de les muestras despus de la


extraccin

Las muestras de sangre se identificaran correctamente en el momento de la


extraccin en la cabecera del paciente con el nombre y los apellidos del
receptor, el nmero de identificacin del paciente (historia clnica) y la
fecha de la extraccin.

La realizacin correcta de este procedimiento evita la aparicin de errores


en la identificacin del paciente y de la muestra, previniendo posibles
reacciones transfusionales fatales.

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Esquema obtencin de muestras

Para las pruebas pre-transfusionales se utiliza preferentemente sangre total


anticoagulada con EDTA.
Adulto o peso superior a 20 Kg: de 7-10 ml (no menos de 3 ml)

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Nio de menos de 20 Kg: 1-3 ml. En neonatos se aceptan capilares


heparinizados.
Se puede obtener la muestra de una va de infusin si el paciente est
recibiendo medicacin intravenosa. Antes de la extraccin de la muestra se
har un lavado de la va con solucin salina y se rechazaran siempre los
primeros 10 ml de la sangre extrada

ya que la medicacin que est

recibiendo podra interferir en la pruebas serolgicas del paciente.


El intervalo aceptable entre la fecha de extraccin de la muestra de sangre y
la de la transfusin tiene que ser:
<72 horas, si existen antecedentes de transfusiones, embarazos o
trasplantes en los ltimos 3 meses.
>72 horas si no hay los antecedentes anteriores.

3.2.3. Recepcin de la muestra

Cuando se recibe una muestra en el laboratorio, un miembro cualificado de


su personal tiene que confirmar que la informacin de la etiqueta de los
tubos y la de la solicitud transfusional son idnticas. En caso de discrepancia
o duda sobre la identidad del paciente se obtendr una nueva muestra. Es
totalmente inaceptable la correccin de una muestra incorrectamente
identificada.
Una vez verificado que no hay errores de identificacin se dar un nmero
de seguridad transfusional para cada tubo extrado y uno para la solicitud
transfusional.
Al recibir una muestra en el laboratorio se tiene que observar su aspecto. Si
las muestras presentan un aspecto anmalo, el responsable mdico decidir
si se acepta o se solicita nueva muestra.
Las anomalas que se observan con ms frecuencia son:
Color anmalo del plasma: rojo, marrn o mbar oscuro. Pueden
indicar presencia de hemlisis.
Muestra coagulada.
Suero muy acuoso y hematocrito muy bajo. Puede ser debido a que
la muestra se haya extrado de una lnea de infusin y que la
muestra est diluida.

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Las muestras mal identificadas, insuficientes o con aspecto anmalo se


rechazarn y se obtendr nueva muestra.

3.2.4. Almacenamiento de muestras

C un mnimo de 7 das

despus de la transfusin.
Suero o plasma: tiempo no inferior a 10 das a una temperatura de -

El almacenamiento de las muestras del paciente y del donante (concentrado


de hemates) hace que sea posible repetir las pruebas o realizar pruebas
adicionales si el paciente presenta una respuesta desfavorable a la
transfusin.
4. Pruebas pretransfusionales: componente y receptor
La realizacin de las pruebas pretransfusionales sirve para seleccionar para cada
receptor los componentes sanguneos ms adecuados para que una vez
transfundidos tengan una supervivencia ptima y

no se produzca una

destruccin clnicamente significativa de los hemates del receptor.


En las pruebas pre-transfusionals se incluyen:

Identificacin positiva del receptor y de la muestra de sangre de este.

Revisin de los registros del servicio de transfusiones para buscar


resultados previos de las muestras del receptor (historial receptor).

Determinacin de grupo ABO y Rh (D).

Determinacin de anticuerpos irregulares.

Pruebas de compatibilidad con el suero o plasma del receptor y los


hemates del donante (pruebas cruzadas).

Etiquetado de los componentes con la informacin del receptor.

Realizar correctamente las pruebas pre-transfusionales asegura que se


administre a un paciente los componentes sanguneos designados, que estos
componentes sean ABO compatibles y que se puedan detectar la mayora de
anticuerpos irregulares clnicamente significativos.

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4.1. Identificacin positiva del receptor y de la muestra de sangre.

Cuando se realiza una extraccin de sangre se tiene que identificar siempre


al paciente de manera positiva comparando la informacin de la solicitud
transfusional con la que obtendremos del paciente si est consciente y
orientado. Si no, obtendremos la informacin de la pulsera del paciente o
preguntando al DUI responsable o al acompaante. No se debe extraer la
muestra si la informacin de la solicitud y la pulsera no coinciden
4.2. Revisin de los registros del servicio de transfusiones

Las pruebas de compatibilidad han de incluir la comprobacin de la historia


serolgica del receptor en los registros del servicio de transfusin. Se
compararan ( si el paciente tiene ya historia transfusional anterior) los
resultados actuales con los resultados anteriores del receptor: Grupo ABO /
Rh (D), anticuerpos clnicamente significativos, dificultades en el estudio del
paciente, las pruebas de compatibilidad realizadas, los componentes
sanguneos transfundidos, reacciones adversas a la transfusin, requisitos
especiales de la transfusin y cualquier incidencia encontrada.
Una de les informaciones ms significativa que se puede obtener de los
registros es la existencia de anticuerpos clnicamente significativos. La
especificidad de los anticuerpos detectados en estudios anteriores ha de
compararse con la de los anticuerpos que se detecten en el ltimo estudio
realizado.
4.3. Determinacin del grupo ABO y Rh (D)

El examen del grupo ABO debe incluir siempre una prueba sobre los
hemates que llamaremos parte o prueba globular, donde estn los
antgenos y otra sobre el suero que llamaremos parte o prueba srica en la
que se encuentran los anticuerpos. Estas dos partes son inseparables a la
hora de clasificar el grupo sanguneo. Si los resultados de ambas partes no
son los esperados el grupo queda invalidado, debern hacerse las
investigaciones oportunas para averiguar las causas de dichas discrepancias
hemtico/sricas que ampliaremos ms adelante.

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En la parte globular enfrentaremos los reactivos correspondientes con los


hemates que queramos analizar ya sean del donante o receptor. Estos
reactivos son comerciales y se denominan:
Reactivo anti A que reaccionar con el antgeno A. Por lo tanto una
reaccin positiva significa que hay aglutinacin entre antgeno y
anticuerpo, de esta forma podemos decir que hay presencia de
antgeno A. Si por el contrario no hay aglutinacin y no se ven los
hemates aglutinados no hay antgeno A.

Reactivo anti B que reaccionar con el antgeno B. Por lo tanto una


reaccin positiva significa que hay aglutinacin entre antgeno y
anticuerpo, de esta manera podemos decir que hay presencia del
antgeno B. Si por el contrario no hay aglutinacin y no se ven los
hemates aglutinados no hay antgeno B.

Reactivo anti AB que reacciona en presencia del antgeno A y/o del


antgeno B. Por lo tanto una reaccin positiva indica presencia del
antgeno A y/o B.

Ejemplo de la
aglutinacin de la
parte
globular
con los reactivos
anti A, anti B i
anti AB

En la parte srica enfrentaremos el suero del donante o receptor, con


hemates A y hemates B cuya aglutinacin indicar la existencia de

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anticuerpos anti A y/o anticuerpos anti B en dicha parte srica. Este


resultado siempre ser coherente con la parte globular, pero si no lo es
estaremos ente una discrepancia srica que deberemos de investigar para
llegar a la correcta determinacin del grupo sanguneo.
A continuacin veremos unas imgenes que describen esta determinacin
al completo, es decir parte globular y parte srica.

Control Albmina
Reactivo anti D

Aglutinacin positiva

Grupo O

Parte globular

Parte srica

Grupo AB

Aglutinacin negativa
Aqu veramos representada la opcin manual con placa, pero
habitualmente este proceso de determinacin tanto del grupo como del Rh

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est automatizado con mquinas que utilizan los mismos reactivos pero
adaptados a la forma de tarjeta con microtubos. Esto lo vemos en la
siguiente figura.
GRUPO B POSITIVO

Resultado
positivo

Resultado
negativo

Automatizacin de la determinacin del grupo sanguneo y Rh. Con


tarjeta.

Vemos

representados

los

mismos

reactivos.

Aqu

la

interpretacin positiva, es decir que existe aglutinacin sera ver la lnea


de los hemates arriba del todo y negativa abajo del todo.
En esta figura vemos muy bien reflejadas las aglutinaciones que
determinan que sea un B pos. En la parte globular aglutinan los hemates
B por lo tanto hay antgeno B y en la srica aglutinan los anticuerpos anti
A. Por lo tanto sigue el mismo patrn del grupo B. Tambin vemos como
aglutina el Rh cuya lnea de hemates est arriba del todo. El resultado
final es de un B positivo.
Los soportes utilizados en Banco de Sangre para la realizacin de las
pruebas pueden ser:
Tarjeta con microtubos
Tubo de cristal
Placa de opalina o plstico
Tarjetas tipo cartulina
Los indicadores de la reaccin Ag-Ac ms utilizados en banco de sangre
son la aglutinacin que tiene lugar cuando el Ac fijado se une a los
hemates adyacentes formando grumos visibles.

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Aglutinacin positiva
que determina
resultado positivo

Aglutinacin negativa
que determina resultado
negativo

Los Acs IgM causan aglutinacin con facilidad, sin embargo la


sensibilizacin por Acs IgG no produce aglutinacin porque la molcula
es demasiado pequea para cubrir la distancia entre hemate y hemate.
Por ese motivo, para detectar la sensibilizacin IgG se utiliza la prueba de
antiglobulina (prueba de coombs), que se fundamenta en la utilizacin
de un suero antiglobulina humana que formar puentes de unin con las
molculas IgG o complemento ya fijadas a los hemates actuando como
puente y favoreciendo su aglutinacin.

4.4. Estudio de la discrepancia sero-hemtica


Se produce una discrepancia cuando la interpretacin de las pruebas de
determinacin del grupo hemtico no coincide con el srico. En estos
casos deben anotarse los resultados discrepantes.
La interpretacin del grupo ABO debe retrasarse hasta que se resuelva la
discrepancia. Si la sangre que se est analizando es una unidad de
donante, no puede autorizarse para transfusin hasta resolver la
discrepancia de resultados. Cuando la sangre proviene de un posible
receptor, el estado clnico del paciente puede hacer necesario
administrar hemates del grupo O con factor Rh compatible antes de
finalizar el estudio. Es importante obtener cantidades suficientes de
sangre de un paciente antes de la transfusin para que puedan realizarse
los estudios adicionales que puedan ser necesarios para resolver la
discrepancia.
Las discrepancias entre los resultados de las pruebas hemtica y srica
pueden deberse:

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Errores tcnicos
Los problemas tcnicos pueden producir discrepancias en las
pruebas ABO bien por la obtencin de resultados negativos en lugar
de positivos o positivos en lugar de negativos. Los problemas
tcnicos que producen falsos negativos en las pruebas ABO
realizadas con hemates o suero son debidas a:
o

No aadir suero o antisuero a una prueba.

Identificar la hemlisis como negativa.

Inadecuada relacin suero (o antisuero)/hemates.

Centrifugado incorrecto.

No incubar a temperatura de 20-25C o menos.

Uso de reactivos que no funcionen adecuadamente.

No interpretar o registrar los resultados correctamente.

Los problemas tcnicos que producen falsos positivos en la prueba


incluyen:
o

Sobrecentrifugacin

Uso de antisueros, hemates o solucin salina contaminados.

Uso de utensilios de vidrio sucios.

Interpretacin o registro incorrecto de los resultados.

Factores intrnsecos de los hemates


o

Las muestras obtenidas de pacientes que han recibido


recientemente transfusiones o trasplante de mdula sea
pueden dar lugar a reacciones inesperadas si contienen una
mezcla de hemates no homogneos en cuanto a su grupo
ABO.

Las muestras de sangre de personas que han heredado


variantes de genes A o B pueden tener antgenos dbilmente
expresados.

Tambin

pueden

detectarse

antgenos

dbilmente expresados en los hemates de algunos


individuos con enfermedades como la leucemia. Las
muestras de estos pacientes pueden no producir las
reacciones esperadas en las pruebas de aglutinacin directas
con anti-A y anti-B.

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Las anomalas de naturaleza heredada o adquirida que


conducen a lo que se llaman estados poliaglutinables
pueden dar lugar a hemates con membranas modificadas.
Los

hemates

modificados

pueden

aglutinarse

inesperadamente por reactivos anti A, anti B o ambos.


o

Las concentraciones anormales de protenas sricas, la


presencia de macromolculas (en muestras de sangre de
cordn, la presencia de gelatina de Wharton), pueden
producir

agregaciones

inespecficas

que

simulan

la

aglutinacin si se suspenden los hemates en su propio


suero.
o

Se

ha

observado

que,

en

raras

ocasiones,

las

concentraciones elevadas de sustancias del grupo A o B en


suero inhiben la actividad de los antisueros de tal manera
que se obtienen reacciones negativas inesperadas cuando se
utilizan hemates resuspendidos en suero o plasma.
o

Los sueros de algunas personas contienen anticuerpos


contra los colorantes utilizados para colorear los reactivos
anti A y anti B. Estos anticuerpos pueden producir falsos
positivos en las reacciones de aglutinacin si se suspenden
los hemates en suero o plasma para realizar la prueba.

Factores intrnsecos del suero


o Frecuentemente, en las pruebas de determinacin del grupo
ABO que utilizan plasma o suero no totalmente coagulado se
producen pequeos cogulos de fibrina. Los cogulos de fibrina
pueden interpretarse errneamente por una aglutinacin
verdadera.
o Los

sueros

de

pacientes

con

concentraciones

sricas

anormalmente elevadas de protenas anmalas, que presentan


relacin suero/protenas alterada, o

que

han

recibido

expansores del plasma de elevado peso molecular o materiales


de contraste intravenoso pueden dar lugar a una agregacin
inespecfica de los hemates en las pruebas de determinacin del

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grupo srico. Esta agregacin es difcil de distinguir de una


aglutinacin verdadera.
o La muestra puede contener anticuerpos distintos a los anti A y
anti B que produzcan una aglutinacin inesperada de los
eritrocitos reactivos A y B.
o Podemos obtener resultados falsos positivos si la muestra de la
prueba contiene anticuerpos contra los constituyentes qumicos
de los diluyentes utilizados para conservar los hemates A y B. La
interaccin entre los anticuerpos y las sustancias qumicas
produce reacciones inespecficas con los hemates que da lugar a
reacciones inesperadas de aglutinacin.
o Pueden presentarse resultados dbiles o negativos inesperados
en las pruebas sricas si la muestra que se est analizando
proviene de una persona inmunodeficiente debido a una
enfermedad o tratamiento y tiene niveles descendidos de
inmunoglobulinas. Tambin pueden observarse pruebas ABO
sricas dbiles en muestras de pacientes ancianos cuyos niveles
de anticuerpos han disminuido con la edad, y en muestras de
pacientes cuyos anticuerpos se han diluido de manera
importante en procedimientos de recambio plasmtico (tema
que veremos en otro captulo).
o Se observan resultados negativos o dbiles en las pruebas
sricas si se realizan con muestras de nios de menos de 4-6
meses de edad. Las pruebas sricas no se realizan de manera
rutinaria con muestras de recin nacidos ya que los anticuerpos
que contienen provienen generalmente de la transferencia in
tero de la madre.
o En las pruebas sricas, el suero del paciente puede contener
anti-A y anti-B inusualmente potentes que fijan el componente
C1 del complemento hasta tal punto que ste interfiere con la
fijacin del anticuerpo y la aglutinacin. Este fenmeno ha sido
publicado por un laboratorio en pruebas de deteccin de grupo
en suero que utilizaban hemates suspendidos en diluyentes sin
EDTA.

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Factores extrnsecos a la prueba


Estaran relacionados con los problemas previos a la realizacin de la
prueba como por ejemplo errores en la extraccin del tubo, por no
ser el tipo de tubo adecuado o la proporcin hemates
anticoagulante.

A continuacin indicaremos unas pautas a seguir en cuanto a la resolucin de


discrepancias en funcin de cul sea su posible causa.

4.5. Resolucin de las discrepancias ABO

Como muchas discrepancias son producto de errores tcnicos, el primer


paso a tener en cuenta para resolver el problema debe ser, simplemente,
repetir la prueba con la misma muestra. Si se realizaran las pruebas iniciales
con hemates suspendidos en suero o plasma, la repeticin debe incorporar
hemates lavados y resuspendidos en solucin salina. Si persisten las
discrepancias, pueden incorporarse los procedimientos siguientes a la
investigacin:
Obtener una nueva muestra de sangre de la unidad de donante o del
paciente y repetir las pruebas con la nueva muestra. Esto ayudar a
identificar las discrepancias debidas a muestras mal etiquetadas o
contaminadas.
Lavar los hemates problema para eliminar el suero que puedan
producir reacciones positivas inesperadas
Analizar los hemates frente a anti-A, B, anti-A1 o anti-H, segn
corresponda al problema particular.
Analizar el suero frente a hemates del grupo A2 si se sospechan
interferencias debidas a la presencia de anti-A1.
Analizar los hemates de grupo O de adultos, grupo O de cordn
umbilical y hemates autlogos para detectar interferencia de auto o
alocrioaglutininas distintas a las anti A y anti B.
Incubar los hemates y suero a temperatura ambiente durante 30
minutos para facilitar la deteccin de antgenos o anticuerpos

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dbiles. Tambien pueden incubarse las pruebas a 4C siempre que se


incluyan en paralelo los controles adecuados.

4.6. Resolucin de discrepancias debidas a la ausencia de antgenos


esperados

Los hemates de los grupos A y B normales presentan reacciones de


aglutinacin potentes en presencia de los anticuerpos reactivos respectivos.
La potencia de las reacciones que se obtienen en las pruebas de
determinacin de grupo que utilizan hemates o suero indica a menudo la
causa de la discrepancia. Por ejemplo, un suero que no aglutina hemates del
grupo A pero aglutina fuertemente del grupo B sugiere que la muestra de la
prueba pertenece al grupo A aunque los hemates correspondientes no
reaccionan con anti A y anti B. Como se ha dicho anteriormente, en personas
que han heredado alelos variantes se producen discrepancias debidas a
formas debilitadas de los antgenos A o B. Estas tambin se producen en
pacientes con enfermedades que han producido una disminucin de la
actividad antignica. En estos casos, los antgenos pueden deprimirse de tal
manera que no sern detectados en las pruebas de aglutinacin directas de
rutina. Pueden utilizarse los siguientes procedimientos para facilitar la
deteccin de antgenos dbilmente expresados.
Analizar los hemates lavados con anti A y anti B durante 30 minutos
a temperatura ambiente o a 4C. La prolongacin de la incubacin a
temperatura ambiente o a 4C puede facilitar la deteccin de
antgenos A o B dbiles por antisueros reactivos.
Tratar los hemates del paciente con enzimas proteolticos como
papana o bromelina. Estos enzimas potencian las reacciones,
haciendo posible de esta manera visualizar ms la reaccin.
Incubar una parte de los hemates problema a temperatura
ambiente con anti A o anti B (segn la discrepancia) para adsorber el
anticuerpo sobre los antgenos eritrocitarios. Una vez adsorbido
lavar bien los hemates y preparar un eluido. Analizar luego este
eluido frente a hemates de los grupos A, B y O. Si los hemates

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Mdulo 3

tienen el antgeno A, el eluido aglutinar los hemates A, pero no los


B u O.
Analizar la presencia en saliva de sustancias A o B y H con el mtodo
para las pruebas de hemaglutinacin-inhibicin de antgenos
salivares. La condicin de secretor se refiere a la presencia o no de
antgenos A B y H en las secreciones glandulares.
Las personas Bombay tienen genes normales A y B pero no pueden
producir sustancia H, precursora tanto del antgeno A como del B. En
consecuencia , los eritrocitos Bombay no pueden producir antgeno
A ni B de modo que su fenotipo aparente es O.

4.7. Resolucin de discrepancias debidas a reacciones inesperadas con


anti A y anti B

En algunos casos, se obtienen reacciones positivas inesperadas en las pruebas


de determinacin de grupo que utilizan hemates. Por ejemplo, los hemates
de una muestra se aglutinan dbilmente en pruebas con anti A aunque el
suero correspondiente produjera las reacciones esperadas de un grupo B u O
normal. Situaciones como esta pueden producirse por la herencia de un alelo
variente en el locus ABO, o por otros problemas sin relacin con las acciones
de los genes ABO. A continuacin haremos una breve descripcin de aquellos
casos que pueden conducir a la aparicin de reacciones inesperadas en las
pruebas de determinacin de grupo y los pasos que pueden darse para
identificar sus causas.

4.7.1. Fenotipo B adquirido

El estado B adquirido debe considerarse cuando el suero de un paciente


contiene anti B y sus hemates parecen pertenecer al grupo AB con
antgeno B dbil. El fenotipo B adquirido se produce por modificacin del
antgeno A debida a la accin de enzimas microbianas denominadas
desacetilasas. Los enzimas modifican los azcares celulares A
inmunodominantes (GalNAc) transformndolos en unidades ms
parecidas al azcar B (Gal).

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Mdulo 3

Los hemates A son el nico grupo que muestra in vivo actividad B


adquirida. Cuando se encuentran presentes en nmero suficiente, los
antgenos B adquiridos reaccionan con anti B humano en pruebas de
aglutinacin directas. Aunque muchos ejemplos de hemates con
antgenos B adquiridos reaccionan dbilmente con anti B, pueden
encontrarse algunos ejemplos que aglutinan con una gran intensidad.
Para confirmar que los hemates A tienen estructura de B adquirida
debemos:
Comprobar el diagnstico del paciente. Los antgenos B
adquiridos tienen tendencia a asociarse con el carcinoma de
coln o recto, infeccin con microorganismos gramnegativos y
obstrucciones intestinales.
Analizar el suero del paciente frente a sus propios hemates. El
anti B en el suero del paciente no aglutinar sus propios
hemates si stos tienen determinante B adquirido.
Analizar los hemates reactivo anti B monoclonal. Algunos
reactivos monoclonales, a diferencia de los anticuerpos de
origen humano, no reaccionan con el fenotipo B adquirido.
Analizar los hemates con suero anti B humano acidificado ya
que los estos sueros no reaccionan con el receptor B adquirido.
Si el paciente es un secretor, analizar la presencia de sustancias
A y B en su saliva. Los pacientes con eritrocitos que tienen
estructuras B adquiridas tendrn sustancia A, pero no B, en su
saliva.

4.7.2. Antgenos A-like adquiridos

Las discrepancias ABO se asocian a veces a poliaglutinacin Tn. Los


hemates

Tn-activados

tienen

glucoprotenas

que

incorporan

oligosacridos incorrectamente formados. Estas estructuras aparecen en


caso de alteracin gentica en una clula madre hematopoytica que da
lugar a la carencia de una glucosiltransferasa particular. Cuando se
analizan hemates Tn de los grupos O,B,Tn, pueden comportarse como si
hubieran adquirido un antgeno de estructura parecida a la del antgeno

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Mdulo 3

A que reacciona con reactivos anti A. El antgeno A-like de los hemates


Tn puede diferenciarse del A que se origina por la accin de una
transferasa gentica A si los hemates se tratan con enzima proteolticos
antes de realizar la prueba. Los antgenos A-like de los hemates Tn son
destruidos por enzimas.
Existen otras formas de poliaglutinacin que pueden interferir con las
pruebas de determinacin del grupo ABO pero que debido a su
complejidad y su baja frecuencia no es significativo comentarlas.

4.7.3. Aglutinacin en campo mixto

En algunos casos, se encuentran muestras que contienen dos


poblaciones distintas y separables de hemates. Normalmente se
produce una mezcla cuando se transfunden hemates O a un paciente de
grupo A (o B). Las mezclas de hemates tambin se producen en una
condicin que recibe el nombre de quimerismo. Una quimera es una
muestra de sangre que contiene ms de una poblacin de hemates. Hay
quimeras naturales que son el resultado del intercambio intratero del
tejido eritropoytico entre gemelos vitelinos. Menos frecuentemente, se
presenta cuando un paciente ha recibido un trasplante de mdula sea
de un grupo ABO distinto del suyo propio. En estos casos, las pruebas
para la determinacin del grupo hemtico pueden dar un patrn de
aglutinacin mixto. Las reacciones en campo mixto producidas por
quimerismo pueden mantenerse durante todo la vida del donante. En
caso de trasplante de mdula sea, la reaccin mixta desaparecer
cuando se hayan eliminado de la circulacin los hemates propios del
paciente. La aglutinacin en campo mixto tambin puede observarse con
hemates que tienen antgenos A debilitados por enfermedades como la
leucemia, o con hemates Tn.

4.7.4. Hemates recubiertos de anticuerpo

Los hemates de nios con enfermedad hemoltica del recin nacido


(EHRN), o de adultos afectos de anemia hemoltica autoinmune(AHAI) o

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Mdulo 3

reacciones hemolticas post-transfusionales pueden estar recubiertos de


molculas de anticuerpo tipo IgG. Estos hemates se aglutinan a menudo
espontneamente en presencia de reactivos ABO con un alto contenido
en protenas como el reactivo anti D dando aglutinaciones con falsos
positivos. Deberemos utilizar tcnicas de adsorcin y elucin para
eliminar estos anticuerpos de los hemates para que puedan analizarse
de manera fiable con anti A y anti B.
Los hemates recubiertos de crioaglutininas IgM se aglutinarn
espontneamente en las pruebas realizadas con soluciones salinas. Si se
lavan los hemates varias veces con solucin salina calentada a 37C,
pueden eluirse los anticuerpos de las membranas eritrocitarias. Si la
aglutinacin por IgM no se anula mediante esta tcnica, podemos utilizar
otras soluciones como por ejemplo el DTT.

4.8. Resolucin de las discrepancias por reacciones sricas inesperadas

4.8.1. Ausencia de las reacciones sricas esperadas

Los pacientes con enfermedades inmunodeficientes pueden no producir


niveles detectables de anti A y anti B. Estos anticuerpos se encuentran
tambin ausentes en el suero de los recin nacidos y de muchos
pacientes ancianos. En estos casos, puede inferirse el grupo ABO slo
con las pruebas hemticas.

4.8.2. Anti A1

El anti A1 en el suero de personas pertenecientes a los subgrupos A2, u


otros puede aglutinar hemates A1 en pruebas de determinacin de
grupo srico. Para identificar el anti A1 como causa de la discrepancia
haremos:
Analizar el suero frente a varios ejemplos de hemates A1,
A2 y O (preferible 3 muestras de cada uno). El anticuerpo es
anti A1, si solo aglutina todas las muestras de hemates A1 y
ninguna de las A2 y O.

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Mdulo 3

Analizar

los

hemates

del

portador

del

anticuerpo

precedente con anti A1. El anti A1 puede hacer que las


pruebas de compatibilidad con unidades A1 den resultados
de incompatibilidad. En la mayora de los casos estos
anticuerpos slo reaccionan a temperaturas inferiores a los
30C y se consideran clnicamente no significativos. Sin
embargo, se han hallado casos que reaccionan a 37C. Los
anticuerpos activos a esta temperatura deben considerarse
clnicamente significativos. En estos casos slo deben
utilizarse para transfusiones los hemates A2 u O.

4.8.3. Autoanticuerpos fros

Cuando crioaglutininas tienen potencia suficiente, pueden aglutinar


hemates de todos los adultos, incluyendo aquellos utilizados para
preparar hemates reactivos. Con pocas excepciones, la aglutinacin
producida por crioaglutininas es ms dbil que la producida por anti A o
anti B. Pueden seguirse los pasos siguientes cuando la reactividad de las
autoaglutininas interfiere hasta el punto de dificultar la interpretacin:

Calentar el suero y los hemates reactivos a 37C antes de mezclarlos


y realizar la prueba.
Adsorber las crioaglutininas del suero mediante mtodos de auto
adsorcin en fro, as el suero adsorbido puede analizarse frente a
los hemates reactivos A1 y B.
Tratar el suero con DTT y analizarlo frente a hemates reactivos A1 y
B. Como el DTT destruye la actividad aglutinante de los anticuerpos
IgM, las pruebas de determinacin de grupo srico que utilizan
suero tratdo con DTT deben convertirse en pruebas AHG en las que
detectaremos la presencia de anticuerpos de la forma IgG.
4.8.4. Aloanticuerpos inesperados

Los aloanticuerpos inesperados reaccionan a temperatura ambiente y


pueden aglutinar los hemates reactivos utilizados en las pruebas de

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Mdulo 3

deteccin de grupo srico que tengan el antgeno correspondiente. Para


determinar el grupo ABO correcto de los sueros que contengan otros
aloanticuerpos fros:

Identificar el aloanticuerpo , tal como describiremos ms adelante.


Analizar los hemates reactivos A y B para determinar qu reactivo
tiene el antgeno correspondiente.
Analizar el suero frente a hemates A y B que no tengan el antgeno
correspondiente. Por ejemplo , si tenemos identificado como
aloanticuerpo un anti M, analizar el suero frente a hemates A ,M- y
hemates B ,M-, es decir que ni los hemates A ni B tengan el
antgeno M, para resolver la discrepancia.

4.8.5. Rouleaux

El suero de pacientes con concentraciones anormalmente elevadas de


protenas sricas, que presenta una alteracin de la relacin
suero/protenas o han recibido expansores de plasma de peso
molecular elevado, pueden dar lugar a que los hemates parezcan
aglutinados. Algunas de estas muestras producen Rouleaux. Su
formacin puede reconocerse fcilmente al microscopio si los hemates
estn agregados formando las llamadas pilas de monedas. Ms
frecuentemente, estos sueros producen agregados que se manifiestan
como masas de formas irregulares muy parecidas a las masas
aglutinadas por la accin de anticuerpos. Los resultados de las pruebas
de determinacin del grupo srico pueden a menudo corregirse si se
sigue el procedimiento siguiente:
Diluir el suero para anular sus propiedades agregantes. Hacer una
dilucin del suero y analizar la dilucin frente a hemates autlogos. Si
no se observa agregacin, analizar el suero diluido frente a los hemates
reactivos. En la mayora de los casos, aunque no en todos, los
aloanticuerpos anti A y anti B reaccionarn a esta dilucin.

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Mdulo 3

5. La prueba cruzada y la investigacin de anticuerpos irregulares

Todas las pruebas pretransfusionales tienen como objetivo seleccionar para cada
receptor potencial los componentes sanguneos adecuados de forma que una
vez transfundidos tengan una supervivencia ptima. Estas pruebas tienen su
fundamento en que el organismo est dotado de un sistema inmunolgico que
reconoce los antgenos extraos y los distingue de los antgenos propios,
desencadenando una respuesta inmune especfica para dicho antgeno. Las
premisas generales y que nunca debemos de pasar por alto son las siguientes:

Asegurar siempre la compatibilidad ABO. Hablaremos de isogrupo


si transfundimos el mismo grupo que el del receptor y compatible
si no es el mismo grupo pero si compatible.
Utilizar sangre del mismo grupo Rh, sobre todo en mujeres con
edad frtil. En varones con escrutinio de anticuerpos irregulares
negativo y sin antecedentes de anticuerpos anti Rh, segn las
disponibilidades del banco de sangre de tener sangre Rh- podremos
transfundir distinto Rh, siempre bajo la supervisin hematolgica.
Cuando el donante y el receptor pertenecen al mismo grupo ABO y
Rh, la transfusin es compatible el 98% de los casos.
Para asegurar la compatibilidad en el

2% restante, son

fundamentales :
o

El

estudio

de

anticuerpos

irregulares

clnicamente

importantes en el suero del receptor.


o

La prueba de compatibilidad directa entre el suero del


receptor y los hemates del donante.

No debe olvidarse que la identificacin inequvoca de las muestras de sangre,


tanto del receptor potencial como del componente o los componentes a
transfundir, es un aspecto fundamental, dado que la mayor parte de las
reacciones hemolticas tienen su origen en errores de identificacin de muestras.
La base de la compatibilidad es la identificacin correcta del grupo ABO y Rh
tanto en el donante como en el receptor.

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Mdulo 3

5.1. Grupo ABO y Rh

El grupo ABO y Rh debe realizarse en cada muestra recibida, y el resultado


compararse con los registrados en estudios previos.
Toda discrepancia entre la prueba srica y hemtica en el estudio del grupo
ABO debe resolverse antes de realizar la transfusin.
Si en el paciente se dan circunstancias que indican la transfusin con urgencia
extrema, se transfundirn hemates del grupo O y Rh -.

5.2. Prueba cruzada

La prueba cruzada tiene doble finalidad:


Detectar incompatibilidad ABO entre bolsa y receptor
Detectar incompatibilidad de anticuerpos entre bolsa y receptor.

A menos que la situacin sea urgente, generalmente se analiza el suero o


plasma del receptor con hemates del donante antes de administrar los
hemates; esto significa que se realiza una prueba cruzada mayor. La muestra
debe obtenerse y etiquetarse de forma inequvoca y los hemates del
donante deben proceder de un segmento de tubo originario de la bolsa. Los
mtodos utilizados deben incluir aqullos que demostraran incompatibilidad
ABO y detectarn anticuerpos irregulares clnicamente significativos, y por lo
tanto deben incluir tambin una prueba de antiglobulina o prueba coombs.
No obstante, cuando no se detectan anticuerpos clnicamente significativos
en las pruebas de escrutinio de anticuerpos, y siempre que el paciente no
tenga historia de anticuerpos positivos, no es imprescindible la fase de
antiglobulina en las pruebas de compatibilidad o prueba cruzada. Es raro
detectar un anticuerpo clnicamente significativo en la fase de antiglobulina
de las pruebas cruzadas cuando la prueba de deteccin de anticuerpos es
negativa. La decisin de omitir la fase de antiglobulina de las pruebas de
compatibilidad en pacientes que cumplen estos criterios debe ser establecida
por criterio mdico.
Si se detectan anticuerpos cnicamente significativos en el procedimiento de
escrutinio, es necesario realizar la fase de antiglobulina en la pruba cruzada.

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Mdulo 3

Para detectar la presencia de Acs contra Ags eritrocitarios, en una primera


fase de sensibilizacin se incuba el suero del paciente con los hemates
correspondientes para favorecer la unin Ag-Ac. En esta fase se puede
aumentar la sensibilizacin de la tcnica y disminuir los tiempos de
incubacin aadiendo distintos potenciadores (medio potencial inico bajo )
o albmina.
Las pruebas para demostrar incompatibilidad ABO son siempre necesarias. El
motivo ms importante para realizar las pruebas cruzadas es que sirven como
comprobacin final de la compatibilidad del grupo sanguneo ABO. No es
necesario analizar los hemates del receptor con el suero o plasma del
donante, es decir realizar la prueba cruzada menor. Esta prueba no se utiliza
en banco. Ya se han efectuado previamente pruebas de deteccin de
anticuerpos en muestras de aquellos donantes con escrutinio de anticuerpos
irregulares positivo.
La mayora de las muestras analizadas presentan un escrutinio de anticuerpos
negativo, en estos casos la prctica habitual de la prueba cruzada recibe el
nombre de salina inmediata, enfrentando suero del paciente con hemates
del receptor a temperatura ambiente con un tiempo corto de unos 5
minutos.
El soporte para realizar la prueba cruzada puede ser en tubo o tarjeta
coombs. En el soporte tubo se lleva a cabo la prueba cruzada en salina, es
decir no incubamos el suero a 37C. Esta determinacin en salina que es ms
rpida y slo est indicada en receptores en los que no tenemos problemas
de discrepancia con el grupo sanguneo ni tenemos presencia de anticuerpos
irregulares.
Cuando tenemos un receptor con anticuerpos irregulares positivos la prueba
cruzada se llevara a cabo en un medio de coombs a 37C ya sea en tubo o
tarjeta para potenciar esta fijacin del antgeno anticuerpo. Cuando se
detecta e identifica un anticuerpo con significado clnico, se deben encontrar
unidades negativas para ese antgeno para cruzarlas con el suero del
paciente.

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Mdulo 3

En

enfermos

previamente

transfundidos,

sobre

todo

en

los

politransfundidos, debe recordarse la posibilidad de que una nueva


transfusin genere una respuesta inmune secundaria y reaccin hemoltica
retardada; en ellos reviste especial importancia la relizacin de la prueba
cruzada con suero obtenido en los 48-72 horas antes, e idealmente en las 24
horas previas. Si la transfusin precedente fue incompatible en un enfermo
sensibilizado con aloanticuerpos de bajo ttulo, stos pueden ser
indetectables tanto en la prueba de escrutinio como en la prueba cruzada
directa, y probablemente es ms resolutivo realizar una prueba de
antiglobulina directa en las pruebas pretransfusionales siguientes.
Si se han identificado aloanticuerpos en el receptor, la sangre seleccionada
para la prueba cruzada debe ser negativa para el antgeno correspondiente.
No debe olvidarse que, adems de la aglutinacin, la hemlisis es un signo de
incompatibilidad.

5.3. Escrutinio de anticuerpos

Implica la investigacin en el suero o en el plasma del receptor de


anticuerpos frente a antgenos eritrocitarios (diferentes de las aglutininas
naturales anti A y anti B), utilizando para ello tres suspensiones distintas de
hemates O, que deben poseer los antgenos eritrocitarios necesarios para
detectar anticuerpos clnicamente importantes desde el punto de vista
transfusional, es decir, capaces de inducir reaccin hemoltica con
acortamiento de la vida media de los hemates transfundidos.

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Mdulo 3

5.4. Identificacin anticuerpos irregulares

Una vez que se ha detectado la existencia de un anticuerpo irregular en las


pruebas, debe determinarse su especificidad y su significacin clnica. Los
aloanticuerpos irregulares son anticuerpos distintos de los anticuerpos
naturales anti A y anti B. Estos aloanticuerpos se encuentran presentes
aproximadamente en un 0,3-2% de la poblacin, segn el grupo de pacientes
o donantes estudiados y la sensibilidad de los mtodos utilizados. Algunos
anticuerpos producen la destruccin de los hemates en pocas horas o incluso
minutos, mientras que otros acortan la supervivencia prevista en slo unos
pocos das. La determinacin de la especificidad de los anticuerpos
detectados en los anlisis pretranfusionales es importante para valorar la
necesidad de seleccionar para la transfusin sangre antgeno negativa. Los
pacientes con anticuerpos clnicamente significativos deben recibir, siempre
que sea posible, sangre que carezca del antgeno contra el que han hecho
anticuerpos.
Cuando se habla de identificacin de anticuerpos irregulares, en Banco de
sangre nos referimos a la realizacin de un panel. Este consiste en enfrentar
el suero problema con hemates, en este caso de 11 clulas

ms un

autocontrol. Esta tabla la tenemos representada en la tabla siguiente.


Estos paneles de hemates pueden adquirirse en casas comerciales. En cada
panel comercial se facilita una lista que recoge de forma detallada, el
fenotipo de cada muestra de hemates. Para que sea eficaz un panel de
hemates reactivos debe permitir identificar con confianza aquellos
aloanticuerpos clnicamente significativos que se detectan con mayor
frecuencia, como anti D, anti E, anti K y anti Fya.
Es importante tambin conocer cmo reacciona el suero problema con los
hemates autlogos. Esto ayuda a determinar si estn presentes
aloanticuerpos, autoanticuerpos o ambos.

A continuacin presentamos una tabla con los diferentes sistemas antgenos


distintos del ABO con su importancia clnica:

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Mdulo 3

Sistema antignico

Aloanticuerpo

Importancia clnica

Rh (D, C/c, E/e)

IgG

HTR - EHRN

Lewis (Lea/Leb)

IgG-IgM

Rara HTR

Kell (Kell/k )

IgG

HTR - EHRN

Duffy (Fya/Fyb)

IgG

HTR - EHRN

Kidd (Jka/Jkb)

IgG

HTR (a menudo tarda)


EHRN (leve)

I/i

IgM

Ninguna

MN,Ss,U

IgG/IgM

EHRN rara anti-M;


HDN-anti-S, anti-s

HTR, reaccin transfusional hemoltica; EHRN, enfermedad hemoltica del recin


nacido.
La identificacin de anticuerpos irregulares la llevaremos a cabo en dos medios
Medio de coombs con hemates sin papainizar y con tarjeta coombs. Es
un medio que se lleva a 37C.
Medio enzimtico utilizando hemates papainizados con tarjeta neutra.
Las tcnicas enzimticas ms adecuadamente en las pruebas de
identificacin de anticuerpos que en las pruebas pre-transfusionales.
Son especialmente tiles en los casos en los que se desea un aumento
de la sensibilidad, como en el estudio de las reacciones posttransfusionales hemolticas retardadas en las que ciertos anticuerpos
pueden no ser detectados por otros mtodos. No obstante, si se utiliza
rutinariamente para la deteccin de anticuerpos un mtodo enzimtico,
nunca debe ser la nica tcnica utilizada debido a que habitualmente se
destruyen los antgenos M, N, S, Fya, Fyb y no se detectaran los
anticuerpos contra estos antgenos.

Todos los resultados obtenidos tanto

positivos como negativos los

registraremos en el folleto adjunto marcando la intensidad de los resultados


positivos. La interpretacin de estos resultados podramos decir que consiste en
ver el patrn de resultados con que patrn antignico coincide, esto es en lneas

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Mdulo 3

generales sin embargo hay que hacer una secuencia de pasos para resolver la
identificacin de estos aloanticuerpos. Estas secuencias las describimos a
continuacin:

Autocontrol. Evaluar las reacciones de autocontrol. Si son negativas, se


excluye la presencia de autoanticuerpos. Si son positivas, considerar la
presencia de autoanticuerpos o aloanticuerpos producidos en respuesta
a una transfusin previa reciente.
Hemates reactivos. No considerar inicialmente los antgenos presentes
en las muestras no reactivas. Es decir no considerar inicialmente los
resultados negativos.
Hemates autlogos. No considerar los anticuerpos contra antgenos
presentes en los hemates autlogos.
Hemates tratados con enzimas. Examinar los fenotipos de las muestras
que reaccionan con los hemates no tratados, pero no son reactivas (o
ms dbiles) frente a hemates tratados con enzimas.
Patrn de reaccin. Examinar los patrones de reaccin en cada fase de
la prueba, recordar las posibles especificaciones implicadas y considerar
posibles especificaciones e relacin a la fase de la prueba y el tipo de
reactividad.
Pruebas adicionales. Analizar un nmero suficiente de muestras de
hemates de fenotipo adecuado. Analizar el suero frente a hemates con
dosis doble de los antgenos contra los cuales el suero puede contener
anticuerpos, si stos no se encontraban presentes en las muestras
anteriormente no reactivas.

6. Reacciones de sensibilizacin, aglutinacin

y prueba de la

antiglobulina humana
6.1. Reaccin antgeno-anticuerpo en inmunohematologa:
La interaccin antgeno-anticuerpo puede ser detectada por diversas tcnicas
serolgicas. Los mtodos utilizados con mayor frecuencia en el banco de
sangre tienen como resultado la hemlisis o la aglutinacin de los hemates.

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Mdulo 3

La hemlisis de los hemates se produce si se activa la secuencia completa del


complemento despus de la interaccin antgeno- anticuerpo. Muchos
anticuerpos activan el complemento, pero la secuencia se interrumpe a
menudo a nivel de C3; por ello la lisis in vitro raras veces se produce.
La aglutinacin de los hemates es el indicador de la reaccin antgenoanticuerpo ms comnmente usado.
Los anticuerpos aglutinan a los eritrocitos en 2 etapas:
1. La primera es la sensibilizacin, mediante la cual el anticuerpo se une
fsicamente al antgeno en la superficie del hemate.

2. La segunda es la aglutinacin. En sta los hemates, a los cuales los


anticuerpos se unieron, aglutinan formando puentes entre ellos para crear
una estructura de enrejado.
Para que la sensibilizacin produzca aglutinacin visible, es preciso que la
porcin Fab del anticuerpo pueda unirse a los hemates adyacentes, para lo
cual stos debern estar suficientemente prximos.

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Mdulo 3

En algunas reacciones antgeno-anticuerpo las 2 etapas ocurren casi


simultneamente, mientras que en otras slo ocurre la primera etapa de la
reaccin, es decir, hay sensibilizacin de los eritrocitos por anticuerpos no
aglutinantes.
La sensibilizacin por IgG no produce aglutinacin debido a que la molcula
de anticuerpo es demasiado pequea para cubrir la distancia entre hemate y
hemate.
Por lo contrario, la molcula de IgM

puede causar la aglutinacin con

facilidad. Para que tenga lugar la aglutinacin deben ser vencidas las fuerzas
de repulsin que normalmente mantienen separados los hemates.

6.2. Teora del potencial Zeta

En inmunohematologa eritrocitaria, el fenmeno de aglutinacin de los


glbulos rojos producido por la reaccin entre anticuerpos y antgenos de
grupos sanguneos, constituye la base de casi todas las tcnicas aplicadas en
la serologia de los grupos sanguneos.

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Mdulo 3

Existen varias teoras para explicar por qu los hemates no aglutinan en


condiciones normales. La teora del potencial Zeta, es la ms aceptada.

Para la comprensin de los fenmenos de hemoaglutinacin, necesitamos de


un modelo ms complejo, con base en procesos fsico-qumicos, donde el
factor ms importante a ser considerado es la distancia media que separa los
glbulos en suspensin. Esta distancia puede ser disminuida por la adicin de
anticuerpos u otras substancias al medio, hasta un punto crtico en que la
aglutinacin ocurre.

Los glbulos rojos se comportan como partculas electronegativas. Los grupos


carboxlicos de las sialo-glucoprotenas (cido silico ) de la membrana
eritrocitaria son los mayores responsables de esta electronegatividad.

En medio salino (NaCl al 0,85%), los iones positivos de sodio (Na+) son
atrados por las cargas negativas de los glbulos rojos, creando una nube de
cargas positivas, que genera una fuerte repulsin interglobular.

La nube de iones positivos que involucra cada glbulo, se vuelve menos


densa mientras se aleja del glbulo. La diferencia de potencial elctrico
creada entre la nube de iones positivos (Na+) cerca del glbulo y el medio con
iones de sodio y cloruro en equilibrio (neutro), se llama Potencial Zeta. La
fuerza de repulsin entre los glbulos rojos, en medio salino, depende del
valor del potencial zeta.

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Mdulo 3

Considerando la carga elctrica del glbulo rojo , la fuerza inica del medio
de la suspensin ( ) y la constante dielctrica del medio , Pollack desarroll la
siguiente expresin del potencial zeta (Z):

Z = f , o sea, la diferencia del potencial zeta es una funcin que varia


directamente con la electronegatividad de la membrana eritrocitaria

inversamente con la constante dielctrica del medio de suspensin (D) y con


la raz cuadrada de su fuerza inica ( u).

Desde el punto de vista fsico-qumico, la aglutinacin ocurre por la


agregacin de los glbulos rojos (aglutinados), cuando la distancia media
entre ellos se reduce hasta un valor mnimo. Esta distancia depende de los
valores de dos fuerzas antagnicas: la tensin interfacial (fuerza de
cohesin), que tiende a agregar los glbulos rojos y la fuerza de repulsin,
debida a los escudos de cargas positivas creados alrededor de los glbulos
(cargas iguales se repelen).

En la ausencia de agentes aglutinantes, la fuerza de repulsin predomina y


mantienen la suspensin globular estable en medio salino.

El potencial Zeta de un sistema puede ser cambiado de dos maneras:

Por la reduccin de la carga elctrica de la membrana eritrocitaria:


Se incluye en esta categora, los efectos debidos al tratamiento de
los glbulos rojos con enzimas proteolticas, que sacan fragmentos
de

glucoprotenas

de

la

membrana,

reduciendo

su

electronegatividad y al efecto de la fijacin de anticuerpos sobre la


membrana eritrocitaria.

Cambios en la composicin del medio:

39

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Mdulo 3

Los efectos debidos a los cambios de la fuerza inica y de la


constante dielctrica del sistema. La aglutinabilidad de un sistema
es ms alta mientras ms bajo sea el valor del potencial Zeta.

Los cambios indicados pueden afectar a la sensibilizacin y a la aglutinacin.

Si se disminuye la densidad de la nube de cationes, los anticuerpos pueden


acercarse ms fcilmente a la superficie de los hemates, favoreciendo as a la
sensibilizacin de los mismos.

La reduccin del potencial Zeta permite un mayor acercamiento entre los


hemates, con lo cual se facilita la aglutinacin.

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Mdulo 3

6.3. Factores que influyen sobre la sensibilizacin de los hemates.

6.3.1 Proporcin relativa del antgeno y del anticuerpo

La velocidad de formacin del complejo antgeno-anticuerpo vara con el


nmero de molculas de anticuerpo presentes en el medio y con el nmero de
sitios antignicos presentes en cada clula. Al aumentar la cantidad de
anticuerpos en el medio puede aumentar la sensibilidad de la prueba, asimismo,
al aumentar la proporcin de suero (que contiene el anticuerpo) en relacin con
los hemates (que contienen el antgeno) se proveen ms anticuerpos por zonas
antignicas.

6.3.2. pH del medio donde se produce la reaccin

El punto isoelctrico de la mayora de los anticuerpos es aproximadamente 7,5.


A un pH inferior al punto isoelctrico el anticuerpo tiene carga positiva. Esto
facilita su unin con los eritrocitos (carga negativa). Anticuerpos como los anti-M
reaccionan mejor a pH bajo, y para los anti-D se reporta el pH ptimo entre 6,5 y
7,0. Por esta razn el pH ptimo para la sensibilizacin est entre 6,5 y 7,5.

6.3.3. Temperatura

La mayora de los anticuerpos de grupos sanguneos reaccionan en un rango


restringido de temperatura. Las reacciones antgeno anticuerpo son
exotrmicas; por lo tanto, a temperaturas ms bajas la velocidad de reaccin
disminuye y existe menor grado de fijacin de anticuerpo. Los anticuerpos de la
clase IgM son ms reactivos a bajas temperaturas (4-27 C), mientras que los de
la clase IgG lo son a 37 C. Por este motivo, las tcnicas de deteccin de
anticuerpos abarcan gamas de temperaturas de 22-37 C 30-37 C.
La temperatura tambin puede afectar la accesibilidad del antgeno situado en la
membrana del glbulo rojo. Algunos anticuerpos del tipo IgM se fijan a sus
correspondientes antgenos a temperaturas inferiores a 37 C. Dichos
anticuerpos se denominan anticuerpos fros.

41

Mster para enfermera en transfusin sangunea y terapia celular y tisular


Mdulo 3

Esta influencia de la temperatura se explica porque dependiendo de la misma, se


producen cambios de configuracin en el antgeno.
Aquellos anticuerpos que reaccionan in vitro a temperaturas por debajo de 37
C, no se consideran clnicamente significativos y rara vez destruyen eritrocitos
transfundidos. Algunos anticuerpos de la clase IgM pueden activar el
complemento a temperaturas por debajo de 30 C, pero slo acortan de forma
mnima la supervivencia de eritrocitos incompatibles transfundidos. Los
anticuerpos clnicamente significativos son aquellos que tienen actividad in vivo
que se manifiesta in vitro al reaccionar a 37 C.

Anticuerpos fros

6.3.4. Potencial inico del medio

En una solucin salina normal, los iones Na+ y Cl- se agrupan alrededor de las
molculas de antgeno y anticuerpo, y neutralizan parcialmente sus cargas
opuestas.
Cuando los hemates estn en suspensin salina de bajo potencial inico, la nube
de cationes que rodea a los hemates es menos densa. La concentracin
disminuida de cationes alrededor de los glbulos rojos permite a las molculas
de anticuerpo tener ms fcil acceso a los lugares antignicos de la membrana
eritrocitaria, aumentando as la tasa de sensibilizacin.

6.4. Factores que influyen sobre la aglutinacin de los hemates.

La aglutinacin se produce cuando los hemates estn lo bastante prximos para


permitir a una molcula de anticuerpo hacer de puente entre clulas
adyacentes. Este proceso puede estar afectado por varios factores entre los que

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Mdulo 3

se incluyen las propiedades del medio utilizado para la suspensin globular y las
caractersticas del antgeno y del anticuerpo.

6.4.1. Potencial inico del medio

Si bien la sensibilizacin aumenta cuando los glbulos rojos estn en suspensin


salina de bajo potencial inico, la aglutinacin de estos glbulos rojos
sensibilizados se ve desfavorecida por un aumento del potencial Zeta. La
densidad de la nube inica alrededor de los eritrocitos disminuye cuando el
potencial inico desciende; ahora, el espesor de la nube aumenta por ser menor
la concentracin de iones en el medio. Esto se traduce en un aumento del
potencial Zeta y por lo tanto, la aglutinacin se hace ms difcil.
Para aumentar la aglutinacin, se debe separar a los eritrocitos de este medio,
lavndolos con suero salino isotnico normal.

6.4.2. Presencia de albmina en el medio


Los anticuerpos que no aglutinan eritrocitos suspendidos en solucin salina, en
ocasiones, los aglutinan cuando estn suspendidos en albmina bovina, esto es
posible porque la albmina provoca un incremento en la constante dielctrica
del medio en el que estn suspendidos los eritrocitos y una disminucin del
potencial zeta. La constante dielctrica de un medio es una medida de su
habilidad para disipar cargas.
No todos los anticuerpos de los grupos sanguneos aumentan su actividad en las
pruebas de albmina. Los anti-A, anti-B y anti-Lewis muestran reduccin de su
actividad en presencia de albmina.

6.4.3. Tratamiento enzimtico de los eritrocitos

Enzimas proteasas como la bromelina, tripsina, papana y ficina se utilizan en las


pruebas serolgicas porque reducen la carga de la superficie de los eritrocitos al
hidrolizar las sialoglicoprotenas de la superficie celular.

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Cualquier mecanismo que elimine las cargas negativas de los eritrocitos reducir
la distancia que los separa al disminuir el potencial zeta y as facilitar su
aglutinacin por parte de anticuerpos de la clase IgG. La disminucin de la carga
superficial de los glbulos rojos permite un mayor acercamiento de stos,
facilitando su aglutinacin por las molculas de anticuerpo. El tratamiento
enzimtico de los eritrocitos tambin incrementa la accesibilidad de algunos
antgenos cuando las glicoprotenas son eliminadas.
Adems de estas acciones, las enzimas proteolticas eliminan zonas antignicas
de otros anticuerpos como anti-M, -N, -S, -s, -Fya, -Fyb y Xga. Esta propiedad de
las enzimas proteolticas son de gran utilidad en la identificacin de anticuerpos
eritrocitarios.
6.4.4. Temperatura
El Tiempo de incubacin afecta a la aglutinacin. Los anticuerpos de los diversos
grupos sanguneos tienen diferentes tiempos para alcanzar el equilibrio, en esto
interviene de manera significativa la clase de inmunoglobulina y la forma en que
se une con antgeno especfico.
Estudios con eritrocitos suspendidos en suero o solucin salina han demostrado
que del 100 % de anticuerpos RhD que se fijan, aproximadamente el 25 % lo
hace en los primeros 15 minutos y el 75 % restante lo hace durante la primera
hora. La adicin de varios agentes potenciadores, por ejemplo disminucin de la
fuerza inica, puede aumentar la cantidad de anticuerpos fijados durante los
primeros 15 minutos, y con esto disminuir el tiempo de incubacin necesario
para alcanzar el equilibrio.
6.4.5. Densidad del antgeno

Cuanto mayor es el nmero de antgenos en la superficie del eritrocito, mayor es


el grado de sensibilizacin. La fijacin de molculas de anticuerpos disminuye el
potencial Zeta y aumenta la aglutinacin.
Por otra parte la mayor densidad del antgeno tambin aumenta las
probabilidades de que el anticuerpo pueda establecer puente entre los
hemates.

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El efecto de dosis es una va por la que algunos antgenos pueden afectar la


fuerza de la reaccin antgeno-anticuerpo. Algunos anticuerpos muestran
diferencias en la fuerza de sus reacciones, en dependencia de la cantidad de
antgeno presente en las clulas. A veces estas cantidades son proporcionales al
genotipo del individuo, por ejemplo, los eritrocitos M+ de un individuo de
genotipo MM contienen ms antgeno M que los eritrocitos M+ de un individuo
de genotipo MN.
6.4.6. Agrupacin y movilidad de los antgenos

La situacin prxima de los antgenos en la membrana eritrocitaria facilita la


aglutinacin ya que supone un mayor nmero de probabilidades para la fijacin
del anticuerpo en el lugar antignico determinado.
Los eritrocitos sensibilizados con anticuerpos de la clase IgM pueden crear la
estructura de enrejado en la segunda etapa de la reaccin de aglutinacin,
porque los anticuerpos de esta clase son capaces de cubrir la distancia que
separa a los eritrocitos entre s por la repulsin de cargas iguales. De forma
contraria, los anticuerpos de la clase IgG son generalmente sensibilizantes, pero
no aglutinantes. El ser molculas de pequeo tamao y con 2 sitios de
combinacin con el antgeno, les imposibilita vencer la distancia que existe entre
los eritrocitos y aglutinarlos.
6.4.7. Caractersticas del anticuerpo

La capacidad de un anticuerpo para aglutinar a los hemates depende de la clase


de inmunoglobulina a que pertenece.
Dos de las caractersticas de los anticuerpos que deben considerarse son el
tamao y el nmero de sitios de combinacin con el antgeno, ya que entre los
anticuerpos de las clases IgG e IgM existen considerables diferencias fsicas.
Los anticuerpos IgM pueden establecer puentes entre los eritrocitos y
aglutinarlos an suspendidos en solucin salina, mientras que los anticuerpos
IgG no. Esto es posible porque las molculas de IgM son circulares y poseen 10
sitios de combinacin con el antgeno, separados a una distancia de 300 ; la

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distancia que separa a 2 clulas normales es 184 y estos anticuerpos para


provocar la aglutinacin de las mismas pueden combinar 2 3 de sus sitios con
una, y el resto de los sitios con otra.
Las molculas de IgG, a diferencia de las IgM, poseen slo 2 sitios de
combinacin con el antgeno y estos estn separados a una distancia de 140 ,
por lo tanto, para aglutinar 2 clulas slo dispone de un sitio de combinacion
para cada una, estos a su vez se encuentran ms cercanos uno del otro que los
sitios de la IgM.

6.5. Utilidad de la prueba directa e indirecta de la anti-globulina humana

La prueba de la anti-globulina humana o prueba de Coombs representa la


tcnica ms importante de aglutinacin artificial en inmunohematologa.

Por un procedimiento inmunolgico, esta reaccin nos permite revelar la


presencia de anticuerpos no aglutinantes en la membrana eritrocitaria.

Como se puede observar ms abajo en el grfico, la capacidad de aglutinacin de


los anticuerpos de la clase IgG ligados a la AGH es similar al de los de clase IgM
que son naturalmente aglutinantes.

Decimos procedimiento inmunolgico, porque los sueros de Coombs son


compuestos de anticuerpos contra anticuerpos humanos. Son producidos por la
inyeccin de cadenas leves y pesadas de IgGs humanas en animales (conejos u
ovejas), que producen anticuerpos contra las fracciones Fc de las
inmunoglobulinas humanas.

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Los sueros de Coombs pueden ser poliespecficos o monoespecficos. Los


llamados poliespecficos contienen, adems de los anticuerpos contra fracciones
Fc de las inmunoglobulinas humanas, anticuerpos contra la fraccin C3d del
Complemento que puede estar presente sensibilizando la membrana
eritrocitaria, en la presencia o ausencia de anticuerpos fijados. Los sueros
monoespecficos contienen anticuerpos contra solamente un tipo de
inmunoglobulina (IgG, IgM o IgA) o contra fracciones del Complemento (C3c o
C3d).

La prueba de Coombs puede ser realizada de dos maneras: Coombs directo e


indirecto.

Por la prueba de Coombs directo (PCD), demostramos glbulos rojos


sensibilizados in vivo por anticuerpos y/o fracciones del complemento. Se usa en
el diagnstico de la Enfermedad Hemoltica del Recin-Nacido (EHRN), de la
Anemia Hemoltica Auto-Inmune (AHAI), de la hemlisis inducida por drogas y en
el diagnstico de las reacciones hemolticas pos transfusionales.

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La prueba de Coombs indirecto (PCI) representa la reaccin clave y de ms


grandes posibilidades en inmunohematologa y nos permite ejecutar una serie
de pruebas como investigacin y identificacin de anticuerpos antieritrocitarios,
pruebas de compatibilidad pre-transfusionales (prueba cruzada) y determinacin
de antgenos eritrocitarios que no pueden ser evidenciados por aglutinacin
directa (ejemplos: variantes dbiles de RhD, antgenos Duffy, Kidd, Kell, etc).

La sensibilidad de la prueba de Coombs indirecto (PCI) puede ser aumentada por


procedimientos que cambian la primera etapa de la reaccin, o sea, de la fijacin
de los anticuerpos durante la incubacin. Los ms utilizados son: adicin de
albmina al 22% (BSA) o polietilenoglicol (PEG) al medio, uso de medios de baja
fuerza inica (LISS) y la utilizacin de glbulos rojos ya tratados por enzimas
proteolticas.

La adicin de albmina o polietilenoglicol (PEG) aumenta la constante dielctrica


(D) del medio de suspensin y baja el valor del potencial zeta (Z), favoreciendo la
aglutinacin de los glbulos rojos. Favorece tambin, la fijacin inicial de los
anticuerpos a la membrana eritrocitaria por la disipacin de iones positivos cerca
de la membrana, sin embargo este procedimiento es menos eficaz que la
disminucin de la fuerza inica del medio.

El uso de un medio isotnico de baja fuerza inica (LISS), en la etapa de


sensibilizacin de los glbulos rojos, aumenta considerablemente la velocidad de
fijacin y la cantidad de anticuerpos fijados sobre la membrana eritrocitaria. Este
hecho nos permite aumentar la sensibilidad y disminuir el tiempo de incubacin
de la prueba.

El uso de glbulos rojos pre-tratados con enzimas proteolticas (tripsina o


papana) en prueba de Coombs indirecto (PCI), es un procedimiento indicado
para mejorar la deteccin de auto y aloanticuerpos como el anti-Rhessus y antiKidd.

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7. Soluciones potenciadoras de la unin antgeno-anticuerpo

Los potenciadores son las substancias que se utilizan para modificar el medio de
la prueba para promover la aglutinacin de hemates antgeno-positivos con los
anticuerpos correspondientes. Con esta finalidad se han desarrollado
potenciadores para la deteccin de anticuerpos irregulares en les pruebas de
rutina. Entre estas substancias potenciadoras, la albmina bovina, las soluciones
de baja fuerza inica y el polietilen glicol PEG), son las ms utilizadas.

Albmina bovina:

El uso de la albmina bovina se introdujo en 1945 y se utiliza para


potenciar la aglutinacin directa de los hemates por anticuerpos de la
clase IgG.
El 1965, Pollack y sus colaboradores investigaron el mecanismo de
accin de la albmina y concluyeron que reduca el potencial zeta y as
permita que los hemates se aproximasen los unos con los otros y as se
produjera la aglutinacin.
Posteriormente se demostr que el efecto de la albmina por s misma
en la primera fase de la reaccin es mnimo y que el aumento de la
captacin del anticuerpo puede ser debido a la fuerza inica del
diluyente de la albmina.

Soluciones de baja fuerza inica:

El uso de soluciones de baja fuerza inica para incrementar la captacin


de anticuerpo en la prueba de antiglobulina indirecta fue ser descrito en
1964 per Hughes-Jones y Elliot y colaboradores.
Existen dos clases de soluciones de baja fuerza inica: el LISS simple o
tradicional y el LISS al que se han aadido macromolculas para
potenciar

la

aglutinacin

directa

por

algunos

anticuerpos,

principalmente los del sistema Rh.


Les soluciones de baja fuerza inica aumentan la velocidad de asociacin
entre los anticuerpos y los antgenos correspondientes y as se puede
reducir el tiempo de incubacin necesario para detectar la mayora de
anticuerpos.

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Polietilen glicol (PEG):

El uso de polietilen glicol (PEG) como

potenciador de la reaccin

antgeno-anticuerpo se describi en 1985 por Nance y Garraty.


PEG es un polmero linear de etilen glicol que afecta la primera fase de la
aglutinacin. Provoca que los hemates y los anticuerpos se aproximen y
as se incrementa la velocidad y la cantidad de la captacin de
anticuerpo.
El uso de PEG incrementa la sensibilidad de las pruebas de deteccin de
anticuerpos irregulares clnicamente significativos mediante la prueba
de la antiglobulina indirecta.

Enzimas:

En 1946 Pickles describi por primera vez el uso de las enzimas. Algunas
enzimas proteolticas como la ficina, la papana, la tripsina y la bromelina
se utilizan para la potenciacin de reacciones serolgicas, sobre todo la
de los anticuerpos de los sistemas Rh y Kidd.
Pero hay algunas desventajas en el uso de las enzimas en les pruebas de
laboratorio. Los antgenos M, N, S, Fya y Fyb son destruidos si estn
tratados con enzimas, por lo tanto estos anticuerpos no podrn ser
detectados. Adems las enzimas potencian anticuerpos fros y eso hace
que algunos anticuerpos no significativos se puedan detectar y eso
interferira en las pruebas de laboratorio.

No existe un reactivo perfecto para la potenciacin de todos los anticuerpos de


importancia clnica. Cada uno de estos potenciadores tiene sus aplicaciones as
como sus limitaciones. La seleccin del medio de potenciacin depende de la
experiencia del personal y de su preferencia.

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