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Universidad Nacional Agraria la Molina

Laboratorio de Microbiologa
01/06/15

1. Introduccin
En la naturaleza, diversos tipos de microorganismos comparten su hbitat con
gran variedad de otras especies; sin embargo, para su estudio se hace
necesario que cada especie pueda ser obtenida en forma aislada, lo que se
conoce como un cultivo puro o axnico. Por ejemplo en muestras clnicas
usualmente las bacterias patgenas se encuentran junto con las de la flora
indgena, por lo que es necesario aislar las primeras; adems, en muchos
procesos industriales es necesario recuperar solo el agente de inters, dentro
de una flora mixta (Rodrguez, 2005). Por estas y otras razones es que se
aplicarn tcnicas de aislamiento que involucran procesos de varias
transferencias y la utilizacin de medios tanto comunes como especiales,
mayormente slidos, seleccionados en funcin a la naturaleza del
microorganismo. El uso de medios de cultivo adecuados debe dar como
resultado el rpido crecimiento de microorganismos viables que, directamente
o mediante posteriores resiembras formarn colonias aisladas disponibles para
su estudio. (Garca, 1994). Adems se deber otorgarle las condiciones
adecuadas para que se desarrollen ptimamente.
Existen dos mtodos de aislamiento tradicionalmente empleados, el primero se
realiza por estras, que consiste en diseminar los microorganismos en la
superficie de un medio slido dispuesto en placa Petri; si el inculo inicial se
encuentra slido o en polvo, es recomendable llevarlo a suspensin. Esta
tcnica requiere entrenamiento constante para obtener una determinada
cantidad de colonias separadas por placa.
La otra tcnica de aislamiento viene a ser la de diluciones sucesivas, que
consiste en hacer diluciones seriadas de la muestra o del inculo inicial y
disponer estas soluciones en placas Petri con medio. Las colonias de varios
microorganismos difieren morfolgicamente, por ello su apariencia en cultivo
es importante para propsitos de identificacin. Si el procedimiento se realiza
con un asa calibrada o con una pipeta que permita medir el volumen que se
traspasa a cada tubo, es posible llegar a determinar el nmero de unidades
formadoras de colonias (UFC) que haba en el cultivo original. (Rodrguez,
2005)
Por otra parte, si se tiene aislado un microorganismo y se quiere mantenerlo en
estado activo deben utilizarse tcnicas de trasplante que son transferencias
constantes de un microorganismo que se asume puro, ya que de lo contrario
podra verse afectado su crecimiento debido a competitividad, antagonismo,
sinergismo, etc., desde un medio carente de nutrientes hacia un medio fresco
(Garca, 1994). Esta tcnica usualmente se realiza en medios lquidos o slidos,
siendo la prctica ms comn de conservacin de cepas, el realizar estras en
tubos de agar inclinado.

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Los objetivos de la presenta prctica son: observar las caractersticas de
crecimiento de los microorganismos al transplante en medios de cultivo lquido
y slido, as como separa colonias individuales a partir de una mezcla de
microorganismos utilizando tcnicas de aislamiento.

2. Resumen de la metodologa
2.1 Cultivo en tubos
A continuacin se mostrar los pasos a seguir para los cultivos de
microorganismo en tubos de ensayo con diferentes medios:

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2.2Tcnicas de aislamiento
2.2.1 Aislamiento por estras

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2.2.2Aislamiento por diluciones

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Bacterias Crecimiento en
Crecimiento en
caldo de cultivo agar vertical por
picadura
profunda
Staphylococus
Turbio
En superficie y
aureus
limitado a la
lnea de
inoculacin
Bacillus cereus
Turbio
Fuera de la lnea
de inoculacin
Escherichia coli

Crecimiento en
estras sobre
agar inclinado
Granulado

Equinulado

Resultados
1. Cultivo en tubos
Tabla I

Bacterias

Caldo de cultivo

Agar vertical

Staphylococ
cus aureus

Agar inclinado

3.

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Bacillus
cereus

Escherichia
coli

a. Staphylococcus aureus
Los resultados obtenidos tras la siembra fueron turbio en caldo de
cultivo, limitado a la lnea de inoculacin y en superficie, en agar vertical
y granulado, en agar inclinado; lo cual est relacionado con sus
requerimientos de oxgeno y tambin con la movilidad que presenta. Con
respecto a su relacin con el oxgeno son aerobios y anaerobios
facultativos (Prieto y Gomez-Lus, 1996), lo que indica que pueden crecer
tanto en presencia como en ausencia de oxgeno por lo que el
crecimiento en agar vertical se manifest en la lnea de inoculacin (alta
concentracin de O2) y en la superficie ya que al introducir la Aguja de
Kolle la mayor parte del inoculo quedo adherido en el extremo superior.
Se sabe que Staphylococcus aureus no presenta movilidad porque
carece de flagelos y por ello no aparece fuera de la picadura o en
profundidad.
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El crecimiento en agar inclinado involucra caractersticas de ambos tipos
(anaerobios facultativos y no mviles); ya que dicho crecimiento fue a
los largo de la lnea de siembra y sin ramificaciones, lo que indica que
crece en superficies arobicas (el agar al encontrarse inclinado presenta
mayor superficie con oxgeno) y no ramificado pues es una bacteria no
mvil.
b. Bacillus cereus
Los resultados obtenidos tras la siembra fueron turbio en caldo de
cultivo, fuera de la lnea de inoculacin, en agar vertical y equinulado, en
agar inclinado.
En relacin a sus requerimientos de oxgeno Bacillus cereus es una
bacteria ubiquitaria, de metabolismo aerbico facultativo, por lo que el
crecimiento en caldo nutritivo ser del tipo turbio ya que no necesitan
cantidades altas de oxgeno para su crecimiento. En cuanto al agar
vertical, se observ el crecimiento fuera de la lnea de inoculacin, lo
cual indica que se trata de una bacteria con motilidad, pues presenta
flagelos distribuidos en toda la superficie celular (Manzo, 2005).
El crecimiento en agar inclinado incluye las caractersticas de motilidad y
requerimiento de oxgeno. Se observ que el crecimiento fue equinulado,
lo cual indica que puede crecer en superficies aerbicas y son mviles,
pues presenta un borde espinoso a los lados de la lnea de siembra.
c. Escherichia coli

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2. Aislamiento y recuento en placas:


A. Aislamiento por estras

Debido a que el Agar Manitol-Salado es


un
medio
de
cultivo
selectivo
diferencial, se observ el crecimiento
de Staphilococcus aureus, despus de
48 horas de incubacin.
Las colonias tenan una coloracin halo
amarillo cremoso de forma circular,
con bordes uniformes; ligeramente
elevadas.
Discusin:
Se pudo realizar una buena
distribucin de las bacterias con el
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Ya que el Agar Mac-Conkey es un medio


de cultivo selectivo diferencial, se
observ el crecimiento de Escherichia
coli despus de 48 horas de incubacin.
Las colonias tenan una coloracin roja
de forma circular convexa, con bordes
redondeados, lactosa positiva lo que les
da coloracin rosada y sobresaliente.
Discusin:
Se realiz el aislamiento E.coli
logrndose ver colonias
de una
manera
muy
disgregada
poco
repartida; por otro lado, se puede
apreciar las colonias medianas. Por
otro lado, se hubiese mejorado la
muestra si se hubiese manipulado
el asa de kolle de una manera
correcta el barrido de la muestra
no tuvo suficiente uniformidad; sin
embargo, este cultivo no creci por
falta de tiempo ya que la American
Heath
Association
(A.P.H.A.)
recomienda incubar durante 3 das
y 32C en aerobiosis.

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asa de kolle, logrndose apreciar
las colonias que crecen en un
medio
salino
con
un
alto
concentracin de Cloruro de Sodio.
Cuando hay produccin de cido
se
fermenta
el
manitol
produciendo colonias con un halo
amarillo, con lo que se modifica el
pH del medio y vira el indicador de
pH del color rojo pH (8.4) al
amarillo
pH
(6.8)
(Chapman,
1945).

B. Aislamiento por diluciones

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Una vez realizada la primera dilucin
cualitativa se realizo una segunda
mezcla con el asa de kolle al segundo
Agar fundido para luego verter en la
placa Petri que tambin se incubo por 48
horas a 37C. Los resultados finales
fueron igual que el primero, se observo
bacterias pero no colonias.
Discusin:
No se obtuvo la formacin de
colonias bacterianas nuevamente.
El problema es de realizarse al
inicio de la extraccin de la pelcula
en la asa de kolle muy poca
cantidad de bacterias para que
luego puedan proliferar en un
medio nutritivo.

Se realizo la primera dilucin cualitativa


del caldo cuyo contenido es la mezcla de
microorganismos que se incubo en la
primera placa Petri por 48 horas a 37C.
Pero no se pudo identificar la colonia,
mas su aparicin de bacterias.
Discusin:
Para no mostrar ninguna colonia
debe haber surgido un problema con
la temperatura del horno, ya que es
un factor muy importante en el
crecimiento de la colonia. Por otro
lado, inicialmente la temperatura
del Agar no fue la ms adecuada, ya
que se debi enfriar y mantenerlo a
50C.

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CONCLUSIONES:

Se aprendi a reconocer las distintas colonias que se formaron


normalmente por bacterias que crecen en Agar Mac-Conkey. Tambin se
pudo identificar su forma circular convexa, color rosada sobresaliente,
borde redondeado. As mismo, tambin se apreci la formacin de
colonias en el Agar Manitol-Salado, mostrando la forma de circular
uniforme, con un halo amarillo cremoso y ligeramente elevado.
No se logr apreciar las colonias en el aislamiento por diluciones, ya que
surgi factores que hayan influenciado en su crecimiento de la colonia.

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Reseas bibliogrficas
-

Prieto J y Gomez-Lus ML. 1996. Gnero Staphylococcus. Microbiologa


Mdica. Garca-Rodriguez, Picazo. Pg 179-191. Ed Doyma
Agencia Catalana de Seguridad Alimentaria (acsabrief). 2011. Riesgos
emergentes. Bacilluscereus
Manzo, Anabelle. 2005. Bacilluscereus: peligro bajo el tenedor. Digital
universitaria. 6(4):2-4.
American Society for Microbiology; [Internet]; [Consultado 2014 feb 09];
Disponible
en:
http://www.microbelibrary.org/component/resource/laboratory-test/2871eosin-methylene-blue
Chapman, G.H. 1945. El significado de cloruro de sodio en studios de
Staphilococcus. J. Bacteriana. 50: 201:20

-Rodrguez, E. 2005. Bacteriologa general: principios y prcticas


de laboratorio. Editorial Universidad de Costa Rica. pg. 101-107.
Garca, P. Paredes, F. Fernndez, M. 1994. Microbiologa clnica
prctica. Servicio publicaciones UCA. Pg. 73-81

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