UNIVERSIDAD DE SAN CARLOS DE GUATEMALA USACSegundo Ao.

Unidad Didctica: Bioqumica Mdica

Docente: Dra. Joisy Noemy Alvarado de Guay
Fecha de entrega: 26 de febrero 2015

Reporte practica de laboratorio Fotometra

INTRODUCCION
Un espectrofotmetro es un aparato electrnico que se utiliza para medir las proporciones
de luz de diferentes longitudes de onda, que son absorbidas y trasmitidas por una
solucin usualmente coloreada.
El fotmetro puede mostrar dos dimensiones transmitancia y absorbancia.
Una escala de transmitancia (expresada en porcentaje), en la cual se expresa la cantidad
de energa que logr atravesar el medio absorbente de la cubeta ptica y llegar hasta la
foto celda. Y una escala de absorbancia que expresa el logaritmo de (100 / %T), en la cual
se expresa la cantidad de energa que qued absorbida en las molculas del medio
absorbente, sin lograr atravesarlo.
La mayora de los compuestos biolgicos, tales como las protenas, las grasas, los
carbohidratos y los cidos nucleicos, absorben energa en alguna parte de las regiones
ultravioleta, luz visible e infrarroja.
Cuando el rayo de luz llega a la cubeta ptica lleva el 100% de su energa. A medida que
penetra en la sustancia, las molculas presentes gradualmente absorbern cada vez ms
energa por lo que la intensidad de la energa del rayo luminoso progresivamente ir
perdiendo su potencia, en funcin de tres variables:
a) El grado de concentracin de solutos en la sustancia.
b) La longitud del medio absorbente o sea la distancia que el rayo debe recorrer.
c) La longitud de onda (o color) del rayo que se est usando.
Las relaciones anteriores se expresan en las Leyes de Beer y Lambert de la manera
siguiente:
LEY DE BEER:Cuando un rayo de luz monocromtica pasa a travs de un medio
absorbente, su intensidad disminuye exponencialmente a medida que la concentracin del
medio absorbente aumenta.
LEY DE LAMBERT:Cuando un rayo de luz monocromtica pasa a travs de un medio
absorbente, su intensidad disminuye exponencialmente a medida que la longitud del
medio absorbente aumenta.
Cuando se desea determinar la concentracin de un compuesto en una solucin mediante
el uso de un espectrofotmetro, en casi todas las Tcnicas de laboratorio debe
procederse a la preparacin de tres tubos: Un tubo blanco, un tubo estndar, y un tubo
muestra.

OBJETIVOS

Conocer el funcionamiento correcto del espectrofotmetro y para que se utiliza.

Investigar la importancia que la fotometra en la medicina y cuando se debe de

utilizar.

ESPECTROFOTOMETRA

Un espectrofotmetro es un aparato electrnico que se utiliza para medir las

proporciones de luz de diferentes longitudes de onda, que son absorbidas y trasmitidas
por una solucin usualmente coloreada.
La luz del sol es una forma de energa conocida como energa electromagntica, tambin
llamada RADIACIN que viaja en ondas rtmicas. La distancia entre las crestas de las
ondas electromagnticas se conoce con el nombre de longitud de onda, se representa por
una letra griega llamada lambda y su dimensional se expresa en nanmetros (1 nm = 109 m).
La radiacin nos proporciona un espectro electromagntico que posee longitudes de onda
que van desde 10-5 nm hasta un poco ms de 1,000 m. Este espectro electromagntico
est constituido por los rayos gamma, los rayos X, la energa ultravioleta, la luz visible, la
energa infrarroja, las microondas y las ondas de radio. Los rayos gamma poseen las
longitudes de onda ms cortas (10-5 a 10-3 nm), luego los rayos X (10-3 a 1 nm) y
despus la energa ultravioleta (1 nm a 400 nm).
La luz visible es el segmento de energa ms importante para la vida y posee una banda
estrecha de longitudes de onda que van desde los 400 nm a los 700 nm. Esta radiacin
es conocida como la luz visible porque el ojo humano puede detectarla en la forma de
diversos colores. En el espectro de luz visible el color violeta corresponde al extremo de
longitud de onda ms corta y el color rojo corresponde al extremo de longitud de onda
ms larga.
Los rayos Infrarrojos poseen longitudes de onda que van desde los 700 nm a los 106 nm,
la banda de microondas va de 106 nm a 1 m y finalmente las ondas de radio van desde 1
m hasta un poco ms de 1000 m
Los espectrofotmetros que utilizaremos proporcionan longitudes de onda que van de los
325 a los 1100 nm. Poseen lmpara incandescente de tungsteno-halgeno como fuente
de emisiones.
Por qu tenemos que cambiar el color de la luz al usar el fotmetro?
Debemos recordar algunos aspectos fundamentales de fsica de la luz y el color:
La energa del sol y la de una bombilla encendida incluye al total de la energa luminosa.
Si un rayo de esa luz pasa por un prisma, se descompone: es el origen del arco iris.

Cuando la energa incide en un objeto que no absorbe energa luminosa, lo vemos de

color blanco porque refleja toda la energa: El blanco es la suma de todos los colores.

En contraste, a un objeto que absorbe la totalidad de la energa luminosa, lo vemos negro

(no refleja nada de la energa luminosa) y se recalienta muy rpido: el negro es la
ausencia de color. En este momento recuerde el experimento del disco de Newton:
coloreado con los colores primarios y secundarios: AL GIRAR A ALTA VELOCIDAD SE VE
BLANCO porque rene a todos los colores del espectro luminoso.
Los objetos coloreados absorben una parte del espectro luminoso y reflejan lo dems. Lo
que perciben nuestros ojos es la energa que es reflejada. Para poder saber qu energa
fue absorbida debemos recordar la definicin del color complementario:
El color complementario de un color primario es un color secundario (y viceversa),
siempre que juntos den como resultado la combinacin de los 3 colores primarios.
Ejemplos: Para el color primario ROJO, el complementario es el secundario VERDE que
incluye los dos primarios amarillo + azul. Para el secundario VIOLETA (que ya incluye a 2
primarios, rojo + azul), el complementario es el primario AMARILLO.

DESCRIPCIN DEL FUNCIONAMIENTO DEL FOTMETRO:

La luz blanca que emite la lmpara, se hace pasar a travs de un prisma, el cual
descompone la luz, separndola en sus colores constituyentes (segn su longitud de
onda), formando un abanico de colores, como en los experimentos de fsica de la luz. El
espectrofotmetro tiene un mecanismo que modifica la posicin del prisma de acuerdo a
la cifra de longitud de onda que se programa. Para cada cifra programada corresponde
diferente color. El rayo de luz es dirigido hacia una rejilla metlica (monocromador), por la
cual podr pasar la luz del color que en ese momento se haya escogido.
Simultneamente, cuando cambia el color, aparece en la ventana de lectura la longitud de
onda del color que estamos usando.
Despus de la rejilla, est el espacio donde se colocan los tubos de ensayo con las
sustancias que se estn estudiando. El tubo de ensayo (denominado en estos casos

cubeta ptica) recibe un rayo de luz monocromtica que posee una determinada longitud
de onda, en funcin de su color (*Io = luz incidente), con 100% de intensidad.
El contenido de la cubeta ptica (que tendr solvente y soluto) podr absorber alguna
parte de la energa de ese rayo luminoso a su paso a travs de la misma, y la luz que
logre atravesar la solucin (**I = luz emergente), llevar una intensidad menor. Este rayo
ms dbil seguir su curso hasta chocar contra un dispositivo (foto celda o tubo
fotoelctrico) sensible a la cantidad de energa que logra pasar, convirtindola en
electricidad y trasladndola, por medio de un galvanmetro, a una pantalla, donde
aparece la cifra que demuestra la cantidad de energa que logr llegar a la foto celda. Si el
rayo luminoso no hubiera encontrado ningn obstculo en su camino, impactara la foto
celda con toda su potencia y la pantalla mostrara su energa en el 100%. En la figura
anterior se ejemplifica el caso de una sustancia que absorbe la mitad de la energa del
rayo luminoso: en la pantalla veramos la cifra correspondiente al 50%.

TRANSMITANCIA Y ABSORBANCIA:
En la pantalla se pueden mostrar dos dimensionales: Una escala de TRANSMITANCIA
(expresada en porcentaje), en la cual se expresa la cantidad de energa que logr
atravesar el medio absorbente de la cubeta ptica y llegar hasta la foto celda. Y una
escala de ABSORBANCIA que expresa el logaritmo de (100 / %T), en la cual se expresa
la cantidad de energa que qued absorbida en las molculas del medio absorbente, sin
lograr atravesarlo.
Son escalas inversas y si estuvieran expresadas en la misma dimensional nos mostraran
que, por ejemplo, una sustancia que absorba el 30 % de la energa del rayo, mostrara en
la pantalla 70 % de transmitancia y 30 % de absorbancia. El concepto se aplica de la
misma forma y por esa razn una sustancia que logre absorber el 50% de la energa del
rayo luminoso nos dar una transmitancia del 50% y una absorbancia de 0.3, el logaritmo
correspondiente a (100 / 50% T) absorbido. Como norma general usaremos la escala de
Absorbancia, porque las cifras obtenidas en logaritmos pueden graficarse en mejor forma
cuando el procedimiento de fotometra es utilizado en estudios de investigacin mdica.

PROCEDIMIENTO:
1. Rotulamos los tubos de ensayo con B (blanco), E (estndar) y M (muestra).

2. Se prepar el blanco (B) con 3ml de agua destilada (slo esta vez se utiliz
agua).

3. Se prepar anticipadamente el estndar (E) con 3ml de la preparacin de azul

de bromofenol constituida por una solucin de 20mg de azul de bromofenol en
100ml de agua destilada, elaborado por el personal del laboratorio.
4. Identificamos las diferentes partes del Espectrofotmetro y aprendimos a utilizarlo
eficientemente. Usaremos un ESPECTROFOTOMETRO GENESYS TM 20 y
podremos ejecutar mediciones de absorbancia y transmitancia, as como clculos
de concentraciones usando un estndar conocido o un factor de conversin.
5. Se tom en cuenta:
a. Encender el aparato hasta que falten entre 5 a 10 minutos para hacer las
lecturas fotomtricas para lograr que la sobrevida de la lmpara especial del
aparato (que viene especificada para llegar aproximadamente a 1000 horas),
pueda prolongarse.
b. asegurarnos de cerrar la tapa del compartimiento de muestras antes de hacer
sus anotaciones de lecturas de absorbancia, porque si llega luz ambiental a la
fotocelda, hay interferencias que alteran las lecturas.
c. En no ponga objetos alrededor del aparato, que pudieran bloquear las entradas
de ventilacin.
d. Nos asegrese de alinear las superficies de lectura de los tubos de ensayo
pticos en forma perpendicular a la fuente de luz, para evitar sesgos en el
aprovechamiento de la energa luminosa.
6. Se hizo clculos de Concentracin con la misma frmula.
7. Ajustamos la longitud de onda para encontrar el espectro de absorcin.
8. Ajustamos la absorbancia en cero con el blanco, preparado esta vez slo con
agua, esto con objetivo de calibrar nuestro aparato.

9. Determinamos la absorbancia del tubo estndar.

GRAFICA DE ESPECTRO DE ABSORCION TUBO ESTANDAR

Ab 1.5
Ab 1.4
Ab 1.3
Ab 1.2
Ab 1.1
Ab 1
Ab 0.9
Ab 0.8
Ab 0.7
Ab 0.6
Ab 0.5
Ab 0.4
Ab 0.3
Ab 0.2
Ab 0.1

E,
ESTANDAR.

0.15

0.1

0.06

0.11

0.25

0.46

0.59

0.65

0.22

0.02

GRAFICA DE ESPECTRO DE ABSORCION TUBO MUESTRA

0.15

0.1

0.06

0.11

0.25

0.46

0.59

0.65

0.22

0.02

Ab 1.5
Ab 1.4
Ab 1.3
Ab 1.2
Ab 1.1
Ab 1
Ab 0.9
Ab 0.8
Ab 0.7
Ab 0.6
Ab 0.5
Ab 0.4
Ab 0.3
Ab 0.2
Ab 0.1

M MUESTRA.

CONCLUSIONES

La espectrofotometra es un instrumento de anlisis ptico que nos permite comparar la

radiacin absorbida o transmitida por una solucin que tiene una cantidad desconocida de
soluto y una que contiene una cantidad conocida de la misma sustancia. Puesto que toda
sustancia puede absorber energa radiante.
Los espectrofotmetros son tiles debido a la relacin de la intensidad de color en una
muestra y su relacin a la cantidad de soluto dentro de la muestra.
Esta tcnica es muy sensible y precisa, por tal motivo es utilizada en laboratorios de todo
el mundo para analizar sustancias tales como el ADN, determinar la cantidad de
sustancias qumicas, analizar muestras biolgicas (ya que la luz utilizada no afecta a la
muestra) y en diversidad de estudios y anlisis dentro de la biotecnologa. Es muy
utilizada sobre todo en el desarrollo de nuevos medicamentos, para determinar
exactamente la cantidad de sustancia que hay en una muestra.