DETECCIN INTEGRADA DE BIOMARCADORES

SRICOS EN BOS
Antelo Ma,c, Cano Ja,b, Galera La, Gutirrez Ma, Mampel Ia, Mercuriali La,c, Nicolau AMa, Porcar
Sa,b, Roldn Ca.

RESUMEN
El Sndrome de Bronquiolitis obliterante (BOS) es la principal causa de disfuncin crnica del
injerto pulmonar. Para cuando se evidencia la clnica de BOS, las opciones teraputicas se ven
muy reducidas, por lo que existe la necesidad de detectar precozmente el proceso
fibroproliferativo causante de este sndrome.
Se han relacionado determinados biomarcadores sricos con el desarrollo de BOS, a pesar de que
ninguno de ellos ha resultado ser un buen marcador, debido al escaso nmero de pacientes
trasplantados que lo desarrollan. En la presente propuesta de proyecto, se plantea que la deteccin
integrada de cuatro de estos biomarcadores (KL-6, YKL-40, ET-1, anti K1-tubulina) permitir
prever la aparicin de BOS. Un estudio transversal a partir de una coleccin de muestras de
pacientes trasplantados constituira el primer paso para certificar la utilidad de estos marcadores.
Paralelamente, se ha considerado necesario el diseo de un dispositivo que permita la
monitorizacin domiciliaria del BOS, mediante la cuantificacin de los niveles sricos de estos
biomarcadores. Para ello, se propone el desarrollo y la verificacin de un nanosensor tipo dipstick
o test de lateral flow, el cual consiste en una herramienta econmica, fcilmente interpretable y
que requiere poca cantidad de muestra.

Palabras clave trasplante pulmonar, Bronquiolitis obliterante, biomarcadores, nanosensor

INTRODUCCIN
a Redactores, b Coordinadores, c Presentadores

Actualmente el trasplante de pulmn es la nica opcin teraputica en pacientes con enfermedad

pulmonar en fase terminal. Segn el registro International Society for Heart and Lung
Transplantation (ISHLT), la supervivencia media de los pacientes trasplantados de pulmn es de
5,5 aos, variando en funcin de la edad y enfermedad de base del receptor [1]. Adems, los
pacientes trasplantados de pulmn presentan las peores tasas de supervivencia de todos los
receptores de trasplante de rgano slido [2]. A largo plazo, la supervivencia tras el trasplante de
pulmn se ve fundamentalmente limitada por el desarrollo de disfuncin crnica del injerto
pulmonar (DCIP). La DCIP es la primera causa de muerte tras un ao de trasplante y es la
responsable de que solo un 75% sigan vivos despus de 10 aos de ser trasplantados.
Clsicamente, DCIP o rechazo crnico de pulmn se utilizaba como sinnimo de Sndrome de
Bronquiolitis Obliterante (BOS), ya que se consideraba la nica causa de rechazo crnico.
Actualmente, el trmico DCIP incluye tres fenotipos diferentes, Sndrome de Bronquiolitis
Obliterante (BOS), Sndrome Restrictivo del Injerto (RAS) y Bronquitis neutroflica reversible
del injerto, con la caracterstica que todos ellos conllevan un aumento del componente fibrtico.
La Bronquitis neutroflica reversible del injerto representa una minora entre la DCIP y responde
al tratamiento con azitromicina siendo, como su nombre indica, reversible. El RAS causa entre el
25-30% de las DCIP. En ste existe un aumento de tejido fibrtico en el parnquima pulmonar
dando un patrn restrictivo. Adems, es el fenotipo que presenta peor pronstico [3]. Por ltimo,
BOS sigue siendo la principal causa de disfuncin crnica del injerto, ya que, aproximadamente
el 50% de los receptores de trasplante de pulmn desarrollan BOS a los 5 aos y un 75 % a los
10 aos [4]. Adems, BOS se presenta como consecuencia de otras patologas como el sndrome
de Stevens-Johnson y como rechazo en el trasplante de precursores hematopoyticos [5]. As, por
la relevancia del Sndrome de Bronquiolitis Obliterante, el trabajo se centrar en este fenotipo en
concreto dejando de lado los mencionados anteriormente.
La Bronquiolitis Obliterante es un proceso fibroproliferativo que estrecha y finalmente destruye
los lmenes de las pequeas vas areas, lo que resulta en la obstruccin progresiva y, en gran
medida, irreversible del flujo areo. Clnicamente se pone de manifiesto por el BOS, una
disminucin progresiva del volumen espiratorio forzado en un segundo (FEV1). En estos
momentos se emplea FEV1 como principal parmetro clnico indicativo de la insuficiencia
respiratoria en pacientes con BOS.
Para cuando se detecta una disminucin de la FEV1, la mayora de los pacientes tienen una prdida
significativa e irreversible de la funcin pulmonar. Por tanto, detectarla precozmente ayudara a
mejorar la disfuncin crnica del injerto y, como consecuencia, la esperanza de vida de los
pacientes trasplantados [4].
OBJETIVOS DEL PROYECTO

Fundamentacin de la hiptesis de partida

La hiptesis de este proyecto es que es posible hacer una deteccin precoz de determinados
biomarcadores sricos que se expresan especficamente en etapas previas al desarrollo de BOS
mediante nanosensores basados en papel.
Se han descrito numerosos biomarcadores de fibrosis que se expresan especficamente en etapas
tempranas durante el desarrollo de BOS, antes de su manifestacin clnica. Estos marcadores se
encuentran principalmente en el lavado bronco-alveolar y el suero de los pacientes. Actualmente
los biomarcadores en suero no son usados en clnica pero su deteccin podra ser de gran utilidad.
Cuatro de estos biomarcadores en suero muestran diferencias estadsticamente significativas entre
pacientes que padecen BOS y pacientes que no: la protena Krebs von de Lungren (KL-6), la
endotelina-1, anticuerpos anti-K1-tubulina y la glicoprotena quitinasa YKL-40 [6-9].
Sera de gran utilidad el desarrollo de un mtodo sencillo y fcil que permita la deteccin conjunta
y la monitorizacin de los niveles de estos biomarcadores en sangre tras el trasplante. Este mtodo
es el biosensor a nanoescala.
El desarrollo y la aplicacin de biosensores a nanoescala es fruto de la sinergia entre la
nanotecnologa y diferentes disciplinas: la biologa, la qumica y la electrnica. Esta tecnologa
pretende reducir los inconvenientes de los sistemas de deteccin tradicionales ya que, por un lado,
requiere menos cantidad de muestra y, por otro, sta se puede obtener a partir del suero sanguneo,
lo cual supone una gran ventaja respecto a otros mtodos de deteccin ms invasivos. Tambin
permite una mejor monitorizacin, ya que se pueden recopilar los datos de manera sencilla,
incluso por el propio paciente, y enviarlos por internet para su anlisis. Finalmente, se trata de
una tecnologa con un precio muy econmico, que la hace ideal para nuestro estudio [10,11].
Nuestra propuesta consiste en el diseo de nanosensores capaces de detectar diferencias en
distintos biomarcadores respecto a un nivel de normalidad. Al ser stas indicativas de un posible
rechazo crnico del trasplante de pulmn mediado por BOS, podra detectarse la patologa antes
de que afecte a la funcionalidad del rgano y as, se podra tratar especficamente.
Cmo se ha validado nuestra hiptesis
El presente proyecto se plantea tras una tarea de investigacin bibliogrfica, a travs de la cual se
fundamenta.
Para determinar la pregunta de investigacin se procedi a una bsqueda bibliogrfica en Pubmed,
un motor de bsqueda de libre acceso a la base de datos MEDLINE de citaciones y resmenes de
artculos de investigacin biomdica, al cual se ha recurrido a lo largo de estos tres meses. A
travs de este portal se ha obtenido toda la informacin referente a los conocimientos actuales y
a los avances en materia de rechazo crnico de trasplante pulmonar y de la evolucin de los
dispositivos de nanodeteccin. La informacin obtenida fue filtrada con tal de acomodarse a
nuestra hiptesis de investigacin. Otra fuente que ha resultado especialmente til ha sido la web

de la Organizacin Nacional de Trasplantes, a travs de la cual se ha reforzado la relevancia de

nuestra pregunta de investigacin.
Finalmente, se ha contactado con personas expertas en el campo de la deteccin precoz de rechazo
crnico a travs de biomarcadores, la Dra. Susana Gmez Olls, del Laboratorio de Pneumologa
y el Dr. Antonio Roman Broto, jefe de la Unidad de trasplante pulmonar del Hospital Vall
d'Hebrn; as como con un miembro del grupo de investigacin en Nanobioelectrnica y
Biosensores del Institut Catal de Nanocincia i Nanotecnologia (ICN2), Alejandro Chamorro
Garca.
Objetivos concretos del proyecto
Nuestro proyecto consta de dos fases, cada una de las cuales consta de objetivos concretos. Se
encuentran detalladas en el cronograma inferior.

Fases

TRIMESTRES

Objetivos
1

10 11 12

Contactar con equipos de investigacin para

la obtencin de las muestras*
Validacin de la
combinacin de 4
biomarcadores
para la deteccin
de BOS

Adquisicin de los materiales necesarios para

realizar la tcnica ELISA
Anlisis mediante ELISA de las muestras
para la determinacin de concentracin de
biomarcadores
Anlisis estadstico
obtenidos

de

los

resultados

Elaboracin de presupuesto y obtencin de

materiales para el desarrollo del nanosensor*

Desarrollo
del
dispositivo
de Desarrollo de prototipos: Verificacin y
testeo de cada prototipo.
nanodeteccin
Produccin del nanosensor definitivo
Validacin de la utilidad del nanosensor desarrollado para la
monitorizacin de pacientes con trasplante pulmonar**

*Para la obtencin de muestras de suero de pacientes trasplantados de pulmn, se emplearn colecciones de

muestras ya existentes.
**Esta parte del estudio no se incluye dentro de nuestra propuesta de proyecto, dado que consistira en un ensayo
clnico amplio que pasara por distintas fases con tal de acomodarse a la reglamentacin y las recomendaciones
de la OMS [12] y de la Comunidad Europea [13] en materia de desarrollo y control de dispositivos mdicos de
diagnstico in vitro.

METODOLOGA Y PLAN DE TRABAJO

Biomarcadores

En este trabajo se han buscado, en la literatura cientfica actual, biomarcadores en suero de sujetos
trasplantados que se expresan especficamente en etapas previas a la aparicin de BOS con el
objetivo de detectar precozmente su desarrollo. Cuatro de estos biomarcadores en suero muestran
diferencias estadsticamente significativas entre pacientes que padecen BOS y pacientes que no:
- Kerbs von de Lungren 6 (KL-6) es una glicoprotena expresada por los neumocitos tipo II y el
epitelio bronquiolar. Sujetos que han desarrollado BOS presentan niveles de KL-6 ms elevados
en suero que los pacientes sin BOS (p<0,05). Se observan oscilaciones en los niveles de KL-6 en
el seguimiento de pacientes post-trasplante, coincidiendo el pico ms elevado con el momento del
diagnstico de BOS. Otro aspecto interesante de KL-6 es que se trata de un marcador especfico
de rechazo crnico, que no se encuentra elevado en rechazo agudo [6].
- La glicoprotena quitinasa YKL-40 es producida por macrfagos alveolares, neutrfilos y
clulas epiteliales, implicada en la respuesta inflamatoria y el remodelaje tisular. Los niveles de
YKL-40 en suero de pacientes antes de ser trasplantados se encuentran ms elevados que en
sujetos sanos (p<0,002), adems de encontrarse ms elevados en aquellos que con el tiempo
desarrollan BOS respecto los que no (p<0,001). Las concentraciones en suero de YKL-40 tanto
en el momento de diagnstico de BOS (p<0,02) como 3 meses despus del diagnstico (p<0,009)
son significativamente ms elevadas en los pacientes con BOS en comparacin con aquellos que
no desarrollan [7].
- Endotelina-1 (ET-1) es una citoquina expresada en el endotelio, msculo liso y epitelio
pulmonar y en los macrfagos alveolares. Los niveles sricos de ET-1 pretrasplante son
significativamente ms elevados en pacientes que posteriormente desarrollan BOS en
comparacin con los pacientes que no lo hacen (p=0,02); adems, los pacientes que llegan a
desarrollar BOS muestran un incremento persistente de ET-1 post-trasplante. Se debe remarcar
que existen ciertas limitaciones para el uso de ET-1 como biomarcador de BOS, ya que los niveles
sricos de ET-1 pretrasplante son significativamente ms elevados que post-trasplante en todos
los pacientes (p<0,001) y, asimismo, unos niveles altos de ET-1 estn correlacionados con el
rechazo pulmonar agudo [8].
- Los anticuerpos anti K1-tubulina son anticuerpos anti-clula epitelial que se forman de novo
en un 37% de los pacientes trasplantados y preceden a la aparicin clnica de BOS. Estos
anticuerpos se unen a clulas epiteliales de la va respiratoria y su interaccin produce un
incremento de la expresin de factores de crecimiento fibrognicos, la activacin del ciclo celular
y la fibroproliferacin [9].
Estudio transversal

A fin de valorar si los cuatro biomarcadores seleccionados permiten conjuntamente detectar la

presencia de BOS, convirtindose en un marcador til y vlido, se realizar el siguiente estudio
transversal, que constituye la primera parte de un estudio en tres fases.
Para optimizar el tiempo de bsqueda de pacientes y obtencin de la muestra se usarn
colecciones de muestras de pacientes trasplantados de pulmn, seleccionando un grupo que
presente BOS y otro libre de esta patologa, adems de un grupo de personas sanas no
trasplantadas, a modo de control. Para obtener la mxima potencia estadstica en nuestro estudio
piloto se seleccionaran todos los pacientes posibles, basndose en los registros disponibles. Se
debe tener en cuenta que el nmero de pacientes trasplantados de pulmn es limitado, por lo que
el tamao muestral ser pequeo, lo cual se convertir en uno de los principales inconvenientes
del estudio.
Una vez seleccionadas las muestras se analizar la presencia y concentracin de los cuatro
biomarcadores conjuntamente en suero, ponderada a partir de los resultados obtenidos. Para ello
se emplear un mtodo de deteccin comercial basado en la tcnica ELISA, ya que es el standard
de referencia que permitir detectar diferencias significativas entre ambos grupos (trasplantados
con BOS y trasplantados sin BOS). El anlisis estadstico de los resultados de la prueba ELISA
se har mediante la prueba t de Student, que comparar la media de ambos grupos para descartar
que las diferencias observadas entre ambas muestras se deban al azar.
Una vez concluido el estudio transversal se espera que los niveles de los cuatro biomarcadores
sean significativamente superiores en los pacientes con BOS, lo que permitira afirmar que
constituyen un buen biomarcador conjuntamente. En cambio no deber haber diferencias entre
los controles y los trasplantados sin BOS. Al finalizar esta primera fase del estudio se proceder
al diseo del nanosensor, que optimizar en gran medida la monitorizacin de los niveles de estos
biomarcadores en los pacientes trasplantados de pulmn, como se expondr a continuacin.
A pesar de no formar parte de nuestro proyecto, en una segunda y tercera fase de este estudio se
debera validar el nanosensor en una cohorte de pacientes trasplantados de pulmn, que requerir
un seguimiento superior a tres aos.

Desarrollo del nanosensor

En el presente trabajo, como ya se ha comentado previamente, se plantea la utilizacin de la
nanotecnologa para detectar la presencia de biomarcadores de rechazo crnico de pulmn en
sangre.
Entre los mltiples nanosensores en desarrollo, aquellos basados en papel poseen una serie de
caractersticas que los hacen muy atractivos: son econmicos, fcilmente interpretables y
requieren poca cantidad de muestra [14,15]. El sistema de tiras inmunocromatogrficas (IST,
conocidas como dipsticks o test de lateral flow) constituyen de entre estos el tipo de sensor que
ofrece mayor versatilidad y capacidad de cuantificacin. Y es, por tanto, el que se propone
desarrollar en este estudio [16,17].
El nanosensor consiste en una superficie de soporte de polister en la que se sitan los cuatro
componentes que constituyen el dispositivo (Anexo 1, figura A). La primera zona, la fibra de
celulosa, es donde se cargan 130l de muestra de sangre del paciente (el equivalente a cuatro
gotas). A continuacin se sita la plantilla donde estn los conjugados de anticuerpos primarios
unidos a nanopartculas de oro (Au-NPAb), capaces de unirse a los respectivos biomarcadores
cuando la muestra fluya por capilaridad y desplazarse a lo largo de la tira. En la zona de la
membrana de nitrocelulosa estn situados, a diferentes distancias, los distintos anticuerpos
secundarios [18], que al unirse el conjugado Au-NPAb-biomarcador concentran las partculas
de oro produciendo un cambio de coloracin rosceo que permite ser cuantificado mediante un
lector porttil (Anexo 1, figura B). Finalmente est la almohadilla de absorcin, que retiene el
resto del suero, ya sin biomarcadores (Anexo 1, figura A).
En este estudio, se propone situar entre la muestra de sangre y el dispositivo un filtro que permita
nicamente el paso del suero hacia la superficie de carga, evitando que los eritrocitos distorsionen
la medicin colorimtrica [19,20].
Para la construccin del nanosensor se emplearan los siguientes materiales: soportes de polister,
membranas de nitrocelulosa (AE 98), fibras de vidrio, y materiales absorbentes adquiribles en
Millipore Corp. (Bedford, MA). Ser necesario, adems, el lector de tiras DT1030 (Shanghai
Goldbio Tech. Co. Ltd)
Como reactivos se utilizarn los siguientes anticuerpos y sus respectivas protenas purificadas:
anti YKL-40, anti Kl-6, anti ET-1 que estn disponibles en el catlogo Millipore y anti K-1
tubulin disponible en el catlogo Sigma Aldrich.
Tambin sern utilizados otros reactivos menos especficos adjuntados junto con la preparacin
detallada de los conjugados Au-NP-Ab en el Anexo 2 [16].

BENEFICIOS DEL PROYECTO Y RESULTADOS ESPERADOS

La deteccin precoz del Sndrome de Bronquiolitis obliterante (BOS) y la monitorizacin de la
evolucin de la enfermedad para adaptar y personalizar el tratamiento puede retrasar los efectos
de dicho sndrome, alargar la vida til del injerto y mejorar la calidad de vida del paciente
trasplantado [21].
Los biomarcadores son una herramienta til en la deteccin de BOS, sin embargo, la mayor parte
de los biomarcadores para esta dolencia se detectan en lavado bronco-alveolar. En el proyecto se
opta por biomarcadores detectados en suero sanguneo ya que la obtencin de unas gotas de sangre
es menos invasiva que realizar un lavado bronco-alveolar al paciente. Asimismo, la deteccin en
sangre permite realizar un mayor nmero de ensayos con la finalidad de monitorizar la
enfermedad, lo que no parece viable mediante lavados bronco-alveolares a efectos de invasividad.
El anlisis simultneo de cuatro biomarcadores distintos para una misma afeccin es un enfoque
innovador en el intento de detectar precozmente BOS. Adems, al considerarlos conjuntamente,
aumenta la significancia de los resultados obtenidos individualmente para cada biomarcador.
El BOS no slo se da como complicacin en los trasplantes de pulmn sino que tambin aparece
en trasplantes de otro tipo de injertos como por ejemplo de progenitores hematopoyticos [21].
Como consecuencia de esto, cualquier hallazgo o avance que se produzca en el estudio podra
tener tambin aplicacin en el rechazo crnico de otro tipo de trasplantes.
Una posible limitacin del estudio es el tamao muestral excesivamente reducido, ya que se parte
de una coleccin de muestras existentes. Sin embargo, cabe la posibilidad de ampliar el estudio
y, por tanto, el nmero de muestras a nivel nacional o internacional.
Otra posible limitacin del proyecto es que an no se ha probado la eficacia de los nanosensores
en la deteccin de los biomarcadores seleccionados, as como, tampoco se han hallado
nanosensores diseados para los mismos. Validar un nuevo nanosensor implica una inversin de
tiempo incompatible con las limitaciones que se imponen en el presente proyecto. Para ello se ha
propuesto una tercera en la que se prueba la eficacia de esta tecnologa.
De este proyecto se espera poder detectar los primeros signos del rechazo crnico, ofrecer una
medicina personalizada mediante nanosensores y por tanto, mejorar el pronstico de los pacientes.
Siendo los nanosensores una herramienta que puede ser empleada en el domicilio sin necesidad
de dirigirse personalmente a un centro sanitario cabe esperar que aumentara la autonoma y la
calidad de vida de los pacientes trasplantados.

ANEXO 1

Fig A. Dispositivo dipstick compuesto por: zona de carga de la muestra (Sample Pad), zona de conjugados Au-Nps-Ab
(Conjugate Pad), membrana de nitrocelulosa (Nitrocellulose Membrane), almohadilla de absorcin (Absorbent Pad).
Fig B. Lector porttil de tiras y ejemplo de resultados de medicin [16]

ANEXO 2
Siguiendo este procedimiento se prepararn Au-NPs de un dimetro medio de 15 nm 3.5 nm:
Un matraz aforado con HAuCl4 (0.01%) en agua destilada se lleva a ebullicin y se aade citrato
trisdico (1%), producindose un cambio de color a rojo vino. Tras la reaccin se guarda en
botellas negras a 4C para preparar los conjugados.
Para ello se aade la cantidad deseada de anticuerpo primario a 1ml de la solucin Au-NP seguido
de una incubacin a temperatura ambiente. En este periodo se produce la unin de anticuerpo al
oro por interacciones inicas e hidrofbicas. Luego, se aade BSA al 10%, que se unir a aquellos
sitios no ocupados de la superficie de la partcula de oro evitando interacciones inespecficas. Las
partculas recubiertas de protena son muy estables y pueden guardarse durante meses.
La solucin se centrifuga dos veces 13,000 g y finalmente los conjugados se resuspenden en
1ml de buffer con fosfato de sodio, Tween-20, sacarosa y SA. Estos conjugados pueden ser
guardados a 4C durante ms de 1 mes sin prdida de actividad. Se puede determinar la unin
correcta mediante picos de absorcin a 520nm [16].

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