18/12/2014

BIOTECNOLOGA MODERNA
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Enzimas de restriccin
Ligasas
Plsmidos
Agrobacterium tumefasien

DESARROLLO Y CARACTERIZACIN DE UN OGM

Todo organismo cuyo material gentico fue modificado por medio
de la tecnologa de genes de una forma tal que no ocurre en la
naturaleza por multiplicacin y/o por recombinacin natural.
(Antunes, Guerrante, Pereira Junior, 2003)

M SC. LZARO NEZ CRDENAS

Uruguay Dic-2014

Conceptos bsicos relacionados a la Biotecnologa Moderna

Uruguay Dic-2014

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Desarrollo de un OGM

Uruguay Dic-2014

BIOTECNOLOGA MODERNA

DESARROLLO DE UN OVGM

Enzimas de restriccin
Ligasas
Plsmidos
Agrobacterium tumefasien

Todo organismo cuyo material gentico fue modificado por medio

de la tecnologa de genes de una forma tal que no ocurre en la
naturaleza por multiplicacin y/o por recombinacin natural.
(Antunes, Guerrante, Pereira Junior, 2003)

Mtodos de obtencin en
plantas
Agrobacterium
tumefaciens.
Transferencia por
polietilenglicol.
Microinyeccin.
Tecnologa de
electroporacin de clulas
intactas
Lanzagenes o biolistica.

PLANTAS

Mtodos de obtencin en
animales
Microinyeccin pronuclear de
ADN.
Manipulacin de clulas
embrionarias.
Clonacin somtica.
Transferencia de genes
mediada por espermatozoides
Vectores lentivirales

MICROORGANISMOS

ANIMALES

ARNm

ARNm

ARNm

PROTEINA/ENZIMAS

PROTEINA/ENZIMAS

PROTEINA/ENZIMAS

METABOLITOS

METABOLITOS

METABOLITOS
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Uruguay Dic-2014

Transferencia de genes mediada por

espermatozoides

Ejemplos de
Transgnesis en Animales

Seleccin del donante de semen.

Colecta del semen.
Lavado de los espermatozoides y
coincubacin con el ADN de inters.
Inseminacin artificial.

Promotor

ADNc del gen

X

PA

PA: Secuencia de corte y poliadenilacin

Uruguay Dic-2014

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Transferencia de genes mediada por

espermatozoides

Microinyeccin pronuclear de ADN

Limitaciones de la SMGT.

Consiste en la microinyeccin directa de ADN desnudo en el

proncleo masculino de un embrin fertilizado.

Se desconocen los eventos moleculares que

median la internalizacin del ADN en los
espermatozoides.

Si el material gentico se integra en uno de los cromosomas

embrionarios, el animal nacer con esta nueva informacin en cada
clula.

Es necesario evaluar un gran nmero de

sementales antes de encontrar uno con las
caractersticas adecuadas para el procedimiento.

El ADN forneo debe integrarse en el genoma antes de la duplicacin

del material gentico que precede al primer clivaje.
ADN unido a espermatozoides

Baja reproducibilidad.
Escepticismo.

Blastosistos
multitransgnicos
Webster NL, Lavitrano ML et al., (2005). Multi-transgenic pigs expressing three fluorescent proteins produced with high
efficiency by sperm mediated gene transfer. Mol Reprod Dev. 72:68-76

Microinyeccin pronuclear de ADN

Microinyeccin pronuclear de ADN

Construccin de un cassette de expresin para microinyeccin.

Pasos para la generacin de un ratn transgnico por

microinyeccin.
50 m

ADNc del gen X

Promotor

PA
Tratamiento hormonal para inducir la
maduracin de los folculos y la ovulacin.

ADN genmico del gen X

Promotor

PA

Colecta de los zigotos

Microinyeccin pronuclear del transgn

gen
X

Promotor

IRES

gen
Y

PA

Transferencia a hembra pseudogestada

Chequeo de la progenie para detectar las
cras transgnicas (PCR, Southern blot).

IRES: Internal ribosome entry

site
PA: Secuencia de corte y poliadenilacin

Cruzamiento de los transgnicos fundadores

para obtener una lnea homocigtica.

Microinyeccin Pronuclear de ADN

Aplicaciones

Limitaciones de la Microinyeccin Pronuclear

1.

Produccin de protenas recombinantes. (Cultivos Celulares)

Efecto de posicin:
Los transgenes se integran en zonas de la cromatina transcripcionalmente inactivas o silentes.
Los transgenes que se integran en secuencias codificantes nativas podran conducir a una discapacidad
o a la muerte del animal transgnico.

2.

Integracin de mltiples copias:

Antes de que ocurra la integracin, los casetes de expresin pueden formar concatmeros de forma tal
que mltiples copias del transgn se integran en una posicin nica del genoma.
Estos

concatmeros

inducen

silenciamiento

mediado

por

metilacin

de

las

citosinas

heterocromatinizacin.
3.

Eficiencia de integracin:
La eficiencia de integracin del transgen mediante MIP difiere significativamente entre las especies
[ratn (5%), conejo(5%), cerdo (2%), cabra y oveja (1%), vaca (-1%)].

Rollers

Wells K., Moore K., Wall R., (1999). Transgene vectors go retro. Nat. Biotech. 17: 25-26.

Fibra Hueca

Suspensin

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Aplicaciones

Aplicaciones
Produccin de protenas recombinantes.

Produccin de protenas recombinantes.

Empleo de animales como biofactoras para la produccin de

protenas recombinantes en fluidos corporales:

Sangre
Orina
Lquido seminal
Saliva
Leche

Fisiologa de la glndula
mamaria

Capacidad de sntesis: 2gr/leche por gr de tejido por da

Alta densidad celular: 2x108 clulas/gr de tejido (100 o
1000 ms alto que en cultivos celulares)
Produccin de leche 10-8 gr/clula/da

Animal

Drug/protein

Use

sheep

alpha1 anti trypsin

deficiency leads to emphysema

sheep

CFTR

treatment of cystic fibrosis

sheep

tissue plasminogen activator

treatment of thrombosis

sheep

factor VIII, IX

treatment of hemophilia

sheep

fibrinogen

treatment of wound healing

pig,

tissue plasminogen activator

treatment of thrombosis

pig

factor VIII, IX

treatment of hemophilia

goat

human protein C

treatment of thrombosis

goat

antithrombin 3

treatment of thrombosis

goat

glutamic acid decarboxylase

treatment of type 1 diabetes

goat

Pro542

treatment of HIV

cow

alpha-lactalbumin

anti-infection

cow

factor VIII

treatment of hemophilia

cow

fibrinogen

wound healing

cow

collagen I, collagen II

tissue repair, treatment of rheumatoid arthritis

cow

lactoferrin

treatment of GI tract infection, treatment of infectious arthritis

cow

human serum albumin

maintains blood volume

chicken, cow, goat

monoclonal antibodies

other vaccine production

Transgnesis en Plantas

Uruguay Dic-2014

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ESQUEMA COMPARATIVO DE OBTENCIN DE

PLANTAS TRANSGNICAS

EJEMPLOS DE MTODOS DE OBTENCIN DE PLANTAS

TRANSGNICAS
Biolgicos: Agrobacterium
tumefaciem o A. rhizogenes

Fsicos: Lanza genes o Biolstica

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Nuevas Tecnologas de
Obtencin de OGM

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CARACTERIZACIN MOLECULAR DE UN OVGM

CARACTERIZACIN MOLECULAR DE
UN OGM

Proceso que integra el trabajo de diferentes

especialistas:
Presentacin del expediente (Registro del producto)
Anlisis de laboratorio (Identificacin del OVGM)
Caracterizacin qumica estructural (aa, peso molecular, glicosilacin,
estructura, 3D)
Caracterizacin funcional.
Digestibilidad/estabilidad.
Ensayos fisiolgicos y toxicolgicos (animales, agudos, subcrnicos,
mutagenicidad, otros)
Alergenicidad e historial de uso.

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Uruguay 2014

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ANLISIS OVGM: CONCEPTOS

Uruguay 2014

CMO IDENTIFICAR UN OVGM?

Caracterizacin: elucidar la estructura molecular del evento

transgnico en el sitio de insercin.

Deteccin: confirmar la presencia de los elementos genticos

de un OGM respecto al T-ADN insertado. (promotor,
terminador).
Identificacin: confirmar la presencia de los elementos
genticos que son caractersticos de un evento transgnico
especifico y que permite determinar su presencia o no.
Cuantificacin : estimar el contenido del OGM.
Uruguay Dic-2014

MTODOS BASADOS
ADN
MODIFICADO

Qumicos
(cidos Grasos)
(Estructura de la fibra)
(HPLC/GC)
Protenas

La nueva protena expresada

puede ser detectada por mtodos
inmuno enzimticos

MTODOS BASADOS
EN LA PROTEINA
EXPRESADA

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Bio analticos

Preparacin muestra
/homogenizacin

ADN
(PCR)
Genotipo

Procesamiento

Ingrediente

Muestra anlisis/
muestra analtica

extraccin

Protena

extraccin

Producto final

Identificacin y
semicuantificacin
OGM
ELISA/STRIP

ADN

c) Cuantificacin OGM
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Procesamiento

Muestra laboratorio

a) Deteccin OGM
b) Identificacin OGM

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Procedimientos para la deteccin de un OVGM

Material crudo

(Ensayos inmunolgicos)

Fenotipo

Las diferencias genticas pueden

ser determinadas con el anlisis de
las secuencias del ADN
(si es conocida)

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Mtodos de anlisis

Biolgicos
(Toda la Planta)

La mayora de los OVGM

comercializados, presentan
idntica apariencia a su
contraparte tradicional

IDENTIFICACIN
FENOTIPO

ESTRATEGIA DE DETECCIN DE UN OVGM

(Ensayos inmunolgicos)

50

PCR cualitativo
PCR cuantitativo
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ANLISIS DE OVGM BASADO EN

ENSAYOS INMUNO ENZIMTICOS

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ANLISIS DE OGM BASADO EN PCR

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VENTAJAS Y DESVENTAJAS DE LOS MTODOS ADN& PROTENAS

OTRAS VAS DE CARACTERIZACIN DE

UN OGM

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Uruguay Dic-2014

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ANLISIS DE RIESGO=EVALUACIN
INOCUIDAD
1.
2.
3.
4.
5.
6.

MARCO DE LA EVALUACIN DE LA INOCUIDAD DE LOS ALIMENTOS

(045 DIRECTRICES CODEX ALIMENTARIUS)

A) Descripcin de la planta de ADN recombinante;

B) Descripcin de la planta base y de su utilizacin como
alimento;
C) Descripcin del organismo u organismos donantes;
D) Descripcin de la modificacin o modificaciones genticas;
E) Caracterizacin de la modificacin o modificaciones
genticas;

Efecto pleiotrpicos.
Metablicos.
Mutacionales.
Efectos y propiedades nueva(s) protena(s)
expresadas.
Composicin, valor nutricional.
Toxinas y anti-nutrientes naturales del alimento.

F) Evaluacin de la inocuidad:
a) sustancias expresadas (sustancias distintas de cidos nucleicos);
b) anlisis de los componentes esenciales;
c) evaluacin de los metabolitos;
d) elaboracin del alimento;
e) modificacin nutricional; y

Equivalencia Sustancial!
OECD (Organizacin para cooperacin econmica y el desarrollo 1993)

G) Otras consideraciones.
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Uruguay Dic-2014

Uruguay Dic-2014

ES(1993-2002-2013)

APLICACIONES DE LA ES.

1.

IDENTIDAD.

2.

LA FUENTE DE ORIGEN Y LA COMPOSICION DEL OGM.

3.

PROCESO DE TRANSFORMACIN.

4.

EL PRODUCTO DE LA EXPRESIN DEL NUEVO ADN.(alergenicidad

y toxicidad)

5.

POSIBLES EFECTOS SECUNDARIOS EXPRESIN GEN.(micronutrientes crticos anti-nutrientes, factores txicos endgenos,
alrgenos, etc.)

OECD/FAO/WHO, 2000,2002 OEM, EFSA 2012

1.

El alimento o ingrediente AGM es sustancialmente

equivalente al anlogo convencional, en cuanto a su
composicin qumica, aspectos agronmicos y
toxicolgicos.

2.

El alimento o ingrediente AGM es sustancialmente

equivalente al anlogo convencional, excepto por
algunas pocas diferencias definidas con claridad.

3.

El alimento o ingrediente AGM NO es sustancialmente

equivalente al anlogo convencional.

DONALDSON, MAY, 1999.

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Uruguay Dic-2014

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ANLISIS ES RESPECTO A EFECTOS DEL PROCESAMIENTO

EVALUACIN DE LA ES DE AGM

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ANLISIS TOXICOLGICO EN ANIMALES

ANLISIS DEL ADN INSERTADO

Gen de seleccin (0,1-1 g ADN/da vs 0,000001 g ADNr).(JONAS ET AL 2001;
EFSA 2004)

1. Genes de resistencia Kanamicina e Higromicina

2. Genes de resistencia a la Ampicilina (uso restringido a estudio de
campo experimentales y no plantas comercializadas).
3. No pueden estar presente en ninguna especie vegetal GM.
Procesamiento del ADN.(BETZ,FUCHS, 2000)

Ensayos de toxicologa aguda en animales, de las

nuevas protenas sin historia alimentaria.(Si procede)
Ensayos toxicologa subcrnica o crnica de las nuevas
protenas o del alimento completo.(Si Procede)
Estos estudios deben considerar:
- limitacin calrica del animal
- las consecuencias negativas de uso nico de un
producto/alimento (desequilibrios nutricionales y efectos
txicos por ingestin excesiva de un componente)

Transferencia de genes desde el alimento modificado hacia las

bacterias intestinales.(KUPFER ET AL, 1999)

65

66

11

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ESTUDIOS DE TOXICIDAD REALIZADOS A PROTENAS

EXPRESADAS EN AGM COMERCIALIZADOS

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ESTUDIOS TOXICOLGICOS REALIZADOS A OGM.

ENSAYOS CON ANIMALES

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Uruguay Dic-2014

Uruguay Dic-2014

Uruguay Dic-2014

EQUIVALENCIA NUTRICIONAL

EQUIVALENCIA NUTRICIONAL
Exmenes para la deteccin del gen insertado o la
protena expresada por este gen. (leche, carne, huevos)

Permite determinar la ocurrencia de problemas nutricionales cuando

el OGM es fuente crtica de nutrientes.
Est diseada a la demostracin de su equivalencia en Zootecnia.
Equivalencia al linaje parenteral.( Inocuidad)

OGM 3ra generacin se debe considerar la diferencia

de la composicin ( carotenoides, Vitaminas, cidos
grasos, etc) y su efecto en el procesamiento sobre el
tenor de nutrientes o biodisponibilidad.

(EINSPAINER et al., 2001).

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Uruguay Dic-2014

Uruguay Dic-2014

DESEMPEO DE ANIMALES ALIMENTADOS CON

CULTIVARES GM

ANLISIS TOXICOLGICO (ALERGENICICAD Y TOXICIDAD)

el 90 % alergias alimentarias: man, soya, leche, huevo, pescado,

crustceos, trigo, nueces (METCALFE et al.,1996).
Resistencia a la digestin, alta estabilidad trmica, homologa aa
antignicos, resistencia a la glicosilacin
Identificacin de alrgenos y toxinas conocidas en las especies
donantes y receptoras a travs de la homologa de secuencias
mediante el uso de bases de datos pblicas. Estudios bioinformtica
6-8 aa, homologa protenas alergnicas)
Similitud de los nuevos productos expresados con alrgenos
conocidos.
Ensayos inmunolgicos.
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ALERGENICIDAD.
(RBOL DE DECISIONES)

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BSQUEDA DE INFORMACIN EN BASES DE DATOS

BLAST (Basic Local Alignment Search Tool/Programa
informtico de alineamiento de secuencias de tipo
local)
Creado por los institutos nacionales de salud de
EE.UU.
Puede usarse desde el servidor del Centro Nacional
para la Informacin Biotecnolgica (NCBI)
Utiliza un algoritmo heurstico.
Blastn, Blastp, PDB, PFAM, UniProt data, InterPro,
Allergenic Database, Allergen Database for Food
Safety, ect.
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BLAST
(Programa informtico de alineamiento de secuencias de tipo local)

EFECTOS INTENCIONALES Y NO INTENCIONALES.

No garantiza que las secuencia que alinea

sean homlogas o que tengan la misma

funcin.

Su puntuacin depende del largo de la

secuencia.

Alteraciones que puedan aparecer en varios

niveles:
- morfologa de la planta y/o tejido.
- metabolismo, composicin qumica.
- influencia del medio ambiente sobre la expresin
gnica.

El eValor depende del tamao de la base

de datos
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PAISES Y MEGAPAISES PRODUCTORES CULTIVOS BIOTECNOLGICOS 2013

FUENTE: CLIVE JAMES, 2013.

EFECTOS NO INTENCIONALES DETECTADOS EN

PRODUCTOS GM.

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SITUACIN MUNDIAL DE LOS CULTIVOS

BIOTECNOLGICOS GM/2013

MUCHAS GRACIAS POR SU ATENCIN

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