Tcnica de produccin Ac monoclonales

El procedimiento para producir anticuerpos monoclonales demora, habitualmente, cuatro meses . Para ello, se
inyecta en ratones el antgeno, an cuando no est puro. Luego de un perodo de espera que permite un aumento
de los linfocitos B especficos, se sacrifica el ratn y se extrae el bazo, rico en linfocitos. Como primera etapa, los
linfocitos que se obtengan del bazo, se mezclan con clulas mielomatosas (clulas de un tumor de linfocitos),
agregando adems polietilenglicol, un agente que facilita la fusin. Con esto se consigue que algunas clulas
mielomatosas se fusionen con linfocitos del bazo, produciendo lo que se llama un hibridoma. Se logra as una clula
que combina la capacidad de producir anticuerpos de los linfocitos, con la capacidad de multiplicarse
indefinidamente de la clula mielomatosa. No todas las clulas logran fusionarse (hibridizarse), sino que por el
contrario, un escaso nmero de ellas (slo una cada 2 x 105 de las clulas del bazo). De all que sea necesario
eliminar
todas
aquellas
clulas
que
no
se
fusionen
(linfocitos
y
clulas
mielomatosas).
Los linfocitos que no se han fusionado se eliminan solos, porque luego de unas pocas divisiones, mueren. El
problema ms complicado es eliminar las clulas del mieloma, que si continan multiplicndose. Las clulas
mielomatosas que se utilizan para la fusin han sido genticamente alteradas, de modo que les falta una enzima
vital para la sntesis de DNA: la hipoxantina guanina fosforibosil trarferasa. Cuando estas clulas mielomatosas
mutadas se hacen crecer en un medie do cultivo especial, ellas tambin mueren. Sin embargo, si se logran fusionar
con linfocitos normales, sobreviven, porque los linfocitos le proveen la enzima que a ellas les falta. De este modo, al
poco
tiempo,
en
el
cultivo
slo
quedan
las
clulas
fusionadas
(hibridomas).
Luego debe seleccionarse y purificarse, entre todos las hibridomas, aquel que produce el anticuerpo especfico que
se desea. Muchas tcnicas se han utilizado para seleccionar los hibridomas especficos, siendo la ms usada
aquella que utiliza un radioinmunoanlisis. Para ello, se fija el antgeno especfico en el fondo de pocillos de plstico.
Luego, a cada uno de los pocillos se agrega el lquido del cultivo donde estn creciendo las colonias de hibridomas.
En aquellos casos en que las colonias secretan el anticuerpo especfico ste va a reaccionar con el antgeno que se
ha fijado al plstico, los dems se eliminan por un simple lavado. En este momento se agrega un reactivo (marcado
con un radioistopo) que reacciona solamente con la molcula de anticuerpo monoclonal (generalmente un segundo
anticuerpo especfico contra los anticuerpos monoclonales). Despus de un tiempo de incubacin apropiada,
nuevamente se lavan los pocillos. Para ubicar el hibridoma que interesa se busca en qu pocillo est la
radioactividad .La etapa final, es separar los distintos hibridomas resultantes, con el fin de obtener una poblacin
proveniente de una sola clula (clon). Para ello, las clulas se diluyen hasta lograr que una clula quede en un
micropocillo de cultivo. El anticuerpo producido por esta clula y sus progenitoras (clon), es un anticuerpo
monoclanal. De all en adelante estas clulas se pueden guardar congeladas o cultivar y multiplicar por siempre
(figura
2).
Estos hibridomas pueden inyectarse en la cavidad peritoneal de un ratn donde se multiplican y desarrollan como un
cncer secretando al mismo tiempo el anticuerpo deseado. Este mtodo es til para el trabajo de laboratorio, pero no
es prctico ni econmico para la produccin comercial del anticuerpo monoclonal. Por esto, se ha buscado otra
forma para poder reproducir y multiplicar el hibridoma; el mtodo llamado Encapel, que consiste en capsular los
hibridomas, en pequeas esferas . Primero se colocan los hibridomas en una solucin biocompatible de alginatos
(sustancia derivada del alga Gracilaria), y luego se encapsulan con una membrana de polmeros de almidn. La
porosidad de la membrana de la cpsula permite que los gases y nutrientes fluyan al interior y que los productos de
desechos, salgan de ella. Cuando se alcanza la densidad apropiada de anticuerpos en su interior, las cpsulas se
rompen y se recolecta la protena .
---------otro texto encontrado-----Para producir anticuerpos monoclonales, primero se extraen clulas B del bazo de un animal que ha sido expuesto al
antgeno. Estas clulas B son fusionadas en presencia de PEG (polietilenglicol) con clulas tumorales de mieloma
mltiple (un tipo de cncer) que pueden crecer indefinidamente en cultivo celular. Esta fusin hace a las membranas
celulares ms permeables. Estas clulas fusionadas hbridas, llamadas hibridomas pueden multiplicarse rpida e
indefinidamente (ya que son clulas tumorales despus de todo) y pueden producir gran cantidad de anticuerpos. Los
hibridomas son suficientemente diluidos y cultivados para obtener un nmero diferente de determinadas colonias, las cuales
producen slo un tipo de anticuerpo. Los anticuerpos de diferentes colonias son analizados para conocer su capacidad de
unirse a un antgeno determinado, por ejemplo con un tipo de test llamado ELISA, y para seleccionarse y aislarse de la
manera ms efectiva.
El proceso de produccin de anticuerpos monoclonales es complejo. Primero se disgrega el bazo del ratn inmunizado,
donde se acumulan los linfocitos B que tienen una escasa viabilidad en cultivo, y se fusionan con clulas de mieloma
deficientes en enzimas implicados en la sntesis del nuevo ADN como la timidina quinasa (TK) o la hipoxantina guanina
fosforibosil transferasa (HGPRT). Los productos de la fusin celular (hibridomas) son cultivados en medio HAT (de
hipoxantina, aminopterina y timidina) donde las clulas mielmicas son eliminadas. Solamente pueden crecer en el medio

de cultivo HAT las clulas que son producto de la fusin entre un linfocito y una clula de mieloma. Las clulas hbridas
obtenidas tras el proceso de fusin contienen un nmero elevado de cromosomas (72 del mieloma y 40 del linfocito B) que
en las sucesivas divisiones celulares se irn perdiendo hasta oscilar entre los 70 y los 80 cromosomas. Como consecuencia
de dicho proceso, algunas clulas pierden la capacidad de secrecin de anticuerpos o bien funciones bsicas para la
viabilidad celular. Por ello tan pronto como se identifica como positivo un pocillo se somete a un proceso de clonacin para
evitar el crecimiento de clulas no productoras que al ser metablicamente ms eficientes acabaran por dominar el cultivo.

Tiselius y Kabat

En 1939 tiselius y kabat realizaron estudios electroforticos con antisuero de conejo especfico para OVA. Ellos encontraron
que la electroforesis del suero de conejos inmunizados resultaron protenas del suero en 4 familias dominantes con
diferente movilidad. La fraccin de la albumina era la mas rpida en migrar (mas negativa) seguida por la alpha, beta,y
gamma globulinas. Tiselius y kabat continuaron inmunizando a los conejos con la OVA de gallina para conseguir una fuerte
respuesta
de
anticuerpos.
Cuando ellos pusieron en electroforesis el suero inmunizado, ellos observaron un gran incremento en la fraccin de gammaglobulina y concluyeron que los anticuerpos eran gammaglobulinas.
----otro-----

selius y Kabat sometieron a electroforesis el suero de conejos inmunizados con albmina de huevo y
demostraron que la actividad de anticuerpo se encontraba en el tercer pico del desplazamiento
electrofortico de las protenas, tambin conocido como pico gamma, por lo que muy pronto se llam
gammaglobulinas a los anticuerpos
Usos gammaglobulina
La gammaglobulina tiene varios usos, en especial en enfermedades infecciosas para las que no hay tratamiento especfico,
como la rabia, la hepatitis, el ttano, y en las deficiencias de inmunidad, La enfermedad de Kawasaki existen
gammaglobulinas polivalentes que se usa para elevar las defensas de personas que estn expuestas a algn contagio o en
las que tienen bajas sus propias defensas.

La enfermedad de Kawasaki es una vasculitis sistmica aguda; qu significa vasculitis: que las
paredes de los vasos sanguneos se han inflamado y qu significa sistmica, que se produce en
ms de una localizacin. Y Aguda; que el tiempo de inicio y fin de la enfermedad es de corta
duracin.
La gammaglobulina constituye la base del tratamiento, ya que es capaz de disminuir el riesgo de
aparicin de las alteraciones coronarias en una gran proporcin de pacientes.

ventajas de jerne detectarpequeos nmeros de clulas productorasde

anticuerpo, entre poblacionesde grantamao.