Revista de Diagnóstico Biológico - Nuevo Procedimiento Colorimétrico para La Determinación de Adenosina Desaminasa en Líquidos Biológicos

24/5/2015
RevistadeDiagnsticoBiolgicoNuevoprocedimientocolorimtricoparaladeterminacindeadenosinadesaminasaenlquidosbiolgicos
RevistadeDiagnsticoBiolgico
versinimpresaISSN00347973
RevDiagnBiolv.50n.2Madridabr.jun.2001
ORIGINAL
Nuevoprocedimientocolorimtricoparaladeterminacin
deadenosinadesaminasaenlquidosbiolgicos
A.Bengoa,M.P.Sanz,A.Rus,L.Borque
ServiciodeAnlisisClnicos.C.H.SanMillnSanPedro.Logroo.LaRioja.
Palabrasclave:adenosinadesaminasa,isoenzimas,mtodocolorimtrico,derramepleural,tuberculosis,
automatizacin.
KeyWords:adenosinedesaminase,isoenzymes,colorimetricmethod,pleuraleffusion,tuberculosis,automation.
Resumen
Sehaevaluadounnuevoreactivoparaladeterminacindelenzimaadenosinadesaminasa(ADA)enlos
analizadoresCobasMiraS(Roche)ySynchronCX7(Beckman),utilizandounmtodocinticocolorimtricobasado
enlacuantificacindeinosina.
Laprecisinexpresadacomocoeficientesdevariacinfuemenordel3%(intrada)ymenordel2.7%(interda)para
valoresdeADAentre15.4y112U/L.Elmtodoresultlinealhastavaloresde395U/Lypresentunlmitede
deteccinmenorde0.5U/L.Nosehanobservadointerferenciasdebidasabilirrubina(hasta25mg/dL),nilpidos
(Iveliphasta2%),perosseobservanaumentossignificativosenlaactividaddeADAdebidosahemolisis.Al
compararestemtodoconunmtodocomercialbasadoenladeteccindelamoniacoliberado,seobtuvieron
coeficientesdecorrelacinsuperioresa0.97entodosloscasos.
Enconclusin,elnuevoprocedimientoevaluadopresentaunabuenapracticabilidadjuntoconunaprecisiny
sensibilidadsatisfactoriasporloqueresultaadecuadoparalasdeterminacionesurgentesyderutinadeadenosina
desaminasaenfludosbiolgicos.
Summary
AnewimprovedreagentforADA(adenosinedeaminase)hasbeenevaluatedinCOBASMiraS(Roche)and
SynchronCX7(Beckman)autoanalyzers,usingakineticcolorimetricmethodbasedintheinosinedetermination.
Theprecisionexpressedasofcoefficientsofvariationwaslowerthan3%(intraassay)andlowerthan2.7%(inter
assay)forADAbetween15.4and112U/L.
Themethodwaslinearupto395U/Landitpresentedadetectionlimitlowerthan0.5U/L.
Interferenceshavenotbeenobservedduetobilirrubin(upto25mg/dl)andlipid(Ivelipupto2%),buthemoglobin
interferredwithADAincreasingit.
ThecomparisonofthepresentmethodwiththecommerciallymethodbasedonthedetectionofliberatedNH3 ,
obtainedcorrelationcoefficientsgreaterthan0.97inallcases.
Inconclusion,thisnewreagentevaluateddemonstratedagoodpracticabilitytogetherwithasatisfactoryprecision
data:text/htmlcharset=utf8,%3Ch2%20href%3D%22http%3A%2F%2Fscielo.isciii.es%2Fscielo.php%3Fscript%3Dsci_serial%26amp%3Bpid%3D00347973
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andsensitivityitsappearstobesuitableforthestatandtheroutinedeterminationsofadenosinedeaminaseinbody
fluids.
Recibido:11IX00
Aceptado:27I01
Correspondencia:LuisBorquedeLarrea
ServiciodeAnlisisClnicos.C.H.SanMillnSanPedro
C/AutonomadeLaRioja3.26003.Logroo
Introduccin
Laadenosinadesaminasa(adenosinaaminohidrolasa,EC3.5.4.4,ADA)esunaenzimadelavadelarecuperacin
delaspurinasquecatalizaladesaminacinirreversibledelaadenosina(ydesoxiadenosina)paraformarinosina(y
desoxiinosina)yamonio1.
LadeterminacindeADAenlquidopleuralresultatileneldiagnsticodetuberculosispleural2,3,4presentandola
ventajade
serunmtodorpidoysencillo,encomparacinconotrosmtodoshabitualmenteempleadosparaeldiagnstico,
comosonlabacteriologaehistologa.Aunquenoexisteunaestandarizacinuniversal,seconsideraque
concentracionescatalticasdeADAsuperioresa45U/Lenlquidopleuralenunapersonajovencon
intradermorreaccindeMantouxpositiva,haceneldiagnsticodetuberculosispleuraltanprobablequenoprecisa
debiopsiapleural5.Noobstante,enlosltimosaossehandescritoalgunascausascapacesdeincrementarla
actividaddeesteenzima,comosonlasneoplasiaslinfoides,ciertasenfermedadesautoinmunesyelempiema6.Por
otrolado,unvalordeADAinferioralpuntodecortepermitedescartardeformacasiabsolutaelorigentuberculoso
delderrame.Aunqueenindividuosinmunodeprimidoslamedidadeestaenzimapuedepresentarciertalimitacinpor
lapresenciadeunnmeronodespreciabledefalsosnegativos.
Sehandescritonumerososmtodos 6,7,8,9,10paraladeterminacindelaactividaddeADA.
Existenmtodosradiomtricosqueutilizancomosustratoadenosinamarcadacon14Co3H.Perosetratade
mtodosque,aunquesonmuysensibles,requiereninstrumentaldelquenosiempresedisponeenloslaboratorios
clnicos.Ademssonmtodoslentos.
Entrelosmtodosespectrofotomtricoscinticosdestacanaquellosenlosquesedeterminaelamoniacoliberado
enlareaccindedesaminacincatalizadaporelADA11.Elmtodoenquesedeterminaelamoniacomediantela
reaccindedeshidrogenacindelcido2cetoglutricopresentalaventajadeserfcilmenteautomatizable.Sin
embargo,hayquetenerencuentaqueesnecesariounblancodemuestraparaeliminarinterferenciasporamoniaco
endgenoyexgeno.
EnotrotipodemtodossecalculalaactividaddelADAmedianteladeterminacindelainosina12liberadaenla
reaccindedesaminacinatravsdeunaseriedereaccionesenzimticasacopladas.
Enelpresentetrabajo,sepresentalaadaptacindeunnuevoreactivocomercial(ADAref.760550LIQUOChem.
ReactivosITCDiagnostics.IZASAS.A.Barcelona.Espaa)paraladeterminacincolorimtricadeADA,basadoen
lacuantificacindeinosina,alosanalizadoresCobasMiraS(Roche)ySynchronCX7(BeckmanCoulter).
ElprocedimientoesevaluadoparalamedidadeADAenlquidopleuralylosresultadossecomparanconlos
obtenidosporunprocedimientocomercialutilizadohabitualmenteenloslaboratoriosparalamedidadelADA.
Materialymtodos
Instrumentacin,reactivosyprincipiosdemedida
LaactividaddelenzimaADAfuedeterminadaconlosreactivosAdenosinDeaminasa(ADA)
LIQUO.Chem.(ADA
ref.760550),suministradosporITCDiagnostics,Barcelona(IZASAS.A.).Setratadeunmtodocintico
colorimtricobasadoenlaaccinhidrolticadelenzimaADAsobrelaadenosinaparaformarinosina,sobrelaque
actalapurinanuclesidofosforilasa(PNF)paradarlugarahipoxantinayribosa1fosfato.Lahipoxantinaes
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oxidadaacidoricoyperxidodehidrgenoporaccindelaxantinaoxidasa.Sedeterminaelperxidode
hidrgenoformadomediantela4aminoantipirinaylaNetilN(2hidroxi3sulfopropil)3metilanilina(TOOS)en
presenciadeperoxidasaproduciendouncompuestocoloreado,segnelsiguienteesquema:
EstemtodoseadaptalosanalizadoresCobasMiraS(Roche)ySynchronCX7(Beckman),segnlas
programacionesquesemuestranenlaTabla1.
Tabla1.Parmetrosdemedicin
COBASMIRASSYNCHRONCX7
Tipodereaccin
CINTICA
CINTICA
Unidades
U/L
U/L
Precisindecimal
X.X
X.X
Calibradores
21.0U/L
Calibrador1:0.00U/L
Calibrador2:21.00U/L
Longituddeonda
550mm
Primaria560mm
Secundaria700mm
Muestra
R1
R2
Volumen
10L
8L
Tiempodeadicin
25seg
2seg
Volumen
180L
200L
Tiempodeadicin
25seg
2seg
90L
75L
Volumen
250seg
592seg
Blancodereactivo
(lectura)
Tiempodeadicin
375seg
Iniciarlectura:500seg
Finlectura:520seg
Reaccin
(lectura)
625seg
Iniciarlectura:820seg
Finlectura:1020seg
Muestras:
Lquidospleuralesalmacenadosa20Chastaelmomentodesuanlisis.
Calibracin:
CalibradorespecficoparaADA,AUTOPlus(Ref.767664),deorigenhumano,liofilizado.
Precisin:
Ladeterminacindelaprecisinserealizpara3mezclasdelquidospleuralesconnivelesdiferentesdeADA(alto,
medioybajo).
Laprecisinintradaseobtuvorealizando20medidasacadaunodelos3niveles,elmismoda.Mientrasquela
precisininterdasecalculmidiendoalcuotasdecadaunodelosnivelesdurante20das,realizandounanica
calibracinalcomienzodelensayo.
Linealidad:
Paraelestudiodelalinealidadseemplearon4lquidospleuralesconactividadesdeADAcomprendidasentre19.1
U/Ly556.4U/L.Apartirdeesoscuatrolquidosseprepararondilucionesseriadas,empleandocomodiluyentesuero
fisiolgico.
Lmitededeteccin:
Paraestablecerellmitededeteccindelatcnica,seanalizarondiezreplicadosdeunblancodesolucinsalina,
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calculndoselamediayladesviacinestndardelasmedidasdeabsorbanciaobtenidas.
Correlacin:
Elestudiodecomparacindemtodosserealizcon52lquidospleuralesobtenidosdepacientesdenuestro
hospitalconvaloresdeADAentre2y115U/L.Losresultadosobtenidosconelmtodoadaptadoenlos
analizadoresCobasMiraSyCX7secompararonconlosencontradosmedianteunprocedimientocomercialADA
TestCombination(Roche.Mannheim)enunanalizadorHitachi917siguiendolasinstruccionesdelfabricante.
Interferencias:
Seevaluaronlasposiblesinterferenciasproducidasporbilirrubina,hemlisisylipemia13.Paraelloseutilizuna
mezcladelquidospleuralescuyaconcentracindeADAera58.3U/Lalaqueseleaadieroncantidades
crecientesdelassustanciasinterferentesaensayar.
Bilirrubina:seaadibilirrubina(SIGMA.Chemical.CO.StLouis.USAB4126).previamentedisueltacon
dimetilsulfxidoyNaOH,ajustandoaunpHadecuadoconHCl0,1N.
Hemoglobina:seobtuvounhemolizadoapartirdeuntubodesangreconvaloreshematolgicosnormales.
Lipemia:SeutilizelIvelip20%(RF693440,Baxter.S.A,Valencia,Espaa).Setratadeunaemulsingrasa
vegetaldeaceitedesoja(20g/100mL).
Resultados
Calibracin:
Enlasfiguras1Ay1Bserepresentanlascinticasdereaccindelblancoydelcalibradorutilizadosenla
calibracindeADAenelanalizadorCobasMiraSySynchronCX7.
Figura1A.CinticasdereaccinparaelSueroFisiolgico(+)yparaelCalibrador(*)enelCobas.
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Figura1B.CinticasdereaccinparaelSueroFisiolgico(+)yparaelCalibrador(*)enelSyncrhonCX7.
Precisin:
Losresultadosdelosestudiosdeimprecisinintraeinterdasemuestranenlatabla2.Entodosloscasosla
imprecisinfuemenordel3%.
Tabla2:Estudiodeprecisin:
Precisinintrada(N=20)
MEDIA(U/)
NIVEL
BAJO
MEDIO
ALTO
D.S.
C.V.(%)
COBAS
MIRA
CX7
COBAS
MIRA
CX7
COBAS
MIRA
CX7
15.4
15.2
0.13
0.39
0.8
3.0
33.3
33.2
0.16
0.27
0.5
1.0
112.0
83.6
0.58
0.45
0.5
1.0
Precisininterda(N=20)
MEDIA(U/L)
NIVEL
D.S.
C.V.(%)
COBAS
MIRA
CX7
COBAS
MIRA
CX7
COBAS
MIRA
CX7
BAJO
16.5
14.5
0.44
0.42
2.7
2.6
MEDIO
38.0
32.3
0.99
0.47
2.6
0.8
ALTO
83.8
82.1
1.31
0.87
1.6
0.5
Linealidad:
Losresultadossemuestranenlafigura2.
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Figura2.Estudiodelinealidadpara4nivelesdeADA.
ParalosnivelesdeconcentracindeADAmuybajo,bajo,medioyalto,loscoeficientesdedeterminacinr2fueron
0.9986,0.9977,0.9964y0.978,respectivamente.Siendolalinealidadpresentadaconelnuevoreactivoenel
analizadorCobasMiraSbuenaenelintervalodeconcentracionesestudiado.
Correlacin:
LosresultadosdelacomparacindelasconcentracionescatalticasdeADAobtenidosconlosanalizadoresCobas
MiraS,SynchronCX7(ambosconelprocedimientocolorimtrico)eHitachi917(porunmtodoUV)seexpresanen
lasfiguras3Ay3B.
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Figura3A.CorrelacinentreCobasMiraySyhnchronCX7
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Figura3.CorrelacinentreHitachi917ySynchronCX7
ParacalcularlasrectasderegresinseutilizelmtododePassingBablokconunintervalodeconfianzadel95%
paralaordenadaenelorigenylapendiente,obtenindoselosresultadosquesemuestranenlatabla3.
Tabla3:ResultadosdelestudiodecorrelacindePassingBablokpara
losanalizadoresSynchronCX7,CobasMiraSeHitachi917.
Correlacin
CX7COBASMIRAS
OO
0.957
0.32
0.996
8/11
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CX7H917
1.200
1.86
0.969
m:pendientedelarectaderegresin.OO:ordenadaenelorigen.r:coeficientedecorrelacin
Interferencias:
Paraobservarlasposiblesinterferenciasserepresentaelporcentajederecuperacinfrentealporcentajede
sustanciainterferente(figuras4Ay4B).Enambas,seobservaqueconcentracionesdebilirrubinahasta25mg/dl
(427mmol/l)eIveliphasta2%noafectaronladeterminacindeADA(diferenciasenel%derecuperacin
<10%).EnelcasodelahemoglobinaseobservaronaumentossignificativosenlaactividaddeADAapartirdeuna
concentracindehemoglobinade4.2g/lenelanalizadorCobasMiraSode2.1g/l,enelCX7.
Figura4A.Estudiodeinterferenciasporhemoglobina(1),lpidos(2)ybilirrubina(3)enelCobasMiraS.
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Figura4B.Estudiodeinterferenciasporhemoglobina(1),lpidos(2)ybilirrubina(3)enelCX7
Lmitededeteccin:
Calculandolamediadelasabsorbanciasms3desviacionesestndardelasealdelblanco(solucinsalina)se
obtuvoparaambosanalizadoresunvalordeADAmenorde0.5U/L.
Discusin
Laisoenzima2delenzimaADA,seconsideraunindicadordelrecambiodelalneamonocito/macrfagoyporlo
tanto,ladeterminacindelaactividaddelADAenfludosbiolgicosseempleaeneldiagnsticodelatuberculosis
pleuralyperitoneal,ascomoenlameningitistuberculosa.LamedidadelaactividaddeADAserealiza
habitualmentemediantemtodosespectrofotomtricosquepuedenserfcilmenteutilizadosenlosanalizadoresde
bioqumicaclnica.Apesardequeloslquidosbiolgicosserecibenenellaboratoriodeurgencias,esfrecuenteque
ladeterminacindeADAseefecteposteriormentecomounapruebadebioqumicanourgenteyqueelresultado
seentreguedeformaseparadaalrestodelasdeterminacionesbioqumicasrealizadasenellquido.
Elmtodoestudiadoenelpresentetrabajo,consisteenunsistemabirreactivoenelque,trasunaincubacininicial
delamuestraconelprimerreactivo(R1),lareaccinseiniciaaladicionarelsustratodeadenosinapresenteenel
segundoreactivo(R2).Esteprocedimientopermiteeliminaralgunasposiblesinterferenciasdebidasalapresencia
deinosinaohipoxantinaenlamuestra,graciasalaxantinaoxidasa,lapurinanuclesidofosforilasaylacatalasa
presentesenelreactivoR1.CuandoseadaptanestascondicionesalosanalizadoresCobasMiraSySynchron
CX7,losblancosdereaccinobtenidosenausenciadeADA,presentabanunsignificativodesarrollodecolora550
nm.Unaposiblesolucinparaestabilizarelblancodereaccinpodraseriniciarlareaccinconlaadicindela
muestra,traslamezcladelosdosreactivos.Enestascondiciones,elblancoobtenidoresultestableylos
resultadosobtenidoscorrelacionabanbienconelmtododecomparacin(r=0.998).Sinembargo,la
reproducibilidadinterserienofueaceptable,especialmentecuandoseutilizaronlquidospleuralespreviamente
congelados.TodoellosugierequeelperiododeincubacindelADAenelmediodereaccinesimportanteparaque
sealcanceunestadoestabledeahlanecesidadderealizarlamedicintrasuntiempodeincubacindela
muestraconelreactivo.Porello,finalmente,serecomiendausarlaprogramacinpropuestaporelfabricante,con
ligerasvariacionesenlarelacindelosvolmenesdereactivosytiemposdeadicindelosmismos,paraajustarlos
alascaractersticasconcretasdecadaanalizador.Paraminimizarelefectodelainestabilidaddelblancode
muestra,seeligieronunosperiodosdelecturalomsalejadosposibledelmomentodeadicindelsegundo
reactivo.
Losprocedimientospresentaronunaadecuadareproducibilidad,enambosanalizadores,conunoscoeficientesde
variacinqueoscilaronentreel0,5%yel3%(reproducibilidadintrada)yel0,5%al2,7%(interda,trascalibracin
nica).Losrangosdemedidaresultaronsuperioresa395U/Lyloslmitesdedeteccininferioresa0,5U/L.
Lasmuestrashemolizadaspresentanvaloresfalsamenteelevados,probablementedebidosaunaumentodel
isoenzima1delADAotambinllamadoeritrocitario,porserlanicaformaqueposeeelhemate.
Lasmuestraslipmicasoictricas,sinembargo,puedensercuantificadasmedianteestemtodosininterferencias
significativas.
LosresultadosobtenidosenlosanalizadoresCobasMiraSyCX7correlacionanbienentresperoseobservan
diferenciasconlosencontradosmedianteelmtododecomparacinempleado,sobretodoaconcentracionesaltas.
As,paralquidospleuralesconactividaddeADAelevada,seobservaronvaloressuperioresconelmtodoa
evaluarquelosobtenidosconeldereferencia.Probablementeestosedebaaqueestenuevomtodoqueseevala
presentaunrangoanalticosuperior(hasta395U/L),mientrasqueeldecomparacinsloeslinealhasta100U/L,
teniendoquerealizarunadilucinapartirdedichovalor.
Enconclusin,lamedidadeADAenlosanalizadoresCX7yCobasMiraSmedianteelmtodoespectrofotomtrico
estudiado,presentaunasbuenascaractersticasanalticas,ylosreactivossonestablesynorequierenpreparacin.
Portodoello,estosprocedimientospuedenserutilizadosparaladeterminacindeADAenlquidosbiolgicos,
comounparmetrodebioqumicaenelmomentoderecibirlamuestraenellaboratoriodeurgencias.
Bibliografa
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