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AFLP: uma nova tcnica para DNA fingerprinting

Pieter Vos, et al. Nucleic Acids Research. V. 23, N 21 (1995) 4407-4414

RESUMO
Uma moderna tcnica de DNA fingerprinting chamada AFLP descrita.
A tcnica AFLP est baseada na seletiva amplificao por PCR de fragmentos
de restrio de uma digesto total do DNA genmico. A tcnica envolve 3
etapas: (i) restrio do DNA e ligao de oligonucleotdeos adaptadores, (ii)
amplificao seletiva dos grupos de fragmentos de restrio, e (iii) anlise em
gel dos fragmentos amplificados. Amplificaes por PCR dos fragmentos de
restrio conseguido usando adaptadores e seqncias stio-restritivas como
stios alvo para anelamento dos primers. A amplificao seletiva conseguida
pelo uso de primers que se estendem dentro dos fragmentos de restrio,
amplificando somente esses fragmentos os quais a extenso do primer
emparelha nos nucleotdeos que flanqueiam o stio de restrio. Usando este
mtodo, grupos de fragmentos de restrio podem ser visualizados por PCR
sem conhecimento da seqncia dos nucleotdeos. O mtodo permite a
especfica co-amplificao de um alto nmeros de fragmentos de restrio. O
nmero de fragmentos que podem ser analisados simultaneamente, porm,
dependente da resoluo do sistema de deteco. Tipicamente 50-100
fragmentos de restrio so amplificados e detectados em gel de
poliacrilamida. A tcnica de AFLP promove uma moderna e muito poderosa
tcnica de DNA fingerprinting para DNAs de qualquer origem ou complexidade.
INTRODUO
DNA fingerprinting envolve a exposio de um conjunto de fragmentos
de DNA de uma amostra especfica. Uma variedade de tcnicas de DNA
fingerprinting est atualmente disponvel, das quais a maior parte usam PCR
para deteco dos fragmentos. A escolha de qual tcnica usar, dependente
da aplicao por exemplo de DNA typing, mapeamento de marcadores e o
organismo sob investigao, por exemplo procariontes, plantas, animais,
humanos. Idealmente, uma tcnica fingerprinting no deve exigir previamente
investimentos em termos de anlises de seqncias, sntese de primers ou
caracterizao de sondas de DNA. Numerosos mtodos fingerprinting, os
quais satisfazem estes requerimentos tem sido desenvolvidos nos ltimos
anos, incluindo random amplified polymorphic DNA (RAPD), DNA amplified
fingerprinting (DAF) e arbitrarily primed PCR (AP-PCR). Estes mtodos so
todos baseados na amplificao ao acaso de fragmentos de DNA pela seleo
arbitrria de primers. Padres de fragmentos de DNA podem ser gerados de
qualquer DNA sem conhecimento prvio de sua seqncia. Os padres
gerados dependem da seqncia dos primers da natureza dos modelos de
DNA. A PCR executada em baixas temperaturas de anelamento para permitir
o anelamento dos primers em mltiplos loci do DNA. Fragmentos de DNA so
gerados quando os primers ligam stios que esto dentro de uma distncia que
permitem amplificaes. Em princpio, um nico primer suficiente para gerar
padres de bandas. Estes novos mtodos de fingerprinting baseados em PCR
tem a maior desvantagem por serem muito sensveis s condies de reao,
qualidade do DNA e perfis de temperatura na PCR, que limitam sua aplicao.
Este trabalho descreve uma nova tcnica para DNA fingerprinting,
chamada AFLP. A tcnica de AFLP est baseada na deteco de fragmentos

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de restrio pela amplificao por PCR, e pode ser usada para DNAs de
qualquer origem ou complexidade. Fingerprints so produzidos sem
conhecimento prvio da seqncia usando um limitado grupo de primers
genricos. O nmero de fragmentos detectados em uma nica reao podem
ser afinados pela seleo de grupos especficos de primers. A tcnica de
AFLP robusta e confivel porque condies de reao estritas so usadas
para anelamento dos primers: a confiabilidade da tcnica RFLP est
combinada com a fora da tcnica de PCR. Este trabalho descreve vrias
caractersticas da tcnica AFLP e ilustra como a tcnica pode ser melhor usada
em fingerprinting de DNAs genmicos.
MATERIAIS E MTODOS
DNAs, enzimas e materiais
DNA do vrus Lambda foi adquirido da Pharmacia (Pharmacia LKB
Biotechnology AB, Uppsala, Sweden). DNA do vrus Autographa californica
(AcNPV) foi uma doao (Agricultural University of Wageningen). DNA de
levedura foi isolado da cepa AB138 como descrito por Green e Olson com
pequenas modificaes. DNA de tomate variedade Moneymaker foi obtido da
University of Wageningen. DNA de Arabidopsis (recombinante congnito linha
240, foi obtido de John Innes Center, UK), DNA de milho (cepa B73, obtido do
Instituto Sperimentale per La, Italy), DNA de pepino (variedade Primera, obtido
de De Ruiter Seeds C.V., The Netherlands), DNA de cevada (variedade Ingrid,
foi obtida da University of Aachen, Germany), DNA de alface (variedade
Calmar, foi obtida do UC Davis, Davis, CA, USA) e DNA de [brassica] (leo da
semente arrebentada, variedade Major, obtida da University of Wisconsin, WI,
USA) foram isolados usando um procedimento CTAB modificado descrito por
Stewart e Via. DNA humano foi preparado como descrito por Miller et al, de
100mL de sangue do Mrs Marjo Bleeker, um dos co-autores deste trabalho.
Todas enzimas de restrio foram adquiridas da Pharmacia (Pharmacia LKB
Biotechnology AB, Uppsala, Sweden), exceto a enzima de restrio MseI, a
qual foi adquirida da New England Biolabs Inc. T4 DNA ligase e T4
polinucleotdeo kinase tambm foram obtidas da Pharmacia. Todos os
reagentes para PCR e materiais de consumo foram obtidos da Perkin Elmer
Corp. todos reagentes radioativos foram adquiridos da Amershan ou da
Isotopchim.
AFLP primers e adaptadores
Todos oligonucleotdeos foram fabricados na Biotronic Synostat DNAsynthesizer (Eppendorf Gmbh, Maintal, Germany) ou Milligen Expedite 8909
DNA-synthesizer (Millipore Corp. Bedford, MA, USA). A qualidade dos
oligonucleotdeos brutos foi determinada por marcao final com polynucleotide
kinase e [32P]ATP e subseqente eletroforese em gel de poliacrilamida 18%.
Oligonucleotdeos foram geralmente usados como adaptadores e primers para
anlises AFLP sem mais purificaes.
Adaptadores AFLP consistem de uma seqncia central e uma
seqncia enzima-especfica. A estrutura do adaptador EcoRI :
5-CTCGTAGACTGCGTACC
CATCTGACGCATGGTTAA-5

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A Estrutura do adaptador MseI :
5-GACGATGAGTCCTGAG
TACTCAGGACTCAT-5
Adaptadores de outras enzimas de corte raro foram idnticas para o
adaptador EcoRI com a exceo que finais coesivos foram usados, quais so
compatveis com estas outras enzimas. O adaptador TaqI foi idntico para o
adaptador MseI com a exceo que um final coesivo foi usado compatvel com
TaqI.
Primers AFLP consistem de 3 partes, uma seqncia central, uma
seqncia enzima-especfica (ENZ) e uma extenso seletiva (EXT). Isso
ilustrado abaixo para primers EcoRI e MseI com 3 nucleotdeos seletivos
(nucleotdeos seletivos so mostrados como NNN):
Centro

ENZ

EXT

EcoRI 5-GACTGCGTACC AATTC NNN-3

MseI 5-GATGAGTCCTGAG TAA NNN-3
Primers AFLP para outras enzimas de corte raro foram similares para os
EcoRI-primers, e TaqI-primers foram similares para os MseI-primers, mas
tinham partes enzima-especficas correspondendo s respectivas enzimas.
Modificao do DNA e preparao do modelo
O protocolo abaixo descreve a gerao de modelos para reaes AFLP
usando a combinao de enzimas EcoRI/MseI. Modelos de DNA com outras
enzimas de restrio foram preparadas usando essencialmente o mesmo
protocolo, exceto no uso de diferentes enzimas de restrio e correspondendo
[double-stranded] adaptadores.
DNA genmico (0,5g) foi incubado por 1h a 37C com 5U de EcoRI e
5U de MseI em 40L de 10mM Tris-Hac pH 7,5, 10mM MgAc, 50mM Kac, 5mM
DTT, 50ng/L BSA. Posteriormente, 10L de uma soluo contendo 5pMol de
adaptador EcoRI, 50pMol de adaptador MseI, 1U de T4 DNA ligase, 1mM ATP
em 10mM Tris-HAc pH 7,5, 10mM MgAc, 50mM KAc, 5mM DTT, 50ng/L BSA
foi adicionado, e a incubao continuou por 3h a 37C. Adaptadores foram
preparados pela adio equimolar, equivalendo para ambos [strands];
adaptadores no foram fosforilados. Aps a ligao, a mistura da reao foi
diluda para 500L com 10mM Tris-HCl, 0,1mM EDTA pH 8,0 e estocado a
20C.
Reaes AFLP
Reaes de amplificao esto descritas usando modelos de DNA para
a combinao de enzimas EcoRI/MseI. AFLP fingerprints com outras
combinaes de enzimas foram executados com primers apropriados.
Reaes AFLP geralmente empregam 2 primers de oligonucleotdeos, 1
correspondendo ao final EcoRI e outro correspondendo ao final MseI. Um dos 2
primers foi radioativamente marcado, preferencialmente o primer EcoRI. Os
primers foram marcadosl usando [33P]ATP e T4 polyonucleotide kinase. A
reao de marcao xecutada em 50L 25mM Tris-HCl pH 7,5, 10mM MgCl2,

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5mM [permidine]-3HCl usando 500ng de primer, 100Ci[33P]ATP e 10U T4
polynucleotide kinase. Vinte L PCRs foram executados contendo 5ng de
primers marcados EcoRI (0,5L da mistura da reao de marcao), 30ng de
primer MseI, 5L de DNA modelo, 0,4U de Taq polimerase, 10mM Tris-HCl pH
8,3, 1,5mM MgCl2, 50mM KCl, 0,2mM de todos 4 dNTPs.
As condies da PCR diferiram dependendo da natureza das extenses
seletivas dos primers AFLP usados para amplificao. Reaes AFLP com
primers tendo nenhum ou 1 nucleotdeo seletivo foram executadas para 20
ciclos com o seguinte perfil: etapa de 30s para desnaturao do DNA a 94C,
etapa de 1 min de anelamento a 56C e uma etapa de 1 min para a extenso a
72C. reaes AFLP com primers contendo 2 ou 3 nucleotdeos seletivos foram
executados por 36 ciclos com o seguinte perfil: uma etapa de 30s para
desnaturao do DNA a 94C, uma etapa de 1 min para anelamento (veja
abaixo) e uma etapa de 1 min para extenso a 72C. A temperatura de
anelamento no primeiro ciclo foi de 65C, foi subseqentemente reduzido em
cada ciclo em 0,7C para os prximos 12 ciclos, e continuou a 56C pelos 23
ciclos remanescentes. Todas reaes de amplificao foram executadas em
um termociclador PE-9600 (Perkin Elmer Corp, USA).
AFLP fingerprinting de genomas complexos geralmente envolvem uma
amplificao em 2 etapas. A primeira etapa desta amplificao, chamada de
pr-amplificao, foi executada com 2 primers AFLP tendo 1 nico nucleotdeo
seletivo como descrito acima, com a exceo que 30ng de ambos primers
AFLP foram usados, e que estes primers no foram radioativamente marcados.
Aps esta etapa de pr-amplificao, a mistura da reao foi diluda 10 vezes,
com 10mM Tris-HCl, 0,1mM EDTA pH 8,0 e usado como modelo para a
segunda reao de amplificao. A segunda reao de amplificao foi
executada conforme descrito acima por reaes AFLP com primers tendo
extenses seletivas longas.

Figura 1. Representao esquemtica da tcnica AFLP.

Anlise em gel
Seguindo, os produtos das reaes de amplificao foram misturados
com um igual volume (20L) de formamide dye (98% formamide, 10mM EDTA
pH 8,0 e azul bromo fenol e xylene cyanol como [tracking dyes]). A mistura
resultante foi aquecida por 3 min a 90C, e ento rapidamente colocado em
gelo. Cada amostra (2L) foi carregada em um gel (5%) de poliacrilamida
denaturing (usado para sequenciamento). A matriz do gel foi preparada usando
5% de acrilamida, 0,25% de methylene bisacril, 7,5M de uria em 50mM
Tris/50mM de cido brico/1mM EDTA. Para 100mL de soluo de gel 500L
de 10% de APS e 100L de TEMED foi adicionado e gis foram lanados
usando umaparato gel SequiGen 38 X 50cm (BioRad Laboratories, USA).
100mM Tris/100mM cido brico/2mM EDTA foi usado como tampo de
corrida. A eletroforese foi executada em fora constante, 110W por 2h. Aps
a eletroforese, os gis foram fixados por 30 min em 10% de cido actico
secado em uma placa de vidro e exposto ao Fuji phosphoimage no escuro por
16h. Padres fingerprint foram visualizados usando um sistema de anlise Fuji
BAS-2000 phosphoimage (Fuji Photo Film Company Ltd, Japan).
RESULTADOS E DISCUSSO
Princpio do mtodo
A tcnica AFLP baseada na amplificao de subconjuntos de
fragmentos de restrio genmicos usando PCR. O DNA clivado com
enzimas de restrio, e [stranded-duplamente] (ds) adaptadores so ligados
nos finais dos fragmentos de DNA para gerar modelos para amplificao. A
seqncia dos adaptadores e dos stios adjacentes de restrio servem como
stios de ligao para os primers para subseqente amplificao dos
fragmentos (Fig. 1). Nucleotdeos seletivos so includos no final 3 dos primers
os quais conseqentemente podem iniciar a sntese de DNA de um
subconjunto dos stios de restrio. Qualquer fragmento de restrio no qual o
nucleotdeo seletivo flanqueia e for complementar com o stio de restrio
poder ser amplificado.
Os fragmentos de restrio para amplificao so geralmente por 2
enzimas de restrio, uma de corte raro e outra de corte freqente. O
procedimento AFLP resulta em amplificaes predominantes destes
fragmentos, os quais tem uma seqncia de corte raro num final e uma
seqncia de corte freqente no outro (isto ser explicado abaixo). A razo
para usar 2 enzimas de restrio pelo seguinte. (i) o corte freqente ir gerar
pequenos fragmentos de DNA, quais sero bem amplificados e esto em timo
tamanho para separao em gel para sequenciamento. (ii) O nmero de
fragmentos para serem amplificados reduzido pelo uso da enzima de corte
raro, desde que somente os fragmentos corte raro/freqente sejam
amplificados. Isto limita o nmero de nucleotdeos seletivos necessrios para a
amplificao seletiva. (iii) o uso de 2 enzimas de restrio faz isto possvel para
marcar um [strand] dos ds produtos de PCR, quais previnem a ocorrncia de
dobras no gel devido a desigual mobilidade dos dois [strands] dos fragmentos
amplificados. (iv) usando 2 diferentes enzimas de restrio d a maior
flexibilidade em afinao do nmero de fragmentos que sero amplificados.

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(v) grande nmero de diferentes fingerprints podem ser gerados por varias
combinaes de um baixo nmero de primers.
AFLP fingerprinting de genomas simples
A tcnica de AFLP feita com uso de adaptadores ds ligados nos finais
dos fragmentos de restrio para criar stios alvo para anelamento de primers
na amplificao dos fragmentos. Um subconjunto dos fragmentos de restrio
especificamente amplificado pelo uso de nucleotdeos seletivos no final 3 dos
primers. Este princpio foi demonstrado pelo fingerprinting de 4 diferentes DNAs
genmicos simples, variando de 48,5 a 16.000Kb de tamanho do genoma. Os
seguintes DNAs genmicos foram selecionados e fingerprinted usando a
combinao de enzimas EcoRI/MseI: DNA do fago (48.451pb), DNA do vrus
AcNPV (129.981pb), DNA de Acinetobacter ( 3.000Kb) e DNA de levedura (
16.000Kb).
Para o DNA do fago e AcNPV, a seqncia completa dos nucleotdeos
conhecida, e por isso todos fragmentos EcoRI/MseI puderam ser exatamente
previstos. Realmente, todos fragmentos previstos foram detectados. Tambm
para DNA de Acinetobacter e levedura, o nmero de fragmentos
corresponderam bem com o tamanho do genoma destes organismos.
Acrescentando nucleotdeos seletivos nos primers se reduz o nmero de
bandas, 4 vezes com cada base seletiva adicional. Alm disso, a adio de
um nucleotdeo seletivo extra sempre resulta em um fingerprint, que foi um
subconjunto do fingerprint original. Isto indica que nucleotdeos seletivos so
um preciso e eficiente caminho para selecionar um grupo especfico de
fragmentos de restrio para amplificao. Os AFLP fingerprints mostraram
que grande nmeros de fragmentos de restrio foram amplificados
simultaneamente, e que em princpio o nmero de bandas detectadas
limitada somente pelo poder do sistema de deteco, i.e. gis de
poliacrilamida. Em geral, as amplificaes simultneas de fragmentos de DNA
usando grupos de primers especficos para cada fragmento PCR (PCR
multiplex) parece ser algo dificultoso. Nossos resultados sugerem que a
amplificao de multi-fragmentos eficiente contanto que todos fragmentos
usem o mesmo grupo de primers para sua amplificao. Isto significa que as
diferenas na eficincia da amplificao dos fragmentos de DNA na PCR so
principalmente associados aos primers e no aos fragmentos especficos.
Os adaptadores ds usados para ligao nos fragmentos de restrio no
so forforilados, o que causa somente 1 [strand] para ser ligado nos finais dos
fragmentos de restrio. Conseqentemente fragmentos no foram
amplificados se os modelos de DNAs foram desnaturados antes amplificao
PCR (resultados no mostrados), exceto quando Taq polimerase e dNTPs
estavam presentes antes da desnaturao. O [filling-in] do final 3 encaixado
pela Taq polimerase segue a dissociao do [strand] no ligado durante a
etapa de aquecimento parece uma matria de somente segundos ou menos.
Alternativamente, a Taq polimerase pode imediatamente deslocar o [strand]
no ligado em baixas temperaturas no processo de juntar as misturas da
reao.
Estes resultados demonstraram que: (i) a tcnica de AFLP promoveu um
eficiente caminho para amplificar grande nmero de fragmentos
simultaneamente, (ii) os fragmentos amplificados so fragmentos de restrio,
(iii) o nmero de fragmentos obtidos aumentou com o aumento do tamanho do

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genoma e correspondeu bem com o que foi teoricamente esperado, (iv) os
nucleotdeos seletivos nos finais dos primers reduziram o nmero de bandas
precisamente como foi de se esperar.
A restrio do DNA genmico com EcoRI e MseI ir resultar em 3
classes de fragmentos de restrio, fragmentos MseI-MseI, fragmentos EcoRIMseI e fragmentos EcoRI-EcoRI. A vasta maioria (>90%) so esperados para
ser MseI-MseI; os fragmentos EcoRI-MseI iro ser aproximadamente 2 vezes o
nmero de stios de restrio EcoRI e um pequeno nmero de fragmentos
sero EcoRI-EcoRI. Em experimentos anteriores o primer EcoRI foi marcado e,
conseqentemente somente os fragmentos de restrio com stios EcoRI
puderam ser detectados. Para investigar a amplificao dos fragmentos MseIMseI um grupo de reaes AFLP de DNA de levedura foi executada com
primer MseI ligado no lugar do primer EcoRI. Isto esperado para mostrar os
fragmentos EcoRI-MseI bem como os fragmentos MseI-MseI.
Fingerprints similares de levedura foram obtidos com a marcao de
qualquer dos EcoRI ou MseI primers (Fig. 3, compare as linhas A e B). Porm,
a maior parte das bandas mostrou uma significativa mudana na mobilidade,
devido ao fato de que outros [strand] de fragmentos foram detectados. Isto foi
surpreendente para achar que quase no fragmentos adicionais, i.e.
fragmentos MseI-MseI, foram detectados marcando no primer MseI no lugar do
primer EcoRI. Conseqentemente, reaes adicionais foram executadas mas
quais somente o primer MseI foi adicionado, que teoricamente ir permitir
somente a amplificao dos fragmentos MseI-MseI (Fig. 3, linha C). Realmente,
estas reaes mostraram produtos de amplificao no observados na
presena de primers EcoRI. Estas observaes implicam que amplificaes
dos fragmentos MseI-MseI ineficiente na presena de primer EcoRI, i.e. que
h amplificao preferencial dos fragmentos EcoRI-MseI comparados com
fragmentos MseI-MseI na reao de AFLP. Isto pode ser explicado de 2
maneiras, (i) o primer MseI tinha uma temperatura menor de anelamento que o
primer EcoRI, fazendo amplificaes MseI-MseI menos eficiente comparado
com fragmentos EcoRI-MseI sob as condies usadas. Ns tnhamos
realmente observado poderosa amplificao de fragmentos MseI-MseI usando
longos ou alternativos primers MseI e adaptadores. (ii) os fragmentos MseIMseI tem uma repetio invertida nos finais, devido ao fato de que eles esto
amplificados por um primer simples. Conseqentemente, uma estrutura de
origem de ala pode ser formada pelo pareamento de bases dos finais dos
fragmentos, que ser completado com anelamento do primer. Isto tambm
confirmado pela observao de que somente grandes fragmentos foram
amplificados em reaes AFLP quando somente o primer MseI foi adicionado.
A formao de uma estrutura de origem de ala ir ser mais difcil nestes
fragmentos grandes. Ns temos realmente demonstrado que amplificaes de
fragmentos grandes (>1Kb) com um primer simples bastante eficiente
(resultados no mostrados).
Primers cuidadosamente projetados crucial para o sucesso da
amplificao por PCR. Primers AFLP consistem de 3 partes: a parte 5
corresponde ao adaptador, a seqncia do stio de restrio e na parte 3 os
nucleotdeos seletivos. Conseqentemente, o design dos primers AFLP
principalmente determinado pelo design dos adaptadores, quais so ligados
nos fragmentos de restrio. Vrios designs de adaptadores foram testados
(resultados no mostrados), todos com bons resultados contanto que as regras

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gerais para bons primers PCR projetados forem seguidos. Um adaptador
diferente projetado ir demandar diferentes condies na PCR, e isto
conseqentemente importante para selecionar um design especfico para os
adaptadores, e para otimizar as condies para este design. Uma importante
caracterstica dos primers AFLP que todos primers comeam com um 5
resduo de guanina (G). ns achamos que uma 5 G-resduo no primer no
marcado crucial para prevenir o fenmeno de bandas duplas. As bandas
duplas aparecem em resultado de adio incompleta de um nucleotdeo extra
para os [strands] sintetizados (resultados no mostrados). Esta atividade
transferase terminal da Taq polimerase bastante forte, e havia sido
freqentemente informada. Ns tambm temos achado que o nucleotdeo 3
adicionado foi influenciado pela concentrao de dNTPs, e que bandas duplas
ocorrem em baixas concentraes de dNTPs indiferentemente do resduo 5
dos primers PCR (resultados no mostrados). Ns conclumos de nossos
resultados que esta atividade transferase terminal mais forte (quase 100%
dos [strands] sintetizados) quando o nucleotdeo 3 do [strand] sintetizado
uma citosina (C).
Nos experimentos descritos to longe, primers AFLP foram usados com
1 ou 2 nucleotdeos 3 seletivos. Este baixo nmero de nucleotdeos seletivos
foram mostrados para promover um caminho efetivo para selecionar o nmero
desejado de fragmento para amplificao. Posteriormente, primers com
[(...onger)] extenses 3 foram testados para determinar o nmero mximo de
nucleotdeos 3 seletivos que iria reter alta seletividade nas reaes AFLP. Para
este propsito, fingerprints foram gerados de DNA de levedura usando primers
com mais de 4 nucleotdeos seletivos. Uma nico primer EcoRI foi selecionado
com 1 nucleotdeo seletivo e combinado com 4 diferentes primers MseI com 1,
2, 3 ou 4 nucleotdeos seletivos, respectivamente. As extenses seletivas MseI
foram escolhidas em um caminho que com cada nucleotdeo seletivo adicional
um fingerprint iria ser gerado que o subconjunto do fingerprint precedente,
e.x. extenses +C, +CT, +CTC, +CTCA. O aparecimento de bandas que no
ocorrem no fingerprint precedente um indicador que fragmentos so
amplificados os quais no correspondem para a seqncia das bases seletivas,
e conseqentemente que a seletividade incompleta (Fig. 4).
Os fingerprints mostrados na Figura 4 e os fingerprints dos experimentos
anteriores demonstraram que a seletividade dos primers boa para primers
com 1 ou 2 nucleotdeos seletivos. A seletividade ainda aceitvel com primers
contendo 3 nucleotdeos seletivos, mas isto perdido com a adio do quarto
nucleotdeo. A perda da seletividade com primers contendo 4 bases seletivas
ilustrada pela amplificao de numerosas bandas no detectadas nos
fingerprints correspondentes com primers contendo 3 bases seletivas (compare
a linha D com a linha C). Isto indica a tolerncia de [mismatches] na
amplificao dos fragmentos usando primers AFLP com 4 bases na extenso.
Isto mais provvel que [mismatches] iro ser tolerados na primeira base
seletiva, porque este nucleotdeo est posicionado mais distante do final 3, e
porque a seletividade da base seletiva 3 ainda foi adequada. Outros
pesquisadores tambm tem investigado a seletividade dos nucleotdeos 3 de
primers PCR. Eles tem achado que [mismatches] foram tolerados em ambos o
ltimo e penltimo 3 nucleotdeo dos primers PCR, que est em conflito com
outros resultados. Em outros experimentos, ns temos achado que a
seletividade dos primers relativo e tambm depende do nmero de

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fragmentos amplificados em uma nica reao, as condies de PCR e o
design dos primers (resultados no mostrados). Ns cremos que alguns nveis
de amplificaes [mismatches] iro sempre ocorrer, mas que as condies de
reao podem prever estas bandas [mismatches] para alcanar os nveis de
deteco. Isto, presumidamente, a maior diferena com experimentos
anteriormente descritos.
AFLP fingerprinting de genomas complexos
Experimentos iniciais com AFLP fingerprinting de numerosos DNAs de
plantas e animais indicaram que primers AFLP com pelo menos 3 nucleotdeos
seletivos em ambos EcoRI e MseI primers foram requeridos para gerar padres
de bandas teis. Por causa dos primers com 3 nucleotdeos seletivos tolerarem
um baixo nvel de amplificaes [mismatch], uma segunda etapa de
amplificao estratgica foi desenvolvida para fingerprinting de DNAs
complexos. Na primeira etapa, chamada de pr-amplificao, o DNA genmico
foi amplificado com ambos primers tendo um nico nucleotdeo seletivo.
Posteriormente os produtos da PCR da reao de pr-amplificao foram
diludos e usados como modelos para a segunda reao AFLP usando ambos
primers com 3 nucleotdeos seletivos. Ns comparamos esta estratgia de
amplificao com a amplificao direta de DNAs genmicos complexos sem o
uso da etapa de pr-amplificao. A segunda etapa da amplificao estratgica
resultou em 2 importantes diferenas em relao amplificao direta. (i)
fundos sujeiras nos padres fingerprint foram reduzidos, e (ii) fingerprints com
primers de combinaes particulares faltaram 1 ou mais bandas comparado
com fingerprints gerados sem pr-amplificao. Isto melhor explicado
assumindo que a amplificao direta com primers contendo 3 nucleotdeos
seletivos resulta em um baixo nvel de produtos de amplificao [mismatch],
que causou o fundo sujo e deu discretos fragmentos amplificados
correspondendo a fragmentos de restrio repetidos. Uma vantagem adicional
da segunda etapa de amplificao estratgica que ela promove virtualmente
quantia ilimitada de modelos de DNA para reaes AFLP. A Figura 5 mostra
um nmero tpico de fingerprints AFLP obtidos com a segunda etapa de
amplificao estratgica usando DNAs de 3 espcies de plantas, Arabidopsis
thaliana, tomate (Lycopersicon esculentum) e milho (Zea mays), e DNA
humano. Para o DNA de Arabidopsis combinao de primers com um total de 5
nucleotdeos seletivos foram usados, por causa do pequeno genoma desta
espcie de planta (145Mb). Pra o DNA de tomate, milho e humano, 6
nucleotdeos seletivos foram usados, 3 bases seletivas para ambos primers
EcoRI e MseI.
Mtodos de DNA fingerprinting baseados na amplificao de fragmentos
de DNA genmico por primers ao acaso tem sido encontrado para ser bastante
suscetvel na concentrao de DNA modelos. Quantidades de DNA podem
variar consideravelmente entre amostras individuais isoladas por
procedimentos padres de extrao. Preferivelmente, a tcnica de DNA
fingerprinting mostrou ser insensvel na variao da concentrao de DNA
modelo. Conseqentemente, a sensibilidade da tcnica AFLP para a
concentrao de DNA modelo foi investigada.
AFLP fingerprints foram executados usando DNA de tomate e
combinao de enzimas EcoRI/MseI. Quantidade de DNA modelo foram
variadas de 2,5pg a 25ng. Na segunda etapa de amplificao o protocolo

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padro foi usado, com a exceo de uma etapa de pr-amplificao estendida
para 2,5 e 25pg de DNA das amostras modelo. Em tomate 2,5pg de DNA
modelo corresponde a aproximadamente 4 molculas para cada fragmento de
DNA no incio da reao AFLP. Padres AFLP fingerprint foram muito similares
usando quantidades de modelo que alcanou 1000 vezes, i.e. de 25ng a 2,5pg
(Fig. 6). Fingerprints gerados somente com 2,5pg de DNA modelo foram
similares para os outros fingerprints, embora bandas variaram
significativamente em intensidade e algumas bandas estavam ausentes. Os
resultados demonstram que o procedimento AFLP insensvel para a
concentrao do DNA modelo, embora fingerprints aberrantes iro ser
observados em diluies muito altas de DNA modelo dando somente umas
poucas molculas modelo no incio da reao. Muito provavelmente os
fragmentos de restrio individuais no esto distribudos ao acaso como
baixas concentraes de DNA explicando as diferenas observadas na
intensidade das bandas. Esta hiptese sustentada pelos nossos achados que
comparaes de um nmero de AFLP fingerprints individuais obtidos somente
com 2,5pg de DNA modelo mostrou alta variao na intensidade das bandas
individuais (resultados no mostrados).
Uma caracterstica notvel das reaes AFLP que geralmente o primer
marcado completamente consumido (o primer no ligado est em excesso), e
que conseqentemente a parada da reao de amplificao quando o primer
marcado est esgotado. Ns tambm achamos que ciclos adicionais na
amplificao no afeta o modelo de bandas desde que o primer marcado
consumido (resultados no mostrados). Esta caracterstica elegantemente
utilizada no protocolo AFLP, que usa um excesso de ciclos PCR, que ir
resultar em fingerprints de igual intensidade apesar da variao na
concentrao do modelo.
Ns tambm temos notado que DNA fingerprints tende a ser incerto se a
concentrao do modelo foi abaixo de certa concentrao absoluta ( 1pg)
indiferentemente da complexidade do DNA (resultados no mostrados). Em um
caso posterior, bandas foram observadas quais foram modelos independentes
e que tambm estavam se DNA no foi adicionado.
O uso de outras combinaes de enzimas de restrio para AFLP
fingerprinting de genomas complexos tambm foi investigado (resultados no
mostrados). Estas combinaes de enzimas incluem EcoRI, HindIII, PstI, BglII,
XbaI e Sse8387I (corte de 8 bases) em combinao com 8 MseI ou TaqI.
Fingerprints foram gerados em uma variedade de DNAs de plantas e animais.
O uso de TaqI como um corte de 4 bases no lugar da MseI resulta em uma
distribuio desigual dos fragmentos amplificados, que estavam presentes
principalmente na parte superior do gel. A maioria dos DNAs eucariticos so
ricos em AT, e como resultado MseI (reconhecimento da seqncia TTAA)
geralmente ir produzir muitos fragmentos de restrio pequenos comparado
com TaqI (reconhecimento da seqncia TCGA). MseI conseqentemente
preferida para AFLP fingerprinting porque ela corta muito freqentemente na
maioria dos genomas eucariticos rendendo fragmentos que esto no tamanho
timo para ambas amplificaes PCR e separao em gel de poliacrilamida
desnaturante. Outras enzimas de corte raro geralmente executaram o mesmo
para EcoRI em AFLP fingerprinting, e o nmero de bandas obtidas refletiram
freqncia de clivagem de vrias enzimas de restrio. Porm, EcoRI
preferida porque ela uma enzima de corte de 6 bases confivel (e baixo

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custo), que limita problemas associados com restries parciais em AFLP
fingerprinting (veja abaixo).
Restrio incompleta do DNA ir causar problemas no AFLP
fingerprinting, porque fragmentos parciais iro ser gerados, que ir ser
detectado pelo procedimento AFLP. Quando vrias amostras de DNA so
comparadas com AFLP fingerprinting, a restrio incompleta ir resultar na
deteco de diferenas em padres de bandas, que no refletem
verdadeiramente polimorfismos do DNA, i.e. quando uma amostra clivada
parcialmente e os outros no so. Restrio incompleta somente se tornar
clara quando diferentes amostras de DNA do mesmo organismo so
comparados. Ela caracterizada pela presena de bandas adicionais nas
linhas, predominantemente de alto peso molecular.
CONCLUSES
AFLP uma tcnica de DNA fingerprinting que detecta fragmentos de
restrio genmicos e se assemelha a tcnica RFLP (restriction fragment
length polymorfims), com a maior diferena que a amplificao PCR ao invs
da Southern Hybridisation usada na deteco dos fragmentos de restrio. A
semelhana com a tcnica RFLP foi a base para escolher o nome AFLP. O
nome AFLP, porm, mostrou no ser usado como uma sigla, porque a tcnica
ir mostrar presena ou ausncia de fragmentos de restrio em lugar de
diferenas compridas.
Em nosso protocolo AFLP inicial uma etapa adicional de purificao foi
incorporada na preparao do modelo. Adaptadores EcoRI [biotinylated] foram
usados para ligao e subseqentemente [biotinylated] fragmentos de DNA
(fragmentos EcoRI-MseI e EcoRI-EcoRI) foram [substracted] da mistura da
ligao usando [streptavidin beads]. Esta etapa reduziu a complexidade do
modelo DNA pela remoo de todos os fragmentos MseI-MseI, que provou ser
importante para gerar alta qualidade de fingerprints de DNAs complexos. O
protocolo descrito neste trabalho omitiu a etapa de purificao, porque as
condies de amplificao so usadas que resultam em amplificao
preferencial dos fragmentos EcoRI-MseI em relao aos fragmentos MseI-MseI
(Fig. 3). Este o resultado de um design cuidadoso dos adaptadores e dos
primers e caractersticas inerentes das reaes de amplificao AFLP.
A tcnica AFLP ir gerar fingerprints de qualquer DNA, indiferentemente
da origem ou complexidade, e neste trabalho ns temos apresentado AFLP
fingerprints de DNAs diferindo em tamanho de genoma em 100.000 vezes. Ns
temos descrito que o nmero de fragmentos amplificados pode ser controlado
pela freqncia de clivagem da enzima de corte raro e o nmero de bases
seletivas. Adicionalmente o nmero de bandas amplificadas pode ser
controlado pela natureza das bases seletivas; extenses seletivas com di ou
trinucleotdeos raramente ir resultar na reduo dos fragmentos amplificados.
Em geral, h uma correlao linear entre nmero de fragmentos amplificados e
tamanho do genoma. Esta correlao linear perdida em genomas complexos
de plantas superiores, quais contm alto nmero de seqncias repetidas e,
por isso, multicpias dos fragmentos de restrio. Fingerprints destes DNAs
complexos consistem predominantemente de fragmentos AFLP nicos, mas
so caracterizados pela presena de pequenos nmeros ou maior intensidade
de fragmentos repetidos.

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Em genomas complexos o nmero de fragmentos de restrio que
podem ser detectados pela tcnica de AFLP virtualmente ilimitado. Uma
nica combinao de enzimas (uma combinao de uma enzima de restrio
que reconhece 6 bases e outra que reconhece 4 bases) j ir permitir a
amplificao de 100.000s de fragmentos AFLP nicos, dos quais geralmente
50-100 so selecionados para cada reao. A maioria dos fragmentos
correspondem a uma nica posio no genoma, e, por isso, pode ser explorado
como marcos em mapas genticos e fsicos, cada fragmento sendo
caracterizado pelo seu tamanho e seus primers requeridos para amplificao.
Adicionalmente, a tcnica de AFLP permite deteco de fragmentos de
restrio em qualquer [background] ou complexidade, incluindo agrupamentos
de amostras de DNA e clonagem (e agrupamento) de segmentos de DNA.
Conseqentemente, a tcnica de AFLP no simplesmente uma tcnica de
fingerprinting, ela uma tecnologia de marcao em pesquisa genmica,
porque ela pode atravessar a lacuna entre mapas genticos e fsicos. Primeiro,
a tcnica AFLP uma ferramenta muito eficiente para revelar polimorfismos em
fragmentos de restrio. Estes fragmentos polimrficos, i.e. marcadores AFLP,
podem ser usados para construir mapas genmicos ou de segmentos de alta
densidade. Na maioria dos organismos AFLP ir demonstrar para ser o
caminho mais eficiente para construir mapas de marcadores genticos de DNA
comparados com outras tecnologias de marcadores existentes. Segundo, os
marcadores AFLP podem ser usados para detectar correspondentes clones
genmicos, por exemplo, cromossomos artificiais de levedura (YACs). Isto
mais eficazmente alcanado pelo trabalho com bibliotecas, quais esto
agrupados para permitir um rpido screening PCR e identificao subseqente
de clones. Um marcador AFLP ir detectar um nico clone YAC
correspondendo em grupos muito como 100 clones YAC. Finalmente, a tcnica
AFLP pode ser usada para fingerprinting de segmentos de DNA clonados tal
como cosmdeos, clones P1, cromossomos bacterianos artificiais (BACs) ou
YACs (resultados no mostrados). Por simplesmente usar ou no poucos
nucleotdeos seletivos, fingerprints de fragmentos de restrio iro ser
produzidos, quais subseqentemente podem ser usados para alinhar clones
individuais e fazer [contigs].
Nota: a tcnica AFLP coberto por patente pela Keygene N.V.