UNIVERSIDADE FEDERAL DO MARANHO

CENTRO DE CINCIAS EXATAS E TECNOLOGIA

PROGRAMA DE PS-GRADUAO EM QUMICA

PR-PROJETO DE PESQUISA

DETECO DE MICROCISTINAS EM AMOSTRAS DE GUAS NATURAL E POTVEL

EMPREGANDO BIOSSENSORES AMPEROMTRICOS BASE DE FOSFATASES

Mestranda:
Laiane Arajo da Silva Souto

Orientadora:
Prof. Dra. Gilvanda Silva Nunes

So Lus - MA
Maio/2015

UNIVERSIDADE FEDERAL DO MARANHO

CENTRO DE CINCIAS EXATAS E TECNOLOGIA
PROGRAMA DE PS-GRADUAO EM QUMICA

PLANO DE PESQUISA

DETECO DE MICROCISTINAS EM AMOSTRAS DE GUAS NATURAL E POTVEL

EMPREGANDO BIOSSENSORES AMPEROMTRICOS BASE DE FOSFATASES

Pr-Projeto de pesquisa apresentado ao

Programa de Ps Graduao em
Qumica da UFMA.

______________________________________
Laiane Arajo da Silva Souto
(Mestranda)

______________________________________
Prof. Dra. Gilvanda Silva Nunes
(Orientadora)

So Lus - MA
Maio/2015

DETECO DE MICROCISTINAS EM AMOSTRAS DE GUAS NATURAL E POTVEL

EMPREGANDO BIOSSENSORES AMPEROMTRICOS BASE DE FOSFATASES

Local de desenvolvimento:
Laboratrio do Ncleo de Anlise em Resduos de Pesticidas - NARP UFMA.
CCET, Bl 7, sala 307.
(98) 3272-8255.

Perodo de Execuo:
Maro de 2015 a fevereiro de 2017.

Equipe de Trabalho:
Laiane Souto - laianesa@hotmail.com
Fernanda Gabrielle Silva - NARP/UFMA fernandag.soares@hotmail.com
Prof. Dra. Gilvanda Silva Nunes NARP/UFMA - gilvanda-dapi@hotmail.com
Prof. Dr. Paulo Brasil Marques NARP/UFMA paulobrasil10@gmail.com

Colaboradores:
Prof. Dr. Paulo Brasil Marques NARP/UFMA paulobrasil10@gmail.com
Prof. Dr. Jean-Louis Marty Universidade de Perpignan, Frana - jlmarty@univ-perp.br

Resumo:
Ambientes aquticos eutrficos, ou seja, ricos em nutrientes oriundos sobretudo de esgotos
domsticos, favorecem a proliferao e predominncia de espcies de cianobactrias, que, por
sua vez, podem produzir diversas toxinas e liber-las no meio aqutico, e especial as
microcistinas. Geralmente, estas floraes tm grande impacto negativo nos corpos d'gua
alterando as caractersticas de qualidade, tais como odor e sabor. Alm disso, a presena das
toxinas, que no so eliminadas nos processos tradicionais de tratameto de gua, podem
causar srios problemas de sade aos homens e aos animais. Deste modo, a presena de tais
contaminantes deve ser controlada e monitorada em ambientes aquticos lnticos e na agia
potvel, sendo que normalmente as metodologias analticas empregadas para tal, baseadas em
tcnicas cromatogrficas (em especial HPLC/MS) so de elevado custo. O presente projeto
objetiva, portanto, desenvolver biossensores amperomtricos, de alta sensibilidade e baixo
custo, capazes de detectar esses contaminantes em amostras de guas natural e potvel. Para
tanto, inicialmente sero selecionadas as protenas fosfatases, como elementos de
biorreconhecimento, para construo dos biossensores, e testados diferentes procedimentos de
imobilizao enzimtica, otimizando-se em seguida o mtodo de inibio da fosfatase pelas
microcistinas, que ser o princpio de deteco destas. Os biossensores sero caracterizados,
mediante testes empregando voltametria cclica, voltametria de pulso diferencial,
cronoamperometria, alm de outras tcnicas eletroquicas, e as condies operacionais
(seleo do mediador eletroqumico, carga enzimtica, tipo e concentrao do substrato,
tempo de corrida cronoamperomtrica, pH do meio, etc) sero otimizadas para posterior
emprego dos biossensores serigrafados na anlise de microcistinas em amostras de guas
naturais (de rios e lagoas) e potvel da cidade de So Luis, MA. Este projeto representa uma
contribuio concreta ao desenvolvimento do Maranho, pois alm de possibilitar a realizao
de monitoramentos precisos, sensveis e a baixo custo, ainda poder originar tecnologias
(prottiipos analticos) com potencial de patenteabilidade e futura produo/comercializao.

1. INTRODUO
As cianobactrias, tambm conhecidas como algas azuis, so bactrias Gramnegativas procariontes fotossintticas que so encontradas em uma variedade de habitats,
colonizando bitopos aquticos e terrestres (MANKIEWICZ et al., 2003; BRIAND et al.,
2003). Seu domnio sobre as demais espcies do ecossistema uma indicao de que elas
possuem algumas capacidades fisiolgicas especficas que lhes permitem competir de forma
muito eficiente (JAYARAJ, ANAND e RAO, 2006).
Cianobactrias produtoras de toxinas so conhecidas por cianobactrias txicas, como
algumas linhagens de Microcystis, Anabaena, Oscillatoria e Cylindrospermopsis .Os efeitos
descritos de toxicidade de cianobactrias so diversos: dermatotxicos, hepatotxicos e
neurotxicos.(FONSECA,2014).Esses organismos produzem uma grande variedade de
metablitos secundrios com funo desconhecida, dentre esses metablitos esto as
cianotoxinas, um grupo diverso de toxinas naturais, tanto do ponto de vista qumico como
toxicolgico. Pela estrutura qumica as cianotoxinas podem ser divididas em trs grandes
grupos: peptdeos cclicos, alcalides e lipopolissacardeos, dentre os pepitideos cclicos as
principais representantes so as Microcistinas.-LR (MICHELINE,2014)
A microcistina-LR uma molcula pequena, composta por sete aminocidos, com
peso molecular entre 0,9 a 1,0 k Daltons classificadas como hepatotoxinas. Os pesquisadores
da rea tm mostrado que a microcistina-LR atua inibindo enzimas intracelulares
denominadas fosfatases, que removem os grupamentos de fosfato das protenas. Isso promove
uma alterao na estrutura do esqueleto celular causando disfuno, ou seja, modifica a
arquitetura e consequentemente a funo das clulas do fgado. (AZEVEDO, 2014).

2. REFERENCIAL TERICO E JUSTIFICATIVA

Vrios mtodos de deteco tm sido utilizados atualmente na deteco/quantificao
de microcistinas, tais como a cromatografia lquida de alta eficincia acoplada
espectrometria de massas (HPLC/MS), os bioensaios envolvendo animais de laboratrios, os
testes de inibio enzimtica (via colorimetria) e os testes imunolgicos baseados em ELISA
(do ingls, Enzyme Linked Immunosorbent Assay) (ETCHEGARAY E BUENO, 2010; LONG
et al., 2009)
Apesar de vrias tcnicas de anlise para deteco de microcistinas tais como
bioensaio, ELISA, HPLC e LC-MS j serem utilizadas, o desenvolvimento de biossensores
abriu novas perspectivas, pois oferece uma deteco rpida e precisa, alm de alta

reprodutibilidade, sensibilidade (LEBOGANG, 2014; SINGH et al,2012). Destaca-se ainda a

e possibilidade desses aparatos virem a ser portteis, ale da miniaturizao e rapidez de
resposta (LEITE, 2012).
Biossensor um dispositivo no qual o material de origem biolgica, tais como enzima,
organela, tecido animal ou vegetal, microrganismo, antgeno ou anticorpo, cidos nucleicos,
lectina, entre outros, imobilizado junto a um transdutor adequado. (RICCARDI et. al.;
2008).O transdutor amperomtrico emprega a medida de intensidade de corrente de uma
clula eletroqumica a um potencial fixo, sendo a corrente gerada por reao redox na
superfcie sensitiva, proporcional a concentrao do analito. No biossensor cataltico a enzima
adequada, imobilizada na superfcie do eletrodo, catalisa a reao dos substratos e o
monitoramento da corrente eltrica poder ser efetuado devido a formao dos produtos ou
consumo de regente.
Geralmente um biossensor permite o uso de mtodos limpos e de baixo custo sem
precisar de pr-tratamentos morosos e de grandes volumes de amostra. O seu uso, na maioria
dos casos, no necessita de tcnicos ou especialistas podendo em alguns casos dispensar o uso
de reagentes, e aparecendo tanto como aparelhos de uso contnuo ou como descartveis
(SALGADO, 2001).
Inmeros registros de florescimentos de cianobactrias tm sido realizados no pas,
sendo que uma expressiva parcela (>50%) tem reconhecido potencial txico (YUNES et al.,
1996; 1998; MINILLO et al. 2000). Conforme SANTANNA E AZEVEDO (2000) existem,
no Brasil, cerca de 20 espcies de 14 gneros de cianobactrias que so txicas, porm, em
vrios Estados brasileiros, principalmente aqueles situados nas regies Norte, Nordeste e
Centro Oeste, os dados continuam subestimados. Assim, a contaminao por Microcistina LR, , um problema Ambiental e de Sade Pblica.
A utilizao de biossensores especficos para a deteco/quantificao desses
compostos levando-se em considerao o princpio da inibio da enzima fosfatase por
microcistinas, parece ser uma alternativa prtica vivel para determinaes em campo, pois
a sua utilizao simples e rpida, no necessitando de prvio tratamento da amostra.
Desta forma, esse trabalho objetiva promover a deteco de microcistinas em amostras
de guas naturais estagnadas (rios, mananciais, lagoas, etc) e de gua potvel, mediante uso
de biossensores amperomtricos, como uma forma de contribuir para o desenvolvimento de
trabalhos envolvendo monitoramentos in situ em reas contaminadas ou em reservatrios de
gua potvel.

3. OBJETIVOS

3.1. Objetivo Geral

Desenvolver biossensores amperomtricos, utilizando diferentes fosfatases como elementos
de biorreconhecimento para detectar microcistinas em amostras de guas natural e potvel.

3.2. Objetivos Especficos

-Definir as protenas fosfatases que sero utilizadas no processo, atravs da sua atividade
relativa e inibio (teste ELISA).
-Testar diferentes procedimentos de imobilizao enzimtica determinando qual o melhor
mtodo para inibir fosfatases.
- Inibir enzimas fosfatases utilizando o mtodo apropriado e previamente testado.
- Preparar e otimizar, mediante testes empregando voltametria cclica, as condies
operacionais (seleo do mediador eletroqumico, carga enzimtica, tipo e concentrao do
substrato, tempo de corrida cronoamperomtrica, pH do meio, etc) dos biossensores
serigrafados;
- Aplicar os sistemas biossensores na deteco de microcistinas em amostras de gua natural e
potvel.
4. MATERIAL E MTODOS

4.1. Reagentes e Solues

Para estudo cintico da atividade enzimtica na ausncia e na presena do inibidor,
sero utilizados os seguintes materiais: p-nitrofenol (PNP) e p-nitrofenilfosfato (PNPP,
substrato cromognico) Sigma-Aldrich Co. (St. Louis, MO, EUA); Enzimas
fosfatases obtidas comercialmente; Soluo-tampo Tris-Glicinato de sdio, 100 mM,
pH 9,5 Merck (Alemanha); Solues de NaOH a 0,1 M e 2 M; Microcistina-LR
(C49H74N10O12, PM = 995,2 g/mol, 96% pureza, solvel em DMSO, etanol ou etanol a
100%) Alxis Biochemicals (San Diego, CA, EUA) soluo estoque: 104 g/L.
Para preparao dos biossensores impressos, sero empregados: lcool polivinilico
contendo grupamentos estirilpiridnicos (PVA-SbQ, forma betana) Toyo Gosei
Kogyo Co. (Chiba, Japo); Soroalbumina bovina (BSA) Biochemical, Biochemical,
BDH Lim. (Poole, Inglaterra); Glutaraldedo a 25% Fluka Chemie (Basel, Sua).
4.2. Caracterizao Inicial dos Eletrodos Impressos
Sero selecionados eletrodos serigrafados em uma base de PVC. Os sistemas
apresentam na sua constituio trs eletrodos: de trabalho, auxiliar e de referncia (Fig. 1).

4.3. Medidas eletroqumicas

Para as anlises por voltametria cclica (CV), ser empregado o aparelho AUTOLAB
(Ecochemie BV, Utrecht, Holanda), que consiste de um sistema de aquisio de dados,
conectado a um potenciostato/galvanostato.

Figura 1. Biossensor baseado na enzima PP contendo trs eletrodos: a eletrodo de

referncia Ag/AgCl; b eletrodo auxiliar de grafite; c eletrodo de trabalho contendo:
TCNQ (mediador), PP(elemento de biorreconhecimento) . Contatos eltricos (d) feitos com o
potenciostato atravs de um conector apropriado.

4.4. Determinao da atividade da enzima fosfatase alcalina em soluo

O mtodo, desenvolvido por Bowers & McComb baseia-se na reao de hidrlise do:
p-nitrofenilfosfato (PNPP), catalisada pela enzima fosfatase alcalina, dando origem ao
p-nitrofenol (PNP) (Fig. ). O PNP incolor no pH do ensaio, mas em meio fortemente
alcalino (a reao enzimtica interrompida pela adio de NaOH 2 M), apresenta-se amarelo
( = 410 nm; = 18.400 M-1. cm-1).

Figura 2. Reao de hidrlise do p-nitrofenol, catalisada pela enzima fosfatase.

4.5. Imobilizao Enzimtica

- Sero testados 2 mtodos de imobilizao da fosfatase:
A) Imobilizao com glutaraldedo: Uma pasta sensvel ser preparada com enzima fosfatase,
glutaraldedo e tampo fosfato (pH 7,5), que ser posteriormente depositada sobre o eletrodo
de trabalho, e conjunto deixado em repouso a 4C por 24h). Em seguida, o eletrodo ser
lavado com tampo fosfato (pH 7,5) e estar pronto para avaliao.
B) Imobilizao com PVA-SbQ: sero misturados a enzima fosfatase, o PVA-SbQ e o tampo
fosfato (pH 7,5). A mistura ser homogeneizada em um agitador Vortex, e a pasta enzimtica
resultante depositada sobre o eletrodo de trabalho. Em seguida, ser aplicada luz de nenio
sobre o eletrodo de trabalho por no mnimo 18h em uma temperatura de 4C, a fim de se
realizar a fotopolimerizao da enzima. Depois disso, o biossensor ser deixado em repouso a
4C por 24h (Fig. 3).

Fig. 3. Mistura da enzima com PVA-SbQ, seguido de fotopolimerizao sob refrigerao.

4.6. Ensaios de Inibio

O substrato (fosfatase) ser adicionado ao tampo fosfato pH 7,5 e a intensidade de
corrente inicial (Io) monitorada cronoamperometricamente em um potenciostato. Aps
lavagem do biossensor, seguida de incubao deste na soluo ou na amostra de gua ou de
uma soluo dopada com o inibidor (microcistina), o biossensor ser novamente lavado e um
segundo sinal de corrente (inferior) ser registrado (I). O valor de dI ser proporcional
concentrao da toxina e a inibio relativa (IR) poder ser calculada como segue (Fig. 4)

Potentiostat

Recorder
Intensity

I1

Buffer

Time
Substrate

Cell
Magnetic stirring

Figura 4. Esquema do ensaio de inibio enzimtica.

4.7. Testes Eletroqumicos e Otimizao das Condies Operacionais

Sero empregadas as tcnicas voltamtricas (voltametria cclica, voltametria de pulso
diferencial, cronoamperometria, etc.) no s para caracterizar os biossensores obtidos, como
tambm para otimizar as seguites condies operacionais:
Seleo do mediador eletroqumico sero testados os mediadores ftalocianina de
cobalto (CoPC) e Meldolas Blue;
Escolha do potencial de trabalho;
Seleo da enzima e sua carga enzimtica;
Escolha do Substrato e sua concentrao;
pH do meio (faixa de trabalho tima para a enzima);
Tempo de corrida cronoamperomtrica;
Condies para inibio (carga da enzima, faixa de concentrao da microcistina,
tempo de inibio,etc).

4.8. Determinao das Figuras de Mrito

A partir da otimizao das condies anteriormente citadas, ser selecionado o
melhor sistema biossensor para deteco de microcistinas de determinadas as seguinets
figuras de mrito:
Preciso das medidas eletroqumicas utilizando o biossensor (repetibilidade e
reprodutibilidade);
Faixa linear de trabalho (linearidade das concentraes da microcistina);
Limiteis de deteco e de quantificao;
Exatido (ndice de recuperao).

4.9. Anlises das Amostras de gua

Sero tomadas para anlise amostras de guas natural e potvel de diferentes fontes
da cidade de So Lus, e aplicados os biossensores para microcistnas otimizados, a fim de se
determinar a presena desses contaminantes.

5. CRONOGRAMA DE ATIVIDADES
2015.2

Atividades
1

SEMESTRES
2016.1
2016.2
Bimestres
4
5
6
1
2

2017.1
3

1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11

1.
2.
3.
4.
5.
6.

Atividades:
Reviso bibliogrfica
Avaliao da atividade enzimtica
Estudo imobilizao enzimtica/seleo substrato
Preparo e otimizao dos biossensores
Testes com solues do inibidor det. figuras de mrito
(preciso e linearidade)
Ensaios de recuperao com solues
e guas naturais e potveis dopadas (exatido)

7. Coleta e testes em amostras reais

8. Estudos em ambientes naturais
empregando os biossensores
9. Elaborao de monografias dissertaes,
Teses, artigos e patente(s)
10. Divulgao dos resultados em eventos
cientficos
11. Depsito(s) de patente(s) no INPI

6. ORAMENTO

Este projeto foi previamente aprovado no Depto de Tecnologia Qumica, CCET/UFMA, e

ser todo financiado com recursos oriundos da SEMA (Contrato SEMA/FSADU 07/2014).
Itens de Custeio
Item

Justificativa

Valor
Total (R$)

Material de consumo suprimentos para cromatografia

(colunas, filtros e membranas de extrao, cartuchos, fases
estacionrias, etc.), padres de subst. quimicas, padres
certificados, adsorventes e vidrarias em geral

Material necessrio construo e

testes dos biossensores

25.000,00

SUB-TOTAL

25.500,00

REFERNCIAS
AZEVEDO, S. M. Toxinas de Cianobactrias: Causas e Consequncias para a Sade Pblica.
Medicina On - Line, v. 1, n. 3, p.1-16, 2014.
BRIAND, J.; JACQUET, S.; BERNARD, C.; HUMBERT, J: Health hazards for terrestrial
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2003.
ETCHEGARAY, A.; BUENO, C. C. Identificao de Microcistina LR ao nvel molecular
empregando microscopia de fora atmica. Quim. Nova, v. 33, n. 9, p. 1837-1842, 2010.
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JAYARAJ, R.; ANAND, T.; RAO, P. V. L. Activity and gene expression profile of certain
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LEITE, C. M.; VERBINNEN, R.T.; MARQUES, P. R. B. O.; NUNES, G. S Desenvolvimento
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