UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE UFF

Faculdade de Farmcia
Departamento de Tecnologia Farmacutica

Relatrio de Tecnologia Enzimtica e das

Fermentaes
Curva Padro e Curva de Crescimento de Saccaromyces cerevisiae

Professoras: Yanina M. A. Calvette

Sorele B. Fiaux
Alunos:

Gabriel Duarte (Turma KC)

Fernanda Krajewski( Turma KC)
Letcia F. de Castro (Turma KC)
Mayara Nogueira Lara (Turma KC)

Niteri, 20 Maio de 2015.

1. Introduo
1.1 Saccharomicces cerevisiae
A Saccharomicces cerevisiae bastante empregada pelo homem, pode ser
utilizada em indstrias de fermentao, alimentcia e de bebidas. As principais
caractersticas que as tomam microrganismos interessante para processos industriais
so:
Desenvolvimento atravs de substrato barato e de fcil disponibilidade
Facilidade de obteno e reproduo
Utilizao de nutrientes em suas formas mais simples
Possibilidade de cultivo independente do ambiente
Pouca exigncia de gua e de espao (rea)
Formao de produtos com valor nutritivo
Outra vantagem do emprego de clulas da S. cerevesiae sua fcil utilizao em
procedimentos moleculares e seu completo sequenciamento gentico. 1
1.1Condies Ambientais
Vrios fatores influenciam o cultivo da S. cerevisiae. O crescimento celular depende
de fatores como pH, temperatura, componentes do meio de cultura e a disponibilidade
de oxignio para a clula.2
As temperaturas timas para sua utilizao em processos industriais esto entre 25
e 35C e o pH timo entre 4,5 e 5,5. Fontes de carbono e nitrognio so muito
importantes no crescimento desses microrganismos, o modo de aplicao e a seleo
de fontes de carbono um dos fatores crticos dos processos fermentativos, pois
muitos compostos, especialmente aucares, podem causar intensa represso
catablica de sntese de vrias enzimas, alm da reduo na velocidade de
crescimento. O estudo da agitao e da aerao em processos fermentativos tambm
essencial, acredita-se que os objetivos principais so a disperso de bolhas de ar, com
consequente suprimento de oxignio aos microrganismos, a manuteno das clulas
em suspenso e o aumento da transferncia de calor e massa no meio. 2
1.2 Importncia para a industria
Saccharomyces cerevisiae se desenvolve tanto em condies aerbias como
anaerbias. Em presena de oxignio e baixa concentrao de acar, a levedura
transforma a glicose em gs carbnico e gua, liberando uma quantidade de energia
que ser utilizada no prprio metabolismo celular. Em alta concentrao de acar, na
presena ou ausncia de oxignio, a levedura fermenta transformando acar em gs
carbnico e lcool e liberando uma quantidade menor de energia. 3
A levedura S. cerevisiae obtida nas destilarias, depois de usada como fermento
para a obteno do lcool a partir da cana de aucar. Ela pode ser considerada como
um residuo na produo do lcool.
Na produo de bolos e pes, a S. cerevisiae transforma os acares disponveis na
massa em lcool e gs carbnico, sendo este ltimo o responsvel pelo crescimento da
massa. O termo "fermento biolgico" se aplica s culturas puras de Saccharomyces
cerevisiae vendidas no comrcio, para conferir um sabor prprio e aumentar o volume
e a porosidade de pes e outros produtos de confeitaria. No deve ser confundido com
o fermento qumico (geralmente bicarbonato de sdio) .3

1.2 Processos fermentativos

Em termos gerais, o processo fermentativo se implica na utilizao de

microrganismos para a obteno de um produto desejado atravs de matria orgnica
(substrato) catalisada por enzimas.2
Hoje em dia temos diversos produtos utilizados nas indstrias qumicas,
farmacuticas e de alimentos que so obtidos por processos fermentativos. Estes
produtos podem ser produzidos pelo metabolismo primrio (ex: etanol) ou secundrio
(ex: antibiticos) do microrganismo cultivado e ao lado da produo de biomassa,
enzimas e protenas em geral, eles so os responsveis pela evoluo tecnolgica e
desenvolvimento das pesquisas na rea.
Em termos industriais, portanto, aceita-se a denominao fermentao ou processo
fermentativo para caracterizar qualquer transformao intermediada por um
microrganismo atravs de uma sequncia de reaes bioqumicas. Assim, tambm so
considerados processos fermentativos as transformaes envolvendo respirao
microbiana, biossntese, fotossntese e respirao com substratos orgnicos. 4

2. Objetivo:

Elaborar as curvas padro e de crescimento utilizando a levedura Saccharomyces

cerevisiae PEDRA por meio da tcnica de Densidade tica associada ao Peso Seco, a
fim de se obter a concentrao do inculo, a taxa especfica de crescimento ( ) e o
tempo de gerao (tg) deste microrganismo.

3. Material e Mtodos (Procedimentos)

3.1

Materiais para a curva padro

Bales volumtricos(10,0ml; 25,0ml; 50,0ml; 100,0ml);

Pipetas volumtricas(1,0ml; 2,0ml; 5,0ml; 10,0ml);
Pipetas Pasteur
Erlenmeyers (100,0ml e 250,0ml);
Cubetas de espectrofotmetro
Espectrofotmetro
Tubos de centrfuga
Centrfuga
Cpsulas de porcelana
Estufa
Balana

Composio do meio de cultura para curva padro

O meio de cultivo foi preparado segundo as quantidades descritas abaixo:
Acar cristal
Sulfato de amnio
Fosfato dicido de
potssio
Extrato de lvedo
Sulfato de magnsio
7.H2O
gua destilada q.s.p
pH

10 g/L
5,0 g/L
1,5 g/L
5.0 g/L
0,5 g/L
1000 mL
6,0

3.2

Materiais para curva de crescimento

Balo de fundo chato de 2000 mL

Filtro
Tubo de exausto
Tubo de coleta
Compressor de ar
Bico de Bunsen
Pipeta Pasteur

Nota: O Balo de fundo chato de 2000 mL contm 1000 mL demeio de cultivo estril,
adaptado a um filtro e um compressor de ar e um tubo de exausto que permite a
sada de ar e tubo de coleta para retirada da amostra.

Composio do meio de cultura para curva de crescimento

3.3

Mtodos

3.3.1 Curva

Acar cristal
Sulfato de amnio
Fosfato dicido de
potssio
Extrato de lvedo
Sulfato de magnsio
7.H2O
gua destilada q.s.p
pH

10 g/L
5,0 g/L
1,5 g/L
5.0 g/L
0,5 g/L
1000 mL
6,0

padro

Para a obteno da suspenso de clulas do Saccharomyces cerevisiae, realizouse o cultivo de fermento biolgico, que foi crescido por cerca de 24h em 100 mL do
meio de cultivo sob agitao a 30C.
O preparo da suspenso me foi realizado dividindo-se em 2 tubos de centrfuga
os 100 mL da suspenso de clulas obtida anteriormente (50 mL para cada tubo). Os
tubos foram conduzidos centrfuga e submetidos centrifugao por 10 minutos a
3000 rpm. O sobrenadante foi retirado com o auxlio de Pipeta de Pasteur e em seguida
as clulas foram ressuspendidas com gua destilada, repetindo o procedimento de
centrifugao e remoo do sobrenadante por duas vezes. Aps este procedimento os
resduos do tubo foram transferidos para um balo volumtrico de 100 mL e ele foi
avolumado.
Para a obteno da concentrao celular da suspenso me (Peso Seco)
pesaram-se 2 cpsulas de porcelana vazias, e em seguida retirou-se 5 mL da
suspenso me (em duplicata) e transferiu-se para as cpsulas previamente secas e
taradas em uma estufa a 80C por 24h. Estas foram ento novamente secas nas
mesmas condies, resfriadas e ento pesadas.
Obteve-se o peso seco de massa celular pela diferena de peso entre as cpsulas
cheia e vazias, dividida pela alquota de soluo me adicionada s cpsulas. O valor
do peso seco foi expresso em grama por litro.
Em seguida foram feitas 4 diluies, selecionadas arbitrariamente, de 1:25 1:35
1:50 1:100 1:200. Estas diluies foram feitas transferindo alquotas da suspenso me
para bales volumtricos que foram avolumados com gua destilada.
Leu-se a densidade tica atravs do espectrofotmetro, no comprimento de onda
a 540nm. Como branco para calibrar o aparelho, utilizou-se gua destilada.

3.3.2 Curva de crescimento

O inculo foi preparado a partir do crescimento do Saccaromyces Cerevisiae em
um erlenmeyer contendo 100 mL de meio de cultivo de mesma composio e meio de
preparo da curva padro. O meio de cultivo estava sob condies asspticas. O inculo
foi crescido por 16h a 30C e 180 rpm.
Adicionou-se 100 mL do inculo em um balo de fundo chato de 2000 ml
contendo 1000 ml do meio estril, com um filtro, compressor de ar e um tubo de
exausto adaptados.
Em intervalos de tempo regulares, foram retirados aproximadamente 5 mL em
duplicata da suspenso pelo tubo de coleta.
Aps a coleta, o volume foi marcado e centrifugou-se a amostra durante 10
inutos a 3500 rpm. Em seguida, lavou-se duas vezes o resduo de clulas com gua
destilada, centrifugando a novamente.
Ressuspendeu-se a amostra para o mesmo volume e em seguida, fez-se a leitura
da densidade ptica pelo espectrofotmetro em 540 nm, utilizando gua destilada
como branco.

4. Resultados
4.1 Curva Padro
Fez-se a mdia aritmtica dos pesos secos encontrados para as duas alquotas
da suspenso-me e calculou-se a concentrao em g/L.
Grup
o

Cpsul
a

Peso da
Peso da cpsula
cpsula
com S.
vazia (g)
cerevisiae (g)
G2
6
43,5945
43,6056
G2
7
44,8990
44,9111
aritmtica dos pesos secos

Peso clulas = 0,1160 g

Massa de
clulas
secas (g)
0,0111
0,0121

Mdia (g)

Tabela
1. Mdia

0,0116

0,0116g ------- 10 mL
Xg ---------------1000mL
X = 1,16 g/L de clulas

Para a construo da curva padro, realizaram-se diluies seriadas da soluo me

e a densidade ptica de cada diluio foi medida pelo espectrofotmetro. Os valores de
densidade tica das amostras diludas bem como os valores de peso seco para as
respectivas diluies podem ser observados na tabela 2:

Tabela 2. Tratamento de dados Curva padro

Diluio
1:25
1:35
1:50
1:100
1:200

Densidade ptica
A
B
Mdia
0,402
0,405
0,4035
0,325
0,323
0,324
0,189
0,188
0,1885
0,091
0,100
0,0955
0,074
0,072
0,073

Fator de Diluio

Peso Seco (g/L)

0,04
0,0286
0,02
0,01
0,005

0,0464
0,0331
0,0232
0,0116
0,0058

A partir dos dados da tabela 2, plota-se a curva padro que relaciona a

densidade tica com o peso seco das clulas.

Curva Padro
f(x) = 8.94x
R = 0.99

Grfico 1: Curva padro DO x PS

Para esta curva temos: y= 8,9383 . x;
Logo, DO = 8,9383 . PS

PS=

DO
8,9383

4.2 Curva de Crescimento

Para o clculo das concentraes da massa celular utilizaram-se as mdias dos
valores de absorvncia obtidos experimentalmente para cada tempo de cultivo (em
horas) e relacionaram-se estas s concentraes atravs da equao obtida a partir da
curva padro: PS = DO / 0,8938, onde DO representa a densidade tica obtida
experimentalmente e PS a concentrao da massa celular.
Algumas amostras coletadas a partir do meio de cultivo tiveram sua massa
celular diluda pois aps um determinado tempo de cultivo, o crescimento j havia sido

grande o suficiente para prejudicar a leitura de densidade tica das amostras no

espectrofotmetro.
Tabela 3. Dados para contruo da curva de crescimento
N
pont
o

Aluno
Responsv
el

Horrio

Tempo
(h)

Dilui
o

DO 1

DO 2

Mdia
DO

Peso Seco
(g/L)

Tatiane

12:30

0,431

0,456

0,4435

0,04962

Peso
Seco
corrigid
o
(g/L)
0,04962

Letcia

13:09

0,65

1:5

0,105

0,104

0,1045

0,01169

0,05845

Vitor

14:05

1,58

1:5

0,132

0,156

0,144

0,01611

0,08055

Mayara

15:05

2,58

1:5

0,171

0,169

0,170

0,01902

0,0951

Fernanda

16:15

3,74

1:5

0,253

0,248

0,2505

0,02803

0,14015

Gabriel

17:00

4,5

1:10

0,238

0,265

0,2515

0,02814

0,2814

Carla

18:00

5,5

1:12,5

0,323

0,327

0,325

0,03636

0,4545

Talita

19:00

6,5

1:25

0,173

0,176

0,1745

0,01952

0,488

ln PS

3,004
2,840
2,519
2,353
1,965
1,268
0,788
0,717

Com base nos dados da tabela 3, plota-se a curva de crescimento da levedura

Saccharomyces cerevisiae:

Curva de Crescimento

Grfico 2. Curva de crescimento da levedura Saccharomyces cerevisiae.

Plota-se ento a curva de crescimento linearizada a fim de identificar a fase
exponencial do crescimento.

Grfico 3. Curva de crescimento linearizada da levedura Saccharomyces

cerevisiae.
Com base em dados da literatura, possvel observar que em cerca de 3 horas
de cultivo a levedura Saccharoymes cerevisiae se encontra na fase exponencial de
crescimento. 5
Ento, do quinto ponto ao stimo, observado que a curva adquire um carter
exponencial, sendo estes pontos os que representam a fase exponencial de
crescimento e os quais sero utilizados para obtermos os valores da taxa especfica de
crescimento () e o tempo de gerao (tg), tempo necessrio para duplicao da
massa celular dessa levedura, para tanto plota-se a curva da fase exponencial de
crescimento linearizada.

f(x) = 0.66x - 4.36

R = 0.97

Grfico 4. Curva exponencial de crescimento linearizada da levedura

Saccharomyces cerevisiae.
Portanto, para esta curva, temos:
y = 0,6591x 4,3588 ; onde y = ln PS e x = tempo

Logo,

ln PS=0,6591t 4,3588

Sendo o coeficiente angular da reta = 0,6591.

Conhecendo o valor de , podemos calcular o tempo de gerao (tg):

tg=

ln 2
ln 2
=
=1,052 h
0,6591

5. Discusso
A concentrao celular do inculo empregado no experimento foi obtido atravs
do clculo:

Cinculo x Vinculo = C0 x V0
Ci x 0,1 L = 0,04962 x 1,0
Ci = 0,4962 g/L

A curva padro construda com o intuito de relacionar a turbidez da amostra

com a concentrao celular. Para isto, esta curva de calibrao construda utilizando
um mtodo direto de medida de concentrao de clulas, que o peso seco.
A turbidez, quando associada ao peso seco um mtodo muito utilizado para se
determinar a concentrao celular. necessrio cruzar esses dois parmetros pois a
turbidez, como um mtodo nico, no um mtodo suficiente para se conhecer a
concentrao celular de uma amostra. preciso se assegurar tambm que a soluo
no tem slidos em suspenso que possam acabar interferindo na turbidez.
Nossa curva padro apresentou um R = 0,9853, apresentando uma linearidade
satisfatria.
A curva de crescimento feita observando-se o crescimento celular em
intervalos de tempo. Existem seis fases que podem ser observadas para o crescimento
celular e para cada uma delas existe um diferente. Este conhecido como taxa
especfica de crescimento e uma grandeza inversamente proporcional ao tempo.
As fases onde apresentam um crescimento celular, que so elas: fase lag
(latente), fase de acelerao de crescimento, fase exponencial de crescimento, fase de
desacelerao do crescimento apresentam esta taxa maior do que zero ( >0). A fase
estacionria onde no h crescimento celular nem morte apresenta = 0 e a as fases
seguintes, onde h morte celular, apresentam uma taxa especfica de crescimento
menor que zero.
Na curva de crescimento, houve uma linearizao da sua fase exponencial que
por sua vez apresentou um R= 0,9663. Este valor um pouco abaixo do esperado
devido a erros associados muitos analistas fazendo a medida. A linearizao da fase
exponencial necessria, pois nesta fase que a taxa especfica de crescimento
constante e diferente de zero.
QUESTES

1 Calcule a concentrao celular do inoculo empregado no experimento

executado objetivando a coleta de dados usados para construir a curva de
crescimento.

Cinculo x Vinculo = C0 x V0
Ci x 0,1 L = 0,04962 x 1,0
Ci = 0,4962 g/L
2- Explique a importncia do inoculo ser constitudo de clulas em fase de
crescimento exponencial.
A fase Lag (latente) a fase de adaptao do microorganismo ao meio. Nesta
fase no h crescimento microbiano e portanto uma fase sem interesse para as
industrias. Sendo assim, procura-se um modo de eliminar ou reduzir o tempo desta
fase. Logo, o inoculo sendo constitudo de clulas na fase exponencial, a fase Lag
consegue ser reduzida.
3- A curva de crescimento resultante do trabalho corresponde uma curva de
crescimento tpica, com todas as suas fases?
Uma curva de crescimento tpica constituda de sete fases. So elas a fase lag
(ou latente), fase de acelerao do crescimento, fase exponencial do crescimento, fase
de desacelerao do crescimento, fase estacionria, fase da acelerao de morte e
fase de morte.
Observando o grfico correspondente curva de crescimento
conseguimos observar a ausncia da fase lag, da fase estacionria, da fase da
acelerao de morte e de morte.
A fase lag (latente) a fase de adaptao do microorganismo ao meio e (taxa
especfica de crescimento) igual zero. Notamos que essa fase no est presente em
nosso grfico pois no primeiro intervalo de tempo j se nota o crescimento de
microorganismos.
A fase estacionria, onde =0, no apresenta crescimento microbiano e as fases
de acelerao de morte ( <0) e morte (< 0 e constante) tambm no esto
presentes no nosso grfico. Evidenciamos este fato visto que o final da curva de
crescimento ainda apresenta crescimento microbiano. Isto se deve ao fato do curto
tempo de durao da anlise.
As fases presentes na curva de crescimento foram:
- Fase de acelerao de crescimento - >0;
- Fase exponencial de crescimento - >> 0, constante e mximo;
- Fase de desacelerao do crescimento - > 0.
4- Explique porque necessrio construir uma curva padro para cada
microorganismo e justifique a necessidade de construir diferentes curvas
padro para o mesmo microorganismo.
necessrio construir uma curva padro para cada microorganismo pois cada
um se desenvolve de uma diferente maneira, em condies diferentes, tornando a
curva padro mais restrita. Assim, uma mudana de microorganismo ou parmetro de
anlise, deve ocasionar uma mudana na curva padro, uma nova construo da
mesma.

5- Variaes, como mudana de microorganismo, alterao de equipamentos

(por exemplo, espectrofotmetro) e alteraes drsticas no meio de cultivo
exigem a construes de novas curvas padres. Por qu?
Quando alteramos qualquer parmetro devemos construir novas curvas padro.
Isto acontece pois, a anlise estaria sendo baseada em dados que no correspondem
aos que vo ser utilizados na anlise da amostra. A mudana de condies do meio e
do prprio microorganismo altera o comportamento e o crescimento do
microorganismo, a mudana nos equipamentos tem efeito na sensibilidade, alterando
resultados e assim sendo necessrio construir uma nova curva padro com as novas
condies.
6- O uso de curva peso seco versus densidade tica no indicada para a
determinao de clulas viveis. Como poderamos construir uma curva
padro que relacionasse a densidade tica concentrao de clulas viveis
de um microorganismo?
Um mtodo utilizado para clulas viveis o de contagem por plaqueamento.
Nesta tcnica o inoculo espalhado por toda a extenso do meio solidificado com
auxlio da ala Drigalski e pode ser usada para isolamento, contagem e identificao
dda morfologia das colnias.
Para a construo da curva padro seria necessrio inicialmente plaquear e
incubar o inoculo e ento fazer a contagem das unidades formadoras de colnia de
clulas viveis e ento, a partir deste dado seria possvel relacionar a densidade tica
com a concentrao de clulas viveis.
7- Avalie e justifique os mtodos para confeco da curva padro e da curva
de crescimento so viveis em escala industrial.
Em escala industrial, a curva padro e a curva de crescimento conseguem ser
confeccionadas. Isto porque elas funcionam como antecessoras ao processo industrial.
Anteriormente ao processo na indstria preciso testar condies e parmetros para
as reaes e nessa fase experimental sero feitas curvas padro e curvas de
crescimento. Sendo assim, quando achada a melhor condio para seguir para uma
escala maior, a confeco destas curvas vivel.

6. Concluso
O experimento foi realizado com sucesso. Em suma, conseguimos calcular a
concentrao do inoculo empregado no experimento utilizando o mtodo de turbidez
associada ao peso seco de clulas, o tempo de gerao (tg), e construmos as curvas
padro e de crescimento para o estudo do crescimento microbiano do Saccharomyces
cerevisiae.

7. Bibliografia:

1) RIO, D. T. Biossoro de Cdmio por leveduras Saccharomyces cerevisiae. Piracicaba,

2004. 54p. Tese (Mestrado em Agronomia) Departamento de Microbiologia agrcola
Universidade de So Paulo.
2) NEVES, L. C. M. Reviso bibliogrfica. Disponvel em:
http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/9/9134/tde-08102006175534/publico/RevisaoBibliografica.pdf
Acesso em: 18 de maio de 2015.
3) MALAJOVICH M. A. Biotecnologia. Rio de Janeiro, Axcel Books do Brasil, 2004
4) BARROS, N. M.; AZEVEDO, J. L.; SERAFINI, L. A. Biotecnologia: avanos na agricultura
e na agroindstria. Caxias do Sul RS: Editora EDUCS, 2002.
5) SANT'ANNA, E.S.; RODRIGUES, A.M.; Efeito do cloreto de sdio na produo de
protenas (Saccharomyces cerevisiae) em fermentao semi-slida. Universidade Federal
de Santa Catarina - Depto. de Cincia e Tecnologia de Alimentos. Florianpolis, SC. 2001.