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Instituto de Química de São Carlos – IQSC Universidade de São Paulo Caracterização de Proteínas
Instituto de Química de São Carlos – IQSC Universidade de São Paulo Caracterização de Proteínas

Instituto de Química de São Carlos IQSC Universidade de São Paulo

de São Carlos – IQSC Universidade de São Paulo Caracterização de Proteínas Disciplina: Bioquímica I
de São Carlos – IQSC Universidade de São Paulo Caracterização de Proteínas Disciplina: Bioquímica I

Caracterização de Proteínas

Universidade de São Paulo Caracterização de Proteínas Disciplina: Bioquímica I Docente: Profa. Dra. Fernanda

Disciplina: Bioquímica I Docente: Profa. Dra. Fernanda Canduri

Disciplina: Bioquímica I Docente: Profa. Dra. Fernanda Canduri Aula modificada de: Profa. Dra. Célia R. Carlini

Aula modificada de: Profa. Dra. Célia R. Carlini - PUCRS

Eletroforese

ELETROFORESE

Condições que determinam a separação

1. pH / tampão

2. Suporte - papel : corrente alta (calor) uso para peptídeos e aminoácidos

- poliacrilamida : proteínas ac. nucleicos não desnaturante ou nativa desnaturante e redutor peso molecular

desnaturante ou nativa desnaturante e redutor peso molecular composição de subunidades focalização isoelétrica: pI

composição de subunidades

focalização isoelétrica: pI bidimensional
bidimensionalfocalização isoelétrica: pI

- agarose : ácidos nucléicos Imunoeletroforese Proteínas nativas

Eletroforese

Gel de eletroforese nativo

Realizado sem fervura das amostras

Pode ter SDS no gel de separação

Proteínas analisadas na sua conformação nativa

É possível observar a presença de oligomerização

Eletroforese desnaturante

A eletroforese em gel de poliacrilamida (PAGE) permite visualizar a composição de proteínas de uma amostra. É um método complementar para a purificação de proteínas.

Fornece informações sobre a massa molecular e composição de subunidades da proteína em meio desnaturante e redutor.

A poliacrilamida é um polímero que forma um gel de malha porosa que funciona como uma peneira, deixando passar através de seus poros as moléculas pequenas e retendo

as grandes.

que funciona como uma peneira , deixando passar através de seus poros as moléculas pequenas e

Desnaturação de proteínas por SDS

H 3 C-CH 2 -CH 2 -CH 2 -CH 2 -CH 2 -CH 2 -CH 2 -CH 2 -CH 2 -CH 2 -CH 2 -

2 -CH 2 -CH 2 -CH 2 -CH 2 -CH 2 - A porção hidrocarboneto do
2 -CH 2 -CH 2 -CH 2 -CH 2 -CH 2 - A porção hidrocarboneto do

A porção hidrocarboneto do

detergente interage com as

regiões hidrofóbicas da proteína,

dispondo o grupo sulfato carregado na superfície, em contato com o meio aquoso. A

repulsão entre os grupos sulfato

desestabiliza os laços não covalentes que mantém a estrutura 3D da proteína, desnaturando-a.

que mantém a estrutura 3D da proteína, desnaturando-a. d o d e c i l s

dodecil sulfato de sódio

e c i l s u l f a t o d e s ó d
e c i l s u l f a t o d e s ó d

Efeito do SDS

s u l f a t o d e s ó d i o Efeito do

a desnaturação uniformiza a forma das proteínas, que poderia influenciar na migração através dos poros da poliacrilamida;

mascara a carga natural das proteínas no pH da corrida, fazendo com que todas

moléculas migrem para o anôdo;

facilita o efeito de redutores, rompendo pontes dissulfeto intra- e inter-cadeias

C A B
C
A
B
C A B C B A A B SDS (dodecil sulfato de sódio + 2-mercaptoetanol Efeitos
C
C

B

A

A

C A B C B A A B SDS (dodecil sulfato de sódio + 2-mercaptoetanol Efeitos

B

C A B C B A A B SDS (dodecil sulfato de sódio + 2-mercaptoetanol Efeitos
C A B C B A A B SDS (dodecil sulfato de sódio + 2-mercaptoetanol Efeitos

SDS (dodecil sulfato de sódio

+

2-mercaptoetanol

Efeitos do SDS

desnaturação uniformiza a forma das proteínas;

mascara a carga natural das

C proteínas no pH da corrida, fazendo

com que todas moléculas migrem para o anôdo;

facilita o efeito de redutores

Eletroforese em Gel de Poliacrilamida (PAGE)

As partes superior e inferior do gel fazem contato com recipientes de tampão, onde estão

os eletrodos que estabelecerão o campo elétrico (~100V) durante a corrida (1 a 2h).

amostra Poços para catodo as amostras 1 mm Placas de vidro gel anodo tampão
amostra
Poços para
catodo
as amostras
1 mm
Placas
de vidro
gel
anodo
tampão

cuba vertical para mini-gel (10 X 8 cm)

SDS-PAGE das proteínas da bactéria Salmonella tiphymurium Cada linha (banda) corada no gel representa uma

SDS-PAGE das proteínas da bactéria Salmonella tiphymurium

SDS-PAGE das proteínas da bactéria Salmonella tiphymurium Cada linha (banda) corada no gel representa uma proteína

Cada linha (banda) corada no gel representa uma proteína

Direção da

migração

Determinação da massa molecular de proteínas

Curva de calibração de SDS-PAGE a 15%

Mobilidade relativa = distância percorrida pela banda X distância percorrida pelo marcador da corrida (-)
Mobilidade relativa =
distância percorrida pela banda X
distância percorrida pelo marcador da corrida
(-)
97.4
87.0
45.0
29.0
21.0
Mobilidade relativa (Rf)
12.5
(+)
6.5
Massa molecular (kD)

Peso molecular ou massa molecular relativa: Mr, relação da massa da molécula para um duodécimo da massa do carbono 12. (adimensional) Massa molecular: m, é expressa em dáltons (Da) (duodécimo da massa do carbono 12)

1 kDa = 1.000 Da

Ex.: uma molécula tem Mr = 18.000 ou m = 18.000 Da (18 kDa)

Eletroforese focalização isoelétrica

migração através de um gradiente de pH

proteínas focalizamnos seus pIs

Anfólitos: Misturas de compostos poliaminados/policarboxilados

Gel não tamponado polimerizado com anfólitos

1ª corrida: anfólitos criam gradiente

2ª corrida: amostras são aplicadas

Após a corrida: pedaços do gel são analisados quanto ao seu pH.

Aplicações:

- Determinação do pI

- Isoformas da mesma proteína:

- glicosilação

- fosforilação

- mutações pontuais

_

3.0 4.0 pH 5.0 6.0 +
3.0
4.0
pH
5.0
6.0
+

Marcadores de pI conhecidos

Eletroforese Bidimensional

- Origem 3 3.5 4 pI P I 4.5 5 5.5 + 10 9 8
-
Origem
3
3.5
4
pI
P I
4.5
5
5.5
+
10
9
8
7
6
5
4
3
2
3.5 4 pI P I 4.5 5 5.5 + 10 9 8 7 6 5 4

MM x 10 3

1a.dimensão: focalização isoelétrica

2a.dimensão: SDS-PAGE

(perpendicular a 1a.)

9 8 7 6 5 4 3 2 MM x 10 3 1a.dimensão: focalização isoelétrica 2a.dimensão

Eletroforese 2D de proteínas totais (proteoma) de Escherichia coli

Proteínas com a mesma massa

PROTEOMA

de Escherichia coli Proteínas com a mesma massa PROTEOMA Proteínas com mesmo pI • análise simultânea

Proteínas com mesmo pI

análise simultânea de até 5.000 proteínas

permite comparação de todas as proteínas expressas por uma célula em dois momentos diferentes:

análise do efeito de hormônios,

análise do efeito de drogas;

estados fisiológicos (desenvolvimento);

condições patológicas diversas (vírus, bactérias,etc.)

Sequenciamento de proteínas

Sequenciamento de proteínas aminoácido Para determinar a estrutura primária de uma proteína, é necessário primeiro
aminoácido
aminoácido
Sequenciamento de proteínas aminoácido Para determinar a estrutura primária de uma proteína, é necessário primeiro

Para determinar a estrutura primária de uma proteína, é necessário primeiro conhecer a composição (número e tipos) de seus aminoácidos.

a composição (número e tipos) de seus aminoácidos. A proteína pura é tratada com HCl 6N

A proteína pura é tratada com HCl 6N fervente para quebrar

(hidrólise) as ligações peptídicas.

para quebrar (hidrólise) as ligações peptídicas. A mistura resultante é submetida a métodos

A mistura resultante é submetida

a métodos cromatográficos (fase

reversa, troca iônica) para separar

os diferentes aminoácidos.

troca iônica) para separar os diferentes aminoácidos. Tempo de retenção (min) fluorescência A posição do
Tempo de retenção (min) fluorescência
Tempo de retenção (min)
fluorescência
aminoácidos. Tempo de retenção (min) fluorescência A posição do pico no cromatograma identifica o aminoácido

A posição do pico no cromatograma identifica o aminoácido e

a área do pico quantifica o aminoácido.

fluorescência A posição do pico no cromatograma identifica o aminoácido e a área do pico quantifica

Sequenciamento de proteínas

Existem vários métodos para se determinar a sequência de aminoácidos de uma proteína.

Os dois métodos atualmente mais utilizados:

a) Método de Edman: reação do aminoácido N-terminal da proteína com fenil-isotiocianato

A proteína modificada é submetida a hidrólise ácida liberando o aminoácido

.
.

N-terminal modificado, e este é identificado por cromatografia. Segue-se

novo ciclo de reação com o próximo aminoácido na proteína, que se tornou

o novo N-terminal.

b) Espectrometria de massa: determinação das massas de fragmentos

correspondendo a aminoácidos, retirados sequencialmente da proteína.

Quando uma proteína possui mais de 20-30 resíduos de aminoácidos, não é possível sequenciá-la diretamente pelo método de degradação de Edman.

Proteína Total 150 a.a

método de degradação de Edman. Proteína Total 150 a.a 30 aa sequência obtida a partir da

30 aa

de degradação de Edman. Proteína Total 150 a.a 30 aa sequência obtida a partir da proteína

sequência obtida a partir da proteína intacta

Para obter a sequência completa de uma proteína, é necessário sequenciar vários peptídeos da mesma proteína, obtidos por diferentes tipos de quebra da cadeia, até haver sobreposição de suas sequências.

proteína

inteira

peptídeos

método A

peptídeos

método B

proteína inteira peptídeos método A peptídeos método B Diferentes métodos são utilizados para obter-se diferentes
proteína inteira peptídeos método A peptídeos método B Diferentes métodos são utilizados para obter-se diferentes
proteína inteira peptídeos método A peptídeos método B Diferentes métodos são utilizados para obter-se diferentes
proteína inteira peptídeos método A peptídeos método B Diferentes métodos são utilizados para obter-se diferentes
proteína inteira peptídeos método A peptídeos método B Diferentes métodos são utilizados para obter-se diferentes
proteína inteira peptídeos método A peptídeos método B Diferentes métodos são utilizados para obter-se diferentes
proteína inteira peptídeos método A peptídeos método B Diferentes métodos são utilizados para obter-se diferentes
proteína inteira peptídeos método A peptídeos método B Diferentes métodos são utilizados para obter-se diferentes
proteína inteira peptídeos método A peptídeos método B Diferentes métodos são utilizados para obter-se diferentes
proteína inteira peptídeos método A peptídeos método B Diferentes métodos são utilizados para obter-se diferentes
proteína inteira peptídeos método A peptídeos método B Diferentes métodos são utilizados para obter-se diferentes
proteína inteira peptídeos método A peptídeos método B Diferentes métodos são utilizados para obter-se diferentes

Diferentes métodos são utilizados para obter-se diferentes peptídeos da proteína:

A) enzimas proteolíticas, como tripsina (quebra em resíduos de Lys ou Arg) e quimotripsina (quebra em resíduos de Phe);

B) tratamento com brometo de cianogênio (quebra em Met).

Sequenciamento de novo de proteínas por espectrometria

de massas

MS/MS ou MS2 é um

sistema em que

dois espectrômetros de massa são utilizados em sequência, separados

por uma câmara de

colisão

A ligação peptídica se

quebra formando

fragmentos típicos, como os íons b e y mostrados na figura acima, que terão

massas diferentes de

acordo com o radical R de cada aminoácido.

hélio ou argônio
hélio ou argônio
Espectro MS/MS do peptídeo GLSDGEWQQVLNVWGK AA Codes Gly G Ala A Ser S Pro P
Espectro MS/MS do peptídeo
GLSDGEWQQVLNVWGK
AA Codes
Gly
G
Ala
A
Ser
S
Pro
P
Val
V
Thr
T
Cys
C
Leu
L
Ile
I
Asn
N
-
-

Mono.

AA Codes

Mono.

57.021464

Asp

D

115.02694

71.037114

Gln

Q

128.05858

87.032029

Lys

K

128.09496

97.052764

Glu

E

129.04259

99.068414

Met

M

131.04048

101.04768

His

H

137.05891

103.00919

Phe

F

147.06841

113.08406

Arg

R

156.10111

113.08406

CMC

161.01467

114.04293

Tyr

Y

163.06333

-

Trp

W

186.07931

Analisa-se o espectro buscando diferenças de

m/z equivalentes a um

resíduo de aminoácido,

que permitem conhecer a sequência dos peptídeos

Dicroismo circular

Dicroismo circular O CD pode ser empregado na obtenção de detalhes estruturais de diferentes tipos de
Dicroismo circular O CD pode ser empregado na obtenção de detalhes estruturais de diferentes tipos de

O CD pode ser empregado na obtenção de detalhes

estruturais de diferentes tipos de compostos:

Proteínas;

Carboidratos;

Ácidos nucléicos;

Fármacos;

É considerado o método de escolha para determinação

rápida do conteúdo de estrutura 2 dária de peptídeos e

proteínas;

O CD é um método altamente sensível, capaz de distinguir

conformações de hélice α, folhas β e alças.

A precisão do método varia em função do tipo de estrutura secundária apresentada pela proteína:

97% para hélices;

▪ 75% para folhas β;

50% para voltas;

89% para outros tipos

A faixa de varredura do CD e propriedades derivadas:

UV distante, 190-250nm

O cromóforo é a ligação peptídica: a intensidade do sinal será dependente dos ângulos torsionais e .

O espectro será a soma das contribuições das curvas de CD de cada um dos tipos de estrutura 2 daria existentes no sistema, consideradas suas abundâncias relativas;

A técnica não tem resolução para identificar os resíduos específicos;

Requer em geral 20-200µL de solução contendo de 1mg/mL a 50µg/mL da proteína em estudo, em qualquer tampão que não absorva

nesta região do espectro.

Luz circularmente polarizada

nesta região do espectro. Luz circularmente polarizada Dicroísmo Circular é a medida da absorbância diferencial

Dicroísmo Circular é a medida da absorbância diferencial entre as duas rotações de luz circularmente polarizada por uma molécula assimétrica.

Ressonância Magnética Nuclear - RMN

Neste caso, o que está sendo absorvido é uma radiação eletromagnética na região de radiofrequências;

Esta absorção, contudo, será uma função do tipo de núcleos atômicos na molécula

em estudo;

1H, o isótopo mais abundante;

13C, enquanto o isótopo mais abundante é o 12C;

15N, enquanto o isótopo mais abundante é o 14N;

31P, enquanto o isótopo mais abundante é o 30P.

14N; ▫ 31P, enquanto o isótopo mais abundante é o 30P. Por que aplicar RMN a

Por que aplicar RMN a proteínas?

Identificação de estados enovelados e não-

enovelados (assim como transições e fatores que os

governam);

Medida de constantes de afinidade;

Avaliar o efeito de mutações na estrutura ou

proteínas homólogas e dinâmica de proteínas;

Determinação de estruturas 2ª e 3ª;

Caracterização da flexibilidade e dinâmica proteicas.

Cristalografia de raios X

A técnica se baseia no uso de raios X para obter um mapa da densidade eletrônica de uma determinada molécula em ambiente cristalino:

uso de Radiação síncrotron;

ou Gerador de raios X em laboratório.

A partir do mapa de densidade eletrônica inicia-se o

preenchimento desta por átomos, relacionados à molécula de interesse, capazes de produzirem a densidade obtida:

o preenchimento desta por átomos, relacionados à molécula de interesse, capazes de produzirem a densidade obtida:
o preenchimento desta por átomos, relacionados à molécula de interesse, capazes de produzirem a densidade obtida:

A resolução da estrutura da proteína por RMN ou por

cristalografia de difração de raios X permite a análise das

interações intra e intermoleculares.

de raios X permite a análise das interações intra e intermoleculares. Proteína p53 – um supressor
Proteína p53 – um supressor de tumor
Proteína p53 – um supressor de tumor