DeteccindelvirusDistempercaninoporRTPCRen

tiemporealycaracterizacingenticadeaislamientos
delRodelaPlatamedianteelanlisisdelosgenesdela
hemaglutininaylaprotenadefusin

Lic.NicolsSarute
TesisdeMaestraPEDECIBABiologa
SubreaGentica
Orientadora:Dra.YaninaPanzera
CoOrientador:Dr.RubenPrez
SeccinGenticaEvolutiva

Agradecimientos
A la Seccin Gentica Evolutiva por permitirme realizar mis estudios de posgrado,
especialmenteamisorientadoresYaninayRuben.
Aloschicos/asdellaboratorio,compaerosdetrabajoyamigosdelavida.
ALourdesporfacilitarnoslasmuestrasycolaborarconnuestroestudio.
AMartnporsuinagotableenerga,apoyoypalabrasdealiento.
A las personas que en algn momento transitaron por el proyecto CDV, y que an
siguenestandopresentes.
Alafamiliayamigos.
AlaAgenciaNacionaldeInvestigacin(ANII),ProgramadeDesarrollodelasCiencias
Bsicas (PEDECIBA), Red AMSUDPasteur y Comisin Sectorial de Investigacin
Cientfica(CSIC)porapoyarelproyectoatravsdebecaspararealizarestudiosenel
pasyenelexterior,yparadifundirnuestrosresultados.
Gracias.

Abreviaturasydefiniciones

Publicaciones

II

Resumen

III

1.INTRODUCCIN

1.1VirusDistempercanino

1.1.1Clasificacintaxonmica

1.1.2Estructura,genomayprotenasvirales

1.1.2.1Estructuraviral

1.1.2.2Genomaviral

1.1.2.3Protenasvirales

1.1.2.3.1Protenadenucleocpside(N)

1.1.2.3.2ProtenascodificadasporelgenP/V/C:fosfoprotenaP
yprotenasVyC
1.1.2.3.3Protenadematriz(M)

1.1.2.3.4Protenadefusin(F)

1.1.2.3.5Protenahemaglutinina(H)

1.1.2.3.6Protenalarge(L)

1.1.3CicloreplicativodeCDV

1.1.3.1Uninyfusinvirusclula

1.1.3.2Transcripcinyreplicacindelgenomaviral

1.1.3.3Formacindelcomplejoribonucleoprteico(RNP)ybrotacin
1.1.3.4Propagacinentreclulashusped

1.2Distemper:patognesis,sintomatologaclnica,epidemiologa,
prevencinycontrol
1.2.1Patognesis

1.2.2SintomatologaClnica

1.2.3Epidemiologa

1.2.4Prevencinycontroldelaenfermedad

1.3DeteccindeCDVenmuestrasclnicas

1.3.1Ensayosserolgicos

1.3.2Tcnicasmoleculares

1.3.2.1RTPCRtiempofinal

1.3.2.2RTPCRentiemporeal

1.4CaracterizacingenticadeCDV

1.4.1Hemaglutinina

1.4.2Pptidosealdelaprotenadefusin

1.5Antecedentesdelgrupodetrabajo

1.6Hiptesisdetrabajo

1.7Objetivos

1
1
1
1
1
2
3
3
3
4
4
5
56
6
6
6
7
78
8
8
910
11
1112
13
14
14
1415
1516
16
1719
1920
2021
22
22


2.MATERIALESyMTODOS
2.1Muestras

2.2Extraccindelgenomaviral

2.3EnsayosderetrotranscripcinyPCR

2.3.1Retrotranscripcin

2.3.2PCRentiemporeal

2.3.3PCRtiempofinal

2.3.3.1AmplificacindelasecuenciacodificantedelgenH

2.3.3.2AmplificacindelaregincodificantedelFsp

2.4Electrofresis

2.5PurificacindelosfragmentosamplificadosporRTPCR

2.6ClonacindelosampliconesdelgenH

2.7Secuenciacin

2.8Anlisisbioinformticodesecuenciasnucleotdicasyaminoacdicas
2.8.1Diseodecebadoresysondas

2.8.2Edicinyalineamientodesecuenciasnucleotdicas

2.8.3Anlisisfilogenticos

2.8.3.1Hemaglutinina

2.8.3.1.1Anlisisdelasecuenciacompleta

2.8.3.1.2Anlisisdeunasecuenciaparcial(134aa)

2.8.3.2Pptidosealdelaprotenadefusin

2.8.4Identificacindesitiosdeglicosilacin

2.8.5Estudiodepresionesselectivas

23
2326
26
2627
27

29
29
29
30
31
3133
33
33
3334
34
34
35
35
35
35

35
36

3.RESULTADOS
3.1DeteccindelgenomaviralporRTPCRentiemporeal

3.2CaracterizacingenticadeaislamientosdelRodelaPlata
3.2.1Hemaglutinina

3.2.1.1AmplificacinporRTPCRtiempofinal

3.2.1.2Edicinyanlisisdesecuenciasnucleotdicasyaminoacdicas
3.2.1.3Estudioscomparativos

3.2.1.4Anlisisfilogenticos

3.2.1.4.1Anlisisdelasecuenciacompletadelahemaglutinina
3.2.1.4.2Anlisisdesecuenciasparciales(134aminocidos)

3.2.1.5ComparacinconlacepavacunalOP

3.2.1.6Identificacindesitiospotencialesdeglicosilacin

3.2.1.7Estudiodepresionesselectivas

3.2.2Pptidosealdelaprotenadefusin

3.2.2.1AmplificacinporRTPCRtiempofinal

40

43
43
43
44
4445
53
53
55
57
57

58
59

59

3.2.2.2Estudioscomparativos

3.2.2.3Anlisisfilogentico

3.2.2.4ComparacinconlacepavacunalOP
3.2.2.5Estudiodepresionesselectivas

60
6263
65
66

4.DISCUSIN

4.1Conclusionesyperspectivas

6778

7880

8191

Referenciasbibliogrficas

Abreviaturasydefiniciones
aa:aminocido/s
Buffer:solucinqumicaquemantieneconstantesupH
C:gradoscentgrados
CDV:virusDistempercanino
Cebadores:oligonucletidosiniciadores
CI:controlinterno
DNA:cidodesoxirribonucleico
DNAsas:enzimasquedegradanelDNA
DNAligasa:enzimaqueformaenlacescovalentesentreelextremo5deunacadena
polinucleotdicayelextremo3deotracadenapolinucleotdica
dNTPs:deoxinucletidos
EDTA:cidoetilendiaminotetraactico
ELISA:Enzymelinkedimmunosorbentassay.Ensayoinmunoenzimticoporadsorcin
F:protenadefusin
H:hemaglutinina
IF:immunofluorescencia
IgM:inmunoglobulinadetipoM
Kb:kilobase
l:litro
L:large(protena)
LCR:lquidocefalorraqudeo
M:matriz(protena)
mAbs:anticuerposmonoclonales
MgCl2:clorurodemagnesio
l:microlitros
M:micromolar
mg:miligramos
ml:mililitros
mRNA:cidoribonucleicomensajero
MV:Measlesvirus.VirusSarampin
N:nucleoprotena
nm:nanmetros
nt:nucletidos
ORF:OpenReadingFrame.Marcoabiertodelectura
pb:paresdebases
P:fosfoprotena
PBS:phosphatebufferedsaline.Solucinsalinadefosfatos
PCR:PolymeraseChainReaction.ReaccinenCadenadelaPolimerasa
PDV:virusDistemperdefcidos
Pellet:precipitadoluegodelacentrifugacin

pH:logaritmodelainversadelaconcentracindeprotones
PI:postinfeccin
pMol:picomoles
RE:retculoendoplasmtico
RFLP:Restriction Fragment LengthPolymorphism. Polimorfismo en la longitud de los
fragmentosderestriccin
RNA:cidoribonucleico
RNasa:nucleasaquecatalizalahidrlisisdeRNA
rpm:revolucionesporminuto
RTPCR:RetroTranscripcinReaccinenCadenadelaPolimerasa
SDS:dodecylsulfatodesodio.Detergentedeaccindesnaturalizante
seg:segundos
SLAM: Signaling lymphocytic activation molecule (CD150). Molcula activadora de la
sealizacindellinfocito
SNC:sistemanerviosocentral
UTR:Untranslatedregion.Reginnotraducida
UV:luzUltravioleta
Vero:clulasepitelialesderindemonoverdeafricano
VeroSLAM: clulas Vero que expresan por transfeccin la molcula activadora de la
sealizacindellinfocito(CD150SLAM)
vol:volumen
VVA:vacunasavirusvivoatenuado

Publicaciones

Primer diagnstico molecular y caracterizacin parcial del gen de la nucleoprotena

delVirusDistemperCaninoenUruguay.Sarute,N.,Prez,R.,Francia,L.,Hernndez,
M., Bed, G., Bonilla, B., Guasco, S., Cardeillac, A., Panzera, Y. (2011). Veterinaria
(Montevideo),47(182):915.

Evidence of two cocirculating genetic lineages of Canine Distemper Virus in South

America.Panzera,Y.,Caldern,M.G.,Sarute,N.,Guasco,S.,Cardeillac,A.,Bonilla,B.,
Hernandez,M.,Francia,L.,Bed,G.,LaTorre,J.,Prez,R.(2011).VirusRes.163,401
404.

Resumen
El virus Distemper canino (CDV) es un virus envuelto del gnero Morbillivirus
perteneciente a la familia Paramyxoviridae; ste presenta un genoma de RNA no
segmentado, cadena simple, polaridad negativa y 15.7 kilobases. CDV es el agente
etiolgicodeunaseveraenfermedadinfecciosa,denominadaDistemperoCarr,que
afectaatodaslasfamiliasdecarnvorosterrestres.
Distemperesunadelasprincipalesenfermedadesinfecciosasdecanesdomsticosy
secaracterizaporpresentarunampliorangodesntomasclnicosasociadosalesiones
enelaparatorespiratorio,digestivoy/oelsistemanerviosocentral.Laenfermedadse
controlaatravsdevacunasconvirusvivosatenuados;sinembargo,recientementese
hanregistradonumerososbrotesinfecciososennuestrareginyalrededordelmundo,
inclusoenpoblacionesdecanescorrectamentevacunados.Aunquesedesconocenlas
causas,dichosbrotespodranexplicarseporlareversindelascepasatenuadasa la
virulencia,laemergenciadenuevascepascapacesdeevadirlarespuestainmune,y/o
fallasenlosplanesdevacunacin.
Uruguay no parece estar exento de esta problemtica, registrndose brotes de la
enfermedad en canes vacunados. El desarrollo de metodologas de diagnstico y
caracterizacin en nuestro laboratorio basadas en RTPCR tiempo final, y posterior
secuenciacindelosamplicones,nospermiticonstatarquelainfeccindeloscanes
sedebaavirusdecampoynoalareversindelacepavacunal.Debidoaello,resulta
fundamentalimplementarenelpasplanesdevigilanciasanitariabasadosenlarpida
deteccindelgenomaviralysuposteriorcaracterizacin.
En este sentido, durante esta tesis desarrollamos por primera vez en Uruguay un
mtododediagnsticobasadoenRTPCRentiemporealconqumicaTaqMan,elcual
brinda resultados c o n f i a b l e s, c o n e le v a d a e s p e c i f i c i d a d y enmenortiempo.
Asuvez,serealizlacaracterizacingenticadeaislamientosdecampodelRodela
Platamedianteelanlisisdelgendelahemaglutinina(H)ydelaregincodificantedel
pptido seal (Fsp) de la protena de fusin (F). Estas regiones genmicas presentan
una elevada variabilidad gentica lo cual permite establecer relaciones evolutivas
entrelascepascirculantes.MedianteRTPCRseamplificlasecuenciacodificantedel
genHylareginFspdeaislamientosdecampouruguayosyargentinos,constituyendo

el primer estudio de caracterizacin basado en estas regiones genmicas en

Sudamrica.
Elanlisisdelassecuenciasobtenidasdelahemaglutininarevellaexistenciadeuna
elevada variabilidad gentica entre los aislamientos de Sudamrica, los cuales se
agrupan en dos linajes cocirculantes en el continente con distinta distribucin y
prevalencia. Uno de ellos corresponde a un linajeyacaracterizado, Europa 1 (EU1),
por tanto proponemos denominar a este linaje como Europa 1/Sudamrica 1
(EU1/SA1),mientrasqueelotrorepresentaunlinajeexclusivodenuestrocontinente
descritoporprimeravez,alcualdenominamosSudamrica2(SA2).EllinajeEU1/SA1
seraelresultadodelintercambiodeanimalesentreamboscontinentesfavoreciendo
la transmisin del virus, mientras que el linaje SA2 se habra originado en la fauna
silvestredeSudamricaysetransmitialoscanesdomsticos.
El anlisis de la regin Fsp de los aislamientos sudamericanos revel las mismas
relaciones evolutivas observadas en el anlisis de la hemaglutinina, registrndose
elevadosvaloresdevariabilidadgentica.Estosresultadossustentansuutilidadcomo
marcador para estudios de caracterizacin gentica y evolucin de CDV, por lo cual
proponemos un nuevo criterio para definir linajes genticos de CDV en base a la
variabilidaddeFsp.
LacomparacindelosaislamientossudamericanosconlacepavacunalOnderstepoort
(OP), utilizada comnmente en nuestro pas, mostr elevados niveles de variabilidad
tantoaniveldelahemaglutinina,comodeFsp,confirmandoqueloscasosdeinfeccin
porCDVfueroncausadosporvirusdecampo,ynoporlareversindelacepavacunal.

Introduccin

INTRODUCCIN
1.1VirusDistempercanino
1.1.1ClasificacinTaxonmica
El virus Distemper canino (CDV) es un virus envuelto del gnero Morbillivirus
perteneciente a la familia Paramyxoviridae. Los Morbillivirus presentan genoma de
RNA no segmentado, cadena simple, polaridad negativa y aproximadamente 15.7 kb
(Lamb&Parks,2007).

1.1.2Estructura,genomayprotenasvirales
1.1.2.1Estructuraviral
CDVesunviruspleomrfico,conundimetroaproximadoentre150300nm(Zipperle
et al., 2010). El RNA genmico se encuentra empaquetado por la protena de
nucleocpside(N)yesreplicadoporelcomplejodelapolimerasaviralformadoporla
protenalarge(L)ysucofactor,lafosfoprotena(P).LasprotenasN,PyL,juntoalRNA
viralformanelcomplejoribonucleoproteico(RNP),elcualdirigelasntesissecuencial
demRNAapartirdelosgenesvirales,obienlareplicacindelosantigenomas(RNAs
viralesdepolaridadpositiva).Laenvolturalipdicacontienedosprotenasintegralesde
membrana,laprotenadefusin(F)ylahemaglutinina(H),yunaprotenaasociadaa
lamembranaqueinteractaconelcomplejoRNP,laprotenadematriz(M)(Figura1)
(vonMesslingetal.,2001).

Figura1.RepresentacinesquemticadeunMorbillivirus.Tomadodelapginaweb

www.expertreviews.org.

Introduccin

1.1.2.2Genomaviral
ElgenomadeCDVpresentaseisgenesllamadosN,P/V/C,M,F,HyL,quecodificanlas
seisprotenasestructuralesdelvirin.Cadagencodificaunanicaprotena,exceptoel
gen P/V/C que codifica la fosfoprotena P y dos protenas no estructurales
denominadasCyV(Figura2).
EnlosextremosdelRNAgenmicoexistenregionesUTRnocodificantes,denominadas
leader3'ytrailer5',quesonesencialesparalareplicacinytranscripcindelosgenes
virales (Lamb & Parks, 2007). Entre genes adyacentes existe un triplete intergnico
consenso(GAA)quenosetranscribeyqueseparaalossitiosdepoliadenilacindelos
sitiosdeinicidelatranscripcin(Liermannetal.,1998).
Los genes son transcriptos por el complejo RNP a partir de un promotor simple
mediante un mecanismo denominado startstop. Este mecanismo implica que la
transcripcin se inicia en el primer gen del extremo 3 (gen N) y se detiene en cada
reginintergnica,debidoaquelapolimerasaviralseescindedelRNAmolde,locual
puede determinar la interrupcin del proceso. Por tanto, este mecanismo conduce a
ungradientetranscripcionalquesemantienedurantelainfeccin;detalmodoquelos
genesprximosalextremo3delgenomasetranscribenmsqueaquelloscercanosal
extremo5delgenoma(Anderson&vonMessling,2008).

Figura2.RepresentacinesquemticadelgenomadeCDV.Imagentomadadelsitioweb
http://expasy.org/viralzone.

1.1.2.3Protenasvirales
1.1.2.3.1Protenadenucleocpside(N)
LaprotenadenucleocpsideescodificadaporelgenNypresenta525aminocidos
(aa).LanucleocpsideesunaprotenadeuninalRNAqueseautoensamblasobreel
genomaviralyelRNAantisentidoparaformar,juntoalasprotenasPyL,elcomplejo
RNP(Figura1)(Lamb&Parks,2007).

Introduccin

1.1.2.3.2ProtenascodificadasporelgenP/V/C:fosfoprotenaPyprotenasVyC
LafosfoprotenaPestconstituidapor507aayesuncofactordelapolimerasaquese
activa por fosforilacin y forma parte activa del complejo RNP (Figura 1) (Lamb &
Parks,2007).
LaprotenaCestraducidaapartirdelmismomRNAqueP,peropresentauncodnde
inicio alternativo situado 22 nucletidos corriente abajo del codn iniciador de la
protena P. Esto produce un corrimiento en el marco abierto de lectura (ORF)
generandoun codn stop prematuro, lo cual determina que la protena C tenga una
extensinde174aa(Bellinietal.,1985).
Porotraparte,laprotenaVconstade299aayestraducidaapartirdelmismocodn
de inicio que la protena P, sin embargo, mediante un proceso de edicin del RNA
mensajero(mRNA)seaadeunaguaninaquedeterminauncorrimientoenelmarco
delecturaylaformacindeuncodnstopprematuro.Ambasprotenaspresentanla
misma secuencia aminoacdica en los primeros 231 aa, pero los 68 aa del extremo
carboxiterminaldelaprotenaVdifierendelospresentesenlaprotenaP(Cattaneo
etal.,1989).
SehasugeridoquelasprotenasaccesoriasVyCestninvolucradasenlaevasindela
respuestainmunemediadaporelInterfern(Lamb&Parks,2007).

1.1.2.3.3Protenadematriz(M)
La protena de matriz es codificada por el gen M y est constituida por 335 aa. Esta
protenaseposicionadebajodelaenvolturalipdica,einteractaconelncleoRNP,la
bcapalipdicayconlascolascitoplasmticasdelasglicoprotenasdemembranaHyF
(Figura1).Debidoalasinteraccionesqueestablece,presentaunpapelfundamentalen
lamorfologayelensamblajedelvirin(Lamb&Parks,2007).

1.1.2.3.4Protenadefusin(F)
La protena de fusin es una glicoprotena transmembrana tipo I de 662 aa que
participa en la fusin de la envoltura viral con la membrana plasmtica de la clula
hospedero(Lamb&Parks,2007).LaprotenaFescodificadaporelgenFbajolaforma
deunprecursorinactivodenominadopreF0;elprocesamientodelaprotenaimplica
elreconocimientodelpptidoseal(Fsp)porunamolculaespecficayelsubsecuente
3

Introduccin

transportehaciaelretculoendoplsmico(RE),dondeelprecursorpreF0esprocesado
cotraduccionalmente(vonMessling&Cattaneo,2002).Elprocesamientoocurreentre
losaminocidos135136porlaaccindeunapeptidasacelular(SPase),generandoal
Fspde135 aayalprecursorinmaduroF0de 527aa.ElprecursorF0esglicosiladoy
clivadoporunafurinacelularqueactaenelcompartimientodelGolgi,formandolas
subunidades F1 y F2. Estas subunidades forman un heterodmero que constituye la
formaactivadelaprotenaF(Plattetetal.,2007).Aniveldelaenvoltura,laprotena
forma un trmero que interacta con la hemaglutinina durante el proceso de fusin
virusclula(Figura3)(vonMesslingetal.,2004).

Figura3.EsquemadelgenFconlasregionesquecodificanparalassubunidadesdelaprotenaF.
ModificadodeVonMessling&Cattaneo(2002).

1.1.2.3.5Protenahemaglutinina(H)
Lahemaglutininapresenta607aayescodificadaporelgenH;dichaprotenaesuna
glicoprotena transmembrana tipo II que media la unin de los viriones a los
receptorescelulares,yposeelacapacidaddepromoverlafusinvirusclula(Lamb&
Parks, 2007). La protena H presenta un dominio citoplasmtico cortoen su extremo
aminoterminal,undominiohidrofbicotransmembranaconfuncionesdelocalizacin
yanclajealamembrana,yunectodominiocarboxiloterminal(Zipperleetal.,2010).
Dichaprotenaformauntetrmeroaniveldelaenvolturaqueinteractafsicamente
conlaprotenaF(Figura4)(vonMesslingetal.,2004).
EstudiosinvitromostraronquelaprotenaHeseldeterminanteprincipaldeltropismo
celular(Sternetal.,1995).EsprobablequenosoloeltropismodeCDV,sinotambinla
fusogenicidad en clulas Vero se mantenga fundamentalmente por accin de la
protenaH(vonMesslingetal.,2001).

Introduccin

Figura 4. Representacin del mecanismo de fusin virusclula mediado por la hemaglutinina y la

protena de fusin. Modificado de Expert Reviews in Molecular Medicine. Cambridge University Press
(2002).

1.1.2.3.6Protenalarge(L)
La protena large codificada por el gen L, consta de 2184 aa y es la subunidad
fundamentaldelcomplejodelaRNApolimerasaporsurolcatalticoenlasntesisdel
RNAviral.LaprotenaLinteractaconlafosfoprotenaPparaformarelcomplejodela
polimerasaactivoyesconstituyenteintegraldelanucleocpsidedelvirin(Figura1)
(LambyParks,2007).

1.1.3CicloreplicativodeCDV
1.1.3.1Uninyfusinvirusclula
La fusin de la envoltura lipdica viral con la membrana plasmtica de la clula
hospederoocurreapHneutro,permitiendoelingresodelcomplejoRNPalaclula.La
actividad de fusin se realiza mediante la accin concertada de las glicoprotenas de
membranaHyF(Sternetal.,1995;VonMesllingetal.,2001;Zipperleetal.,2010).El
procesodefusincomienzaporlaunindelahemaglutininaalreceptorcelularSLAM
(Signaling Lymphocytic Activation Molecule) presente en linfocitos B y T activados,
timocitos inmaduros y clulas dendrticas. Luego de la unin, la protena H induce
cambiosconformacionalessobrelaprotenaFquefavorecensuactividadfusognica,
desencadenandolafusindelamembranacelularylaenvolturaviral(Sawatsky&von
Messling,2010).Dichoprocesoocurreporlaaccinespecficadelpptidodefusin,
localizado en la subunidad F1, sobre la membrana celular del hospedero (Figura 4)
(VonMesslingetal.,2004).

Introduccin

1.1.3.2Transcripcinyreplicacindelgenomaviral
TraselingresodelcomplejoRNPenelcitoplasmaocurrelatranscripcindelgenoma
viral. La sntesis del mRNA comienza en el extremo 3' del genoma y los genes son
transcriptosenmensajerosquecodificarnparalasprotenasvirales.Unavezocurrida
latranscripcin,lapolimerasaviralcomienzalasntesisdelosantigenomasquesern
utilizados como molde para la produccin de nuevos RNA genmicos. Los genomas
virales neosintetizados son encapsidados y transportados hacia la membrana
plasmticaparaformarnuevaspartculasvirales(Figura5)(Lamb&Parks,2007).

1.1.3.3Formacindelcomplejoribonucleoprteico(RNP)ybrotacin
ElRNAgenmicoencapsidadoporlasprotenasN,PyLformaelcomplejoRNP.Dicho
complejo se asocia con la protena M localizada en la membrana plasmtica, donde
yacen las glicoprotenas H y F previamente exportadas. Las partculas virales
neosintetizadassonliberadasmediantebrotacindelamembranacelularyposeenla
capacidaddeinfectarnuevasclulassusceptibles(Figura5)(Lamb&Parks,2007).

Figura5.RepresentacindelciclodevidadeunMorbillivirusenlacluladelhospedero.Tomadode
Moss&Griffin(2006).

Introduccin

1.1.3.4Propagacinentreclulasdelhospedero
Mediantelaformacindeclulasmultinucleadas(sincitios),elvirussepropagaentre
las clulas del hospedero. Los sincitios son el resultado de la fusin de clulas
infectadas que expresan las glicoprotenas virales en su superficie, con clulas
susceptiblesquepresentanelreceptorSLAM(Sternetal.,1995).LaprotenaHesel
determinante principal de la fusogenicidad, por tanto el grado y la eficiencia de la
fusinclulaclulasedebeprincipalmenteaestaprotena(VonMesslingetal.,2001).

1.2 Distemper: patognesis, sintomatologa clnica, epidemiologa, prevencin y

control
1.2.1Patognesis
El modo principal de transmisin del virus es a travs de aerosoles de secreciones
respiratorias.Elvirusingresaatravsdeltractorespiratorioy,dentrodelasprimeras
24 horas, se disemina va macrfagos desde los ganglios linfticos locales hacia las
amgdalas y los ndulos linfticos bronquiales. La replicacin viral ocurre en estos
rganosentre24daspostinfeccin(PI).Dentrodelos46dasPI,elvirusproliferaen
losrganoslinfoides,ysediseminavasanguneaalostejidosepitelialesyalsistema
nerviosocentral(SNC)entre89dasPI(Appel&Summers,1999).
Lapatognesisentrelos9y14dasdependedelarespuestainmunehumoralycelular
del hospedero. Animales con ttulos adecuados de anticuerpos y de citotoxicidad
celular pueden eliminar al virus de la mayora de los tejidos sin que se evidencien
sntomasclnicos,mientrasqueanimalesconunarespuestainmuneinadecuadasufren
la diseminacin del virus a diversos tejidos. En trminos generales, la diseminacin
viralpuededeterminarinfeccinporunperodode6090das(Figura6)(Deemetal.,
2000).

Introduccin

Figura6.EsquemadelapatognesisdeDistemper.PI:postinfeccin.ModificadodeAppel&

Summers(1999).

1.2.2SintomatologaClnica
La sintomatologa clnica asociada a la enfermedad depende de la virulencia de la
estirpe viral, y de la edad, estado inmune y sanitario del animal. En especies
susceptibles, los sistemas respiratorios, gastrointestinal y el SNC son los ms
comprometidos.Hastael70%delasinfeccionesencanesdomsticossonsubclnicas,
manifestndose la enfermedad de forma leve con ocurrencia de languidez, anorexia,
fiebreeinfeccindeltractorespiratoriosuperior.Sinembargo,laformaagudadela
enfermedad presenta una elevada mortalidad con ocurrencia de sntomas clnicos
asociadosalsistemarespiratorioygastrointestinal,incluyendoconjuntivitis,descargas
culonasales (Figura 7A), neumona, diarrea (muchas veces hemorrgica) y
deshidratacinsevera(Deemetal.,2000).Losanimalesinfectadoseliminanalvirusen
todas las excreciones corporales, independientemente de los sntomas clnicos que
presenten(Frolichetal.,2000).

Introduccin

La primera viremia ocurre entre los das 46 PI y produce la infeccin de los tejidos
linfticosconaparicindefiebreyelcomienzodelalinfopenia.Lasegundaviremiase
acompaa de pirexia y determina la infeccin de las clulas epiteliales de todos los
tejidos del cuerpo. Esta viremia se acompaa por la aparicin de sarpullidos e
hiperqueratirosis, y determina el comienzo de la fase sintomtica (Figura 7B y 7C).
Dependiendo de la cepa viral, puede ocurrir encefalomielitis aguda en asociacin o
inmediatamente despus de la manifestacin sistmica (von Messling et al., 2003);
dentrodelasnumerosasmanifestacionesneurolgicasasociadasalainfeccin(rigidez
cervical, convulsiones, sntomas vestibulares y cerebrales y ataxia sensorial), la
miocloniaeselnicosntomaneurolgicosugestivodeDistemper(Deemetal.,2000).
La inmunosupresin severa y duradera asociada a la infeccin por CDV, potencia la
susceptibilidad individual a infecciones secundarias, lo cual contribuye a las elevadas
tasasdemortalidaddelaenfermedad.Elingresodelvirusaloslinfocitosmediadapor
la interaccin con el receptor SLAM, es considerado un posible determinante de la
inmunosupresin; de hecho, la expresin del SLAM en diversos tipos celulares se
asociaconladiseminacindelainfeccinatravsdelsistemalinftico(vonMessling
etal.,2005).

Figura7.ManifestacionesclnicassecundariascaractersticasdeinfeccinporCDV.Adescargaculo
nasal;Bhiperqueratirosisplantar;Csarpullido.Tomadodelsitiowebwww.adoptagdl.com

1.2.3Epidemiologa
CDV representa una importante amenaza para carnvoros domsticos y silvestres en
todoelmundo.Encnidosdomsticos,Distemperesunadelasenfermedadesvirales
demayorincidenciaconelevadastasasdemortalidad(Appel&Summers,1999),yen
las ltimas dcadas se han reportado infecciones en todas las familias de carnvoros
9

Introduccin

terrestres:Canidae,Felidae,Hyaenidae,Mustelidae,Procyonidae,Ursidae,yViverridae
(Deemetal.,2000;Frolichetal.,2000).
Enalgunasregionesgeogrficasloscarnvorossilvestresrepresentanelreservoriodel
virus en la naturaleza, posibilitando su transmisin a canes domsticos. En
Norteamrica se han registrado epidemias regulares de Distemper en mapaches
(Procyon lotor), y en Japn se han registrado brotes de la enfermedad en civetas
(Paguma larvata), los cuales tienen un rol fundamental en la transmisin de la
enfermedadacanesyaotrasespeciessilvestressusceptibles(Hashimotoetal.,2001;
Lednicky et al., 2004). Alternativamente, en diversas regiones de frica donde no se
implementan planes de vacunacin adecuados, los canes son el reservorio del virus,
loscualeslotransmitenalafaunasilvestre(Deemetal.,2000).

1.2.4Prevencinycontroldelaenfermedad
La vacunacin es la principal estrategia para controlar a la enfermedad en canes
domsticos. Las vacunas con virus vivos atenuados (VVA) estimulan la respuesta
inmune humoral y celular e inducen memoria inmunolgica. El desarrollo y la
utilizacin de estas vacunas desde la dcada del 50, ha contribuido a una drstica
reduccin en la incidencia de Distemper en canes domsticos. Sin embargo,
recientementesehanobservadobrotesdelaenfermedadenpoblacionesinmunizadas
de canes de diversas regiones geogrficas (Gemma et al. 1996, Bolt et al., 1997, Ek
Kommonenetal.1997,Keawcharoenetal.2005,Lanetal.2006,Caldernetal.2007).
Aunque no se han determinado las causas, dichos brotes podran explicarse por la
reversindelascepasatenuadasalavirulencia(Appel,1987),oporlaemergenciade
nuevas cepas lo suficientemente variables como para evadir la respuesta inmune
generada por las vacunas (Pardo et al., 2005). Los casos en poblaciones vacunadas
tambinpodranexplicarseporfallasenlaadministracindelasvacunas,obienporel
estadosanitarioeinmunolgicodelanimal(Figura8)(Rikula,2008).
Las vacunas utilizadas en nuestro pas estn principalmente formuladas con la cepa
Onderstepoort(OP),lacualfueatenuadapornumerosospasajesenlneascelularesy
huevosembrionados(Haig,1956).Dichacepadatadeunbrotedelaenfermedaddela
dcada del 30 ocurrido en zorros de Norte Amrica. Se estableci que las cepas

10

Introduccin

circulantesenlaactualidadpresentanelevadosvaloresdedivergenciarespectoaesta
cepavacunal(Martellaetal.,2006).

Figura8.Razonesgeneralesdefallasasociadasalavacunacin.ModificadodeRikula(2008).

1.3DeteccindeCDVenmuestrasclnicas
LossntomasclnicosasociadosalainfeccinporCDVsonsimilaresalosproducidos
porotrosagentesvirales,comoelvirusparainfluenzacanino,adenoviruscaninotipo2
o coronavirus respiratorio canino, provocando frecuentemente confusin en el
diagnstico clnico (Demeter et al., 2007). Por tanto, se han desarrollado diversas
metodologas de diagnstico complementario, entre las que se incluyen las tcnicas
serolgicas como ensayos de inmunohistoqumica y ELISA (EnzymeLinked
InmunoSorbent Assay), y las tcnicas moleculares como el ensayo de RTPCR (Retro
TranscripcinReaccinenCadenadelaPoliermasa).

11

Introduccin

1.3.1Ensayosserolgicos
EldiagnsticoserolgicoserealizamedianteladeteccindeanticuerposdeltipoIgM
antiCDV(BlixenkroneMolleretal.,1991).Actualmenteseaceptaqueexisteunnico
serotipo de CDV, observndose que aislamientos con diferentes propiedades
biolgicaspuedenreaccionardeigualmodoenensayosconanticuerposmonoclonales
(mAbs) (Appel & Summers, 1999). La tcnica ELISA se emplea para detectar estos
anticuerpos,ydeterminareliniciooeldesarrollorecientedelainfeccinenanimales
consntomasclnicospresuntivosdeDistemper.Sinembargo,animalesconinfeccin
aguda pueden perecer sin presentar ttulos mensurables de anticuerpos, o animales
con infecciones subclnicas pueden presentar ttulos de IgM semejantes a los de
animalesvacunados(Appel&Summers,1999).
Elensayodeinmunohistoqumicaseutilizaparadetectarantgenosviralesy/ocuerpos
deinclusinenclulasbronquiales,nduloslinfticos,vejigaurinaria,obienentejidos
delSNC.Estatcnicaofreceresultadosconfiablesnicamenteenaquelloscasosdonde
seregistraunamarcadaviremia,ademspuederealizarseexclusivamenteenmuestras
tomadaspostmortem(Frisketal.,1999).

1.3.2Tcnicasmoleculares
1.3.2.1RTPCRtiempofinal
EnlasltimasdcadassehandesarrolladometodologasmolecularesbasadasenRT
PCR, las cuales permiten realizar un diagnstico antemortem preciso en casos
presuntivosdeinfeccinporCDV(Sternetal.,1995;Frisketal.,1999).Enlosestudios
diagnsticos, los blancos de amplificacin son genes o regiones genmicas que
presentan un alto grado de conservacin entre los aislamientos, como ser N, P y M
(Frisketal.,1999;Kimetal.,2001;Golleretal.,2009;Sietal.,2010).Frisketal.(1999)
desarrollaron un mtodo muy eficaz de deteccin del genoma de CDV basado en la
amplificacindeunfragmentoconservadode287pbdel genN,elcualfueutilizado
posteriormentepordiversosautores(Gebaraetal.,2004;Eliaetal.,2006;Saitoetal.,
2006;Caldernetal.,2007;Saruteetal.,2011).
Si bien la RTPCR en tiempo final se utiliza comnmente en ensayos de diagnstico
molecular,presentaalgunaslimitacionestalescomoelbajorendimientodelamisma

12

Introduccin

enmuestrasconttulosviralesdiscretos,yproblemasdecontaminacinasociadosala
manipulacindelamplicn(Eliaetal.,2006).

1.3.2.2RTPCRtiemporeal
EldesarrollodelatecnologadelRTPCRentiemporealconstituyeunodelosaportes
ms relevantes aplicado al diagnstico viral (Mackay, 2007; Scagliarini et al., 2007).
Medianteestatcnica,sehanimplementadometodologasdiagnsticasmsrpidasy
especficas,capacesdedetectaralagenteviralinclusoenmuestrasconcargasvirales
discretas. Adems, presenta la ventaja de no requerir manipulacin postreaccin
evitando posibles problemas de contaminacin (Mackay, 2007). La deteccin de un
bajonmerodecopiasdeRNAviralestilparalaidentificacindeperrosinfectados
que no presentan sintomatologa (manifestacin subclnica) pero que contribuyen
activamentealadiseminacindelvirus(Scagliarinietal.,2007).
Alafecha,secuentaconslotresestudiosdedeteccindelgenomadeCDVporRT
RTPCRentiemporeal.EnSudamrica,existeunnicoestudiobasadoenlautilizacin
delagenteintercalanteSYBRGreenparaladeteccindelgenomaviral(DelPuertoet
al.,2010).EnEuropa,Eliaycols(2006)desarrollaronunmtododedeteccinbasado
enlahibridacinyamplificacindeunareginconservadadelgenNmediantequmica
TaqMan,mientrasqueScagliariniycols(2007)implementaronunmtodobasadoen
lamismaestrategia,amplificandounareginconservadadelgenP.
Los mtodos basados en sondas de hidrlisis TaqMan son sistemas de deteccin
especficos,debidoaquepermitendiscriminarentrelasecuenciadeintersyposibles
amplicones inespecficos o dmeros de cebadores. Estas sondas presentan un
fluorforo unido al extremo 5, y una molcula quencher en el extremo 3 la cual
absorbe la energa emitida por el fluorforo si ambos se encuentran prximos
fsicamente. Cuando la Taq polimerasa comienza a polimerizar a partir de los
cebadores y se encuentra con el extremo 5 de la sonda, lo degrada gracias a su
actividadexonucleasa35.Esteprocesoliberaalfluorforoyloseparadelquencher,
locualocasionaunincrementodelafluorescenciaqueesdetectadaporelequipode
PCR (Figura 9). El parmetro fundamental de la reaccin es el ciclo umbral (Ct),
definido cmo el nmero de ciclos necesarios para que se produzca un aumento

13

Introduccin

significativodelafluorescenciarespectoalasealdebase;estevaloresinversamente
proporcionalalacantidadinicialdemolculasdeDNAmolde(Mackay,2007).

Figura9.RepresentacinesquemticadeamplificacinporPCRtiemporealmediantesondasTaqMan.
TomadodeMackay,2007.

1.4CaracterizacingenticadeCDV
LaamplificacinporRTPCRtiempofinalyposteriorsecuenciacindelosamplicones
permite conocer y comparar los aislamientos de campo, con el fin de establecer sus
niveles de variabilidad gentica respecto a aislamientos de diferentes regiones
geogrficas y las cepas vacunales. En los estudios de caracterizacin los blancos de
amplificacin son genes o regiones genmicas con altos niveles de variabilidad
gentica.

1.4.1Hemaglutinina
El gen H es el ms variable del genoma de los Morbillivirus. A nivel de su secuencia
aminoacdicasedetectanvaloresdedivergenciadel8%entreaislamientosdecampo,
y de hasta el 11% respecto a las cepas vacunales (Bolt et al., 1997; Martella et al.,
2006).
EnbasealanlisisdelahemaglutininasehandescritoloslinajesdeCDVcirculantesen
elmundo.Elcriterioestablecequedosaislamientospertenecenaunmismolinajesise
agrupan dentro de un mismo clado en la filogenia y presentan una variacin
aminoacdica menor al 4%. Si los aislamientos se agrupan en clados distintos y
presentanvaloresdedivergenciamayoresal4%,pertenecenalinajesdistintos(Boltet
al.,1997;Martellaetal.,2006).LoslinajesdeCDVsedistribuyensegnunpatrnde
14

Introduccin

distribucin geogrfica, salvo escasas excepciones (Martella et al., 2006). Hasta la

fecha, se han identificado ocho linajes en el mundo: frica, Amrica1
(correspondienteallinajedelascepasvacunales),Amrica2,Asia1,Asia2,Europa1,
Europa2(Europewildlife)yEuropa3(Arcticlike)(Figura10)(Mochizukietal.,1999;
Hashimoto et al., 2001; Lednicky et al. 2004; Martella et al., 2006; Demeter et al.,
2007;Anetal.,2008;Womaetal.,2009).

15

Introduccin

Figura10.CladogramaenbasealasecuencianucleotdicacompletadelgenH(1824pb)deaislamientos
deCDV.ExtradodeWomaetal.,2009.

16

Introduccin

LaprotenaHeseldeterminanteprincipaldeltropismocelularyaqueinteractaconel
receptorcelularSLAMmedianteaadereconocimientoespecficos(Sekietal.,2003).El
modelado de su estructura permiti identificar que los residuos 530 y 549 estn
involucradosenlaadsorcinviralmediadaporelreceptorSLAM(Vongpunsawadetal.
2004;von Messlingetal.2005;McCarthyetal.,2007).Elanlisisdeaislamientosde
campo determin que dichos residuos difieren entre cepas aisladas de hospederos
domsticos y silvestres. En el residuo 530 se observan los aminocidos glicina (G) y
cido glutmico (E)en la mayorade los aislamientos de canes domsticos, mientras
quelascepasaisladasdeespeciessilvestresmuestranlosaaaspartato(D),asparagina
(N) y arginina (R). A nivel del residuo 549, el aa tirosina (Y) es caracterstico de
aislamientos de canes, mientras que en aislamientos de silvestres se registra la
sustitucinporhistidina(H),sugiriendoqueladispersindelvirusaotroshospederos
podraasociarseacambiosenestossitios(McCarthyetal.,2007).
LascadenasdeNglicanospresentesenlaprotenaHtambinpodraninfluirsobrelas
interaccionesconelreceptorSLAMyelingresodelvirusalaclula.Sedemostren
otras glicoprotenas de Paramyxovirus que la Nglicosilacin es fundamental para el
correctoplegamiento,transporteyfuncindelaprotena(vonMesslingetal.,2001).
ElposibleroldelaNglicosilacinenlafisiologadelahemaglutininadeCDVseanaliz
recientementemediantelaconstruccindevariantesconlaprotenadeglicosilada.Los
virusconprotenaHdeglicosiladamantenansufuncionalidad,aunquepresentabanun
fenotipoatenuadoinvivo,demostrandoqueserequiereunmnimodeNglicanospara
lavirulencia(Sawatsky&vonMessling,2010).

1.4.2Pptidosealdelaprotenadefusin
EL gen F es el segundo ms variable dentro del genoma de CDV. A nivel de su
secuencia aminoacdica, la protena F vara en torno al 4% entre aislamientos de
campo.Sinembargo,losprimeros135aacorrespondientesalFspvaranhastaun27%
(von Messling & Cattaneo, 2002). La comparacin entre aislamientos de campo y la
cepavacunalOP,mostrvaloresdevariabilidadaminoacdicaentre30y49%(Plattet
et al., 2007; Lee et al., 2008; Sultan et al., 2009). Los valores de variabilidad de la
reginFspsoninclusosuperioresalosdescritosparalahemaglutinina,comenzndose

17

Introduccin

autilizarenestudiosdecaracterizacinyevolucindeCDV(Leeetal.,2008;Sultanet
al.,2009).
El Fsp no se encuentra en las partculas virales debido a que la maduracin de la
protena F requiere su procesamiento proteoltico. Sin embargo, estara involucrado
indirectamenteenlaactividadlaprotenaF,limitandosuexpresinanivelintracelular
yenlasuperficie,conlaconsecuentereduccindelosnivelesdefusinclulaclula
(Plattet et al., 2007). Esta regin tambin contribuira a la virulencia e incluso en la
patognesis viral (Von Messling & Cattaneo, 2002; Plattet et al., 2007). Se han
analizado los efectos de la eliminacin de aa del Fsp y su posible relacin con la
funcindelaprotena;ladelecindelosprimeros60aadeterminunincrementode
laactividaddefusinde15rdenes,mientrasquelareduccinadicionaldelFspa8aa
resultenunincrementode70rdenesenlaactividaddefusin,sustentandoqueel
acortamientodelFspdeterminaunincrementoenlafusogenicidadviral(vonMessling
&Cattaneo,2002).Sinembargo,estudiosinvivosugierenqueelpptidosealnoes
esencial para la virulencia, ya que infecciones experimentales con virus carentes del
Fsp, resultaron en el desarrollo de la enfermedad y la muerte de los animales
(Anderson&vonMessling,2008).

1.5Antecedentesdelgrupodetrabajo
EnlosltimosaossehanregistradonumerososcasosdeDistemperennuestropas,
inclusoencanesvacunados.Debidoaello,implementamosporprimeravezenelpas
una metodologa molecular de deteccin de CDV (Sarute et al., 2011); esta
metodologasebasaenlaamplificacinmedianteRTPCRdeunfragmentode287pb
del gen N (Frisk et al., 1999). Su aplicacin nos permiti constatar la presencia del
genoma viral en el 86% de las muestras analizadas, de las cuales el 74%
correspondieron a animales vacunados. El anlisis de las secuencias de ocho
aislamientosdecampomostrelevadosvaloresdeidentidadnucleotdica(99.6100
%)confirmandoyextendiendoresultadospreviossobrelaconservacindeestaregin
genmicaysuutilidadenensayosdediagnsticomolecular.Lacomparacindeestas
secuenciasconlacepavacunalOP,revelnumerosasvariacionesnucleotdicas.Estas
diferenciasnospermitierondisearunmtododeRFLPparadiscriminarentrelacepa
vacunalylosvirusdecampo.Losresultadosobtenidosnospermitieronconstatarque
18

Introduccin

lainfeccindeloscanesfuecausadaporunvirusdecampoynodebidoalareversin
delacepavacunal(Saruteetal.,2011).
Con el objetivo de avanzar en la investigacin nos propusimos desarrollar nuevas
metodologas diagnosticas, as como relevar la variabilidad gentica de las cepas
circulantes en la regin. Durante el presente trabajo de Tesis, desarrollamos un
mtodo de deteccin del genoma viral por RTPCR en tiempo real, y caracterizamos
aislamientos de CDV del Ro de la Plata, mediante el anlisis de las regiones ms
variableseinformativasdelgenoma:lasecuenciacompletadelgenHylareginFsp.

19

Introduccin

1.6Hiptesisdetrabajo

Los mtodos moleculares permiten realizar un diagnstico rpido y sensible de

Distemper.

El anlisis del gen H y la regin Fsp de aislamientos de nuestra regin nos

permitirestablecerelgradodevariabilidadexistenteenlascepascirculantes.

1.7Objetivos
ObjetivoGeneral
DetectarycaracterizargenticamenteaislamientosdecampodeCDVdelRodela
Plata.
ObjetivosEspecficos

DesarrollarunsistemadediagnsticobasadoenRTPCRentiemporeal.

Establecer la variabilidad gentica de aislamientos uruguayos y argentinos

medianteelanlisisdelasecuenciacompletadelgendelahemaglutininaylaregin
Fspdelgendelaprotenadefusin.

InferirlasrelacionesevolutivasentrelosaislamientosdelRodelaPlataycepas

caracterizadas en otras regiones geogrficas, mediante el anlisis de las secuencias

nucleotdicasyaminoacdicasdeambosmarcadores.

20

MaterialesyMtodos

2.MATERIALESyMTODOS
2.1Muestras
Seanalizaronmuestrasdeorina,sangreysecrecionesculonasalesde30canescon
sntomaspresuntivosdeinfeccinporCDVprocedentesdeUruguayyArgentina(Tabla
1).Lacolectadelmaterialbiolgicofuerealizadapormdicosveterinariosyelmismo
sealmacena20Chastasuprocesamiento.
Lasmuestrasuruguayasfueroncolectadasenelperodo20062010,mientrasquelas
argentinas se colectaron durante 20032010. Estas ltimas fueron procesadas y
analizadasenelmarcodeunapasantaregionalfinanciadaporlaredAMSUDPasteur
enelInstitutoMilstein(CONICET)deBuenosAires.
Adems, se utilizaron muestras provenientes de animales sin sintomatologa clnica
como controles negativos. Para estandarizar los ensayos de diagnstico y
caracterizacin molecular, se usaron muestras de vacunas comerciales de CDV (cepa
Onderstepoort, Puppy DP Nobivac, Intervet, The Netherlands) y del Virus de la
BronquitisInfecciosaAviar(IBV)(cepaMassachussets,FortDodgeAnimalHealth,Iowa,
USA).

2.2Extraccindelgenomaviral
LaextraccindelRNAviralserealizmediantedosprotocolosdiferentesdependiendo
delorigendelamuestra.Enambosprotocolosseadicionalasmuestras0.5ldeuna
solucin de 1 mg de la vacuna de IBV diluida en 1ml de 1X PBS pH=8 que se utiliz
comocontrolinterno(CI)enlasreaccionesdeRTPCRtiemporeal.

23

MaterialesyMtodos

Tabla1.Muestrasempleadasenelestudio.Sedetallaladenominacin,edad,procedencia,estadode
vacunacin y sintomatologa de los animales. NV: no vacunado; V: vacunado; DS: desconocido; SN:
sintomatologia neurolgica; GI: sintomatologia gastrointestinal; SR: sintomatologia respiratoria; Conj:
conjuntivitis.

Muestra

Edad
(meses)

Procedencia

CDV75

CDV116
CDV127

8
24

CDV128

CDV134
CDV139

32
12

CDV141
CDV142
CDV143
CDV144
CDV145
CDV146

2
20
18
14
10
6

CDV148
CDV149
CDV150
CDV162
CDV164
CDV166
CDV167
CDV168
CDV169
CDV170
CDV172
CDV190

2
3
4
12
36
3
3
2
3
3
2
7

CDV191
CDV0801
Arg23
Arg24

4
12
15
4

SanJos
(SantaLuca)
Montevideo
Canelones
(SantaRosa)
Canelones
(SantaRosa)
Colonia
SanJos
(SantaLuca)
ND
Montevideo
Montevideo
Montevideo
Montevideo
Canelones
(SantaRosa)
Tacuaremb
Montevideo
Tacuaremb
DS
DS
Rivera
Montevideo
Montevideo
DS
DS
Tacuaremb
SanJos
(SantaLuca)
Montevideo
Rocha(Chuy)
BahaBlanca
BahaBlanca

Arg25

10

Arg26

48

BuenosAires
(Capital
Federal)
BuenosAires
(Capital
Federal)

Vacunacin

SN
+

SintomatologaClnica

GI
SR
Conj
Otros

+
+
Leucopenia

V
V

+
+

NV

V
V

Pirexia

V
V
DS
NV
V
NV

+
+

+
+
+
+

+
+

+
+
+
+

Pirexia
Depresin
Depresin
Pirexia

V
NV
V
V
V
V
V
NV
V
NV
V
V

+
+
+

+
+
+
+
+
+
+

+
+
+

+
+
+

Pirexia

Depresin

Pirexia

Depresin

Pirexia
Depresin
Pirexia

V
V
V
V

+
+
+

+
+

Hiperquerat
irosis
Pirexia,
Hiperquerat
irosis
Pirexia

1.EnloscasosdeorinayliofilizadovacunalOP(unvialdelavacunaen800lde1X
PBS pH=8), se utiliz el kit de extraccin libre de clulas "QIAmp Viral RNA Mini Kit"
(Qiagen)apartirde140ldefluido,segnelsiguienteprotocolo:

Agregar560ldebufferdelisisy5.6ldeRNAcarrierauntubode1.5ml.

Adicionar140ldefluido.Mezclarconvortexpor15s.

Incubaratemperaturaambiente(TA)por10min.
24

MaterialesyMtodos

Centrifugarpor15sa13.000rpm.

Adicionar560ldeetanolabsolutoymezclarconvortexpor15s.

Agregar630ldelasolucinaunacolumnaQIAampMinicolumnycentrifugar
a8000rpmpor1min.Colocarlacolumnaenunnuevotuboydescartarelfiltrado.

Repetirelpasoanterior.

Adicionar500ldebufferdelavado1ycentrifugara8000rpmpor1min.Colocar
lacolumnaenunnuevotuboydescartarelfiltrado.

Adicionar 500 l de buffer de lavado 2 y centrifugar a 13.000 rpm por 3 min.

Descartarelfiltrado.

Secarlacolumnacentrifugandoa13.000rpmpor1min.

Colocar la columna en un nuevo tubo de 1.5 ml y adicionar 60 l de buffer de

elucin.IncubaraTApor1minycentrifugara8000rpmpor1min.

2.Enloscasosdesecrecionesculonasalesysangreperifrica,laextraccinserealiz
mediante el reagente TRIzol (Invitrogen Life Technologies) a partir de un
homogeneizado de 200 l de muestra y 1 ml de TRIzol, de acuerdo al siguiente
protocolo:

MezclarconvortexeincubaraTApor5min.

Adicionar200ldecloroformo,mezclarporinversineincubaraTApor3min.

Centrifugara12.000rpmpor10mina4C.

Transferir el sobrenadante a un nuevo tubo de 1.5 ml y adicionar 500 l de

isopropanol.Mezclarporinversin.

IncubaraTApor10minycentrifugara12.000rpmpor20mina4C.

Descartar el isopropanol. Adicionar 500 l de etanol 70% y centrifugar a 12.000

rpmpor5mina4C.

Aspirareletanol.SecarelpelletRNAaTApor10min.

Adicionar2040ldeagualibredeRNAsasprecalentadaa50C.

IncubaraTApor5min.ResuspenderelpelletRNA.

25

MaterialesyMtodos

2.3EnsayosderetrotranscripcinyPCR
2.3.1Retrotranscripcin
El DNA complementario (cDNA) se sintetiz mediante retrotranscripcin con el kit
RevertAid MMLV Reverse Transcriptase (Fermentas), de acuerdo al siguiente
protocolo:

Colocarenuntubo510ldeRNAy1520pmoldecebadordirecto.

Incubarlamezclaa70Cpor5min,llevarahielopor2min.

Adicionar4ldebufferMMLV,2ldedNTPs10mMy1ldeRibolockRNAase
inhibitoreincubara37Cpor5min.

Agregar1ldeRTRevertAidMMLVReverseTranscriptase.

Incubara42Cpor60minya70Cpor10min.

Se utilizaron distintos cebadores de acuerdo al ensayo. En los ensayos diagnsticos

medianteRTPCRentiemporeal,elcDNAdelgenNsegenerapartirdelcebadorp1
(Tabla 2). Cuando se incorpor el uso de un control interno en los ensayos de
diagnstico, la reaccin de RT se realiz con cebadores hexmericos universales
(Integrated DNA Technologies) capaces de retrotranscribir en forma conjunta al
genomadeCDVeIBV.
Paralosestudiosdecaracterizacin,segenerelcDNAcorrespondientealasecuencia
completa del gen H a travs de los cebadores FUP y FI7742 (Figura 11; Tabla 2),
mientrasqueeldelareginFspfueobtenidomedianteelcebadorF4784(Tabla2).

2.3.2RTPCRentiemporeal
El genoma de CDV se detect mediante la amplificacin de un fragmento de 101 pb
conloscebadoresF906R1007ylasondaTaqManCDVNR(Tabla2).
Dicha sonda presenta en el extremo 5 a la molcula 6carboxifluorescena (FAM)
como fluorforo y a la tetrametilrodamina (TAMRA) como molcula quencher en el
extremo3.
MedianteeljuegodecebadoresIBVF391IBVR533ylasondaIBV5UTRseamplificy
detect un fragmento de 142 pb del genoma de IBV, utilizado como CI (Tabla 2). La
sondaIBV5UTRpresentaVICcomofluorforo,yTAMRAcomomolculaquencher.El
juegodecebadoresysondafuegentilmentecedidoporlaLicenciadaAnaMarandino.
26

MaterialesyMtodos

LascondicionesdecicladosedetallanenlaTabla3(Protocolo1).Losexperimentosse
realizaronenelequipoABI7500(AppliedBiosystems)delaSeccinGenticaEvolutiva
medianteelsoftwareABI7500versin3.0.

Tabla2.CebadoresysondasTaqManutilizadosenlasreaccionesdeRTPCRtiempofinalyPCRtiempo
real.Sesealaconasteriscoelcebadorp1descritoporFrisketal.(1999),yloscebadoresIBVF391R533
ylasondaIBV5UTRdescritosporCallisonetal.(2006).

Cebadoresy
sondas

Secuencianucleotdica(53)

Posicinen
elgenoma

genN(CDV)
p1*

ACAGGATTGCTGAGGACCTAT

769789

F906

GCTAGTTTCATCCTAACTATCA

906926

R1007

CATAAGGGATTCAATAGTTGTTA

9841007

CDVNR

FAMAGAGCCGGATACATAGTTTCTGCCATAMRA

939958

genF(CDV)
F4784

CCACGCACTTGCCTGATCTCA

47844805

F4854

TCCAGGACATAGCAAGCCAACA

48544876

R5535

GGTTGATTGGTTCGAGGACTGAA

55125535

genH(CDV)
FUP

CACTCAAGCAGCATACTAAGGTCG

68546878

F7061

GGCTCAGGTAGTCCAGCAATG

70617083

FI7742

GCTATCTCAGACGGAGTGTATGG

77427765

RI8094

GAGCGACAGGTATCACCTCTTC

80728094

R8492

ACTGGTCTCCTCTACTTGCTTTG

84698492

RE8969

GTCGGTAAGGGATTTCTCACCAC

89468969

IBV(CI)
IBVF391*

GCTTTTGAGCCTAGCGTT

391409

IBVR533*

GCCATGTTGTCACTGTCTATTG

511533

IBV5`UTR*

VICCACCACCAGACCTGTCACCTCTAMRA

444465

27

MaterialesyMtodos

2.3.3PCRtiempofinal
2.3.3.1AmplificacindelasecuenciacodificantedelgenH
La secuencia completa del gen H fue amplificada en dos fragmentos solapantes
mediantePCR(Figura11).Unfragmentode1038pbdelaregin3(fragmentoHI)se
amplific utilizando los cebadores F7061RI8094, y un fragmento de 1227 pb de la
regin 5 (fragmento HD) se obtuvo mediante el juego de cebadores FI7742RE8969
(Tabla2).Sedisetambinuncebador(R8492)queseutilizjuntoalcebadorFI7742
paraamplificarunfragmentode750pb(Figura11).

Figura11.RepresentacindelgenHydeloscebadoresutilizadosenlosensayosdeRTPCR.La
secuenciadeloscebadoressedescribeenlaTabla2.

Las condiciones empleadas para la amplificacin del gen H por PCR se detallan en la
Tabla3(Protocolo2).Lasreaccionesserealizaroneneltermocicladorcongradientede
temperaturaCG1/96(CorbettResearch).

2.3.3.2AmplificacindelaregincodificantedelFsp
Laamplificacindeunfragmentode681pbdelgenF,elcualincluyealareginFsp
(405pb),serealizconeljuegodecebadoresF4854yR5535(Tabla2).Lareaccinde
PCR se realiz con las condiciones detalladas en la Tabla 3 (Protocolo 3), en un
termocicladorcongradientedetemperaturaCG1/96(CorbettResearch).

28

MaterialesyMtodos

Tabla 3. Protocolos estandarizados de PCR. Protocolo 1, amplificacin del gen N. Protocolo 2,

amplificacin del gen H. Entre parntesis se detalla la temperatura de hibridacin empleada para
amplificaralfragmentode750pb.Protocolo3,amplificacindelareginFsp.

Proceso

Temperatura

Tiempo

LecturaprePCR

50C

2min

Desnaturalizacin

95C

30seg

Protocolo1

40ciclos
Hibridacinextensin

55C

1min

LecturapostPCR

50C

1min

Desn.Inicial

95C

3min

Desnaturalizacin

95C

30seg

Hibridacin

57C(54C)

45seg

Extensin

72C

1:30min

Extensinfinal

72C

10min

Desn.Inicial

95C

3min

Desnaturalizacin

95C

30seg

Hibridacin

58C

45seg

Extensin

72C

1min

Extensinfinal

72C

5min

Protocolo2

35ciclos

Protocolo3

30ciclos

2.4Electrofresis
Los productos de PCR fueron separados mediante electroforesis en gel de
poliacrilamidaal6%duranteunahoraa110voltsconstantes.Lacorridaserealizcon
buffer1XTBE(TrisBase89mM,cidoBrico89mM,EDTApH8.0,2mM),losgeles
fueronreveladosportincinconnitratodeplata(10mg/ml).

29

MaterialesyMtodos

2.5PurificacindelosfragmentosamplificadosporRTPCR
Todos los amplicones se purificaron con el kit Illustra GFX PCR DNA and Gel Band
PurificationKit(GeneralElectric)segnelsiguienteprotocolo:

Adicionar500ldebufferdecapturaa20100ldeproductodePCR.Mezclar
porinversin.

Cargarlamezclaenunacolumna"GFXMicroSpincolumn.Centrifugara13.000
rpmpor30s.Descartarelfiltrado.

Adicionar500ldebufferdelavadoalacolumna.Centrifugara13.000rpmpor
30s.Descartarelfiltrado.

Secarlacolumnacentrifugandoa13.000rpmpor30sadicionales.

Transferirlacolumnaauntubode1.5ml,agregar1050ldebufferdeelucin
eincubaraTApor1min.

RecuperarelDNApurificadocentrifugandoa13.000rpmpor1min.

AlmacenarelDNAa20C.

LaconcentracindelDNApurificadofuemedidaconelespectrofotmetroNanoDrop
8000(ThermoScientific).

2.6ClonacindelosampliconesdelgenH
ELDNApurificadodelosfragmentosHIyHDdelgenHfueclonadoconelkitGeneJet
PCR Product Cloning kit (Fermentas) utilizando clulas competentes de E. Coli XL1
Blue.LosproductosdePCRcontienenunaregindepoliAenelextremo3,portanto
debensertratadosconunaenzimadebluntingquegeneraextremosromosantesde
serclonados.
ReaccindeBlunting
Mezclar
Bufferreaccin2X10l.
ProductoPCR5l.
AgualibredeDNAsas2l.
EnzimaDNABlunting1l.
Incubarlamezclaa70Cpor5min,llevarahielopor10s.
30

MaterialesyMtodos

ReaccindeLigacin
Adicionar
VectordeclonacinpJET1/Blunt(50ng/l)1l.
T4DNALigasa(5U/l)1l.
IncubarlamezcladeligacinaTApor20min.

Transformacin
PrecalentarplacasdeLBagarampicilinaa37C.
Transferir5ldelamezcladeligacinauntuboeincubarpor2minenhielo.
Agregar50ldeclulascompetentes(XL1Blue)eincubarpor15minenhielo.
Realizarshocktrmicoa42Cpor45s.
Incubarenhielopor1min.
Incubarlamezclaenagitadorpor90min.
Plaqueareincubara37Ctodalanoche(ON).

La extraccin del DNA plasmdico de las colonias se realiz mediante la tcnica de

minipreparaciones(Sambrooketal.,1989),descritaacontinuacin:

ExtraerunacoloniadelaplacaLBagarycrecerlaen3mldeLBlquidocon1lde
ampicilina(50g/ml).

IncubarONenagitadora37C.

Transferir1.5mldelcultivoauntuboycentrifugara13.000rpmdurante5min,
eliminar el sobrenadante. Agregar al tubo el volumen restante y centrifugar
nuevamente,descartartodoellquido.

Resuspender el pellet en 300 l de solucin P1 (50 mM TrisHCl; 10 mM EDTA

pH=8).

Agregar300ldelasolucinP2(200mMNaOH;1%SDS).Mezclarporinversin.

Aadir 300 l de solucin P3 fra (3M NaAc pH=5.5). Mezclar por inversin e
incubarpor15minenhielo.

Agitar por inversin y centrifugar a 13.000 rpm durante 15 min, recoger el

sobrenadante.

31

MaterialesyMtodos

Adicionar 1 vol de fenol:cloroformo (1:1) y mezclar con vortex. Centrifugar a

13.000rpmdurante15min.

Transferirlafaseacuosasuperioraunnuevotubo.

Lavarconcloroformoycentrifugara13.000rpmdurante15min.Transferirlafase
superioraunnuevotubo.

Precipitar el ADN con 0.1 vol de acetato de sodio (NaAc) 3M y 3 vol de etanol
absolutofro.IncubarONa20C.

Centrifugara13.000rpmpor15min.

Lavar con etanol 70%, centrifugando a 13.000 rpm durante 15 min. Descartar el
etanol.SecarelpelletaTA.

Resuspenderelpelleten30ldeH2OmiliQyalmacenara20C.

2.7Secuenciacin
Los plsmidos con inserto fueron secuenciados en ambas direcciones utilizando los
cebadores del vector pJET, mientras que para el DNA purificado de la regin Fsp se
utilizaronloscebadoresespecficosF4854R5535(Tabla2).
La secuenciacin se realiz de forma automtica en el equipo ABI3130 (Applied
Biosystems)delaUnidaddeSecuenciacindelInstitutoPasteurdeMontevideo.

2.8Anlisisbioinformticodesecuenciasnucleotdicasyaminoacdicas
2.8.1Diseodecebadoresysondas
LoscebadoresF906R1007ylasondaCDVNRutilizadoseneldiagnstico,sedisearon
enbasealalineamientodesecuenciasdelgenNdeaislamientosuruguayosobtenidas
en nuestro laboratorio con secuencias de aislamientos provenientes de diversas
regionesgeogrficas(Saruteetal.,2011).LoscebadoresylasondadeIBVutilizadosen
elcontrolinternofuerondescritosporCallisonetal.(2006).
LoscebadorescapacesdeamplificaralgenHylareginFspsedisearonenbaseal
alineamientodesecuenciasdisponiblesenelGenbank(Tabla4).
Los cebadores y sondas se analizaron con los programas Beacon Designer 7.5
(Applied Biosystems) y Oligo Analyzer 3.1 de Integrated DNA Technologies
(www.idtdna.com).

32

MaterialesyMtodos

2.8.2Edicinyalineamientodesecuenciasnucleotdicas
LassecuenciasdelgenHydelareginFspseensamblaronyeditaronconelprograma
Seqman(DNASTAR,Lasergene).LassecuenciasobtenidasdelgenHfuerondepositadas
enlabasededatosdelGenbank(Tabla4).Estassecuenciassealinearonycompararon
con tres secuencias de aislamientos uruguayos obtenidas previamente en nuestro
laboratorio, con seis secuencias de cepas sudamericanas publicadas en el Genbank
(dos argentinas y cuatro brasileras), y con 33 secuencias representativas de los ocho
linajes, a travs del mtodo ClustalW del programa Molecular Evolutionary Genetic
Analysis(MEGA4.1)(Tabla4).
LassecuenciasdelFspdescritasenestetrabajofueronalineadasmedianteClustalW,
consecuenciasdeaislamientosdeNorteamrica,AsiayEuropa(Tabla4).

2.8.3Anlisisfilogenticos
Los cladogramas fueron inferidos a travs del mtodo NeighborJoining utilizando el
modelodedistanciapaminoacdicadelprogramaMEGA4.1.Elsoporteestadsticode
los nodos de la filogenia se obtuvo mediante anlisis por bootstrap con 1000
seudorplicas(Tamuraetal.,2007).

2.8.3.1Hemaglutinina
2.8.3.1.1Anlisisdelasecuenciacompleta
Seanalizaron46secuenciasaminoacdicasdeducidasdelalineamientodelasecuencia
codificantedelgenH.Destas,33correspondenaaislamientosrepresentativosdelos
ocholinajes,mientrasquelasotras13pertenecenalosaislamientossudamericanos,
cuatrodeelloscaracterizadosenestaTesis(Tabla4).

2.8.3.1.2Anlisisdeunasecuenciaparcial(134aa)
Seanalizaronuntotalde38secuencias(completasyparciales)delgenHdescritasala
fecha en Sudamrica, incluyndose la secuencia completa de 13 aislamientos
sudamericanos,la secuencia parcial (134 aa) de dos aislamientos de Uruguay,22
argentinos (Caldern et al., 2007) y un aislamiento de un zorro perro (Cerdocyon
thous) de Argentina (Ferreyra et al., 2009). El anlisis se realiz en base a un
fragmento solapante de 402 pb (134 aa) presente en todos las cepas
33

MaterialesyMtodos

sudamericanas analizadas.Tambin se incluyeron en el estudio las 33 cepas

representativas de los ocho linajes analizadaspara la secuencia completa de
lahemaglutinina(Tabla4).

2.8.3.2Pptidosealdelaprotenadefusin
El anlisis del Fsp incluy 26 secuencias, de las cuales 11 correspondieron a los
aislamientos caracterizados en el presente trabajo, y las otras 15 a aislamientos de
diversasregionesgeogrficas(Tabla4).

2.8.4Identificacindesitiosdeglicosilacin
Laidentificacindesitiospotencialesdeglicosilacindelassecuenciasaminoacdicas
delahemaglutininadelosaislamientosdeUruguay,ArgentinaylacepaOP,serealiz
con el programa MEGA 4.1. Estos sitios presentan la secuencia NXS/T, donde N
correspondeaArginina,XacualquieraaexceptoProlina,SaSerinayTaTriptfano.

2.8.5Estudiodepresionesselectivas
Mediante el algoritmo Single Likelihood Ancestor Counting (SLAC) del sitio web
DataMonkey(www.datamonkey.org)seanalizaronlassecuenciasaminoacdicasdela
hemaglutinina descritas en este trabajo, junto a las 198 secuencias no redundantes
disponiblesenelGenbank.Tambinseanalizaronlas11secuenciasdelareginFspde
Uruguay y Argentina, junto con las 47 secuencias no redundantes de esta regin
publicadasenlabasededatos.
El algoritmo SLAC es un mtodo de conteo basado en verosimilitud para identificar
presionesselectivasencadacodndelalineamiento.Elmtodoinfiereelnmerode
cambiossinnimos(S)ynosinnimos(NS)porcodn,yestablecesilosNSporsitiono
sinnimo (dN) son significativamente diferentes de los S por sitio sinnimo (dS); el
niveldesignificanciaempleadoenlosanlisis()fuedel0,25.

34

MaterialesyMtodos

Tabla4.Secuenciasnucleotdicasutilizadasenlosanlisisbioinformticosyfilogenticos.EU1:Europa
1,EU2:Europa2,EU3:Europa3,NA1:Norteamrica1,NA2:Norteamrica2,OG:grupoexterno,SA1:
Sudamrica1;SA2:Sudamrica2,Vac:cepavacunal,ZA:frica.LosgruposSA1ySA2fuerondescritos
enestaTesisenbasealanlisisdelahemaglutininayelFspdeaislamientosdelRodelaPlata.
Aislamiento
Arg1
Arg2
Arg3
Arg4
Arg5
Arg6
Arg7
Arg8
Arg9
Arg10
Arg11
Arg12
Arg13
Arg14
Arg15
Arg16
Arg17
Arg18
Arg19
Arg20
Arg21
Arg22
Arg23
Arg24
Arg25
Arg26
ArgFox
CDV75
CDV102
CDV109
CDV111
CDV116
CDV128
CDV141
BR1
BR2
BR3
BR4

NaccesoGenbank
AM422846
AM422847
AM422848
AM422849
AM422850
AM422851
AM422852
AM422853
AM422854
AM422855
AM422856
AM422857
AM422858
AM422859
AM422860
AM422861
AM422862
AM422863
AM422864
AM422865
AM422866
AM422867
FJ392652
FJ392653

EU624414

JN215473
JN215474
JN215475

JN215476
JN215477
EU098102
EU098103
EU098104
EU098105

Pas
Argentina
Argentina
Argentina
Argentina
Argentina
Argentina
Argentina
Argentina
Argentina
Argentina
Argentina
Argentina
Argentina
Argentina
Argentina
Argentina
Argentina
Argentina
Argentina
Argentina
Argentina
Argentina
Argentina
Argentina
Argentina
Argentina
Argentina
Uruguay
Uruguay
Uruguay
Uruguay
Uruguay
Uruguay
Uruguay
Brasil
Brasil
Brasil
Brasil

Secuencia
871pbgenH
871pbgenH
871pbgenH
871pbgenH
871pbgenH
871pbgenH
871pbgenH
871pbgenH
871pbgenH
871pbgenH
871pbgenH
871pbgenH
871pbgenH
871pbgenH
871pbgenH
871pbgenH
871pbgenH
871pbgenH
871pbgenH
871pbgenH
871pbgenH
871pbgenH
genH
genH
genH
genH
871pbgenH
1269pbgenH
genH
genH
genH
1269pbgenH
genH
genH
genH
genH
genH
genH

Linaje/Grupo
SA2
SA2
SA2
SA2
SA2
SA2
SA2
SA2
SA2
SA2
SA2
SA2
SA2
SA2
SA2
SA2
SA2
SA2
SA2
SA2
SA2
SA2
SA1
SA2
SA2
SA2
SA2
SA1
SA1
SA1
SA1
SA1
SA1
SA1
SA1
SA1
SA1
SA1

35

MaterialesyMtodos

5804

AY386315
DQ494319
AF478543
AY093764
DQ494319
DQ228166
DQ889187
DQ889189
AF172411
DQ226088
DQ889186

AF164967

Z47765

Z54166

AF112189

AY526496

AY542312

AY445077

Onderstepoort(Vac)

AF378705

AY548111

virusDistemperde
fcidos(PDV)
Arg23
Arg24
Arg25
Arg26
CDV75
CDV102
CDV111
CDV116
CDV127

DQ191765
DQ887547
D85754
AB212964
AB212729
AB252717
FJ461693
FJ461694
FJ461696
FJ461713
FJ461721

Alemania
Italia
Dinamarca
Turqua
Italia
Italia
Hungra
Hungra
China
Italia
Hungra
Estados
Unidos
Estados
Unidos
Estados
Unidos
Estados
Unidos
Estados
Unidos
Estados
Unidos
Estados
Unidos
Estados
Unidos
Estados
Unidos
Taiwan
Taiwan
Japn
Japn
Japn
Japn
Sudfrica
Sudfrica
Sudfrica
Sudfrica
Sudfrica

genomacompleto
genomacompleto
genH
genH
genH
genH
genH
genH
genH
genH
genH

EU1
EU1
EU1
EU1
EU1
EU2
EU2
EU2
EU3
EU3
EU3

genH

NA1

genH

NA1

genH

NA1

genH

NA1

genH

NA1

genomacompleto

NA2

genomacompleto

NA2

genomacompleto

NA2

genH

NA2

genH
genH
genH
genH
genH
genH
genH
genH
genH
genH
genH

Asia1
Asia1
Asia1
Asia1
Asia2
Asia2
frica
frica
frica
frica
frica

AF479277

Dinamarca

genomacompleto

OG

Argentina
Argentina
Argentina
Argentina
Uruguay
Uruguay
Uruguay
Uruguay
Uruguay

Fsp
Fsp
Fsp
Fsp
Fsp
Fsp
Fsp
Fsp
Fsp

SA1
SA2
SA2
SA2
SA1
SA1
SA1
SA1
SA1

36

MaterialesyMtodos

CDV128
CDV141
CN1
CN2
Tw1
Tw2
Tw3
Tw4
Jp

EF596903
EF445055
FJ694842
FJ694848
EU192008
EU192199
AB512286

US1

AY443350

US2

AY395984

CDV3
SnyderHill
virusdelSarampin
(MV)

EU263644
GU138403
U03760

Uruguay
Uruguay
China
China
Taiwan
Taiwan
Taiwan
Taiwan
Japn
Estados
Unidos
Estados
Unidos
China
Canad
Estados
Unidos

Fsp
Fsp
genF
genF
genF
genF
genF
genF
genF

SA1
SA1
Asia
Asia
Asia
Asia
Asia
Asia
Asia

genF

NA

genF

NA

genF
genomacompleto

Vac
Vac

genomacompleto

OG

37

Resultados

3.RESULTADOS
3.1DeteccindelgenomaviralporRTPCRentiemporeal
LadeteccindelgenomaviralporRTPCRentiemporealseestandarizconcDNAde
muestras positivas diagnosticadas por RTPCR en tiempo final, y cDNA de la cepa
Onderstepoort (OP) de una vacuna comercial disponible en nuestro pas (Puppy DP,
Novibac, Intervet). La cepa vacunal OP fue posteriormente utilizada como control
positivo de los ensayos diagnsticos. Posteriormente, se instrument el uso de un
controlinterno(CI)(liofilizadovacunaldeIBV)enlasreaccionesdeRTPCRentiempo
real.
Se analizaron 26 muestras de canes provenientes de Uruguay con sintomatologa
clnica asociada a Distemper, detectando al genoma viral en 19 de las muestras
analizadas(73%).EnestasmuestrasyenlacorrespondientealacepaOPseregistr
incremento de fluorescencia para las sondas de CDV y el CI. En las siete muestras
negativas (27%) slo se detect incremento de fluorescencia para la sonda del CI. El
cicloumbral(Ct)seubicentrelosciclos32y35paraelcDNAdeCDV,mientrasqueel
CtparaelCIseencontrenelciclo36(Figura12).

40

Resultados

41

Resultados

Figura 12. Grficos de amplificacin del ensayo de RTPCR en tiempo real de cinco muestras de CDV
utilizandocDNAdeIBVcomocontrolinterno.LacurvarojacorrespondealasondadeCDVylaazulala
sondadeIBV.A.BlancoPCR:noseobservalacurvadeamplificacinparaningunadelassondas.B.CDV
164: muestra positiva, se aprecia la curva de amplificacin para ambas sondas. C. CDV 167: muestra
positiva, se aprecia la curva de amplificacin para ambas sondas. D. CDV 168: muestra positiva, se
aprecialacurvadeamplificacinparaambassondas.E.CDV169:muestrapositiva,seaprecialacurva
deamplificacinparaambassondas.F.CDV170:muestranegativa,seaprecialacurvadeamplificacin
solamenteparalasondadeIBVutilizadacomoCI.G.ControlpositivoCDV:cDNAOP,seaprecialacurva
deamplificacinparalasondadeCDV.H.ControlpositivoCDVyCI:cDNAOP+cDNAIBV,seapreciala
curvadeamplificacinparaambassondas.

De las 19 muestras diagnosticadas como positivas, 14 (74%) correspondieron a

animalesvacunados,cuatro(21%)aanimalesquenofueronvacunadosyunamuestra
(5%) corresponda a un animal sin informacin respecto al estado de vacunacin
(Figura 13). En los siete casos negativos, cuatro (57%) correspondieron a animales
vacunadosylastresrestantes(43%)aanimalessinplandevacunacin.

Figura13.NmerodeanimalesdiagnosticadosporRTPCRentiemporeal,discriminadosporpositivosy
negativosparaelensayo.ND:Nodeterminado.

Se analiz la distribucin de los casos positivos segn clases etarias, al grupo de

animales entre tres y seis meses correspondi el porcentaje ms elevado de casos
(45%). Los animales entre siete y 12 meses, y entre 13 y 36 meses representaron el
20%deloscasos,mientrasquelosmenoresatresmesesfueronel10%deloscasos.

42

Resultados

Tambinseanalizunamuestradeunanimalsininformacinsobrelaedad(ND),el
cualrepresentel5%deloscasos(Figura14).

45%
40%

35%
30%

25%
20%

% Anim ales
positivos

15%
10%

5%

0%
<3

3a6

7 a 12

13 a 36

ND

Edad (meses)
Figura14.Discriminacindecasospositivosporfranjasetarias.ND:nodeterminado.

3.2CaracterizacingenticadeaislamientosdelRodelaPlata
3.2.1Hemaglutinina
3.2.1.1AmplificacinporRTPCRtiempofinal
EntodaslasmuestrasuruguayasdiagnosticadascomopositivasporRTPCRentiempo
real,serealizlareaccindeRTPCRparaamplificaralgenHcompleto.Seobtuvieron
ampliconesdelosfragmentosHIyHD(Figura11,15A)endosaislamientos(CDV128y
CDV141). En otros dos aislamientos uruguayos (CDV75 y CDV116) se obtuvo el
fragmentoHI,yunareginde750pbconloscebadoresFI7742R8492(Figura11,15B).
Se analizaron tambin ocho muestras argentinas diagnosticados como positivos por
RTPCRtiempofinal,obtenindoseampliconesdelosfragmentosHIyHDensolodos
muestras(Arg25yArg26).

43

Resultados

Figura 15. Electroforesis en gel de acrilamida al 6% de productos de PCR del gen H de muestras de
campoydelacepaOP(control+).
A.

Carril1:blancoPCR,Carril2:CDV128fragmentoHI,Carril3:cepaOP(C+)fragmentoHI,Carril4:
CDV128fragmentoHD,Carril5:cepaOP(C+)fragmentoHD.

B.

Carril 1: blanco PCR, Carril 2: CDV75 fragmento HI, Carril 3: cepa OP (C+) fragmento HI, Carril 4:
marcador de pes molecular (1200pb, 850pb, 450pb, 200pb), Carril 5: CDV75 fragmento FI7742
RI8492, Carril6:cepaOP(C+)fragmentoFI7742RI8492.

3.2.1.2Edicinyanlisisdesecuenciasnucleotdicasyaminoacdicas
Mediante el ensamblaje de los fragmentos HI y HD se obtuvo la secuencia completa
delgenHdedosaislamientosuruguayos(CDV128yCDV141)ydosargentinos(Arg25y
Arg26).ElgenHpresentunORFde1824pbquecodificaparaunaprotenade607aa
(Figura16,17).Enelcasodeotrosdosaislamientosuruguayos(CDV75yCDV116), las
secuenciasensambladastuvieronunaextensinde1269pb,loscualescodificanpara
423aadelaprotena(Figura16,17).

3.2.1.3Estudioscomparativos
Los estudios se realizaron con las cinco secuencias completas del gen H de
aislamientos de campo uruguayos descritas a la fecha: las dos obtenidas en este
trabajo y otras tres descritas previamente por nuestro grupo (CDV102, CDV109,
CDV111)(Tabla4).Lassecuenciassealinearonycompararon,observndose23sitios
nucleotdicosvariablesy11cambiosaminoacdicos(Figura16,17).Estosaislamientos
presentaron una divergencia aminoacdica entre 0 1.5% (Tabla 5A). Se observaron
valores de divergenciasimilares en el anlisis de las secuencias parciales de 1269 pb
(resultadosnomostrados).
En cuanto a los aislamientos argentinos, los anlisis se realizaron con las dos
secuencias obtenidas en esta Tesis (Arg25 y Arg26), y otras dos publicadas en el
Genbank (Arg23 y Arg24) (Tabla 4). Estas secuencias se alinearon y compararon,
mostrandounamayordivergenciaquelaobservadaentrelosaislamientosdeUruguay,
con94sitiosnucleotdicosvariablesy31cambiosanivelaminoacdico(Figura16,17).
Ladivergenciaaminoacdicadeestosaislamientosseubicentre0.35.1%(Tabla5A).
ConelobjetivodeestudiartodaslassecuenciasdelgenHdescritashastalafechaen
Sudamrica,seanalizaronademslassecuenciasdecuatroaislamientosdecampode
44

Resultados

Brasil publicadas en el Genbank (Tabla 4). Las secuencias brasileras presentaron

valoresdedivergenciaaminoacdicaentre1.03.5%(Tabla4,5A).
La comparacin de las secuencias sudamericanas revel que todos los aislamientos
uruguayos,brasilerosyunargentino(Arg23)presentaronunaelevadaidentidad,con
valores de divergencia entre 0 3,5% (Tabla 5A). El resto de los aislamientos
sudamericanos, todos argentinos (Arg24, Arg25 y Arg26), presentaron valores de
divergenciaconrespectoalosprimerosdehasta5.3%(Tabla5A).Sinembargo,entre
estos tres aislamientos presentaban una elevada identidad, con valores entre 0,3
1,8%(Tabla5A).

45

Resultados

46

Resultados

47

Resultados

48

Resultados

49

Resultados

Figura 16. Alineamiento de las secuencias nucleotdicas de la hemaglutinina de los aislamientos de

Uruguay, Argentina y la cepa OP. Se incluyeron las secuencias correspondientes a siete aislamientos
uruguayos, tres obtenidas previamente en nuestro laboratorio (CDV102, CDV109, CDV111), y otras
cuatro en este trabajo de Tesis (CDV128, CDV141, CDV75 y CDV116). Tambin se analizaron cuatro
secuenciasdeaislamientosargentinos,dosdeellasdescritaspreviamenteporCaldern(2008)(Arg23y
Arg24)yotrasdosobtenidasenestetrabajo(Arg25yArg26).

50

Resultados

51

Resultados

Figura 17. Alineamiento de las secuencias amioacdicas de la hemaglutinina de los aislamientos de

Uruguay, Argentina y la cepa OP. Se incluyeron las secuencias correspondientes a siete aislamientos
uruguayos, tres obtenidas previamente en nuestro laboratorio (CDV102, CDV109, CDV111), y otras
cuatro en este trabajo de Tesis (CDV128, CDV141, CDV75 y CDV116). Tambin se analizaron cuatro
secuenciasdeaislamientosargentinos,dosdeellasdescritaspreviamenteporCaldern(2008)(Arg23y
Arg24) y otras dos obtenidas en este trabajo (Arg25 y Arg26). Se destacan en recuadro los sitios
potencialesdeNglicosilacin,ylosresiduos530y549ubicadosenlazonadeuninalreceptorSLAM.
A

CDV102
CDV109
CDV111
CDV128
CDV141
BR1
BR2
BR3
BR4
Arg23
Arg24
Arg25
Arg26

CDV102

0.008
0
0.007
0
0.025
0.026
0.022
0.022
0.026
0.045
0.046
0.046

CDV109

0.008
0.015
0.008
0.03
0.03
0.026
0.025
0.031
0.05
0.05
0.051

CDV111

0.007
0
0.025
0.026
0.022
0.022
0.026
0.045
0.045
0.046

SA1

0.047
0.025
0.046
0.062
0.055
0.07
0.052
0.078
0.054
0.083

SA2

0.044
0.054
0.071
0.065
0.076
0.062
0.088
0.059
0.095

EU1

0.044
0.062
0.049
0.065
0.048
0.082
0.051
0.086

CDV128

0.007
0.031
0.033
0.028
0.028
0.033
0.051
0.051
0.053

CDV141

0.025
0.026
0.022
0.022
0.026
0.045
0.045
0.046

BR1

0.035
0.03
0.023
0.031
0.051
0.051
0.053

BR2

0.012
0.015
0.033
0.046
0.045
0.046

BR3

0.01
0.028
0.041
0.041
0.043

BR4

0.028
0.04
0.04
0.041

Arg23

0.051
0.048
0.05

Arg24

0.017
0.018

Arg25

0.003

SA1
SA2
EU1
EU2
EU3
Asia1
Asia2
NA1
NA2
ZA
Vac

EU2

0.061
0.054
0.068
0.05
0.081
0.05
0.084

EU3

0.068
0.073
0.059
0.085
0.057
0.088

Asia1

0.069
0.06
0.087
0.059
0.095

Asia2

0.073
0.098
0.065
0.099

NA1

0.087
0.058
0.092

NA2

0.083
0.045

ZA

0.09

Tabla5.Anlisisdedistanciaaminoacdicadelahemaglutinina.
A. Anlisis de los aislamientos de Uruguay, Brasil y Argentina. Se seala en recuadro los valores de
divergenciasuperioresal4%.
B. Porcentaje promedio de diferencias aminoacdicas entre los ocho linajes de CDV y los grupos
sudamericanos. Se recuadran los valores de divergencia de los clados SA1 y SA2 respecto a los ocho
linajes de CDV. Los valores son superiores al 4% excepto para el linaje EU1, donde es del 2.5%. SA1:
Sudamrica1,EU1:Europa1,SA2:Sudamrica2,EU2:Europa2,EU3:Europa3,NA1:Norteamrica1,
ZA:frica,NA2:Norteamrica2,Vac:cepaOnderstepoort.

52

Resultados

3.2.1.4Anlisisfilogenticos
3.2.1.4.1Anlisisdelasecuenciacompletadelahemaglutinina
Esteanlisisserealizapartirdelalineamientode46secuenciasaminoacdicasdela
hemaglutinina, donde se incluyeron las secuencias de los cuatro aislamientos
caracterizadosenestaTesis,lassecuenciasdelosnueveaislamientossudamericanos
caracterizadas hasta la fecha (tres uruguayos, dos argentinos y cuatro brasileros), y
secuenciasde33aislamientosrepresentativosdelosocholinajesdeCDVdisponibles
enelGenbank(Tabla4).
Los13aislamientosdeSudamricaseseparanclaramenteendosclados.Uncladoest
constituido pordiezaislamientos(cincouruguayos,cuatrobrasilerosyelaislamiento
argentino Arg23), con un valor de bootstrap de 97%. Todos los aislamientos de este
clado,alcualdenominamosSudamrica1(SA1),seasocianconelcladoquedefineal
linajeEuropa1(EU1)conunvalordebootstrapde100%(Figura18).Losaislamientos
pertenecientesaSA1presentanvaloresdedivergenciaaminoacdicade2,5%respecto
allinajeEU1,ysuperioresal4,6%respectoalrestodeloslinajescaracterizados(Tabla
5B).
El otro clado sudamericano est constituido nicamente por tres aislamientos de
Argentina (Arg24, Arg25 y Arg26), y presenta un valor de bootstrap del 100%. Este
clado,alquedenominamosSudamrica2(SA2),sehallaseparadodelresto,aunquese
relacionaconellinajeEuropa2(EU2)conunbajovalordebootstrap(50%)(Figura18).
Los aislamientos de SA2 muestran valores de divergencia de hasta 1,8% entre s, y
superioresal4,4%respectoaSA1yalrestodeloslinajescaracterizados,incluyendoa
EU2(Tabla5B).

53

Resultados

54

Resultados

Figura 18. Cladograma en base a la secuencia aminoacdica de la hemaglutinina de los aislamientos

sudamericanosyaislamientosdelosocholinajesdeCDV.Comogrupoexternoseempleolasecuencia
deunaislamientodelvirusDistemperdefcidos(PDV)(NaccesoZ36979).UY:Uruguay,BR:Brasil,AR:
Argentina, US: Estados Unidos, GM: Alemania, IT: Italia, HU: Hungria, DK: Dinamarca, TK: Turkia, JP:
Japn, TW: Taiwan, SK: Corea del Sur, CN: China, OP: cepa Onderstepoort. SA1: Sudamrica1, EU1:
Europa1, SA2: Sudamrica2, EU2: Europa2, EU3: Europa3, NA1: Norteamrica1, ZA: frica, NA2:
Norteamrica2.

3.2.1.4.2Anlisisdesecuenciasparcialesdelahemaglutinina(134aminocidos)
Este anlisis comprendi las 38 secuencias sudamericanas descritas a la fecha y las
33 secuencias representativas de los ocho linajes utilizadas en el anlisis de la
secuencia completa. Dicho anlisis mostr que los aislamientos sudamericanos se
dividenendoscladoscomoseobservenelanlisisdelahemaglutininacompleta.Un
clado comprende los mismos aislamientos de SA1 (excepto por EU098102
pertenecienteaBrasil)ytambinlosuruguayos(CDV75yCDV116),ypresentaunvalor
debootstrapde84%.EstecladoseagrupaconlasvariantesdellinajeEU1(queincluye
alacepaEU098102)conunbootstrapde60%(Figura19).
ElotrocladodeSudamricaagrupalostresaislamientospertenecientesalcladoSA2
definidoconlasecuenciacompletadeH,los22decanesdomsticosyelproveniente
deunzorroperrodeArgentina,conunvalordebootstrapde99%(Figura19).

55

Resultados

56

Resultados

Figura 19. Cladograma en base a 134 aa de la hemaglutinina de los aislamientos sudamericanos y de

aislamientosrepresentativosdelosocholinajesdeCDV.Comogrupoexternoseempleolasecuenciade
un aislamiento del virus Distemper de fcidos (PDV) (N acceso Z36979). UY: Uruguay, BR: Brasil, AR:
Argentina, US: Estados Unidos, GM: Alemania, IT: Italia, HU: Hungra, DK: Dinamarca, TK: Turqua, JP:
Japn,TW:Taiwan,SK:CoreadelSur,CH:China,IN:India,OP:cepaOnderstepoort.SA1:Sudamrica1,
EU1: Europa1, SA2: Sudamrica2, EU2: Europa2, EU3: Europa3, NA1: Norteamrica1, ZA: frica,
NA2:Norteamrica2.

3.2.1.5ComparacinconlacepavacunalOP
En el alineamiento de las secuencias aminoacdicas de la hemaglutinina de todos los
aislamientos de Uruguay y Argentina junto a los 604 aa de la cepa OP (N acceso
AF378705), se observ un rango de 134 149 diferencias nucleotdicas, y cambios
aminoacdicosenelrangode4756(Figura16,17).
La comparacin de dichas secuencias revel elevados valores de variabilidad
aminoacdica (~8,3% respecto a los aislamientos del clado SA1 y ~9,5% con los
aislamientosdelcladoSA2)(Tabla5B).
Elanlisisfilogenticoconlasecuenciacompletayparcialdelahemaglutinina,mostr
quetodoslosaislamientosdeSudamricaaparecenclaramenteseparadosdelacepa
vacunalOP(Figura18,19).

3.2.1.6Identificacindesitiospotencialesdeglicosilacin
Las nueve secuencias completas de los aislamientos de Uruguay y Argentina
presentaron ocho sitios de glicosilacin en toda su extensin, excepto por el
aislamientodeArgentina(Arg23)quepresentsietesitios.EnlacepaOP(Nacceso:
AF378705) se observaron seis sitios, lo cual concuerda con anlisis previos donde se
estableci que la mayora de los aislamientos de campo de CDV poseen sitios de
glicosilacinadicionalesenlahemaglutininarespectoalacepavacunalOP(Figura17y
20)(Mochizukietal.,1999;Sawatsky&vonMessling,2010).

57

Resultados

Figura20.Representacinesquemticadelossitiospotencialesdeglicosilacindelasecuencia
aminoacdicadelahemaglutininadelosaislamientosdeUruguay,ArgentinaylacepaOP.OP:
Onderstepoort,Uy:Uruguay,Arg:Argentina.

3.2.1.7Estudiodepresionesselectivas
El anlisis de presiones selectivas mediante el algoritmo SLAC se realiz con las
secuencias de la hemaglutinina descritas en esta Tesis y las 198 secuencias no
redundantespublicadasenlabasededatos.ElvalordN/dSglobaldelaprotenafue
menorque1(0.28),indicandoqueseencuentrabajoseleccinnegativa.Elanlisisde
las presiones selectivas en los codones individuales revel que 246 codones estn
seleccionadosnegativamente,347evolucionandeformaneutraly11estaransujetos
aseleccinpositiva(Tabla6).
Entre los codones seleccionados positivamente, se encuentran dos (530 y 549) que
estnlocalizadosenlaregincodificantedelazonadeuninalreceptorcelularSLAM.
Se observ que el aa codificado por el codn 530 difiere entre los grupos
sudamericanos SA1 y SA2, en los aislamientos de SA1 se identific glicina (530G),
mientrasqueenlospertenecientesaSA2seobservcidoasprtico(530D).Enelcaso
del codn 549, todos los aislamientos sudamericanos codificaron tirosina (549Y)
(Figura17).

58

Resultados

Codon
146
160
302
309
370
376
401
412
417
530
549

Cambios S
obs
0
0
0
0
0
1
0
0
0
2.50
0

Cambios NS
obs
E [sitios S] E [sitios NS]
3
0.35
0.81
4
0.32
0.78
3
0.34
0.82
4
0.30
0.86
4
0.29
0.80
7
0.30
0.86
3
0.38
0.73
4
0.38
0.78
3
0.35
0.81
9.50
0.35
0.81
5
0.30
0.79

dS
0
0
0
0
0
3.28
0
0
0
7.19
0

dN
3.72
5.12
3.66
4.64
4.99
8.18
4.09
5.14
3.71
11.75
6.32

dN-dS
3.72
5.12
3.66
4.64
4.99
4.90
4.09
5.14
3.71
4.55
6.32

Tabla6.Representacindelosresiduossujetosaseleccinpositivaenlahemaglutinina.Sedestacaen
recuadrolosresiduos530y549.CambiosSobs:nmerodecambiossinnimosobservadosenelsitio,
Cambios NS obs: nmero de cambios no sinnimos observados en el sitio, E [sitios S]: nmero de
cambiossinnimosesperadosenelsitio,E[sitiosNS]:nmerodecambiosnosinnimosesperadosenel
sitio,dS:cambiosSobs/E[sitiosS],dN:cambiosNSobs/E[sitiosNS],dN:cambiosNSobs/E[sitiosNS]
cambiosSobs/E[sitiosS].

3.2.2Pptidosealdelaprotenadefusin
3.2.2.1AmplificacinporRTPCRtiempofinal
SerealizlaRTPCRparaamplificarlos681pbqueincluyenalareginFsp(405pb)en
todaslasmuestrasuruguayasdondesehabaobtenidolasecuenciaparcialocompleta
delgenH,aexcepcindeunaislamiento(CDV109).Seobtuvieronresultadospositivos
paraseisaislamientoscaracterizadospreviamenteporelgenH,yademsseobtuvoel
amplicnenunnuevoaislamiento(CDV127)(Tabla4)(Figura21).
Conlosaislamientosargentinossesiguielmismocriterio,yseamplificlareginFsp
deloscuatroaislamientoscaracterizadosmedianteelanlisisdelgenH(Tabla4).

59

Resultados

Figura21.Electroforesisengeldeacrilamidaal6%deproductodePCRdelareginFsp.Carril1:blanco
PCR, Carril 2: CDV75 fragmento F4854R5535, Carril 3: CDV128 fragmento F4854R5535, Carril 4:
marcadordepesomolecular(850pb,450pb,200pb,50pb).

3.2.2.2Estudioscomparativos
Las secuencias nucleotdicas de 405 pb correspondientes a los 135 aa del Fsp de los
aislamientos de Uruguay y Argentina, se editaron, alinearon y compararon. Los
aislamientosuruguayospresentaronsietesitiosnucleotdicosvariablesycincocambios
aminoacdicos(Figura22,23).Elanlisisdelassecuenciasdeloscuatroaislamientos
argentinos mostr una elevada variabilidad gentica con 45 sitios nucleotdicos
variablesy28cambiosanivelaminoacdico(Figura22,23).

60

Resultados

61

Resultados

Figura22.AlineamientodelassecuenciasnucleotdicasdelFspdelosaislamientosdeUruguay,
ArgentinaylacepaOP.

Figura23.AlineamientodelassecuenciasaminoacdicasdelFspdelosaislamientosdeUruguay,
ArgentinaylacepaOP.

3.2.2.3Anlisisfilogentico
El estudio incluy las secuencias aminoacdicas de los 11 aislamientos de Uruguay y
Argentina caracterizados en esta Tesis, y 15 secuencias de aislamientos de
Norteamrica,AsiayEuropapublicadosenlabasededatos(Tabla4).
El anlisis filogentico revel que los aislamientos de Sudamrica se agrupan en dos
cladosseparadosaligualqueloobservadoenelanlisisdelahemaglutinina.Elprimer
cladoestconstituidoportodoslosaislamientosuruguayosyelargentino(Arg23)con
un valor de bootstrap de 89%. Este clado se relaciona con cepas de Europa,
correspondientesallinajeEU1segnelanlisisdelahemaglutinina,conunbootstrap
de100%(Figura24).Ladivergenciaaminoacdicadentrodeestecladoseubicentre0
6,7%,dondelosaislamientosdeUruguaypresentaronvaloresdedivergenciaentre0
3%,yvaloresdel4,46,7%respectoalaislamientoargentinoArg23(Tabla7A).Este
cladoserelaciona con cepas de Europa,correspondientes al linaje EU1 segn el
anlisis de la hemaglutinina, con un bootstrapde100% (Figura24).Losaislamientos
62

Resultados

de este clado sudamericano mostraron un porcentaje promedio de diferencias

aminoacdicasdel10.5%respectoaloseuropeosconlasqueseagrupan,ysuperiores
al22.8%encomparacinalosaislamientosdeAsiayNorteamrica(Tabla7B).
El otro clado sudamericano est constituido por los aislamientos argentinos (Arg24,
Arg25 y Arg26), y posee un valor de bootstrap del 100%, el cual aparece claramente
separadodelrestodelosaislamientosenelcladograma.Losvaloresdedivergenciade
dichosaislamientosseubicaronentre0y2,2%(Figura24)(Tabla7A).Lacomparacin
deamboscladossudamericanosmostrvaloresdedivergenciadehasta22.2%(Tabla
7A). Sus valores de divergencia respecto a los aislamientos de Asia y Norteamrica
fueronsuperioresal23.8%(Tabla7B).
Debido a que los aislamientos sudamericanos presentan las mismas relaciones
filogenticas que las observadas con el anlisis de la hemaglutinina, tambin
denominamosSA1ySA2aambosclados.

63

Resultados

64

Resultados

Figura 24. Cladograma en base a la secuencia aminoacdica del Fsp de los aislamientos del Ro de la
Plata,dediversasregionesgeogrficasycepasvacunales.Comogrupoexternoseempleolasecuencia
del Fsp de unaislamiento del virus del Sarampin (MV) (N acceso U03670). SA1: Sudamrica1,SA2:
Sudamrica2,NA:Norteamrica,Vac:Cepasvacunales.

3.2.2.4ComparacinconlacepavacunalOP
En la comparacin de las secuencias aminoacdicas de ambos clados sudamericanos
con la cepa OP (n acceso AF378705), se observ un rango de 65 69 diferencias
nucleotdicas, y cambios aminoacdicos en el rango de 42 44 (Figura 22, 23). El
anlisis filogentico revel que todos los aislamientos de Sudamrica aparecen
claramenteseparadosdelacepaOP(Figura24).Elvalordedivergenciaaminoacdica
promedioparaelcladoSA1fuede32,4%,mientrasqueparaelcladoSA2elvalorse
ubicen32,1%(Tabla7B).

CDV75
CDV102
CDV111
CDV116
CDV127
CDV128
CDV141
Arg23
Arg24
Arg25
Arg26

CDV75

0.015
0.015
0.022
0.03
0.03
0.03
0.044
0.193
0.215
0.215

CDV102

0
0.007
0.015
0.015
0.015
0.052
0.193
0.215
0.215

CDV111

0.007
0.015
0.015
0.015
0.052
0.193
0.215
0.215

CDV116

0.022
0.022
0.022
0.059
0.2
0.222
0.222

CDV127

0
0
0.067
0.2
0.222
0.222

CDV128

0
0.067
0.2
0.222
0.222

CDV141

0.067
0.2
0.222
0.222

Arg23

0.193
0.215
0.215

Arg24

0.022
0.022

Arg25

SA1
SA2
Euro
NA
Asia
Vac

SA1

0.211
0.105
0.228
0.256
0.324

SA2

0.207
0.238
0.259
0.321

Europa

0.221
0.242
0.319

NA

0.274
0.265

Asia

0.279

Tabla7.AnlisisdedistanciaaminoacdicadelFsp.
A.AnlisisdelosaislamientosdeUruguayyArgentina.Sedestacaenrecuadrolosvaloresdedivergencia
entrelosaislamientosdeloscladossudamericanosSA1ySA2.
B.Porcentajepromediodediferenciasaminoacdicasentrelosaislamientosdeloscladossudamericanos
yaislamientosdeEuropa,Norteamrica,AsiaylacepavacunalOnderstepoort.Serecuadranlosvalores
de divergencia respecto al grupo SA1. SA1: Sudamrica1, Euro: Europa, SA2: Sudamrica2, NA:
Norteamrica,Vac:cepaOnderstepoort.

65

Resultados

3.2.2.5Estudiodepresionesselectivas
El anlisis de presiones selectivas mediante el algoritmo SLAC se realiz con las 11
secuencias descritas en esta Tesis y las 47 secuencias no redundantes del Fsp
publicadasenlabasededatos.ElvalordN/dSglobalfuecercanoa1(0.97),indicando
queevolucionadeformaneutral.Elanlisisdelaspresionesselectivasenloscodones
individualesrevelque18codonesestnsujetosaseleccinnegativa,104evolucionan
demodoneutral,mientrasque12lohacenbajoseleccinpositiva(Tabla8).

Codon

Cambios S
obs

Cambios NS
obs

E [sitios S]

E [sitios NS]

dS

dN

dN-dS

3
4
12
19
21
28
49
51
58
64
99
110

0
0
1
0
0
0
0
0
0
0
0
0

5
6
8
4
9
7
5
3
6
5
5
4

0.79
0.82
1.45
1.08
0.90
1.06
1.02
1.32
0.79
1.06
0.88
1.04

2.43
2.32
1.50
2.15
1.85
2.17
2.21
1.23
2.42
2.17
2.30
2.18

0
0
0.69
0
0
0
0
0
0
0
0
0

2.06
2.59
5.35
1.86
4.88
3.23
2.26
2.43
2.48
2.31
2.17
1.83

2.06
2.59
4.65
1.86
4.88
3.23
2.26
2.43
2.48
2.31
2.17
1.83

Tabla8.RepresentacindelosresiduossujetosaseleccinpositivaenelFsp.CambiosSobs:nmerode
cambios sinnimos observados en el sitio, Cambios NS obs: nmero de cambios no sinnimos
observados en el sitio, E [sitios S]: nmero de cambios sinnimos esperados en el sitio, E [sitios NS]:
nmerodecambiosnosinnimosesperadosenelsitio,dS:cambiosSobs/E[sitiosS],dN:cambiosNS
obs/E[sitiosNS],dN:cambiosNSobs/E[sitiosNS]cambiosSobs/E[sitiosS].

66

Discusin

4.DISCUSIN
Distemper es una de las afecciones virales de mayor incidencia y relevancia a nivel
mundial en cnidos domsticos y salvajes. Desde hace unas dcadas, se registran
continuamente brotes de la enfermedad en el mundo (Appel & Summers, 1999;
Lednicky et al., 2004; Keawcharoen et al., 2005; Lan et al., 2006), as como una
preocupanteexpansinenelrangodehuspedes(Harderetal.,1996;Lednickyetal.,
2004; Goller et al., 2009). Sudamrica no est exenta de esta problemtica,
observndose un aumento en los casos de Distemper en canes domsticos de
Argentina y Brasil (Gebara et al., 2004; Saito et al., 2006; Caldern et al., 2007). En
Brasil,Distemperconstituyeademslaprincipalcausademuerteoeutanasiaencanes
domsticos (Del Puerto et al., 2010). En ambos pases tambin se han registrado
infecciones naturales por CDV en felinos y zorros (Nava et al., 2008; Ferreyra et al.,
2009;Megidetal.,2009).
En los ltimos aos en nuestro pas, los mdicos veterinarios han informado de un
elevadonmerodecasosdeDistemper,inclusoencanesvacunados.Conelobjetivo
decontribuirconlaimplementacindeplanesdevigilanciasanitaria,enelmarcode
mi tesina de grado implementamos, por primera vez en Uruguay, un mtodo de
deteccindelgenomadeCDV.EstemtodoimplicalaamplificacinporRTPCRtiempo
final de un fragmento conservado de 287 pb del gen N (Frisk et al., 1999). La
secuenciacindelosampliconesobtenidosdecepasdecampouruguayas,suposterior
anlisisbioinformticoycomparacinconlacepavacunalOP,nospermitidesarrollar
unsistemadeRFLPparalarpidadiscriminacinentrecepasdecampoyvacunales.De
estemodo,determinamosqueloscasosdeinfeccinenanimalesvacunadossedeban
avirusdecampo,ynoalareversindelacepavacunal(Saruteetal.,2011).
En el marco de esta tesis de Maestra nos propusimos avanzar en el desarrollo de
metodologasdiagnosticas,yenlacaracterizacindelascepascirculantesdeCDVenel
Rio de la Plata, en base al anlisis del gen de la hemaglutinina (H) y la regin
codificante del pptido seal de la protena de fusin (Fsp). El primer objetivo fue
desarrollarunmtododedeteccindelgenomaviralbasadoenRTPCRentiemporeal
conqumicaTaqMan,mediantelahibridacinyamplificacindeunfragmentodeuna
reginconservadadelgenN.

67

Discusin

LatecnologadeRTPCRentiemporealesunadelascontribucionesmsimportantes
enelreadiagnstica,permitiendorealizarprocedimientosmsrpidosyespecficos
(Mackay,2007).AlafechaenSudamrica,elnicoestudiodedeteccindelgenoma
viralporRTPCRentiemporealsebasaenlautilizacindelagenteintercalanteSYBR
Green(DelPuertoetal.,2010).Dichomtodoesconsideradonoespecficodebidoa
que la molcula de SYBR Green se intercala en todas las estructuras de DNA doble
hebra,incluidosampliconesinespecficosodmerosdecebadores,ynosolamenteen
el amplicn de inters (Mackay, 2007). Por tanto, el mtodo diagnstico aqu
desarrollado, constituye el primer desarrollo en Sudamrica de deteccin especfica
delgenomadeCDVporRTPCRtiemporealmediantequmicaTaqMan.
Nuestrotrabajocomenzporcompararmuestrasdiagnosticadascomopositivasporel
mtodo de RTPCR tiempo final previamente implementado, y el uso de un control
positivo (cDNA cepa vacunal Onderstepoort). Una vez estandarizado el protocolo del
PCR y las condiciones de ciclado, desarrollamos el uso de un control interno (CI)
(genomaviralIBV),elcualbrindunamayorrigurosidadalmtododediagnstico.
Mediante este ensayo, detectamos al genoma viral en el 73% de las muestras
analizadas,yenlamuestradelacepavacunalOPutilizadacomocontrolpositivo.Enel
restante27%delasmuestras,nosedetectalgenomaviralaunquestasprovenan
de animales con sintomatologa compatible con Distemper. En estos casos puede
haber ocurrido que los sntomas observados fueran causados por otro agente viral,
debido a la similitud en la sintomatologa de Distemper con otras virosis de canes
(Appel & Summers, 1999), o bien que las muestras no se hayan conservado
adecuadamenteantesderecibirlasennuestrolaboratorio.LautilizacindelCIenlos
ensayos,aseguraqueenloscasosnegativosnohubodegradacindelRNAdurantela
extraccindelgenomaviral,oinhibicinenlasreaccionesdeRTy/oRTPCRentiempo
real. Estas muestras negativas tambin fueron sometidas al ensayo de RTPCR por
tiempo final, y en ningn caso de detect la presencia del genoma viral. Estos
resultadosconcuerdanconlosdatosdeEliaycols.(2006),quienesestablecieronque
ellmitededeteccindelgenomaviraleselmismoparasumtodobasadoenRTRT
PCR en tiempo real con qumica Taqman, y el desarrollado por Frisk y cols (1999).
Aunque ambos mtodos puedan presentar la misma sensibilidad, el mtodo de

68

Discusin

diagnstico desarrollado, presenta la ventaja de ser ms rpido y evitar posibles

problemasdecontaminacin,debidoaquenoexistemanipulacindelamplicn.
En el ensayo diagnstico, utilizamos muestras de orina y secreciones culonasales
debidoaquepresentandiversasventajascomomuestrasdiagnsticas:seobtienena
travs de mtodos que no son invasivos para el animal y son fciles de colectar,
procesar y almacenar. Mediante cuantificacin por RTPCR en tiempo real, se
determinquelacargaviraldeestosfluidosessuperioraladetectadaenmuestrasde
sangreydiversostejidos,sustentandoelusodelasmismasparaensayosdedeteccin
delgenomaviral(Eliaetal.,2006).
Con el fin de realizar un anlisis preliminar sobre la ocurrencia y distribucin de los
casos de Distemper enUruguay, se establecieron correlaciones entre los parmetros
sanitariosdelosanimalesyeldiagnsticopor RTPCRentiemporeal.Del total de
las muestras diagnosticadas como positivas,el21%provenandeanimalesno
vacunados, en estos casos se observ una mayor frecuencia de la enfermedad en
animalesentretresyseismesesdeedad.Esteresultadonoessorprendentedebidoa
que durante este perodo los animales pierden los anticuerpos neutralizantes
maternos,locuallosvuelvesusceptiblesalvirus(Kimetal.,2001).Debidoaello,los
planesdevacunacinsiguenelsiguienteesquema:laprimeradosissedebeaplicara
los dos meses, aunque los anticuerpos maternos interfieran con el desarrollo de la
respuesta,lasegundadosisdebeseradministradadespusdetresocuatrosemanas
delaprimera,yfinalmentelaterceraaloscuatromesesdevida;sesugieren,adems,
refuerzos anuales de por vida (Kim et al., 2001; Caldern, 2008). La mayora de los
casos positivos (74%), sin embargo, provenan de animales vacunados. Resultados
similares se observaron previamente en la regin, donde animales vacunados
contrajeronlaenfermedad(Saitoetal.,2006;Caldern,2008;DelPuertoetal.,2010;
Saruteetal.,2011).Estoscasospodrandeberseaunainsuficientecoberturavacunal,
asociada al no seguimiento de los planes de vacunacin recomendados, a la
inadecuada administracin de las vacunas, o ms importante an a la falta de
neutralizacincruzadaentrelascepasdecampoyvacunales(Rikula,2008).
El segundo objetivo de nuestro trabajo fue caracterizar genticamente a los
aislamientos de campo del Ro de la Plata mediante el anlisis de la secuencia
codificante del gen H y la regin Fsp. La caracterizacin de los aislamientos tambin
69

Discusin

nos permiti compararlos con la cepa vacunal OP, revlelando elevados valores de
divergenciaaminoacdicaparaambasregionesgenmicas:enelordendel9%anivel
delahemaglutinina,ydel32%enlareginFsp(Tabla5B;6B).Esteresultadoconfirma
anlisis previos donde se estableci que existe una marcada diferenciacin gentica
entrelascepasvacunalesylosaislamientosdecampodeotrasregionesgeogrficas,
con valores de divergencia aminoacdica semejantes a los detectados en los
aislamientosdelRodelaPlata(Boltetal.,1997;Lanetal.,2006;Martellaetal.,2006;
Leeetal.,2008;Sultanetal.,2009).
La diferenciacin gentica entre cepas de campo y vacunales es particularmente
importanteenelcasodelaprotenaH,debidoaqueeseldeterminanteinmungenico
principal del virus (BlixenkroneMoller et al., 1991). El anlisis de la secuencia
aminoacdica de la hemaglutinina de los aislamientos de campo, nos permiti
identificar sitios potenciales de glicosilacin que no estn presentes en la cepa OP.
Estas diferencias contribuiran a la falta de neutralizacin cruzada entre las cepas de
campo y vacunales (Sawatsky & von Messling, 2010). La eficacia de las vacunas
comercialespodraversecomprometidaporlaelevadavariacingentica/antignicay
laocurrenciadenuevossitiosdeglicosilacinenlascepasdecampo,favoreciendola
ocurrencia de casos de Distemper en poblaciones de canes vacunados (Bolt et al.,
1997).Laelevadadivergenciadetectadaenlahemaglutininaentrecepasdecampoy
vacunalesenAsiahadeterminadoquesecomiencenautilizarnuevasvacunasbasadas
enlaatenuacindecepasquecirculanactualmenteenestaregin(Zhaoetal.,2009).
Portanto,elanlisisdelavariabilidadgenticanosoloesrelevanteparaestudiosde
caracterizacin,sinoquetambinconstituyeunimportanteaporteparalaformulacin
denuevasvacunas.
Nuestro trabajo constituye el primer estudio de caracterizacin realizado en
SudamricaenbasealanlisisdelasecuenciacompletadelahemaglutininayelFsp.El
trabajodeCaldernycols.(2007),nicoestudiodevariabilidadgenticadeCDVenla
reginalafecha,estbasadoenelanlisisdeunasecuenciaparcialdelgenH(871pb)
deaislamientosdecampodeArgentina.Laobtencindelasecuenciacompletadela
hemaglutinina de los aislamientos de Uruguay y Argentina, nos permiti analizar las
relacionesevolutivasentredichosaislamientosylosocholinajesdeCDVdescritosala
fecha(Martellaetal.,2006;Demeteretal.,2007;Anetal.,2008;Womaetal.,2009).
70

Discusin

El anlisis filogentico revel que todos los aislamientos de Uruguay, Brasil y un

aislamientoargentinoArg23,formanuncladoquedenominamosSA1.Losaislamientos
de este clado forman parte de un clado mayor que incluye el linaje EU1, los cuales
mostraronnivelesdedivergenciaaminoacdicadel2.5%entresyconlosaislamientos
de EU1, y valores superiores al 4.6% con el resto de los linajes caracterizados. Se
consideraquedosaislamientospertenecenaunmismolinajesiformanuncladoenla
filogenia y presentan valores de divergencia aminoacdica en la hemaglutinina
menoresal4%,mientrasquesilosvaloressonsuperioresal4%pertenecenalinajes
distintos(Boltetal.,1997;Martellaetal.,2006).Podemosafirmar,entonces,quelos
aislamientossudamericanosdeSA1pertenecenallinajeEU1,porloqueproponemos
denominarallinajeEU1comoEuropa1/Sudamrica1(EU1/SA1).Estelinajeconstituye
unodelosmsdistribuidosalrededordelmundo,yaqueestpresenteentrespases
deSudamrica(Uruguay,ArgentinayBrasil),yenvariospasesdeEuropa(Martellaet
al., 2006). El anlisis de cepas de CDV aisladas en distintas regiones geogrficas, y
pertenecientes a diversos huspedes carnvoros, revel que la deriva
gentica/antignica acta sobre el gen H principalmente por un patrn geogrfico
(Martella et al., 2006). Sin embargo, los aislamientos de SA1 y los de EU1 presentan
unaelevadaidentidadgentica,locualindicaraquecompartenunancestrocomn,o
bien que el trfico incontrolado de animales ha favorecido a la dispersin del virus
entre ambos continentes. Este intercambio debe sera reciente y continuo debido a
queambaspoblacionesviralesnopresentanelevadosvaloresdedivergencia.
Los aislamientos argentinos (Arg24, Arg25 y Arg26) forman el segundo clado
sudamericano. Estos aislamientos presentan valores de divergencia de hasta 1,8%
entres,ymayoresal4,4%respectoalosaislamientosdelosocholinajespreviamente
caracterizados. Este clado constituye, por tanto, un nuevo linaje gentico al cual
denominamos Sudamrica 2 (SA2). Caldern y cols. (2007) establecieron en base al
anlisis de una secuencia parcial del gen H, que los aislamientos de campo de
Argentinasepuedenclasificarendosgenotipos,unodeloscualesagrupaalamayora
delosaislamientoscaracterizados(23de24).Nuestroanlisisdelasecuenciaparcial
de la protena H (134 aa), incluyendo a las secuencias de todos los aislamientos
uruguayos, argentinos y brasileros caracterizados a la fecha, confirma que 23 de los
aislamientosanalizadosporCaldernycols.(2007)seagrupandentrodellinajeSA2,
71

Discusin

mientras que el restante (Arg 23) lo hace en el linaje EU1/SA1 (Figura 19). Estos
resultados indican que el linaje SA2 es el mayoritario en Argentina, mientras que el
linaje EU1/SA1 es el de menor prevalencia. Por el contrario, el linaje EU1/SA1 es el
nicorepresentadoenUruguayyBrasil.
El linaje SA2 se encuentra relacionado con un bajo soporte (50%) con un linaje de
Europa caracterstico de carnvoros silvestres (EU2) (Figura 18). El linaje EU2 incluye
cepasaisladasdehurones,visones yzorrosrojos(Martellaetal.,2006).Estevinculo
sugiere que SA2 sera un linaje circulante entre la fauna silvestre de Sudamrica.
Ferreyraycols.(2009)determinaronenbaseaunasecuenciaparcialdelgenH,quela
cepa de zorro perro (Cerdocyon thous) (N acceso EU624410) se agrupa con el
genotipomayoritariode Argentina.Nuestroanlisisbasadoenlasecuenciade134aa
delahemaglutininamostr que dicho aislamientopertenece al linaje SA2, e l m s
r e p r e s e n t a d o e n A r g e n t i n a (Figura19).Estezorroperteneceaunareserva
dondelosvisitantespuedeningresarconcanesyensusproximidadeshabitanungran
nmero de perros, la mayora de ellos sin vacunacin. Debido a ello, los autores
proponenqueloscanesdomsticoshabrantransmitidoelvirusaloscarnvorosdela
reserva(Ferreyraetal.,2009).Sinembargo,nosepuededescartarqueelflujodeCDV
haya sido desde los carnvoros silvestres a los canes domsticos. La presencia de un
residuo aminoacdico en la hemaglutinina caracterstico de carnvoros silvestres
presente en los aislamientos de canes del linaje SA2, favorecera esta hiptesis. El
residuo 530, ubicado en la zona de unin al receptor SLAM, est involucrado en la
determinacin del tropismo celular y posiblemente en la transmisin interespecfica
del virus (von Messling et al., 2005). En esta posicin se observaron cinco residuos
aminoacdicosdiferentesentreaislamientosdecampo(D,E,G,NyR).Lamayorade
los aislamientos de canes domsticos presentan G o E, mientras que en los
aislamientos de silvestres se observa R, D o N (McCarthy et al. 2007). Todos los
aislamientos del clado SA1 presentan 530G (caracterstico de canes domsticos),
mientrasquelosdeSA2,incluyendoalaislamientodelzorrodeArgentina,presentan
530Dcaractersticodelafaunasilvestre,yausenteenaislamientosdecanesdeotros
linajes(McCarthyetal.,2007).EstehallazgosugierequeellinajeSA2probablemente
tuvosuorigenenlafaunasilvestreysetransmitiacnidosdomsticos.

72

Discusin

Otro residuo aminoacdico de la protena H, presuntamente implicado en la

transmisin de CDV entre huspedes carnvoros es el residuo 549, que tambin se
ubicaenlazonadeuninalreceptorSLAM(vonMesslingetal.,2005).Lamayorade
los aislamientos de carnvoros silvestres presenta el residuo 549H, mientras que los
canes domsticos poseen 549Y (McCarthy et al., 2007). Sin embargo, todos los
aislamientos de canes de los clados SA1 y SA2 presentan el residuo 549Y.
Recientemente, el residuo 549Y tambin se detect en el aislamiento del zorro
argentino,yentresaislamientosdezorrossilvestresdeAlemania(Nikolinetal.,2011).
Por tanto, este residuo no parece ser exclusivo de canes domsticos, limitando su
utilidadcomomarcadordecepaspornodiscriminarentrehuspedescarnvoros.
Losresiduos530y549seencuentranseleccionadospositivamentejuntoaotrosnueve
residuosdelahemaglutinina.Estosnueveresiduosnocambianentrelosaislamientos
deSudamrica,portantonosepodranasociarenprimerainstanciaaladiversificacin
delascepasdenuestrareginysucapacidadparainfectarnuevoshuspedes.
EnSudamricaexistendoslinajescocirculantescondistintadistribucinyprevalencia.
Este hecho extiende resultados previos donde se estableci que en cierta regin
geogrficapuedencoexistirmsdeunlinajedeCDV(Hashimotoetal.,2001;Lednicky
etal.,2004;Martellaetal.,2006;Zhaoetal.,2009).Entodosloscontinentessehan
descrito ms de un linaje circulante, a excepcin de frica (Woma et al., 2009).
Asimismo, se estableci que excepcionalmente aislamientos con diferente origen
geogrficopuedenagruparsedentrodeunmismolinaje,comoeselcasodeEuropa3
(EU3) (Martella et al., 2006; Demeter et al., 2007). En nuestro trabajo, establecimos
que los aislamientos sudamericanos de SA1 pertenecen a un linaje distante
geogrficamente como EU1, igual a lo observado para el linaje EU3 que agrupa
aislamientosdeAsiayEuropa(Martellaetal.,2006).
Elanlisisdelahemaglutininanospermiti,porprimeravez,caracterizarydescribira
los linajes de CDV circulantes en Sudamrica, trabajo que recientemente publicamos
(Panzera et al., 2011). Sin embargo, la amplificacin del gen H es dificultosa si no se
propagaalviruspreviamenteencultivocelular,debiendoutilizarcuatroyhastacinco
juegos de cebadores para amplificar su secuencia completa a partir de muestras
clnicas (Pardo, 2006; Negrao, 2007). En nuestro estudio, intentamos amplificar la
secuencia completa del gen H en 34 muestras (26 uruguayas y ocho argentinas),
73

Discusin

obteniendo la secuencia completa en solo cuatro de ellas. Debido a esta dificultad,

comenzamos a analizar otras regiones del genoma que fueran informativas para
estudiosdecaracterizacinyevolucindeCDV.Deestemodo,amplificamoslaregin
Fsp de los siete aislamientos uruguayos y los cuatro argentinos caracterizados
mediante el anlisis de la hemaglutinina, y de un nuevo aislamiento de nuestro pas
(CDV127)(Tabla4).SeestableciquelareginFsppresentaunavariabilidadgentica
mayor a la detectada en la hemaglutinina (hasta 27% a nivel aminoacdico entre
aislamientosdecampo)yconstasolamentede405pb,locualfacilitasuamplificacin
(vonMessling&Cattaneo,2002).
AligualqueloobservadoparalaprotenaH,elanlisisfilogenticorealizadoconlas
secuenciasaminoacdicasdelFsprevelquelascepassudamericanassedistribuyenen
dos clados. La mayora de los aislamientos sudamericanos pertenecen a un mismo
clado (SA1), el cual se encuentra relacionado con cepas europeas, mientras que tres
aislamientos argentinos (Arg24, Arg25, Arg26), forman un clado independiente (SA2)
(Figura 24; Tabla 7B). El anlisis de la secuencia completa de la hemaglutinina y la
protena de fusin (1989 pb) de aislamientos de Asia, revel las mismas relaciones
evolutivas para ambos genes (Lee et al., 2008). No obstante, nuestro trabajo es el
primerestudioqueanalizaenconjuntolavariabilidaddelahemaglutininaylaregin
Fsp, estableciendo que ambas regiones genmicas ofrecen la misma informacin
debidoaqueseobservanlasmismasrelacionesfilogenticas.
Elanlisisdelavariacinaminoacdicadentrodeloscladosrevelquelosaislamientos
de SA1 y los europeos con los que se agrupan (n acceso AY386315, DQ494319)
presentaron valores de divergencia de hasta 11,9%, mientras que entre los
aislamientosdelcladoSA2losvaloresfuerondehasta2,2%(Tabla7A).Losvaloresde
divergencia aminoacdica promedio entre los clados SA1 y SA2 fueron del 21%. La
comparacin de ambos clados sudamericanos con los aislamientos de Asia y
Norteamrica, tambin revel elevados valores de divergencia (hasta 22,5%) (Tabla
7B).Estosvalores dedivergencia s o n s u p e r i o r e s a l o s d e t e c t a d o s en b a s e a l
a n l i s i s d e la hemaglutinina (hasta3.5% dentro un mismo clado, y superiores al
4% entre los clados). Por tanto, la variabilidad de la regin Fsp es, al menos, tres
veces superior a la observada en la hemaglutinina. Las relaciones filogenticas y los
valoresdevariabilidaddetectadosenelFsp,nospermiteproponerunnuevocriterio
74

Discusin

para definir linajes de CDV en base a esta regin: dos aislamientos pertenecen a un
mismo linaje si se agrupan en un mismo clado, y presentan valores de divergencia
aminoacdica menores a 12%, mientras que pertenecen a linajes distintos si dichos
valoressonsuperioresa12%yseagrupanencladosdiferentes.
LadivergenciaaminoacdicadetectadaenlareginFspdelosaislamientosdelRode
laPlata,soninclusosuperioresalosdedivergencianucleotdica(Figura22,23).Esto
tambin se observ en aislamientos de otras regiones geogrficas, por tanto se han
analizadolasposiblesimplicanciasdelFspsobrelafuncindelaprotenaFmadurayla
patognesisviral.EstudiosrealizadosconcepasmutantesenlareginFspmostraron
que la presencia de mutaciones especficas tiene efectos drsticos sobre la actividad
defusindeF.VonMessling&Cattaneo(2002)generaronmutantesconcambiosen
unodelosdoscodonesdeiniciopresentesenelFsp(posiciones1y61),sustituyendo
en ambos casos metionina por leucina (M1L y M61L). Para ambos mutantes M1L y
M61L, se detect una actividad de fusin 20 veces superior respecto a los virus
parentales. En dicho estudio, tambin se estableci que la longitud del Fsp influye
sobre los niveles de actividad de la protena F. El anlisis de mutantes con el Fsp de
longitud variable, revel que la variante con el Fsp ms corto (28 aa) present una
actividad de fusin 70 veces mayor que la protena parental. Se propone, por tanto,
quedichareginpodramodularlafuncindelaprotenaF,yaquelasprotenascon
mutaciones especficas o un Fsp de menor longitud presentaron mayor actividad
fusognicainvitro(VonMessling&Cattaneo,2002).
Adems,cabedestacarqueelFsppresentaunavidamediade30minutosluegodeser
procesado.Elhechoqueelpptidosealnoseadegradadoinmediatamentedespus
desuclivajesugierequeestarainvolucradoenotrafuncinadicional(vonMessling&
Cattaneo, 2002). Estudios realizados con clulas infectadas por HIV, mostraron que
muchos procesos de la respuesta inmune dependientes de la calmodulina (protena
intracelularqueactacomoreceptorparaelcalcioentodaslasclulaseucariotas),son
interrumpidos por la interaccin de esta molcula con el pptido seal de la
glicoprotenagp160delvirusdelainmunodeficienciahumana(HIV)(Martoglioetal.,
1997).Lacalmodulinareconoceregionescargadaspositivamenteconhlicesanfiflicas
de 16 a 35 residuos (hlices baa). La secuencia del pptido seal de gp160 presenta
unareginqueformaunahlicebaa,lacualtienegranafinidadporlacalmodulinae
75

Discusin

inhibe su unin al calcio in vitro (Martoglio et al., 1997). A nivel del Fsp de CDV,
tambin se describi una estructura de hlice baa con polaridad positiva. Esta
estructurafavoreceraunainteraccinconlacalmodulinasemejantealaqueocurreen
HIV, influyendo sobre la patognesis viral (von Messling & Cattaneo, 2002). Sera
relevanteanalizarsielelevadonmerodesustitucionesaminoacdicasobservadasen
elFsp,determinanuncambiosobrelapolaridaddeestareginentreaislamientosde
campo. Esta aproximacin permitira establecer si en los aislamientos analizados la
hlicebaaseencuentraalteradadebidoavariacionesenlasecuenciaprimariadelFsp,
lo cual impedira su unin a la calmodulina y la consecuente interrupcin de los
procesosquestaregula.
ElanlisisdepresionesselectivasdelFsp,revelqueelcocientedN/dSfuecercanoa1
(0.97),loqueindicaraqueestareginevolucionadeformaneutral.Sinembargo,12
de los 135 codones estn sujetos a seleccin positiva, sugiriendo que son relevantes
paraelFsp,aunquelareginensuconjuntopresenteundN/dSglobalneutral(Tabla
8). En otros modelos virales tambin se observ que la regin aminoterminal de
ciertas glicoprotenas de la envoltura, presenta un sesgo hacia los cambios no
sinnimos,conunelevadonmeroderesiduosseleccionados(Curranetal.,2002).La
regin hipervariable 1 (HRV1) de la glicoprotena E2 del virus de la Hepatitis C,
presentaunpatrnevolutivosemejantealFspdeCDV.Estareginformapartedela
protena E2 que se expresa en superficie y presenta un sitio de unin a anticuerpos
neutralizantes (Curran et al., 2002; Mondelli et al., 2003). Debido a que el Fsp es
procesado en el medio intracelularantes que la protena F se exportea la envoltura
viral, dicha regin no sera blanco de anticuerpos. Sin embargo, la variabilidad
aminoacdica y el nmero de residuos bajo seleccin positiva detectados en el Fsp,
semejante a lo observado en la regin HRV1, permite especular sobre una posible
funcindeestareginannoidentificada.

4.1Conclusionesyperspectivas
Elestudiodelaprevalenciadelaenfermedadydelavariabilidadgenticadelascepas
circulantessonelementosfundamentalesparaanalizarlaepidemiologadeDistemper
en nuestra regin. En el presente trabajo de Tesis se presenta, por primera vez en
Sudmerica,unmtododedeteccindelgenomadeCDVporRTPCRentiemporeal
76

Discusin

conqumicaTaqMan.Estemtodoconstituyeunaherramientarpidayconfiablepara
la deteccin del genoma viral, y podra incluirse dentro de un eventual plan de
contingenciadeDistemperennuestropasylaregin.
Tambinpresentamoselprimerestudiodecaracterizacingenticadeaislamientosde
campoennuestrocontinente,enbasealanlisisdelasecuenciacompletadelgenHy
la regin Fsp. Mediante el anlisis de ambas regiones genmicas, identificamos la
presencia de dos linajes cocirculantes con diferente distribucin y abundancia, uno
correspondiente a un linaje ya caracterizado (EU1), el cual proponemos que se
denomine EU1/SA1, y un nuevo linaje descrito en este trabajo denominado SA2. El
linaje EU1/SA1 est representado por aislamientos de Uruguay, Brasil y Argentina,
mientrasqueSA2estformadosolamenteporaislamientosargentinos.Lasrelaciones
evolutivas entre las cepas sudamericanas de SA1 y el linaje EU1, puede deberse al
intercambioincontroladodeanimalesentreamboscontinentes,mientrasqueellinaje
SA2sehabraoriginadoporelcontactoentrecarnvorossilvestresycanesdomsticos.
Dichosresultadosfueronrecientementepublicadospornuestrogrupodeinvestigacin
(Panzeraetal.,2011).
ElanlisisdeunnmeromayordeaislamientosdeSudamricapermitirestablecerla
prevalenciadeamboslinajesenlaregin,enespecialenArgentinayBrasildondela
informacinsobrelavariabilidadgenticadelascepascirculantesendistintasregiones
eslimitada.Elanlisisdeaislamientosdecarnvorossilvestrespermitirdeterminarsi
stospertenecenallinajeSA2,locualserarelevanteparaelucidarelorigendeeste
linaje.Estoesderelevanciaprincipalmenteennuestropas,debidoaquenosecuenta
conregistrosdeCDVenanimalessilvestres.
El anlisis de la regin Fsp, permiti identificar un nuevo marcador para estudios de
caracterizacin y evolucin de CDV, el cual presenta valores de variabilidad gentica
mselevadosquelahemaglutininayrevellasmismasrelacionesevolutivas.Debidoa
ello,proponemosunanuevadefinicindelinajesparaCDVenbaseasuvariabilidad.
Estos resultados sern publicados en un manuscrito que se encuentra en etapa de
correccinporlosautores.

Dentrodelasactividadesfuturasdenuestralneadeinvestigacinsedestacan:

77

Discusin

Desarrollar un ensayo de sensibilidad y un mtodo de cuantificacin de la carga

viralmedianteRTPCRentiemporeal.

AmpliarlosestudiosdecaracterizacinmoleculardeCDVennuestraregin,conel
objetivo de monitorear a las cepas circulantes y eventualmente detectar nuevas
variantesemergentes.

Relevar la variabilidad gentica de los CDVs que puedan ser detectados en

carnvorossilvestresoencautiveriodenuestropas.

Realizar anlisis funcionales para establecer los efectos de la variabilidad del Fsp
sobrelafisiologadelaprotenaFylapatognesisviral.

Estudiar la dinmica poblacional de CDV y su posible rol en la patognesis y

virulencia.

78

Referenciasbibliogrficas

Referenciasbibliogrficas
An,D.J.,Yoon,S.H.,Park,J.Y.,No,I.S.,Park,B.(2008).Phylogeneticcharacterizationof
Canine Distemper Virus isolates from naturally infected dogs and a marten in Korea.
Vet.Microbiol.132,389395.

Anderson,D.E.,vonMessling,V.(2008).RegionbetweenthecaninedistempervirusM
andFgenesmodulatesvirulencebycontrollingfusionproteinexpression.J.Virol.82,
1051010522.

Appel,M.J.(1987).En:Horzinek,M.C.(Ed.),CanineDistemperVirusinVirusInfections
ofCarnivores,vol.1.ElsevierSciencePublishersB.V.179,133159.

Appel,M.J.,Summers,B.A.(1999).CanineDistemper:CurrentStatus.RecentAdvances
inCanineInfectiousDiseases.Carmichael,L.E.Ed.InternationalVeterinaryInformation
Service.

Bellini,W.J.,Englund,G.,Richardson,C.D.,Rozenblatt,S.,Lazzarini,R.A.(1985).Matrix
genesofmeaslesvirusandcaninedistempervirus:cloning,nucleotidesequences,and
deducedaminoacidsequences.J.Virol.58,408416.

BlixenkroneMoller,M.,Pedersen,I.R.,Appel,M.J.,Griot,C.(1991).DetectionofIgM
antibodies canine distemper virus in dog and mink sera employing enzymelinked
immunosorbenassay(ELISA).J.Vet.Diagn.Invest.3,39.

Bolt, G., Jensen, T.D., Gottschalck, E., Arctander, P., Appel, M., Buckland, R.,
BlixenkroneMoller,M.,(1997).Geneticdiversityoftheattachment(H)proteingeneof
currentfieldisolatesofcaninedistempervirus.J.Gen.Virology.78,367372.

Caldern,M.G.,Remorini,P.,Periolo,O.,Iglesias,M.,Mattion,N.,LaTorre,J.(2007).
Detection by RTPCR and genetic characterization of canine distemper virus from
vaccinatedandnonvaccinateddogsinArgentina.Vet.Microbiol.125,341349.

81

Referenciasbibliogrficas

Caldern, M.G. (2008). Caracterizacin molecular de cepas de Parvovirus y virus

Distemper canino provenientes de perros domsticos vacunados y no vacunados de
Argentina. Tesis de Doctorado de la Universidad de Buenos Aires en el reaQumica
Biolgica.

Callison,S.A.,Hilt, D.A.,Boynton, T.O.,Sample, B.F.,Robison, R.,Swayne, D.E.,

Jackwood, M.W. (2006). Development and evaluation of a realtime Taqman RTPCR
assay for the detection of infectious bronchitis virus from infected chickens. J. Virol.
Methods.138,6065.

Cattaneo,R.,Kaelin,K.,Baczko,K.,Billeter,M.A.(1989).Measlesviruseditingprovides
anadditionalcysteinerichprotein.Cell.56,759764.

Curran,R.,Jameson, C.L.,Craggs, J.K.,Grabowska, A.M.,Thomson, B.J.,Robins,

A.,Irving,W.L.,Ball,J.K.(2002).Evolutionarytrendsofthefirsthypervariableregionof
thehepatitis Cvirus E2 protein in individuals with differing liver disease severity. J.
Gen.Virol.83,1123.

Deem, S.L., Spelman, L.H., Yates, R.A., Montali, R.J. (2000). Canine distemper in
terrestrialcarnivores:areview.J.Zoo.Wildl.Med.31,441451.

Demeter,Z.,Lakatos,B.,Palade,E.A.,Kozma,T.,Forgach,P.,Rusvai,M.(2007).Genetic
diversityofHungariancaninedistempervirusstrains.Vet.Microbiol.122,258269.

Del Puerto, H., Vasconcelos, A. C., Moro, L., Alves, F., Braz, G. F., Martins, S. (2010).
Caninedistempervirusdetectioninasymptomaticandnonvaccinateddogs.Pesq.Vet.
Bras.30,139144.

EkKommonen,C.,Sihvonen,L.,Pekkanen,K.,Rikula,U.,Nuotio,L.(1997).Outbreakof
caninedistemperinvaccinateddogsinFinland.Vet.Rec.141,380383.

82

Referenciasbibliogrficas

Elia, G., Decaro, N., Martella, V., Cirone, F., Lucente, M., Lurosso, E., Di Trani, L.,
Buonavoglia, C. (2006). Detection of canine distemper virus in dogs by realtime RT
PCR.J.Virol.Methods.136,171176.

Frisk, A.L., Konig, M., Moritz, A., Baumgartner, W. (1999). Detection of Canine
DistemperVirusNucleoproteinRNAbyReverseTranscriptionPCRUsingSerum,Whole
Blood,andCerebrospinalFluidsfromDogswithDistemper.J.Clin.Microbiol.37,3634
3643.

Ferreyra,H.,Caldern,M.G.,Marticorena,D.,Marull,C.,Leonardo,B.C.(2009).Canine
distemperinfectionincrabeatingfox(Cerdocyonthous)fromArgentina.J.Wild.Dis.
45,115862.

Frolich, K., Czupalla, O., Haas, L., Hentschke, J., Dedek, J., Fickel, J. 2000.
Epizootiological investigations of canine distemper virus in freeranging carnivores
fromGermany.Vet.Microbiol.74,283292.

Gebara, C.M.S., Wosiacki, S.R., Negrao, F.J., de Oliveira, D.B., Beloni, S.N.E., Alfieri,
A.A.,Alfieri,A.F.(2004).DetectionofcaninedistempervirusnucleoproteingenebyRT
PCRinurineofdogswithdistemperclinicalsigns.Arq.Bras.Med.Vet.Zootec.56,480
487.

Gemma, T., Watari, T., Akiyama, K., Miyashita, N., Shin, Y.S., Iwatsuki, K., Kai, C.,
Mikami, T. (1996). Epidemiological observations on recent outbreaks of canine
distemperinTokyoarea.J.Vet.Med.Sci.58,547550.

Goller, K.V.,Fyumagwa, R.D.,Nikolin, V.,East, M.L.,Kilewo, M.,Speck, S.,Mller

T.,Matzke,
T

M.,Wibbelt,

G.

(2009).

Fatalcaninedistemperinfectionin

apackofAfricanwilddogsin theSerengetiecosystem, Tanzania. Vet Microbiol. 146,

245252.

83

Referenciasbibliogrficas

Haig,D.(1956).Caninedistemperimmunisationwithavianisedvirus.Onderstepoort.J
VetRes27,1953.

Harder,T.C.,Kenter,M.,Vos,H.,Siebelink,K.,Huisman,W.,vanAmerongen,G.,Orvell,
C., Barrett, T., Appel, M.J., Osterhaus A.D. (1996). Canine distemper virus from
diseasedlargefelids:biologicalpropertiesandphylogeneticrelationships.J.Gen.Virol.
77,397405.

Hashimoto, M., Une, Y., Mochizuki, M. (2001). Hemagglutinin genotype profiles of

caninedistempervirusfromdomesticdogsinJapan.Arch.Virol.146,149155.

Iwatsuki,K.,Miyashita,N.,Yoshida,E.,Gemma,T.,Shin,Y.,Mori,T.,Hirayama,N.,Kai,
C.,Mikami,T.(1997).Molecularandphylogeneticanalysesofthehaemagglutinin(H)
proteinsoffieldisolatesofcaninedistempervirusfromnaturallyinfecteddogs.J.Gen.
Virology.78,373380.

Keawcharoen,J.,Theamboonlers,A.,Jantaradsamee,R.,Rungsipipat,A.,Poovorawan,
Y.,Oraveerakul,K.(2005).NucleotideSequenceanalysisofnucleocapsidproteingene
ofcaninedistempervirusisolatesinThailand.Vet.Microbiol.105,137142.

Kim,Y.,Cho,K.,Youn,H.,Yoo,H.,Han,H.(2001).Detectionofcaninedistempervirus
(CDV)throughonestepRTPCRcombinedwithnestedPCR.J.Vet.Sci.2,5963.

Lamb,R.A.,Parks,G.D.(2007).Paramyxoviridae:TheVirusesandTheirReplicationen
FieldsVirology,LippincottWilliams&Wilkins,5Ed.

Lan N.T., Yamaguchi R., Inomata A., Furuya Y., Uchida K., Sugano S., Tateyama S.
(2006). Comparative analyses of canine distemper viral isolates from clinical cases of
caninedistemperinvaccinateddogs.Vet.Microbiol.115,3242.

84

Referenciasbibliogrficas

Lednicky, J.A., Dubach, J., Kinsel, M.J., Meehan, T.P., Bocchetta, M., Hungerford, L.L.,
Sarich, N.A., Witecki, K.E., Braid, M.D., Pedrak, C., Houde, C.M. (2004). Genetically
distantAmericanCaninedistemperviruslineageshaverecentlycausedepizooticswith
somewhat different characteristics in raccoons living around a large suburban zoo in
theUSA.Virol.J.2,1:2.

Lee, M.S., Tsai, K.J., Chen, L.H., Chen, C.Y., Liu, Y.P., Chang, C.C., Lee S.H., Hsu, W.L.
(2008). The identification of frequent variations in the fusion protein of canine
distempervirus.Vet.Journal.183,184190.

Liermann,H.,Harder,T.C.,Lochelt,M.,vonMessling,V.,Baumgartner,W.,Moennig,
V., Haas, L. (1998). Genetic analysis of the central unstranslated genome region and
the proximal coding part of the F gene of wildtype and vaccine canine Distemper
Morbilliviruses.VirusGenes.17,259270

Mackay,I.(2007).RealTimePCRinMicrobiology:fromdiagnosistocharacterization.
CaisterAcademicPress,1Ed.

Martella, V., Elia, G., Lucente, M, Decaro, N., Lorusso, E., Banyai, K., Blixenkrone
Mller, M., Lan, N., Yamaguchi, R., Cirone, F., Carmichael, L., Buonavoglia, C. (2006).
Heterogeneitywithinthehemagglutiningenesofcaninedistempervirus(CDV)strains
detectedinItaly.Vet.Microbiol.116,301309.

Martoglio,B.,Graf,R.,Dobberstein,B.(1997).Signalpeptidefragmentsofpreprolactin
andHIV1pgp160interactwithcalmodulin.EMBOJ.16,66366645.
McCarthyA.J.,ShawM.,GoodmanS.J.,B.P.R.(2007).Pathogenevolutionanddisease
emergence in carnivores Pathogen evolution and disease emergence in carnivores.
Proc.R.Soc.B.31653174.

85

Referenciasbibliogrficas

Megid,J.,de Souza, V.A.,Teixeira, C.R.,Cortez, A.,Amorin, R.L.,Heinemman,

M.B.,Cagnini, D.Q.,Richtzenhain, L.J. (2009). Canine distemper virusin a crabeating
fox(Cerdocyonthous)inBrazil:casereportandphylogeneticanalyses.J.Wildl.Dis.45,
527530.
Mochizuki, M., Hashimoto, M., Hagiwara, S., Yoshida, Y., Ishiguro, S., (1999).
Genotypes of canine distemper virus determined by analysis of the hemagglutinin
genesofrecentisolatesfromdogsinJapan.J.Clin.Microbiol.37,29362942.

Mondelli,M.U.,Cerino, A.,Meola, A.,Nicosia, A. (2003). Variability or conservation

ofhepatitis Cvirus hypervariable region 1? Implications for immune responses. J.
Biosci.28,305310.

Nava, A.F., Cullen, L. Jr, Sana, D.A., Nardi, M.S., Filho, J.D., Lima, T.F., Abreu, K.C.,
Ferreira, F. (2008). First evidence of canine distemper in Brazilian freeranging felids.
Ecohealth.5,513518.

Negrao, F.B. (2007). Anlise filogentica do gene da hemaglutinina de estirpes

selvagensbrasileirasdovrusdaCinomosecanina.TesisdeDoctoradodelProgramaen
postgraduacinenCienciaAnimal,UniversidadEstadualdeLondrina.

Panzera, Y., Caldern, M.G., Sarute, N., Guasco, S., Cardeillac, A., Bonilla, B.,
Hernndez,M.,Francia,L.,Bed,G.,LaTorre,J.,Prez,R.(2011).Evidenceoftwoco
circulatinggeneticlineagesofcaninedistempervirusinSouthAmerica.VirusRes.163,
401404.

Pardo, I., Johnson, G.C., Kleiboecker, S.B. (2005). Phylogenetic Characterization of

CanineDistemperVirusesDetectedinNaturallyInfectedDogsinNorthAmerica.J.Clin.
Microbiol.43,50095017.

86

Referenciasbibliogrficas

Pardo, I. (2006). Phylogenetic characterization of canine Distemper virus detected in

naturally infected North American dogs. Master of Science. University of Missouri
Columbia.

Plattet, P., Cherpillod, P., Wiener, D., Zipperle, L., Vandevelde, M., Wittek. R.,
Zurbriggen, A. (2007). Signal peptide and helical bundle domains of virulent canine
distempervirusfusionproteinrestrictfusogenicity.J.Virol.81,1141311425.

Rikula, U.K. (2008). Canine distemper in Finland: vaccination and epidemiology.

DisertacinacadmicapresentadaenlaFacultaddeMedicinaVeterinaria,Universidad
deHelsinki.

Saito,T.B.,Alfieri,A.A.,Wosiacki,S.R.,Negrao,F.J.,Morais,H.S.A.,Alfieri,A.F.(2006).
Detection of canine distemper virus by reverse transcriptasepolymerase chain
reactionintheurineofdogswithclinicalsignsofdistemperencephalitis.Res.Vet.Sci.
80,116119.

Sambrook,J.,Fritsch,E.F.,Maniatis,T.(1989).Molecularcloning:alaboratorymanual,
2ed.ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor.

Sarute, N., Prez, R., Francia, L., Hernndez, M., Bed, G., Bonilla, B., Guasco, S.,
Cardeillac, A., Panzera, Y. (2011). Primer diagnstico molecular y caracterizacin
parcial del gen de la nucleoprotena del Virus Distemper Canino en Uruguay.
Veterinaria.47,713.

Sawatsky,B.,von Messling,V. (2010). Canine distemper viruses expressing a

hemagglutinin without Nglycans lose virulence but retain immunosuppression. J.
Virol.84,27532761.

Scagliarini,A.,Dal Pozzo, F.,Gallina, L.,Vaccari, F.,Morganti L. (2007). TaqMan based

real time PCR for the quantification ofcanine distemper virus. Vet. Res. Commun. 1,
261263.
87

Referenciasbibliogrficas

Seki, F.,Ono, N.,Yamaguchi, R.,Yanagi, Y. (2003). Efficient isolation of wild strains

ofcanine distemper virusin Vero cells expressingcanine SLAM (CD150) and their
adaptabilitytomarmosetB95acells.J.Virol.77,99439950.

Si, W.,Zhou, S.,Wang, Z.,Cui, S.J. (2010). A multiplex reverse transcriptionnested

polymerase chain reaction for detection and differentiation of wildtype and vaccine
strainsofcaninedistempervirus.Virol.J.7,8691.

Stern,L.B.,Greenberg, M.,Gershoni, J.M.,Rozenblatt, S. (1995). The hemagglutinin

envelopeproteinofcaninedistempervirus(CDV)conferscelltropismasillustratedby
CDVandmeaslesviruscomplementationanalysis.J.Virol.69,16611668.

Sultan, S., Charoenvisal. N., Lan, N.T., Yamaguchi, R., Maeda, K., Kai, K., (2009). The
Asia 2 specific signal peptide region and other domains in fusion protein genes
characterizedAsia1andAsia2caninedistemperviruses.Virol.J.6,157166.

Tamura, K., Dudley, J., Nei, M., Kumar, S. (2007). MEGA 4: Molecular Evolutionary
Genetics Analysis (MEGA) software version 4.0. Molecular Biology and Evolution. 24,
15961599.

von Messling, V., Zimmer, G., Herrler, G., Haas, L., Cattaneo, R. (2001). The
hemagglutininofcaninedistempervirusdeterminestropismandcytopathogenicity.J.
Virol.75,64186427.

von Messling,V.,Cattaneo, R. (2002). Aminoterminal precursor sequence modulates

caninedistempervirusfusionproteinfunction.J.Virol.76,41724180.

von Messling, V., Springfeld, C., Devaux, P., Cattaneo, R., (2003). A Ferret Model of
CanineDistemperVirusVirulenceandImmunosuppression.J.Virol.77,1257912591.

88

Referenciasbibliogrficas

vonMessling,V.,Milosevic,D.,Devaux,P.,Cattaneo,R.(2004)Caninedistempervirus
andmeaslesvirusfusionglycoproteintrimers:partialmembraneproximalectodomain
cleavageenhancesfunction.J.Virol.78,78947903.

vonMesslingV.,OezguenN.,ZhengQ.,VongpunsawadS.,BraunW.andCattaneoR.
(2005). Nearby Clusters of Hemagglutinin Residues Sustain SLAMDependent Canine
DistemperVirusEntryinPeripheralBloodMononuclearCells.J.Virol.79,58575862.

Vongpunsawad,S.,Oezgun, N.,Braun, W.,Cattaneo, R. (2004). Selectively receptor

blindmeaslesviruses:IdentificationofresiduesnecessaryforSLAMorCD46induced
fusionandtheirlocalizationonanewhemagglutininstructuralmodel.J.Virol.78,302
313.

Woma T.Y., van Vuuren M., Bosman A.M., Quan M., Oosthuizen M., (2009).
Phylogenetic analysis of the haemagglutinin gene of current wildtype canine
distempervirusesfromSouthAfrica:lineageAfrica.Vet.Microbiol.143,12632.

Zhao,J.J.,Yan,X.J.,Chai,X.L.,Martella,V.,Luo,G.L.,Zhan,H.L.,Gao,H.,Liu,Y.X.,Bai,
X.,Zhang,L.,Chen,T.,Xu,L.,Zhao,C.F.,Wang,F.X.,Shao,X.Q.,Wu,W.,Cheng,S.P.,
(2009). Phylogenetic analysis of the haemagglutinin gene of canine distemper virus
strainsdetectedfrombreedingfoxes,raccoondogsandminksinChina.Vet.Microbiol.
140,3442.

Zipperle,L.,Langedijk,J.P.,Orvell,C.,Vandevelde,M.,Zurbriggen,A.,Plattet,P.(2010).
Identification of key residues in virulent canine distemper virus hemagglutinin that
controlCD150/SLAMbindingactivity.J.Virol.84,96189624.

89