Академический Документы
Профессиональный Документы
Культура Документы
Esta forma de cultivo tiene una importantsima utilizacin prctica a escala industrial en virtud
de las grandes ventajas que ofrece. Al dosificar el sustrato a la velocidad con la que est
siendo consumido y transformado por el microorganismo se eliminan problemas de represin
de la sntesis del producto por glucosa (efecto glucosa) y problemas de limitacin del
crecimiento celular por exceso de sustrato (principalmente por aquellos que presentan un
umbral de toxicidad a concentraciones relativamente bajas como metanol, etanol, fenol, etc.);
tambin puede emplearse en fermentaciones en las que se utilicen cepas sobreproductoras
sujetas a auxotrofa; etc. Los equipos adicionales y la forma operacional requerida en un CLA,
al compararse con el cultivo por lote, ni ocasionan problemas ni representan gastos
econmicos que no puedan ser solventados exitsamente como consecuencia de los
incrementos en los rendimientos, concentraciones del producto o productividad alcanzadas en
esta forma de cultivo4,5,6,7.
El CLA presenta, bajo ciertas circunstancias, ciertas analogas con la tcnica de cultivo
continuo "CC" como son: a) la velocidad especfica de crecimiento puede ser controlada por la
velocidad volumtrica a la cual se suministra el sustrato al fermentador8; b) se puede
mantener constante la velocidad especfica de crecimiento, as como la concentracin de
sustrato residual y/o concentracin celular.
De acuerdo a Jones8, los CLA se pueden clasificar en tres tipos principales que son:
1. - Aqullos que permiten mantener constante la velocidad especfica de crecimiento del
cultivo (flujo de alimentacin exponencial).
2. - Aqullos en los que el flujo de alimentacin es una funcin lineal del tiempo (velocidad
de cambio de flujo constante).
3. - Aqullos que trabajan a una velocidad de flujo constante.
La caracterstica principal de esta forma de cultivo es la existencia de una corriente de
alimentacin de medio fresco (constante o funcin del tiempo) sin que exista una corriente de
salida. La corriente de alimentacin tiene por objeto mantener el crecimiento del
microorganismo o la produccin de un metabolito proporcionando los materiales necesarios.
As se crea el juego entre la demanda y la oferta de nutrientes ("DN" y "ON" respectivamente),
la primera establecida por el microorganismo y las condiciones fisicoqumicas de su
crecimiento y la segunda manipulada por el operador.
De acuerdo a la ecuacin 5, para obtener distintos perfiles de la oferta, existen tres soluciones
posibles que son: a) variar el flujo de alimentacin (Fa) y mantener constante la concentracin
de sustrato en la corriente de alimentacin (sa); b) variar sa y mantener constante Fa; c) variar
ambos a la vez. Por facilidad prctica se prefiere la opcin marcada como a. Al ajustarse la
alimentacin a una funcin determinada del tiempo [Fa = f (t)], se obtienen los distintos perfiles
o clasificaciones ya enunciadas de los CLA. Por ejemplo, para lograr una alimentacin
exponencial [Fa = F0 e t] se requiere de una bomba programable capaz de variar el flujo (en
forma exponencial) con el tiempo y que presente un control muy preciso de la velocidad. Los
problemas inherentes al manejo de tales equipos y las soluciones a los mismos, son puntos
que no se mencionarn aqu. Dndose por entendido que la programacin precisa de la ON
es factible (exponencial, lineal o constante).
Las ecuaciones matemticas que describen a estos procesos son resultado de balances de
materia de los componentes que entran en juego y su solucin implica sofisticados y
complicados mtodos numricos con ayuda de computadoras.
Esta seccin tiene por objeto establecer la cintica de crecimiento y produccin en esta forma
de cultivo, sin embargo, para facilitar la solucin de las ecuaciones de balance (diferenciales
por lo general), se establecern las siguientes suposiciones:
2
La inhibicin del crecimiento por los productos propios del metabolismo es despreciable.
Las anteriores consideraciones slo sirven para dar solucin analtica a las ecuaciones de
balance, pero no siempre se cumplen, ya que dependen de la fermentacin que se trate.
(dX/dt) = X
(1)
(2)
(dV/dt) = Fa
(3)
= maxs / (s + Ks)
(4)
ON = Fasa
(5)
DN = X / Yx/s
(6)
X = Vx
(7)
S = Vs
(8)
Puesto que todo CLA parte de una etapa previa de cultivo por lote, una de las preguntas
fundamentales que nacen de esta aseveracin es con qu criterio y en qu momento se
iniciar la alimentacin? En la literatura se han mencionado distintos criterios, formas y
momentos en las que se realizan las alimentaciones. En forma general puede mencionarse
que la alimentacin se inicia cuando en el cultivo por lote se alcanza una determinada
concentracin de biomasa, producto o sustrato en el reactor, o una variacin determinada del
pH, oxgeno disuelto u otro parmetro indicativo. Para el caso particular de produccin de
biomasa microbiana por ejemplo, la alimentacin debe iniciarse cuando la velocidad especfica
de crecimiento empieza a disminuir de su valor mximo debido al agotamiento de nutrientes y
la cdula de alimentacin deber ajustarse a un perfil exponencial con objeto de mantener la
a su mximo valor, pero sin que exista acumulacin de sustrato. Para otras
fermentaciones, la cdula de alimentacin deber ajustarse de acuerdo a las
particularidades del proceso.
V V0 Fa ( t t0 )
X X0 e
(9)
max ( t t 0 )
(10)
S s0V0 Fa sa ( t t0 )
V0 x0
Yx / s
max ( t t 0 )
(11)
Con las cuales se puede calcular el volumen, masa celular y sustrato, respectivamente, con
respecto al tiempo. Dado que la concentracin celular se define como la biomasa total por
unidad de volumen de cultivo, sta se puede calcular utilizando las ecuaciones 7, 9 y 10. En
igual forma se puede calcular la concentracin del sustrato con las ecuaciones 8, 9 y 11 dando
como resultado las ecuaciones 12 y 13 respectivamente:
x
V0 x0 Exp max ( t t0 )
V0 s0 Fa sa ( t t0 )
s
(12)
V0 Fa ( t t0 )
V0 x0
Yx / s
V0 Fa ( t t0 )
max ( t t 0 )
(13)
V0 s0 Yx / s V0 x0 Fa sa Yx / s ( t t0 )
(14)
V0 Fa ( t t0 )
X V0 s0 Yx / s V0 x0 Fa sa Yx / s ( t t0 )
(15)
1 dX
X dt
Fa sa Yx / s
(16)
V0 s0 Yx / s V0 x0 Fa sa Yx / s ( t t0 )
La ecuacin (15) indica claramente que en esta fase (FCL) la biomasa se incrementa en forma
lineal con respecto al tiempo, caracterstica que la distingue. La concentracin de sustrato se
puede calcular utilizando las ecuaciones 4 y 16 obtenindose, despus de una serie de
arreglos, la siguiente expresin:
s Ks
Fa sa Yx / s
(17)
max X Fa sa Yx / s
Figura 2. Variacin de X, S, , ON
y DN VS. t, en un CLA-AC en el
que ON>DN0.
X
ON
EL
QUE
LA
CONCENTRACION
CELULAR
Si tanto el volumen del caldo de fermentacin (V) como la masa celular total (X) se
incrementan con el tiempo, la concentracin celular (x) slo ser constante si los incrementos
en las dos variables son proporcionales (ver ecuacin 7). Al darse este caso particular, existir
otra analoga de esta forma de cultivo con el CC. Lo interesante de este caso no es el hecho
de su existencia misma, sino establecer las condiciones necesarias para lograrlo.
Si la concentracin celular permanece constante, significa que su derivada con respecto al
tiempo se hace cero (dx/dt = 0), por lo que utilizando las ecuaciones 1, 7 y 3 se puede llegar a
demostrar que:
dx
0 ( Fa V ) x
dt
Fa
D
V
(18)
Esta ecuacin (18) indica que la velocidad especfica de crecimiento se ajusta, de manera
semejante al CC, a la velocidad de dilucin del cultivo (Fa/V). A este estado se le denomina
"estado cuasiestacionario", pero a diferencia del CC, la velocidad especfica de crecimiento ""
no es constante, sino que disminuye continua e inversamente proporcional con el tiempo. Lo
anterior se hace evidente sustituyendo la ecuacin 9 en la 18 obtenindose:
Fa
(19)
V0 Fa ( t t0 )
Es necesario destacar que este caso particular slo se presenta durante la FCL y no en la
FCE, ya que utilizando las ecuaciones 12, 1, 7, 3 se puede demostrar que:
Fa
V0 max
(20)
1 max ( t t0 )
Ecuacin que est en contradiccin al tipo de CLA analizado (con flujo de alimentacin
constante).
Para analizar este caso particular, se tienen que tomar las ecuaciones establecidas para la
FCL. Al obtener la derivada con respecto al tiempo de la ecuacin 14 e igualarla a cero y
despus de algunos arreglos se obtiene:
sa s0 x0 Yx / s
(21)
Esta ecuacin indica la condicin necesaria y suficiente para la existencia de este caso
particular, que es cuando la concentracin de sustrato en la corriente de alimentacin "sa" es
igual a la suma de la concentracin de sustrato residual al inicio de la alimentacin "s0" y la
relacin "x0/Yx/s". Con esta ecuacin se puede calcular la concentracin celular y la biomasa
total en el reactor al sustituirla en la ecuacin 14, obtenindose:
x s0 Y x / s x 0
(22)
X ( s0 Y x / s x 0 ) V 0 F a t t 0
(23)
Por ltimo, para calcular tanto la concentracin como la cantidad total de sustrato en el reactor
se utilizan las ecuaciones 4, 8 y 19 obtenindose:
s Ks
Fa
max V0 Fa ( t t0 ) Fa
S Ks
Fa
(24)
(25)
max D
X X0e
( t t 0 )
(26)
DN
Yx / s
X 0 e t
(27)
Para satisfacer la demanda es necesario que la ON se ajuste en cada momento a ella, por lo
que el flujo de alimentacin de medio fresco tambin deber ser de tipo exponencial.
DN ON Fa s a
Yx / s
X 0 e t
(28)
Fa
X 0
s a Yx / s
e F e
t
(29)
Ecuacin que indica claramente que el flujo de alimentacin inicial (F0) est establecido por: la
velocidad especfica de crecimiento con la que se desee trabajar (), la cantidad de masa
celular inicial (X0), el rendimiento celular con base en el sustrato (Yx/s) y la concentracin del
sustrato en la corriente de alimentacin (sa).
La variacin del volumen en el reactor se obtiene aplicando la ecuacin 3 a la 29:
V V0
F0
(30)
Para conocer la concentracin celular en el reactor basta dividir la ecuacin 26 entre la 30,
con lo que se obtiene:
X 0 e t
F
V0 0 e t 1
(31)
Fa V D
(19)
En este caso, al igual que en CC, la "" se ajusta a la velocidad de dilucin del cultivo y ser
constante con valor igual a:
F0
(33)
V0
Esta ecuacin tambin se obtiene al derivar con respecto al tiempo la ecuacin 31 e igualarla
a cero. El valor del flujo inicial en este caso particular es el producto del volumen inicial por la
velocidad especfica de crecimiento que se desee trabajar.
F0 V0
(34)
sa
X0
V0 Y x / s
(35)
Todas estas consideraciones acentan las similitudes entre esta forma de cultivo particular
con el cultivo continuo. En ambos casos se cumple lo siguiente: a) la velocidad especfica de
crecimiento es constante y controlada por el flujo de alimentacin de medio de fresco; b) las
concentraciones celular y de sustrato en el reactor son constantes. Quiz la nica diferencia
entre ambos radique en una distribucin distinta de estados fisiolgicos de las clulas en el
reactor.
(36)
a partir de esta ecuacin y en combinacin con la 3, se puede calcular el volumen del cultivo
en funcin del tiempo:
V V0 F0 ( t t0 )
1
2
g ( t t0 )
(37)
Al igual que en el CLA-AC, de acuerdo a la relacin existente entre la ON0 y la DN0, se pueden
presentar las fases de crecimiento exponencial y limitada (FCE y FCL).
1.5.1. FASE DE CRECIMIENTO EXPONENCIAL.
El anlisis de esta fase es semejante a la correspondiente a la del tipo de CLA-AC, con la
aclaracin de que las ecuaciones para "Fa" y "V" estarn dadas por las ecuaciones 36 y 37
respectivamente; las ecuaciones resultantes para esta fase son:
= max
(38)
X X 0 e maxt
(39)
V0 x0 e maxt
x
1
V0 F0 (t ) g (t ) 2
2
(40)
V0 x0 max ( t )
e
1
Yx / s
1
V0 F0 (t ) g (t ) 2
2
V0 s 0 s a (V V0 )
s
(41)
s
x
V0 s 0 Y x / s
s a Y x / s Fa
V0 x 0 s a Y x / s (V V0 )
max V0 s 0 Y x / s
(42)
s a Y x / s Fa K s
V0 x 0 s a Y x / s (V V0 ) s a Y x / s Fa
V0 s 0Yx / s V0 x 0 s a Yx / s (V V0 )
1
V0 F0 (t ) g (t ) 2
2
X V0 s 0Yx / s V0 x0 s a Yx / s F0 (t ) g (t ) 2 / 2
(43)
(44)
(45)
Como en todas las modalidades de CLA analizadas hasta el momento, el perfil de crecimiento
de la biomasa total con el tiempo es semejante al aumento del volumen en el reactor (en el
CLA-AC el volumen aumenta linealmente con el tiempo al igual que la biomasa; en el CLAAExp el volumen aumenta en forma exponencial al igual que la biomasa).
1.5.3. CASO PARTICULAR EN EL QUE LA CONCENTRACION CELULAR PERMANECE
CONSTANTE.
En este tipo de CLA tambin se puede presentar el "estado cuasiestacionario", en el cual la
concentracin celular permanece constante. Ya se ha demostrado que para cuando x = cte, o
dx/dt = 0 la ecuacin 1 da:
= Fa/V= D
(46)
Por otro lado, al derivar con respecto al tiempo la ecuacin 46, igualarla a cero y considerando
la ecuacin 3 se obtiene:
sa s0
x0
Yx / s
(47)
Esta ecuacin marca la condicin necesaria para obtener el caso particular que nos atae. Por
otro lado, al sustituir la ecuacin anterior en la 44 se puede conocer la concentracin celular
que se mantendr en el reactor:
x x0 s 0Yx / s
(48)
Con base en estas ecuaciones se pueden establecer las restantes que son:
s Ks
Fa
maxV Fa
(49)
2
X ( x0 s0 Yx / s ) V0 F0 ( t t0 ) g ( t t0 ) / 2
(50)
Todas las ecuaciones anteriormente desarrolladas corresponden a aquellos casos en los que
existe variacin del volumen en el reactor por accin de la alimentacin de una corriente
lquida que contiene al sustrato y/o nutrientes en forma diluida. Si se considera que el volumen
de agua que se evapora del caldo de cultivo a lo largo de la fermentacin es equiparable a la
que se produce debida al metabolismo, se puede considerar que la variacin del volumen en
el reactor solo es en funcin del flujo de alimentacin (como se expresa en la ecuacin 3). No
obstante, en aquellos casos en los que la variacin del volumen del medio en el reactor afecte
alguna caracterstica del proceso (patrn de mezclado, consumo de potencia, formacin de
espuma, velocidad de transferencia de oxgeno, etc.), es deseable que el volumen
permanezca constante. Para lograr que en un CLA el volumen en el interior del reactor no se
incremente significativamente (V = cte.), los nutrientes debern alimentarse en forma
concentrada o slida (cuando se usa alcohol como fuente de carbono, se puede alimentar en
forma concentrada - alcohol del 96 - o cuando se usa un material lignocelulsico se puede
alimentar en forma slida), no obstante, esta modalidad de cultivo encuentra muy poca
aplicacin por las siguientes razones:
*
Al alimentar exclusivamente sustrato, las relaciones "C/N", "C/S", "C/P", etc., se pueden
alterar de manera tal que tengan un efecto negativo sobre los rendimientos y
concentraciones de producto de la fermentacin o que se desven las rutas metablicas
hacia la generacin de subproductos indeseables.
Por las razones anteriores, los CLA en los que la alimentacin del sustrato se realiza en forma
slida, no se desarrollaron en esta seccin. De igual manera debe mencionarse que no se
desarrollaron aquellos modelos de crecimiento microbiano diferentes al de Monod tales como
el de Contois, Konak, con limitacin del crecimiento por exceso de sustrato o producto, con
doble limitacin, con limitacin por transferencia de oxgeno y/ calor, etc. En la literatura ya se
encuentran disponibles softwares que simulan estos procesos de fermentacin9,10 a los
cuales se remite al lector.
10
1.6. BIBLIOGRAFIA.
1. Dunn, I. J., and J. R. Mor. 1975. Variable-Volume Continuous Cultivation. Biotech.
Bioeng. 17:1805-1822.
2. Eduards, V. H. 1970. Extended Culture: The Growth of Candida utilis at Controlled
Acetate Concentrations. Biotech. Bioeng. 15:975-999.
3. Gentina, J. C. 1981. Cultivo por Lote Alimentado. Curso "Biofuels Productions from
Sugar Cane and Agroindustrial Wastes". (PROIMI). San Miguel de Tucumn, Repblica
Argentina.
4. Jones, R., and R. Anthony. 1977. The Relantionship between Nutrient Feed Rate and
Specific Growth Rate in Fed-batch Cultures. Eur. J. Appl. Microbiol. 4:87.
5. Lim, H. et. al. 1977. An Analysis of Extendend and Exponentially Fed-batch Cultures.
Biotech. Bioeng. 19:425.
6. Whitaker, A. 1980. Fed-batch Culture. Process Biochem. (May): 10-15 and 32.
7. Yaman, T., and S. Hirano. 1977. Semi-batch Culture of Microorganisms with Constant
Feed of Substrate: An Experimental Study. J. Ferment. Technol. 55:380.
8. Yoshida, F., T. Yaman., and K. Nakamoto. 1973. Fed-batch Hidrocarbon Fermentation
with Colloidal Emulsion Feed. Biotech. Bioeng. 15:257-270.
9. Salgado, M. Edgar. 1994. Simulacin de Fermentaciones y de Biorreactores Tipo
Tanque Agitado. Informe Final del Proyecto Profesional de Licenciatura. UPIBI-IPN.
Mxico D. F.
10. Dunn, Y. J., E. Heinzle, J. Ingham and J. E. Prenosil. 1992. Biological Reaction
Engineering; Principles, Applications and Modeling with PC Simulation. VCH. Weinheim.
New-York. Basel. Cambridge.
11
1.7. NOMENCLATURA.
D = Velocidad de dilucin del cultivo [=] t-1.
DN = Demanda de nutrientes [=] M t-1.
Fa = Flujo volumtrico de alimentacin del medio fresco [=] L3 t-1.
F0 = Flujo volumtrico inicial de alimentacin del medio fresco [=] L3 t-1.
g = Aceleracin del flujo volumtrico de alimentacin [=] L3 t-2.
Ks = Constante de afinidad del microorganismo por el sustrato [=] [=] M L-3.
ON = Oferta de nutrientes [=] M t-1.
S = Masa del sustrato [=] M.
s = Concentracin del sustrato en el mosto de fermentacin [=] M L-3.
sa = Concentracin del sustrato en la alimentacin [=] M L-3.
t = Tiempo de fermentacin [=] t.
V = Volumen del mosto de fermentacin [=] L3.
X = Masa celular [=] M.
x = Concentracin celular [=] M L-3.
Yx/s = Rendimiento celular con base en el sustrato [=] Mcel/Msust.
GRIEGAS
= Velocidad especfica de crecimiento [=] t-1.
max = Velocidad especfica de crecimiento mxima [=] t-1.
SUBINDICE
0 = Denota condiciones iniciales de un CLA.
12