BRUNA FONTANA THOMAZINI

AVALIAO DO LEO DE SACHA KIRUMA (Plukenetia volubilis L.) NO

DUODENO E FGADO DE CAMUNDONGOS C57BL/6 E APO E-/-.

Dissertao apresentada
Universidade Federal de Viosa,
como parte das exigncias do
Programa de Ps-Graduao em
Biologia Celular e Estrutural, para
obteno do ttulo de Magister
Scientiae.

VIOSA
MINAS GERAIS BRASIL
2011

iii

BRUNA FONTANA THOMAZINI

AVALIAO DO LEO DE SACHA KIRUMA (Plukenetia volubilis L.) NO

DUODENO E FGADO DE CAMUNDONGOS C57BL/6 E APO E-/-.

Dissertao apresentada
Universidade Federal de Viosa,
como parte das exigncias do
Programa de Ps-Graduao em
Biologia Celular e Estrutural, para
obteno do ttulo de Magister
Scientiae.

APROVADA: 16 de setembro de 2011.

______________________________
Maria do Carmo Gouveia Peluzio

______________________________
Sirlene Souza Rodrigues Sartori

___________________________________
Izabel Regina dos Santos Costa Maldonado
(Orientadora)

Aos meus pais e ao meu irmo.

Amo Vocs!

ii

 E voltou, ento, raposa:

Adeus... disse ele.
Adeus disse a raposa. Eis o meu segredo. muito simples: s se v bem com o
corao. O essencial invisvel aos olhos.
O essencial invisvel aos olhos repetiu o principezinho, para no se esquecer.
Foi o tempo que perdeste com a tua rosa que a fez to importante.
Foi o tempo que perdi com a minha rosa... repetiu ele, para no se esquecer.
Os homens esqueceram essa verdade disse ainda a raposa. Mas tu no a deves
esquecer. Tu te tornas eternamente responsvel por aquilo que cativas. Tu s
responsvel pela tua rosa...
Eu sou responsvel pela minha rosa... repetiu o principezinho, para no se
esquecer.
Da obra O Pequeno Prncipe, de Antoine de Saint- Exupry.

iii

AGRADECIMENTOS
Dai graas ao Senhor porque ele bom, eterna sua misericrdia (Sal 117, 29).
Aos meus pais, Aldejair e Creuza, e ao meu irmo, Willian, por fazerem tudo possvel.
Pelo apoio incondicional e pela torcida sem fim. Amo vocs!
A minha famlia que, mesmo com a distncia estiveram sempre torcendo. Grata pelas
oraes e pelo incentivo.
A Universidade Federal de Viosa pela oportunidade.
A CAPES pela concesso da bolsa de estudos do Programa REUNI.
A Prof Izabel Regina dos Santos Costa Maldonado pelo exemplo de profissionalismo,
pela orientao e confiana depositada em mim.
A Prof Maria do Carmo Gouveia Peluzio (DNS/UFV) pelo profissionalismo,
contribuio e por ceder gentilmente os animais utilizados neste estudo e o laboratrio
para as anlises.
Ao Prof Eduardo Euclydes de Lima e Borges (DEF/UFV) pela colaborao e por
disponibilizar toda a estrutura para a extrao do leo.
A Prof Luzimar Campos da Silva (DBV/UFV) por disponibilizar o uso do
fotomicroscpio.
A Prof Ana Vldia Bandeira Moreira (DNS/UFV) por disponibilizar o uso do
cromatgrafo gasoso e pela valiosa ajuda nas anlises.
Ao Prof. Clvis Andrade Neves, chefe do Departamento de Biologia Geral, que me deu
grande apoio no incio da realizao deste trabalho, e que agora na etapa final aceitou o
convite para ser membro suplente na banca examinadora deste trabalho. Grata pela
disponibilidade e ajuda em todo momento em que foi procurado.
As professoras Maria do Carmo Gouveia Peluzio e Sirlene Souza Rodrigues Sartori por
aceitarem fazer parte da banca examinadora deste trabalho.
Ao professor Srgio Luis Pinto da Matta (Super Srgio!) por aceitar fazer parte da banca
examinadora deste trabalho como professor suplente. Grata ainda pelo incentivo,
recepo e ajuda ao longo de todos estes anos.
Aos professores do curso de Ps-Graduao em Biologia Celular e Estrutural pelo
exemplo de profissionalismo, pela disponibilidade em ajudar e pelo aprendizado ao
longo do curso.
Aos Departamentos de Biologia Geral, Engenharia Florestal, Nutrio e Sade por
cederem o espao e materiais necessrios para o desenvolvimento do trabalho.
Aos camundongos.

iv

Aos amigos Cynthia, Eduardo, Kyvia, Marli, Suellen e Vitor, e as professoras Izabel e
Maria do Carmo pela ajuda no dia do sacrifcio.
Ao Alex de Freitas Bhering Cardoso, tcnico do Laboratrio de Biologia Estrutural e
Histofisiologia Reprodutiva e Digestiva. Grata por toda a ajuda e pela pacincia!
A Elizabeth Alves Pena, a Beth, secretria do curso de Ps-Graduao em Biologia
Celular e Estrutural. Grata por toda a ajuda e pacincia e por no nos deixar ficar
perdidos em meio a tantas datas importantes e prazos.
Ao Eduardo Frana Castro pela parceria e companhia. Pelas caronas e pela ajuda ao
longo dos ltimos 12 meses.
Ao Jos Mauro Ferreira (DEF/UFV), tcnico do Laboratrio de Sementes, pelas
sugestes e auxlio na extrao do leo.
Ao Sr. Toninho, tcnico do Laboratrio de Bioqumica Nutricional por toda a ajuda e
disponibilidade.
Ao aluno de iniciao cientfica Vtor Maurcio pela ajuda na manuteno dos animais.
A aluna de iniciao cientfica Camila pela ajuda com as anlises no cromatgrafo
gasoso.
As mestres Cynthia e Natlia pela ajuda na extrao dos lipdeos e a Damiana, sempre
disponvel para esclarecer as dvidas.
A Suellen pela ajuda nas anlises histomorfomtricas.
A Daiane pelos inmeros momentos em que me socorreu no laboratrio!
Aos amigos do Laboratrio de Biologia Estrutural e Histofisiologia Reprodutiva e
Digestiva, pelos momentos de distrao, trabalho, sufoco e ajuda!
Aos amigos do curso de Ps-Graduao em Biologia Celular e Estrutural, grata pela
companhia e pelos bons momentos.
As amigas Daiane, Marli e Suellen! Obrigada por tudo!
As companheiras de repblica, Carla, Nathalia e Renata, por contribuir para que Viosa
se tornasse um segundo lar.
Aos Biodesagradveis! Por todos os momentos maravilhosos e divertidos ao longo
destes anos em Viosa.
Aos amigos que Viosa me permitiu conhecer.
As amigas Izabela e Renata pelo incentivo, pelas risadas, pela companhia, torcida e
presena.
A todos que direta ou indiretamente participaram para que tudo fosse possvel. O meu
sincero... Muito Obrigada!
v

BIOGRAFIA

Bruna Fontana Thomazini, filha de Aldejair Jos Thomazini e Creuza Maria

Fontana Thomazini, nasceu em Cachoeiro de Itapemirim, Esprito Santo, em 22 de
setembro de 1987. Em maro de 2005 iniciou o curso de Cincias Biolgicas na
Universidade Federal de Viosa, graduando-se como Bacharela e Licenciada em julho
de 2009. Durante a graduao foi monitora nas disciplinas de Citologia, Histologia e
Embriologia e estagiria do Laboratrio de Biologia Estrutural e Histofisiologia
Reprodutiva e Digestiva. Em agosto de 2009 iniciou o curso de Mestrado em Biologia
Celular e Estrutural pela Universidade Federal de Viosa, apresentando a dissertao em
16 de setembro de 2011.

vi

SUMRIO
LISTA DE ABREVIATURAS____________________________________________x
LISTA DE FIGURAS__________________________________________________xi
LISTA DE TABELAS _________________________________________________xii
RESUMO___________________________________________________________xiii
ABSTRACT_________________________________________________________xiv
Introduo ___________________________________________________________ 1
Referencial terico ____________________________________________________ 3
1.

2.

Plukenetia volubilis Linneo ___________________________________________ 3

1.1.

Caractersticas Botnicas _________________________________________ 3

1.2.

Composio qumica das sementes e do leo de sacha kiruma ____________ 4

Mtodos de extrao de leos vegetais __________________________________ 5

2.1.

Extrao por prensagem a frio _____________________________________ 5

2.2.

Hidrodestilao _________________________________________________ 6

2.3.

Extrao supercrtica ____________________________________________ 6

2.4.

Extrao com solvente orgnico ____________________________________ 6

3.

As lipoprotenas ____________________________________________________ 7

4.

Os cidos graxos poliinsaturados: metabolismo e importncia ________________ 8

5.

O modelo animal __________________________________________________ 11

6.

O intestino delgado ________________________________________________ 12

7.

6.1.

O epitlio do intestino delgado ____________________________________ 13

6.2.

Duodeno: caracterizao e absoro de lipdeos ______________________ 15

Fgado: estrutura e funo ___________________________________________ 17

7.1.

Hepatcitos e o metabolismo dos lipdeos ___________________________ 18

Objetivos ___________________________________________________________ 20
1.

Objetivos gerais ___________________________________________________ 20

2.

Objetivos especficos _______________________________________________ 20

Metodologia _________________________________________________________ 21
1.

2.

Obteno do leo __________________________________________________ 21

1.1.

Sementes _____________________________________________________ 21

1.2.

Moagem das sementes __________________________________________ 21

1.3.

Extrao do leo de sacha kiruma _________________________________ 21

Eficincia do processo de extrao ____________________________________ 22

vii

3.

Obteno dos steres de cidos graxos do leo de sacha kiruma _____________ 22

3.1. Avaliao do perfil lipdico do leo de sacha kiruma utilizando a
cromatografia gasosa _________________________________________________ 22

4.

Ensaio biolgico __________________________________________________ 23

4.1.

Origem e manuteno dos animais _________________________________ 23

4.2.

Dieta com o leo de sacha kiruma _________________________________ 24

4.3.

Desenvolvimento dos animais ____________________________________ 25

4.4.

Eutansia ____________________________________________________ 25

5.

Avaliao dos efeitos do tratamento no duodeno _________________________ 25

5.1.

Obteno dos fragmentos do duodeno ______________________________ 25

5.2.

Microtomia, Colorao e Histoqumica _____________________________ 26

5.3.

Captura de imagens ____________________________________________ 26

5.4.

Anlise histomorfomtrica _______________________________________ 27

6.

Avaliaes dos efeitos do tratamento no fgado __________________________ 28

6.1.

Obteno dos fragmentos de fgado ________________________________ 28

6.2. Microtomia e Colorao ___________________________________________ 28

6.3. Captura de imagens ______________________________________________ 28
6.4. Anlise histomorfomtrica _________________________________________ 29
7.

Anlise Estatstica _________________________________________________ 29

8.

Interpretao dos resultados__________________________________________ 29

Resultados __________________________________________________________ 30
Extrao e avaliao do leo das sementes de sacha kiruma ____________________ 30
1.

Rendimento da extrao de leo ______________________________________ 30

2.

Perfil de cidos graxos do leo de sacha kiruma __________________________ 30

3.

Relao de cidos graxos poliinsaturados/saturados no leo ________________ 32

Ensaio Biolgico ______________________________________________________ 33

1.

Consumo alimentar ________________________________________________ 33

2.

Evoluo ponderal _________________________________________________ 34

3.

Variao da massa corporal, consumo alimentar e ndice hepatossomtico _____ 34

Avaliao histomorfomtrica do duodeno __________________________________ 36

1.

Morfologia do duodeno ___________________________________________ 36

2.

Morfometria dos vilos ____________________________________________ 36

3.

Superfcie de absoro ____________________________________________ 36

viii

4.

Morfometria da mucosa ___________________________________________ 37

5.

Morfometria da tnica muscular ____________________________________ 37

6.

Morfometria da cripta de Lieberkhn ________________________________ 38

7.

Linfcitos intraepiteliais e entercitos ________________________________ 38

8.

Quantificao das clulas caliciformes e clulas de Paneth por mm2 de mucosa 39

Avaliao histomorfomtrica do fgado ____________________________________ 44

1.

Morfologia do fgado _____________________________________________ 44

2.

Morfometria dos hepatcitos _______________________________________ 44

3.

Morfometria de outros componentes do fgado _________________________ 44

4.

Dimetro celular e nuclear de hepatcitos _____________________________ 45

Discusso dos resultados _______________________________________________ 48

1.

Extrao e avaliao do leo de sacha kiruma ___________________________ 48

2. Evoluo do consumo alimentar e massa corporal dos camundongos durante o

ensaio biolgico ______________________________________________________ 49
3.

Avaliao dos efeitos do tratamento no duodeno _________________________ 49

4.

Avaliao dos efeitos do tratamento no fgado ___________________________ 52

Concluses __________________________________________________________ 54
Anexos _____________________________________________________________ 55
Preparo de Solues __________________________________________________ 58
Referncias __________________________________________________________ 61

ix

LISTA DE ABREVIATURAS
AB+-Clula caliciforme marcada apenas pelo Azul de Alcian ph2,5, produtoras de
mucina cida no sulfatada ou sialomucina, caracterizada pela colorao azulada
AB+PAS+-Clula caliciforme marcada simultaneamente pelo Azul de Alcian e Reativo
de Schiff, produz e secreta ambos tipos de mucina, neutra e cida, caracterizada por
uma colorao que varia do prpura ao violeta
ACF- Grupo com 5 animais Apo-E -/-; dieta controle, fmeas
ACM- Grupo com 5 animais Apo-E -/-; dieta controle, machos
Apo-E- Apoprotena E
Apo-E -/-- Camundondo da linhagem BlackC57/6 knockout para o gene da
apolipoprotena E
ATF- Grupo com 5 animais Apo-E -/-; dieta tratada com o leo de sacha kiruma, fmeas
ATM- Grupo com 5 animais Apo-E -/-; dieta tratada com o leo de sacha kiruma,
machos
BCF- Grupo com 5 animais BlackC57/6 selvagem; dieta controle, fmeas
BCM- Grupo com 5 animais BlackC57/6 selvagem; dieta controle, machos
BlackC57/6- Camundongo da linhagem BlackC57/6 normal
BTF- Grupo com 5 animais BlackC57/6 selvagem; dieta tratada com o leo de sacha
kiruma, fmeas
BTM- Grupo com 5 animais BlackC57/6 selvagem; dieta tratada com o leo de sacha
kiruma,, machos
HDL- Lipoprotenas de densidade alta
IDL- Lipoprotenas de densidade intermediria
LDL- Lipoprotenas de densidade baixa
PAS+-Clula caliciforme marcada apenas pelo Reativo de Schiff, produtoras de mucina
neutra, caracterizada pela colorao azulada
QM- Quilomcrons
VLDL- Lipoprotenas de densidade muito baixa
-3- mega trs, famlia de cidos graxos essenciais
-6- mega seis, famlia de cidos graxos essenciais
-9- mega nove, famlia de cidos graxos

LISTA DE FIGURAS
Figura 1: Planta de sacha kiruma com frutos imaturos e maduros - (Janeiro de 2010). ... 4
Figura 2: Semente de sacha kiruma - (Setembro de 2011). .............................................. 4
Figura 3: Atuao da Apo-E. Adaptado de Pendse et al. (2009). ..................................... 8
Figura 4: Estrutura qumica dos principais cidos graxos da famlia -3 (MOREIRA,
2006). ................................................................................................................................ 9
Figura 5: Metabolismo dos cidos graxos das famlias -3 (n-3) e -6 (n-6) (Adaptado
de PERINI et al., 2010). .................................................................................................. 10
Figura 6: Desenho esquemtico da organizao da parede do tudo digestivo (Adaptado
de GARTNER & HIATT, 2002). .................................................................................... 12
Figura 7: Diagrama esquemtico da mucosa, vilos, criptas de Lieberkhn, e
componentes celulares do intestino delgado de humanos (Adaptado de GARTNER &
HIATT, 2002). ................................................................................................................ 15
Figura 8: Diagrama esquemtico da cripta de Lieberkhn (a), do pice do vilo (b) e dos
componentes celulares do intestino delgado de humanos (Adaptado de JUNQUEIRA &
CARNEIRO, 2008). ........................................................................................................ 15
Figura 9: Absoro de lipdeos no intestino delgado (Adaptado de GARTNER &
HIATT, 2002). ................................................................................................................ 17
Figura 10: Desenho esquemtico do fgado.(Adaptado de GARTNER & HIATT, 2002).
......................................................................................................................................... 18
Figura 11: Consumo alimentar dos grupos tratados, controles e consumo geral ao longo
do tratamento. .................................................................................................................. 33
Figura 12: Evoluo ponderal dos camundongos ao longo das quinzenas (Q). ............. 34
Figura 13: Seco transversal do duodeno com destaque para o vilo, cripta, mucosa e
tnica muscular Azul de Toluidina Borato de Sdio 1%.. ............................................. 40
Figura 14: Seco transversal do duodeno. Tcnica combinada de Azul de Alcian e
PAS. ................................................................................................................................ 41
Figura 15: Seces transversais do duodeno representando os oito tratamentos. Azul de
Toluidina Borato de Sdio 1%. Barra: 100m. .............................................................. 42
Figura 16: Seces transversais do duodeno representando os oito tratamentos. Tcnica
combinada de Azul de Alcian e PAS. Barra: 50m. ....................................................... 43
Figura 17: Seco transversal do fgado. Hematoxilina- Eosina. Barra: 50m. ............. 46
Figura 18: Seces do fgado representando os oito tratamentos. Hematoxilina- Eosina.
Barra: 50m. ................................................................................................................... 47
xi

LISTA DE TABELAS
Tabela 1: Composio em cidos graxos do leo de sacha kiruma extrado com hexano,
segundo Hamaker et al. (1992) ......................................................................................... 5
Tabela 2: Caracterizao dos grupos experimentais. ...................................................... 24
Tabela 3: Formulao das dietas controle e experimental. Em acordo com
determinaes AIN-93G formulada para roedores em fase de crescimento, gestao e
lactao. ........................................................................................................................... 25
Tabela 4: Combinao de grupos utilizada para a interpretao dos resultados. ............ 29
Tabela 5: Rendimento das seis baterias de extrao do leo de sacha kiruma. .............. 30
Tabela 6: cidos graxos (% de rea) do leo extrado das sementes de sacha kiruma. . 31
Tabela 7: Principais cidos graxos encontrados no leo de sacha kiruma e a relao
poliinsaturados/saturados. ............................................................................................... 32
Tabela 8: Dados de massa corporal, consumo alimentar e ndice hepatossomtico. ...... 35
Tabela 9: Dados da morfometria dos vilos do duodeno. ................................................. 36
Tabela 10: Morfometria da superfcie de absoro do duodeno. .................................... 37
Tabela 11: Morfometria da mucosa do duodeno............................................................. 37
Tabela 12: Morfometria das camadas musculares do duodeno. ..................................... 38
Tabela 13: Morfometria da cripta de Lieberkhn no duodeno. ...................................... 38
Tabela 14: Frequncia de entercitos e linfcitos intraepiteliais no duodeno. ............... 39
Tabela 15: Tipos celulares secretores e clula de Paneth por mm de mucosa no
duodeno. .......................................................................................................................... 39
Tabela 16: Quantificao dos componentes celulares no fgado. ................................... 44
Tabela 17: Freqncia dos componentes intercelulares no fgado.................................. 45
Tabela 18: Dimetros nuclear e celular dos hepatcitos. ................................................ 45

xii

RESUMO
THOMAZINI, Bruna Fontana, M.Sc., Universidade Federal de Viosa, Setembro de
2011. Avaliao do leo de sacha kiruma (Plukenetia volubilis L.) no duodeno e
fgado de camundongos C57BL/6 e APO E-/-. Orientadora: Izabel Regina dos Santos
Costa Maldonado.
Sacha kiruma (Plukenetia volubilis L.) uma planta oleaginosa nativa da Amaznia
Peruana. O leo extrado de suas sementes muito rico em cidos graxos
poliinsaturados, diretamente relacionados preveno de doenas cardiovasculares,
dentre elas, a aterosclerose. Para seu transporte, os lipdeos formam complexos com
protenas, as apoprotenas. A apoprotena E (Apo-E) sintetizada principalmente no
fgado e no intestino e se relaciona com a absoro celular de quilomcrons ricos em
triglicerdeos remanescentes e VLDL. A produo de animais knockout para o gene da
apoprotena E apresenta como principal caracterstica o rpido e espontneo
aparecimento de leses aterosclerticas nas artrias, similares quelas encontradas em
humanos. O intestino delgado o stio de absoro de componentes da dieta, dentre eles
os lipdeos, enquanto o fgado apresenta-se como o stio de modificao e/ou
armazenamento de compostos. Os objetivos foram extrair o leo de sementes de sacha
kiruma por meio de mtodo qumico (hexano), determinar o perfil de cidos graxos e
avaliar os efeitos desse leo na estrutura do duodeno e fgado de camundongos Apo-E /- e selvagens BlackC56/7. Os resultados da avaliao do leo extrado para este estudo
indica percentual de cidos graxos similar ao citado na literatura. Entre os tratamentos
no foram encontradas alteraes no duodeno com relao superfcie de absoro,
morfometria de cripta e espessura das camadas musculares e da mucosa. Com relao
altura do epitlio absortivo, os animais knockout do grupo controle apresentaram maior
mdia se comparados com os grupos knockout tratados com o leo. A freqncia de
entercitos, linfcitos, clulas caliciformes e clulas de Paneth no sofreram alteraes
devido ao tratamento proposto. Em relao s clulas caliciformes AB+PAS+, foi
observada maior freqncia nos grupos selvagens tratados com leo de sacha kiruma em
relao aos controles. No fgado tambm no foram encontradas diferenas devido ao
tratamento na frequncia dos componentes hepticos, nem na relao de dimetro do
citoplasma/ dimetro do ncleo dos hepatcitos. Com isso, concluiu-se que o mtodo de
extrao com hexano mostrou ser eficiente na extrao de leo das sementes de sacha
kiruma. Este leo apresentou composio lipdica similar daquela descrita na literatura,
mantendo suas propriedades teraputicas. O ensaio no mostrou indcios de que a dieta
com o leo de sacha kiruma possa ter alterado a estrutura histolgica no duodeno ou
fgado dos camundongos.

xiii

ABSTRACT
THOMAZINI, Bruna Fontana, M.Sc., Universidade Federal de Viosa. September,
2011. Evaluation of the effects of sacha kiruma oil (Plukenetia volubilis L.) in the
duodenum and liver in C57BL/6 and APO E -/- mice. Advisor: Izabel Regina dos
Santos Costa Maldonado.
Sacha kiruma (Plukenetia volubilis L.) is an oleaginous native plant of the Peruvian
Amazon. The oil extracted from its seeds is very rich in polyunsaturated fatty acids,
directly related to the prevention of cardiovascular diseases, among them, the
atherosclerosis. For transportation, lipids form complexes with proteins, the
apoproteins. The apoprotein E (Apo E) is mainly synthesized in the liver and intestine
and is related to the cellular uptake of triglyceride-rich chylomicrons and VLDL
remmants. The production of knockout animals for the apoprotein E gene presents as
main characteristic the rapid and spontaneous development of atherosclerosis lesions in
the arteries, similar to those found in humans. The small intestine is the site of
absorption of dietary components, including lipids, whiles the liver is the site of
modification and/or storage of compounds. The objectives were extract sacha kiruma
seedss oil by chemical method (hexane) and determine the acid profile. Also evaluate
the histological structure of the duodenum and the liver of Apo E-/- mice and wild
BlackC57/6 after the treatment with this oil. The evaluation of the oil extracted in this
study indicates the percentage of polyunsaturated fatty acids similar to that found in the
literature. There were no histological changes due the treatment in the duodenum, with
regard to the surface absorption, morphology of the crypt and the thickness of muscle
layers and mucosa. With respect to the height of the absorptive epithelium, the control
animals have high average compared with animals treated with the oil. The frequency of
enterocytes, lymphocytes, goblet cells and Paneth cells did not change due to the
proposal treatment. In relation to the goblet cell AB+PAS+ was observed more
frequently in the groups of BlackC57/6 mice treated with the sacha kirumas oil
compared to control groups. In the liver were not found differences due to the treatment
in the frequency of liver components or the ratio cytoplasm/ nucleus of the liver cells.
The solvent extraction method was efficient in extracting oil from sacha kirumas seeds.
The oil showed similar lipid composition from the described in the literature. The test
showed no evidence that the diet with sacha kiruma oil may have altered the histological
structure of the duodenum and liver of mice Apo E -/- or wild BlackC57/6.

xiv

Introduo
Sacha kiruma (Plukenetia volubilis Linneo), uma planta nativa do Peru, que foi
descrita em 1753 pelo naturalista Linneo. A espcie tambm ocorre no norte do Brasil e
em outros pases que formam o complexo amaznico, sendo conhecida por vrias
denominaes, dentre elas, sacha inchi, mani do inca, amendoim selvagem, amndoalopo, amendoim inca, amendoim da montanha e amui (CIED, 2007; GUILLN et al.,
2003; HUAMAN & FLORES, 2009). De acordo com Huaman & Flores (2009) o leo
extrado das sementes de sacha kiruma tem elevada concentrao de cidos graxos
poliinsaturados: 48,60% de cido -linolnico (-3, mega 3); 36,80% de cido linolico (-6, mega 6) e 8,28% de cido olico (-9, mega 9). O leo tambm
contm cidos graxos saturados, dentre eles cido palmtico (3,85%) e cido esterico
(3,85%) (HUAMAN & FLORES, 2009).
Os cidos graxos da famlia -3 so conhecidos por vrios benefcios sade,
dentre eles a reduo de triglicerdeo e colesterol srico, efeitos antiinflamatrios e
retardo do crescimento de tumores (TSUKUI et al., 2009; ZHANG et al., 2010). Em
estudo realizado com humanos verificou-se que o consumo do leo de sacha kiruma
reduz a trigliceridemia posprandial (HUAMN et al., 2008). Os mecanismos de ao
dos cidos graxos poliinsaturados para diminuir a quantidade de lipdeos plasmticos
so mltiplos: reduo da sntese de triglicerdeos e da secreo de VLDL, aumento da
-oxidao dos cidos graxos no fgado, aumento da depurao dos quilomcrons e
triglicerdeos por incremento da atividade da lipase lipoprotica (HUAMN et al.,
2008). Por outro lado, os cidos graxos -6, principalmente os cidos graxos linolico e
araquidnico, possuem efeitos proinflamatrios. A concentrao equilibrada destes
cidos graxos possui efeito crucial no processo inflamatrio (ZHANG, 2010). A relao
desejada desses cidos graxos na dieta de 4:1 de -6 em relao a -3 (PEREIRA,
2009; SOUZA & VISENTAINER, 2006). Os cidos graxos so constitudos por cadeias
hidrocarbonadas cidas de comprimento entre quatro e 36 carbonos (C4 a C36), sendo
que os mais frequentes na natureza contm nmeros pares de tomos de carbono, de 12
a 24, em cadeias no ramificadas. (GAZZINELLI et al., 2010).
Por serem insolveis em meio aquoso, os lipdeos formam complexos com
protenas, as apoprotenas, as quais possibilitam seu transporte. A apoprotena E (ApoE) foi inicialmente identificada como um componente das partculas de lipoprotena rica
em triglicerdeos. Apo-E conhecida por facilitar a remoo de partculas
remanescentes hepticas de quilomcrons ricos em colesterol, e tambm agindo como
ligante de algumas partculas de lipoprotenas para o receptor de LDL. Embora o fgado
apresenta-se como o maior local de sntese de Apo-E, uma grande variedade de tecidos
perifricos tambm expressam essa protena. Tecidos esteroidognicos, em particular,
expressam altos nveis de Apo-E. A glndula adrenal de humanos e macacos, por
exemplo, sintetizam Apo-E numa taxa similar ou mesmo maior do que o fgado
(PRACK, 1991).
O camundongo knockout para o gene da apoprotena E (Apo-E -/-) um dos
modelos mais utilizados na pesquisa para o estudo do desenvolvimento espontneo de
leses aterosclerticas (ZADELAAR et al., 2007). A aterosclerose uma doena
multifatorial que pode ser modulada com a dieta e com a condio de
1

estresse/antioxidante na clula (WANG et al., 2004). uma doena do sistema

cardiovascular que causa o estreitamento das artrias ou sua completa obstruo.
Trata-se de um processo complexo que envolve disfuno endotelial, depsito de
lipdios e reao inflamatria na parede vascular. A modificao da LDL por meio da
oxidao possui papel importante no desenvolvimento da aterosclerose. Os cidos
graxos poliinsaturados obtidos pela dieta so incorporados em lipoprotenas, afetando
potencialmente a susceptibilidade de oxidao da LDL, representando um efeito
preventivo contra a doena (WANG et al., 2004).
A mucosa intestinal de mamferos um dos tecidos que se renovam mais
rapidamente e a dinmica da renovao celular um ponto chave na diferenciao e
consequentemente, no nmero de clulas absortivas ou entercitos nos vilos (CARUSO
& DEMONTE, 2005; GARCA-MIRANDA, 2010). A unidade funcional bsica do
intestino a cripta-vilo. Os entercitos proliferam na cripta ou glndula intestinal e
migram em direo ao pice dos vilos onde so descartados no final da sua vida til.
Em geral, cada vilo suprido de clulas provenientes de trs criptas, embora isso varie
entre as espcies animais. Nos ratos, esse ciclo proliferativo completo de um dia e o
tempo de vida das clulas nos vilos de dois dias. Em seres humanos, o tempo de
migrao da clula at atingir o topo do vilo e ser descartada de 48-72 horas. A taxa
de reproduo das clulas na cripta e a proporo de migrao desses entercitos so
alteradas em vrios estados fisiolgicos ou patolgicos. Essas mudanas na dinmica
celular determinam nos entercitos do vilo, por exemplo, alterao na atividade
transportadora relacionada ao tempo de vida. Como outro exemplo, relatou-se que em
ratos submetidos a jejum de quatro dias, h significativo decrscimo na taxa de
reproduo das clulas da cripta. Desse modo, a absoro pode se alterar como
resultado da variao da rea de superfcie total da mucosa (CARUSO & DEMONTE,
2005).
Enquanto no intestino delgado ocorre absoro dos nutrientes, o fgado
responsvel pelos processos de desintoxicao e biotransformao. Pela sua exposio a
estas substncias, o fgado um rgo muito suscetvel a leses (ALVARADO-RICO,
2010).
Considerando que o leo de sacha kiruma tem potencial para utilizao na
indstria alimentar e farmacutica, o objetivo deste trabalho foi extrair o leo das
sementes de sacha kiruma pelo mtodo de extrao com hexano; determinar a
composio de cidos graxos nesse leo, e avaliar os efeitos desse produto na estrutura
histolgica do duodeno e do fgado de camundongos selvagens e deficientes para
apoprotena E.

Referencial terico
1.
Plukenetia volubilis Linneo
Sacha kiruma (Plukenetia volubilis Linneo) originria da Amaznia peruana,
sendo conhecida no complexo regional Amaznico do Brasil pelo nome de amndoalopo. Segundo estudos arqueolgicos, h indcios de que as civilizaes pr-inca e inca
utilizavam as sementes de sacha kiruma na alimentao (CIED, 2007). um arbusto
perene, hermafrodita, e pertencente famlia Euphorbiaceae (CIED, 2007), que rene
aproximadamente 7.500 espcies, distribudas em todo o mundo principalmente nas
regies tropicais, em altitudes entre 200 e 1500m (GUILLN et al., 2003).
Os nativos da Amaznia obtm farinha e leo das sementes de sacha kiruma,
subprodutos que so utilizados na preparao de diferentes alimentos e bebidas. No
entanto, esta planta tem sido pouco estudada, e sua importncia do ponto de vista
nutricional e funcional ainda assunto de pesquisa. Hamaker et al. (1992), em trabalho
pioneiro, determinaram a composio de suas sementes, encontrando 35-60% de
lipdeos e 27% de protenas ricas em cistena, tirosina, treonina e triptofano.
1.1. Caractersticas Botnicas
Na famlia Euphorbiaceae esto espcies importantes sob o aspecto econmico,
destacando-se a seringueira, a mamona e a mandioca (JOLY, 1976). O gnero
Plukenetia L. possui 16 espcies conhecidas (GILLESPIE, 1994), 11 de ocorrncia na
regio neotropical, quatro na frica e em Madagascar, e uma na sia (BUSSMANN et
al, 2009). Todas as espcies neotropicais do gnero so cips ou lianas, e a maioria
ocorre em floresta tropical mida. Sacha kiruma encontrada principalmente a partir
do nvel do mar at cerca de 1000 a 1500m de altitude (BUSSMANN et al., 2009).
Exemplares de sacha kiruma atingem altura mdia de dois metros e necessitam
do apoio de estacas para se desenvolver adequadamente (CIED, 2007). Os frutos so em
forma de cpsulas de 30-50 mm de dimetro, de cor verde intensa (Figura 1a), porm
quando amadurecem apresentam colorao marrom escura (Figura 1b). Os frutos
geralmente tm quatro lbulos, mas existem aqueles com cinco a sete. As sementes
(Figura 2) so de forma lenticular e se encontram dentro dos lbulos das cpsulas,
medindo de 15 a 20 mm de largura por 7 a 8 mm de espessura. O peso de cada semente
varia de 0,8 a 1,4g com 33 a 35% de casca e 65 a 67% da amndoa (CAI, 2011,
FOLLEGATTI ROMERO, 2007).
Os frutos ficam maduros quando a planta atinge a idade de sete a oito meses de
estabelecimento no campo. Aps a primeira colheita, a planta no deixa de produzir e o
intervalo entre colheitas em torno de 20 a 25 dias, por at 10 anos (CSPEDES,
2006).

Figura 1: Planta de sacha kiruma com frutos imaturos (a) e maduros (b) - (Janeiro de 2010).

Figura 2: Semente de sacha kiruma - (Setembro de 2011).

1.2.

Composio qumica das sementes e do leo de sacha kiruma

O perfil de aminocidos e cidos graxos das sementes de sacha kiruma foi determinado
por Hamaker et al. (1992). O contedo protico das sementes foi aproximadamente o mesmo
encontrado em outras oleaginosas da regio dos Andes e o contedo protico da farinha livre de
lipdeos foi aproximadamente 53%. O perfil de aminocidos foi comparado com o de outras
oleaginosas. Os autores encontraram nveis de leucina e lisina menores em relao protena de
soja, enquanto foi igual ou superior aos nveis de sementes de amendoim, algodo e girassol.

Considerando o contedo sulfrico (metionina + cistena), a quantidade de tirosina,

treonina e triptofano, Hamaker et al. (1992) perceberam que estes aminocidos estavam
presentes em maior quantidade nas sementes de sacha kiruma, enquanto que o contedo
de fenilalanina foi relativamente menor. Comparado com as doses destes aminocidos
recomendadas pela FAO/WHO/UNU (Joint FAO/WHO/UNU Expert Consultation
1985, apud Hamaker et al. 1992) para crianas com idade entre dois e cinco anos, o
contedo protico de sacha kiruma, se completamente digerido, seria deficiente apenas
em leucina e lisina (HAMAKER et al., 1992).
Hamaker et al. (1992) tambm analisaram a composio do leo de sementes de sacha
kiruma, extrado com hexano, revelando um total de cidos graxos insaturados equivalente a
4

91,6%, dos quais o cido linolnico representa 45,2% seguido do cido linolico com 36,80%
(Tabela 1).

Tabela 1: Composio em cidos graxos do leo de sacha kiruma extrado com hexano,
segundo Hamaker et al. (1992)
cidos graxos
Saturados
Palmtico (C16:0)
Esterico (C18:0)
Insaturados
Olico (C18:1)
Linolico (C18:2)
Linolnico (C18:3)
Resumo
Saturados
Monoinsaturados
Poliinsaturados

Porcentagem (%)
4,5
3,2
9,6
36,8
45,2
7,7
9,6
82,0

Hamaker et al. (1992) comparando sacha kiruma com soja, amendoim, algodo
e girassol, mostraram que as sementes de sacha kiruma possuem maior teor lipdico na
semente (HAMAKER et al., 1992). Guilln et al. (2003) compararam o leo de sacha
kiruma com o de linhaa e verificaram que o leo de linhaa possui mais olico
(monoinsaturado) enquanto o leo de sacha kiruma
possui mais linolico
(diinsaturado).
O leo de sacha kiruma, por apresentar alta concentrao de poliinsaturados,
poderia ser bastante instvel oxidao, produzindo sabores e odores desagradveis.
Entretanto, estudos preliminares no Peru mostraram que o leo de sacha kiruma no
refinado parece ser relativamente estvel (HAMAKER et al., 1992). Os resultados
obtidos por Follegatti Romero (2007) mostraram um elevado teor de tocoferis, o que
possibilita a estabilizao deste leo.
2.
Mtodos de extrao de leos vegetais
Os mtodos de extrao empregados no passado eram bem simplificados e os
produtos obtidos a partir destes nem sempre eram leos 100% puros. As caractersticas
de um leo podem mudar conforme o mtodo empregado, tendo em vista que as suas
propriedades qumicas podero ser totalmente alteradas a depender das condies a qual
ele submetido quando determinada tcnica utilizada (PEREIRA, 2009).
2.1. Extrao por prensagem a frio
A prensagem um mtodo comumente empregado para obteno dos leos
vegetais. So prensas de alta presso e bastantes flexveis para operar com diferentes
tipos de oleaginosas. Um aspecto negativo deste processo que pode restar um residual
de leo na torta. Existe tambm o processo denominado misto que se refere
combinao do sistema de prensagem com o sistema de extrao por solvente. Esse
5

processo pode ser utilizado em larga escala e tambm ser adaptado para vrios tipos de
oleaginosas (PEREIRA, 2009).
2.2. Hidrodestilao
A destilao um processo de separao de misturas lquidas baseado na
diferena de composies dos constituintes na fase lquida e vapor em equilbrio, devido
diferena de volatilidade entre os componentes do lquido. Existem trs formas de se
expressar a hidrodestilao: destilao com gua, destilao a vapor e destilao com
vapor direto (PEREIRA, 2009).
Neste mtodo, o material vegetal imerso em gua sob aquecimento at a
fervura, resultando na formao de vapores que arrastam os compostos volteis, os
quais, aps condensao, separam-se da fase aquosa por decantao. A composio dos
leos essenciais pode ser influenciada pelo contato com a gua, tempo de extrao e
velocidade de aquecimento do equipamento (PRINS et al., 2006).
2.3. Extrao supercrtica
A extrao com fluido supercrtico uma tcnica que explora o poder de
solvncia de fluidos geralmente a temperaturas e presses prximas ao seu ponto
crtico. particularmente efetiva no isolamento de substncias de massa molar mdia e
polaridade relativamente baixa (FOLLEGATTI ROMERO, 2007).
Neste processo so empregados solventes acima de seus pontos crticos para
extrarem componentes solveis de uma mistura. Pode ser definida como a
solubilizao de determinados compostos de uma matriz slida ou lquida em um
solvente em condies supercrticas. Uma vantagem da extrao com fluido supercrtico
a possibilidade de fcil recuperao do solvente supercrtico aps o processo de
extrao, apenas pelo ajuste da presso e/ou temperatura, podendo o mesmo ser
continuamente reciclado. Isto elimina uma das etapas mais dispendiosas dos processos
de extrao convencionais que a separao do produto extrado do solvente orgnico
(PEREIRA, 2009).
2.4. Extrao com solvente orgnico
A extrao por solvente orgnico uma operao unitria simples e foi aplicada
pela primeira vez em 1835 por Robiquet para extrao de compostos de flores (HUI &
JOHN, 2007; PEREIRA, 2009). Os componentes contidos em uma matriz slida so
extrados dissolvendo-os em um solvente lquido. Este processo conhecido como
lixiviao ou ainda extrao slido-lquido. A soluo obtida, chamada micela (leo +
solvente), removida do extrator e encaminhada para um evaporador para a remoo do
solvente. Depois que o solvente removido completamente, obtm-se um extrato
concentrado. O solvente influencia na composio do extrato (parmetros diferentes de
solubilidade), na sua qualidade sensorial e no rendimento da extrao (PEREIRA,
2009).
O solvente orgnico mais utilizado o hexano, por ser o mais seletivo, possuir
estreita faixa de ebulio (entre 69 e 70C) e ser imiscvel em gua, o que evita misturas
azeotrpicas. Nestas, o ponto de ebulio constante, e a mistura se comporta como
uma substncia pura, dificultando a separao dos componentes pela destilao comum.
6

H desvantagens em seu uso, podendo-se destacar seu custo, toxidez e o fato de ser
extremamente inflamvel (FOLLEGATTI ROMERO, 2007; PEREIRA, 2009).
3.
As lipoprotenas
As lipoprotenas so compostas por lipdeos e protenas, denominadas, por sua
vez, apoprotenas (OJOPI et al., 2004). As lipoprotenas so caracterizadas por suas
propriedades fsico-qumicas (LOPES et al., 1996), sendo, porm, a densidade a
propriedade fsica na qual se baseia a atual classificao (GARCIA & OLIVEIRA,
1992; VALENTE, 1998). Pelo mtodo da ultracentrifugao preparativa, classes
distintas de lipoprotenas podem ser isoladas do plasma ps-prandial, e se diferenciam
pelo tamanho, pela densidade e pela composio tanto lipdica como apoprotica:
quilomcrons (QM), lipoprotenas de densidade muito baixa (VLDL), lipoprotenas de
densidade intermediria (IDL), lipoprotenas de densidade baixa (LDL) e lipoprotenas
de densidade alta (HDL), subdivididas em HDL2 e HDL3. A densidade das lipoprotenas
aumenta proporcionalmente ao aumento do teor protico e reduo do contedo
lipdico (FORTI & DIAMENT, 2006; VALENTE, 1998; THOMPSON, 1989).
As interaes entre as apoprotenas e os lipdeos das lipoprotenas podem
ocorrer por duas maneiras: (1) por meio de regies apolares hidrofbicas das
apoprotenas com o colesterol esterificado, triglicerdeos e com as cadeias de
hidrocarbonetos dos fosfolipdeos; (2) por meio de ligaes inicas entre aminocidos
da regio -hlice das apoprotenas e a cabea polar dos fosfolipdeos (GARCIA &
OLIVEIRA, 1992; VALENTE, 1998). As apoprotenas desempenham papel importante
no metabolismo lipdico. Alm da funo estrutural, permitindo a solubilizao das
lipoprotenas, contribuem para a regulao do metabolismo das lipoprotenas,
modulando a atividade de enzimas como a lecitina-colesterol aciltransferase e
lipoprotena-lipase, ligando-se tambm aos receptores da superfcie celular
(THOMPSON, 1989).
As lipoprotenas so sintetizadas no fgado e no intestino, ou formadas no
plasma, pela modificao de outras lipoprotenas (CHAPMAN, 1982; VALENTE,
1998). As apoprotenas so sintetizadas como pr-apoprotenas e, aps processamento,
modificam-se em apoprotenas. Algumas permanecem fixas nas lipoprotenas, enquanto
outras podem ser trocadas entre as diferentes lipoprotenas (MARINETTI, 1990;
VALENTE, 1998).
4.
A Apoprotena-E
A apoprotena-E (Apo-E) uma glicoprotena plasmtica de 36-kD que
representa um papel crucial no metabolismo de lipoprotenas no plasma. Esta protena
facilita a absoro celular de quilomcrons remanescentes ricos em triglicerdeos e
VLDL por meio do receptor de LDL e protenas relacionadas (CALLEJA et al., 1999;
KASHYAP et al., 1995; MAEDA et al., 2007; OSUGA, 1998). A apo-E componente
estrutural da superfcie de quilomcrons, quilomcrons remanescentes, VLDL, IDL e
HDL, sendo o principal componente de VLDL e HDL (CALLEJA et al., 1999; OJOPI
et al., 2004). Esta apoprotena primariamente sintetizada no fgado, podendo ser
produzida no crebro, intestino e em outras clulas e tecidos perifricos, incluindo
macrfagos (FAZIO et al., 1997; OSUGA, 1998).
7

Deficincias na apo-E causam vrias doenas envolvidas com o aumento no

nvel de colesterol e triglicerdeos na circulao, dentre elas, a aterosclerose. Alm
disso, j foi demonstrado que a apo-E regula o transporte e a solubilidade da protena
amilide (A) (GALLOWAY et al., 2008). Esta protena o principal constituinte do
material amilide que se concentra nos espaos intersticiais de vrios tecidos em
patologias denominadas genericamente de amiloidoses. Pacientes com a doena de
Alzheimer apresentam no tecido nervoso acmulos de protena amilide denominados
de placas senis (OJOPI et al., 2004).
Segundo Pendse et al. (2009) a absoro de triglicerdeos mediada pela apo-E no
fgado e tecido adiposo contribui para a manuteno dos nveis normais de lipdeos
plasmticos. A absoro de triglicerdeos no fgado e tecido adiposo na ausncia da apoE, contribui para o acmulo de VLDL e quilomcrons remanescentes no plasma (Figura
3).

Figura 3: Atuao da Apo-E. Adaptado de Pendse et al. (2009). As setas representam mudanas
no acmulo dos lipdeos nos diferentes tecidos na presena ou ausncia da Apo-E.

4.
Os cidos graxos poliinsaturados: metabolismo e importncia
O nosso organismo consegue sintetizar a maioria dos cidos graxos saturados e
insaturados, exceto os chamados essenciais. Estes esto divididos em dois grupos
principais: os da famlia -3 (cido linolnico) e -6 (cido linolico) (ANJO, 2004).
Estas famlias abrangem cidos graxos que apresentam insaturaes separadas apenas
por um carbono metilnico, com a primeira insaturao (dupla ligao) no terceiro e
sexto carbono, respectivamente, enumerado a partir do grupo metil terminal
(extremidade identificada pela letra mega- ) (MARTIN et al., 2006; MOREIRA,
2006). Os cidos graxos -3 so encontrados abundantemente em certas plantas e em
leo de peixe e os -6 so encontrados em leos vegetais (ANJO, 2004).
Os cidos graxos destas famlias so obtidos por meio da dieta ou produzidos
pelo organismo a partir dos cidos graxos -linolnico e linolico, pela ao de enzimas
elongase e dessaturase. O processo ocorre no retculo endoplasmtico, especialmente no
fgado. As elongases atuam adicionando dois tomos de carbono parte inicial da
cadeia, e as dessaturases agem oxidando dois carbonos da cadeia, originando uma dupla
8

ligao com a configurao cis (MARTIN et al., 2006; PERINI et al., 2010). Se a ao
dessas enzimas for bloqueada no corpo, esses cidos graxos tero de ser obtidos em
outras fontes. Isso significa que os cidos graxos -linolnico e linolico so cidos
graxos essenciais. O mesmo grupo de enzimas na via principal afeta o metabolismo
tanto da srie de cidos graxos essenciais -3 quanto da srie -6. Com isso concluiu-se
que, os fatores que bloqueiam a produo de molculas biologicamente ativas a partir
do cido linolico, tambm sejam responsveis pelo bloqueio da via metablica a partir
do cido -linolnico (EWIN, 1997). Os cidos graxos destas duas famlias competem
pelas mesmas enzimas envolvidas nas reaes de dessaturao e elongao, sendo que
essas enzimas tm maior afinidade pelos cidos graxos da famlia -3 (PERINI et al.,
2010).
Os principais cidos graxos poliinsaturados da famlia -3 so: cidos linolnico (-LNA, 18:3-3), cido eisosapentaenico (EPA, 20:5-3) e o cido
docosahexaenico (DHA, 22:6-3) (Figura 4). O organismo humano no consegue
sintetizar o cido -linolnico e o cido linolico (18:2-6) devido ausncia das
enzimas -15 e -12 dessaturases que so capazes de inserir duplas ligaes no terceiro
e sexto carbono, respectivamente, contados a partir do terminal metil. Por isso,
necessrio obt-los por meio da dieta para manter um pool adequado no organismo
(MOREIRA, 2006). O cido eisosapentaenico muito importante na preveno de
doenas cardiovasculares e hipertenso. O cido docosahexaenico apresenta
capacidade de prevenir doena cardaca, reduzir a taxa de triglicerdeos, alm de ser
importante no desenvolvimento da funo visual e cerebral (ANJO, 2004).

Figura 4: Estrutura qumica dos principais cidos graxos da famlia -3 (MOREIRA, 2006).

Na srie de cidos graxos -6, existem outros compostos nos quais os cidos
graxos essenciais so importantes: cido -linolnico (GLA, 18:3-6), o primeiro
produto metablico formado a partir do cido linolico, e dois metablitos do cido linolnico, a prostaglandina E1 (PGE1) e o cido dihomo- - linolnico (DGLA, 20:3 6), que pode ser convertido em prostaglandina E1 (Figura 5). O cido linolico
precursor ainda do cido araquidnico (AA, 20:4-6) (EWIN, 1997; MOREIRA, 2006).
Outros derivados importantes so os eicosanides. Os eicosanides so mediadores
9

inflamatrios, metablitos oxigenados dos cidos graxos essenciais compostos por

prostaglandinas, leucotrienos, prostaciclinas, tromboxanos e derivados dos cidos
graxos, sendo o cido araquidnico seu principal precursor (CAMPBELL &
FARRELL, 2007; PERINI et al., 2010).

Figura 5: Metabolismo dos cidos graxos das famlias -3 (n-3) e -6 (n-6) (Adaptado de
PERINI et al., 2010).

As prostaglandinas possuem uma ampla gama de reaes no organismo.

Algumas atividades atribudas srie de prostaglandina E1 e derivadas do cido linolnico so: inibio da proliferao de clulas anormais; diminuio da presso
arterial; inibio da sntese de colesterol; inibio da inflamao e ativao de
determinados leuccitos (EWIN, 1997). As prostaglandinas da srie 3, derivadas do
cido eisosapentaenico, so substncias que se assemelham aos hormnios e que
regulam e protegem o organismo de efeitos como agregao plaquetria (devido a sua
ao antitrombtica), inflamao e reduo das respostas imunes (CAMPBELL &
FARRELL, 2007; PERINI et al., 2010). Uma importante propriedade dos leucotrienos
sua capacidade de contrair o msculo liso. Essas substncias regulam a maioria das
atividades nos tecidos e so vitais para seu equilbrio (CAMPBELL & FARRELL,
2007; PERINI et al., 2010).
Se a alimentao for deficiente no cido graxo essencial a partir do qual essas
substncias so produzidas, a atividade do tecido ser alterada (EWIN, 1997).
Entretanto, um excesso de -6 na forma de cido linolico pode ser prejudicial sade.
Um problema que a concentrao de -3 influencia a de -6 e, portanto, necessrio
equilibrar a proporo destes na dieta (ANJO, 2004).
A razo entre as quantidades dos cidos graxos -6 e -3 importante na
nutrio humana. Estudos clnicos demonstraram que razes de -6 e -3 em torno de
10

4:1 atuam reduzindo em at 70% o risco de doenas cardiovasculares. A relevncia

dessa razo decorrente destes cidos graxos competirem pelas enzimas envolvidas nas
reaes de dessaturao e elongamento da cadeia. Embora o equilbrio favorea a
famlia -3, a converso do cido -linolnico em cidos graxos poliinsaturados de
cadeia longa fortemente influenciada pelos nveis de cido linolico na dieta (SOUZA
& VISENTAINER, 2006).
Ao longo do tempo tem ocorrido um aumento da ingesto de gordura com maior
consumo do -6 em relao ao -3. Entre os cidos graxos da famlia -6, o cido
linolico o mais consumido na dieta ocidental, sendo 15g/dia, cerca de 10 vezes mais
que o cido -linolnico, da famlia -3, cujo consumo na dieta ocidental de 1,5g/dia
(BURDGE & WOOTTON, 2002). A Organizao Mundial da Sade, em seu relatrio
sobre dieta, nutrio e preveno de doenas crnicas, recomenda uma ingesto diria
de 5 a 8% das calorias totais provenientes do -6, enquanto 1 a 2% oriundas do -3
(MOREIRA, 2006). Nveis de ingesto adequada de cidos graxos essenciais foram
estabelecidos pelo Instituto de Medicina de Washington, baseadas na ingesto mdia da
populao norte-americana. Esses valores preconizados de consumo so de 17g e
12g/dia de cido linolico (-6) e 1,6g e 1,1g/dia de cido linolnico (-3) para homens
e mulheres, respectivamente (INSTITUTE OF MEDICINE, 2002 Apud GARFOLO &
PETRILLI, 2006).
A dieta considerada o fator ambiental mais importante na determinao de
doenas cardiovasculares. Dieta rica em colesterol e lipdeo saturado promove o
desenvolvimento da aterosclerose. Por outro lado, dieta rica em lipdeo poliinsaturado
reduz o desenvolvimento da doena em vrias espcies. Estudos mostrando o efeito dos
lipdeos monoinsaturados neste contexto so escassos (CALLEJA et al., 1999). Uma
maior ingesto de cidos graxos saturados aumenta os nveis de LDL e reduz HDL
sendo essa, uma conhecida condio para o desenvolvimento de doenas
cardiovasculares, pois o HDL inversamente relacionado aterosclerose, enquanto o
LDL um importante fator de risco para eventos cardiovasculares (GERMAN &
DILLARD, 2004; GORDON et al., 1977). Por outro lado, uma dieta contendo
monoinsaturados e poliinsaturados, como exposto, atualmente recomendada, pois
entre outros efeitos benficos, pode reduzir o risco de aterosclerose. Alm disso, estudo
prvio mostra um papel benfico dos cidos graxos poliinsaturados na preservao da
mucosa intestinal e na melhora da absoro lipdica (VIJAIMOHAN, 2006).
5.
O modelo animal
Linhagens de camundongos tm sido utilizadas como modelos experimentais de
pesquisa biomdica desde o incio do sculo XX. O camundongo o animal
experimental de escolha em vrias reas por ser de fcil criao e manipulao, ter uma
reproduo rpida e apresentar uma grande diversidade gentica (SOARES et al., 2001).
O primeiro modelo de camundongos para o estudo da aterosclerose foi
desenvolvido pela inativao do gene que codifica a apoprotena E (MAEDA et al.,
2007; PIEDRAHITA et al., 1992; PLUMP et al., 1992; ZHANG et al., 1992). Este
camundongo saudvel quando nasce, mas possui uma marcante alterao do perfil de
lipdeos plasmticos comparados ao camundongo normal, e rapidamente desenvolve
leses aterosclerticas (TACONIC, 2008).
11

Esses camundongos possuem colesterol plasmtico cerca de cinco vezes mais

alto de que os normais, mesmo quando o indivduo tratado regularmente com rao
com baixas taxas de lipdeos e colesterol. Nestes indivduos, a evoluo da leso
gordurosa na aorta proximal se desenvolve aos trs meses de idade (BRITO, 2008;
CALLEJA et al., 1999; MAEDA et al., 2007; NAKASHIMA et al., 1994; REDDICK et
al., 1994; ZHANG et al., 1992). Os camundongos knockout possuem, portanto,
mudana da distribuio normal de lipdeos plasmticos (colesterol e triglicerdeos) para
o predomnio da lipoprotena de muito baixa densidade (VLDL) e complexos de
lipoprotenas de densidade intermediria (IDL) em detrimento do predomnio dos
complexos de lipoprotena de alta densidade (HDL). Vale ressaltar ainda, que a
condio do modelo no interfere no desempenho reprodutivo em ambos sexos, e
nenhuma diferena foi reportada com relao massa corporal ou ao tamanho da
ninhada, comparado com o camundongo normal (TACONIC, 2008).
6.
O intestino delgado
O intestino delgado corresponde ao rgo do tubo digestivo situado entre o
piloro e o ceco e o stio terminal da digesto dos alimentos, absoro de nutrientes e
secreo endcrina. Os processos de digesto so completados no intestino delgado,
onde os nutrientes so absorvidos pelas clulas epiteliais de revestimento. O intestino
delgado relativamente longo, possui a organizao tpica do tubo digestivo (Figura 6)
e consiste em trs segmentos: duodeno, jejuno e leo (JUNQUEIRA & CARNEIRO,
2008).

Figura 6: Desenho esquemtico da organizao da parede do tudo digestivo (Adaptado de

GARTNER & HIATT, 2002).

A mucosa do intestino delgado apresenta vrias estruturas que aumentam sua

superfcie, aumentando assim, a rea disponvel para absoro de nutrientes. So
observadas trs modificaes (GARTNER & HIATT, 2003; JUNQUEIRA &
CARNEIRO, 2008):
12


As pregas circulares, denominadas plicae circularis, em forma
semilunar, circular ou espiral, consistem em dobras da mucosa e submucosa. Estas
pregas so estruturas permanentes e so mais desenvolvidas no jejuno e, embora
estejam frequentemente presentes no duodeno e leo, no so caractersticas destes
rgos;

As vilosidades intestinais ou vilos so projees alongadas da mucosa

(epitlio e lmina prpria) em direo ao lmen. No duodeno possuem forma de folhas,
gradualmente assumindo forma de dedos medida que se aproximam do leo. Entre os
vilos existem pequenas aberturas de glndulas tubulares simples denominadas criptas
(glndulas de Lieberkhn). O eixo central de cada vilosidade contm alas capilares, um
canal linftico em fundo cego (quilfero ou lcteo) e algumas fibras musculares lisas, em
um tecido conjuntivo frouxo rico em clulas linfides;

As microvilosidades so projees da membrana plasmtica das clulas

epiteliais que cobrem as vilosidades intestinais.
A presena de pregas, vilosidades e microvilosidades aumentam muito a
superfcie de revestimento intestinal, uma caracterstica importante num rgo onde a
absoro ocorre to intensamente. Calcula-se que as pregas aumentem a superfcie
intestinal em cerca de trs vezes, as vilosidades aumentem em cerca de 10 vezes e as
microvilosidades aumentem em cerca de 20 vezes a superfcie. Em conjunto, estes
processos so responsveis por um aumento de aproximadamente 600 vezes na
superfcie intestinal (JUNQUEIRA & CARNEIRO, 2008).
6.1. O epitlio do intestino delgado
O epitlio dos vilos formado principalmente por clulas absortivas
(entercitos) e clulas caliciformes e se continua com o epitlio das criptas, que por sua
vez contm algumas clulas absortivas, clulas caliciformes, clulas enteroendcrinas,
clulas de Paneth e clulas-tronco (Figuras 7 e 8) (GARTNER & HIATT, 2003;
JUNQUEIRA & CARNEIRO, 2008).
As clulas absortivas superficiais, ou entercitos, so clulas colunares altas e
com microvilosidades. Estas estruturas so protruses cilndricas do citoplasma apical,
cujas pontas esto cobertas por uma espessa camada de glicoclix que, no somente
protege as microvilosidades da autodigesto, mas seus componentes enzimticos
tambm participam da parte final da digesto de dipeptdios e dissacardios em seus
monmeros. Estima-se que cada clula absortiva possua em mdia 3.000
microvilosidades (GARTNER & HIATT, 2003; JUNQUEIRA & CARNEIRO, 2008).
Estas clulas reesterificam os cidos graxos em triglicerdeos, formam os quilomcrons
e transportam a massa dos nutrientes absorvidos para a lmina prpria, de onde so
distribudos para o restante do corpo (GARTNER & HIATT, 2003).
As clulas caliciformes so glndulas unicelulares. O duodeno tem o menor
nmero de clulas caliciformes e seu nmero aumenta ao se aproximar do jejuno. Estas
clulas produzem e secretam as mucinas, que formam o muco aderido no plo apical
dos entercitos (GARTNER & HIATT, 2003). A principal funo do muco proteger o
13

epitlio de agressores qumicos, fsicos e biolgicos, que podem estar presentes na luz
intestinal. Dependendo da composio de seus monossacardeos, as mucinas so
classificadas em neutras e subtipos cidos: no-sulfatadas (sialomucinas) e sulfatadas
(sulfomucinas). As mucinas neutras contm monossacardeos de manose, galactose e
galactosamina. As sialomucinas compem um grupo que contm diversos
monossacardeos, compostos de nove carbonos, e na posio C1 h um grupo
carboxilato, que est sempre ionizado a um pH fisiolgico (SHIRAISHI et al, 2009).
As criptas de Lieberkhn so glndulas tubulosas simples (ou tubulosas
ramificadas) que abrem espaos entre as vilosidades. Estas glndulas tubulosas so
compostas por entercitos, clulas caliciformes, clulas-tronco, clulas enteroendcrinas
e clulas de Paneth (GARTNER & HIATT, 2003). Os entercitos e as clulas
caliciformes ocupam a metade superior da glndula. A metade basal da glndula no
tem entercitos e somente algumas clulas caliciformes; ao invs disso, a maioria das
clulas so clulas-tronco, clulas enteroendcrinas e as clulas de Paneth (GARTNER
& HIATT, 2003).
O percentual de renovao celular determinado pela atividade das clulastronco/ progenitoras multipotentes, localizadas perto da base da cripta de Lieberkhn,
prximas as clulas de Paneth (GARCIA & MIRANDA, 2010; JUNQUEIRA &
CARNEIRO, 2008). A taxa de reproduo das clulas na cripta e a proporo de
migrao desses entercitos so alteradas em vrios estados fisiolgicos ou patolgicos.
Essas mudanas na dinmica celular determinam nos entercitos do vilo, por exemplo,
alterao na atividade transportadora relacionada ao tempo de vida (CARUSO &
DEMONTE, 2005).
Esta proliferao para na juno cripta-vilosidade. As novas clulas podem
mover-se para baixo e situar-se na base das criptas como clulas diferenciadas, as
clulas de Paneth, ou podem migrar para cima ao longo dos vilos enquanto se
diferenciam em entercitos, clulas enteroendcrinas ou clulas caliciformes. Quando
as clulas alcanam o pice do vilo, eventualmente elas passam pelo processo de
apoptose e so eliminadas para o lmen intestinal (CARUSO & DEMONTE, 2005;
GARCIA-MIRANDA, 2010).
As clulas de Paneth esto localizadas na poro basal das glndulas intestinais e
produzem o agente antomicrobiano lisozima. Devido sua atividade antibacteriana, a
lisozima tambm exerce controle sobre a microbiota intestinal. Ao contrrio das outras
clulas, as clulas de Paneth tm o tempo de vida comparativamente longo, cerca de 20
dias nas microvilosidades (GARTNER & HIATT, 2003; JUNQUEIRA & CARNEIRO,
2008).
Os linfcitos intra-epiteliais esto localizados acima da lmina prpria,
principalmente no duodeno e no jejuno proximal, e participam de modo decisivo na
regulao das interaes que ocorrem entre o meio ambiente e o sistema imunolgico,
tanto local quanto sistmico. Estes linfcitos so predominantemente (98%) linfcitos
T CD8+ CD45RO+ (clulas de memria) (MAYER, 2005).

14

Figura 7: Diagrama esquemtico da mucosa, vilos, criptas de Lieberkhn, e componentes

celulares do intestino delgado de humanos (Adaptado de GARTNER & HIATT, 2002).

Figura 8: Diagrama esquemtico da cripta de Lieberkhn (a), do pice do vilo (b) e dos
componentes celulares do intestino delgado de humanos (Adaptado de JUNQUEIRA &
CARNEIRO, 2008).

6.2. Duodeno: caracterizao e absoro de lipdeos

O duodeno o segmento mais curto do intestino delgado. Ele recebe a bile do
fgado e sucos digestivos do pncreas, por meio do duto biliar comum e do duto
pancretico, respectivamente. Estes dutos desembocam na luz do duodeno na papila
duodenal (de Vater). O duodeno difere do jejuno e do leo por suas vilosidades que so
15

mais largas, mais altas e mais numerosas por unidade de rea. Ele possui menos clulas
caliciformes por unidade de rea do que os outros segmentos e possui as glndulas de
Brnner em sua submucosa (GARTNER & HIATT, 2003).
O intestino tem um papel importante na homeostase do colesterol. o rgo
responsvel pela regulao da quantidade de colesterol que ser absorvido, seja ele
oriundo da dieta ou produzido no organismo. Nesta regio ocorre a montagem
intracelular e liberao de quilomcrons, HDL nascentes e uma forma intestinal de
lipoprotena de baixa densidade (NGUYEN et al., 2001).
Em mamferos, os triglicerdeos so parcialmente hidrolisados no lmen
intestinal a cidos graxos livres e monoacilgliceris. Os produtos ento se difundem em
micelas para a mucosa intestinal onde so absorvidos como monmeros (OLSEN &
RINGO, 1997). Os cidos graxos so reesterificados em triglicerdeos no retculo
endoplasmtico antes de serem incorporados em lipoprotenas e serem exocitados ao
espao intersticial (THOMSON et al., 1993; TSO & FUJIMOTO, 1991).
Os cidos graxos de cadeia longa e os monoglicerdeos entram no retculo
endoplasmtico liso dos entercitos, onde so reesterificados formando triglicerdeos.
Estes triglicerdeos so transferidos para o aparelho de Golgi, onde so combinados com
uma capa de -lipoprotena, produzida no retculo endoplasmtico rugoso, formando
quilomcrons. Estas grandes gotculas lipoproticas, empacotadas e liberadas pelo
aparelho de Golgi, so transportadas para a membrana basolateral das clulas e
liberadas na lmina prpria. Os quilomcrons seguem para os vasos quilferos,
preenchendo-os com uma substncia rica em lipdeos, denominada quilo (GARTNER &
HIATT, 2003).
cidos graxos de cadeia curta no entram no retculo endoplasmtico liso para
serem reesterificados. Estes cidos graxos livres, que so suficientemente curtos para
serem hidrossolveis, dirigem-se para a membrana basolateral do entercito, se
difundem para a lmina prpria e penetram nas alas capilares e vo para o fgado onde
so processados (Figura 9) (GARTNER & HIATT, 2003).
Os cidos biliares so sintetizados a partir do colesterol no fgado e so
secretados com a bile no intestino delgado. Uma pequena frao dos conjugados
lipoflicos de cidos biliares so absorvidos passivamente no pH cido do duodeno.
cidos biliares conjugados so absorvidos no jejuno por troca aninica e por um
mecanismo de transporte antiporte. No leo, um transportador de cido biliar Na+
dependente participa do processo de absoro dos cidos biliares conjugados
(THOMSON et al., 2001).

16

Figura 9: Absoro de lipdeos no intestino delgado (Adaptado de GARTNER & HIATT,

2002).

7.

Fgado: estrutura e funo

O fgado o segundo maior rgo do corpo e considerado tambm a maior
glndula. Nele os nutrientes absorvidos no intestino delgado so processados e
armazenados para utilizao por outros rgos. Grande parte do sangue que vai para o
fgado chega pela veia porta (70-80%); uma menor porcentagem suprida pela artria
heptica. Todos os nutrientes absorvidos pelo intestino chegam ao fgado pela veia
porta, exceto os quilomcrons, que chegam ao fgado pela artria heptica. Sua posio
no sistema circulatrio ideal para captar, transformar e acumular metablitos e para a
neutralizao e eliminao de toxinas. A eliminao ocorre na bile, uma secreo
excrina do fgado, importante para a digesto de lipdeos (JUNQUEIRA &
CARNEIRO, 2008).
O componente estrutural bsico do fgado a clula heptica ou hepatcito
(JUNQUEIRA & CARNEIRO, 2008). Estas esto dispostas em lbulos hexagonais
claramente demarcados por delgados elementos de tecido conjuntivo. Estas placas so
separadas por espaos vasculares denominados sinusides hepticos. Nos locais em que
trs lbulos clssicos entram em contato uns com os outros, os elementos de tecido
17

conjuntivo so mais abundantes e estas regies so denominadas espao porta (trades).

Os espaos porta contm ramos pequenos da artria heptica, da veia porta, dutos
biliares interlobulares e vasos linfticos (Figura 10) (GARTNER & HIATT, 2003).
Alm disso, macrfagos residentes, denominados clulas de Kupffer, esto
associados ao endotlio dos sinusides. Este endotlio est separado dos hepatcitos
pelo estreito espao perissinusoidal ou espao de Disse, e o plasma que passa pelos
sinusides tem livre acesso a este espao (GARTNER & HIATT, 2003).

Figura 10: Desenho esquemtico do fgado. A: Anatomia macroscpica do fgado; B: Lbulos

hepticos mostrando os espaos porta e veia central; C: Parte do lbulo esquerdo mostrando o
espao porta, placas de hepatcitos, sinusides e canalculos biliares (Adaptado de GARTNER
& HIATT, 2002).

7.1. Hepatcitos e o metabolismo dos lipdeos

Os hepatcitos constituem quase 75% do peso do fgado e produzem a bile
primria que, modificada pelas clulas que revestem os dutos biliares e a vescula biliar,
torna-se a bile. Aproximadamente 75% dos hepatcitos possuem um nico ncleo,
enquanto os demais hepatcitos so binucleados. Os hepatcitos sintetizam ativamente
protenas para uso prprio, assim como, para exportao. Portanto, eles possuem
abundncia de ribossomos livres, retculo endoplasmtico rugoso e aparelho de Golgi
(GARTNER & HIATT, 2003).
18

Os hepatcitos contm quantidades variveis de incluses sob a forma de

gotculas de lipdeos. Estas gotculas so principalmente lipoprotenas de densidade
muito baixa (VLDL). Depsitos de glicognio esto presentes como acmulos eltrondensos denominados partculas e localizados na vizinhana do retculo
endoplasmtico liso (GARTNER & HIATT, 2003).
Os quilomcrons, liberados pelos entercitos no intestino delgado, seguem para o
sistema linftico e chegam ao fgado por meio dos ramos da artria heptica. Dentro dos
hepatcitos, eles so degradados a cidos graxos e glicerol. A seguir, os cidos graxos
so desnaturados e usados na sntese de fosfolipdeos e colesterol, ou so degradados
para acetil coenzima A. Duas molculas de acetil coenzima A se combinam formando
cido acetoactico. Grande parte deste cido convertida no cido - hidroxibutrico e
parte em acetona. Estes trs compostos so denominados corpos cetnicos.
Fosfolipdeos, colesterol e corpos cetnicos so armazenados nos hepatcitos at sua
liberao no espao de Disse. Alm disso, o fgado produz lipoprotenas de densidade
muito baixa, que tambm so liberadas no espao de Disse (GARTNER & HIATT,
2003).

19

Objetivos
1.
Objetivos gerais
O objetivo geral deste trabalho foi extrair o leo de sementes de sacha kiruma,
determinar o perfil de cidos graxos e avaliar os efeitos desse leo na estrutura do
duodeno e fgado de camundongos.
2.
Objetivos especficos
a)
Obter o leo das sementes de sacha kiruma utilizando o mtodo de
extrao por solvente (hexano);
b)
Determinar o rendimento do processo de extrao de leo;
c)
Determinar a composio de cidos graxos nas amostras do leo
extrado;
d)
Acompanhar o consumo alimentar e a evoluo ponderal de
camundongos selvagens e knockout Apo-E tratados com dieta controle e dieta com o
leo de sacha kiruma;
e)
Avaliar os efeitos do leo de sacha kiruma na estrutura histolgica do
duodeno e fgado de camundongos selvagens e knockout Apo-E, machos e fmeas.

20

Metodologia
1.

Obteno do leo

1.1. Sementes
Foram utilizados trs espcimes de sacha kiruma, estabelecidos em Viosa, a
partir da germinao de sementes provenientes da Estao Experimental Agraria "El
Polvenir", Tarapoto (Peru). A cidade de Viosa est localizada na Zona da Mata mineira
(20 45' 14" S, 42 52' 53" O, 648,74 m), com clima caracterizado como tropical de
altitude, com veres chuvosos, invernos frios e secos, temperatura mdia de 19C e solo
argissolo vermelho-amarelo (ABREU et al., 2008; MARAGON et al., 2003). Quando os
frutos atingiram a maturidade, procedeu-se a coleta das sementes. Foram feitas trs
coletas ao longo de dois meses.
Aps a colheita, as sementes foram secas em temperatura ambiente por 15 dias.
Em seguida, foram acondicionadas em estufa com Circulao e Renovao de ar TE394/2, Tecnal a 45C por 24 horas, a fim de desumidific-las. Esta estufa foi
gentilmente cedida pelo Laboratrio de Micorriza, do Departamento de Engenharia
Florestal da Universidade Federal de Viosa. Aps o processo foram obtidos 2,127kg de
sementes desumidificadas.
1.2. Moagem das sementes
As sementes foram modas em Moinho de Rotor Vertical com facas mveis e
fixas, cedido pelo Laboratrio de Painis e Energia da Madeira, Departamento de
Engenharia Florestal da Universidade Federal de Viosa. Aps a moagem foram
obtidos 2,042kg de amostra.
1.3. Extrao do leo de sacha kiruma
Foi utilizado o mtodo de extrao por solvente com Soxhlet, utilizando hexano.
Este mtodo pode ser aplicado devido s caractersticas das sementes de sacha kiruma
que apresentam alto teor de lipdeos. Toda a metodologia de extrao foi realizada no
Laboratrio de Sementes, Departamento de Engenharia Florestal da Universidade
Federal de Viosa. O mtodo foi adaptado para a amostra de acordo com descrio no
Anexo I.
A primeira etapa do processo de extrao foi a padronizao da massa de
sementes modas a ser utilizada no cartucho de extrao. De acordo com a aparelhagem
disponvel para o processo, foi possvel utilizar cartuchos com 50g ou com 100g de
amostra. O uso de cartuchos com 100g de amostra, apesar de representar a princpio
uma vantagem pela reduo do tempo total para a extrao, mostrou-se pouco vantajoso
devido ao menor rendimento em relao aos cartuchos de 50g. Optou-se pelos cartuchos
com a menor massa a fim de se obter o maior rendimento possvel e minimizar o
desperdcio de amostra.
Para remoo de partculas que tenham permanecido durante a extrao, a
amostra contendo solvente e leo foi recolhida e filtrada a vcuo, utilizando uma bomba
de 1,5 HP e papel de filtro com porosidade 11. Em seguida, a amostra passou por uma
destilao.
21

A destilao utilizando rotavapor com vcuo tem como objetivo separar o

hexano do leo utilizando o seguinte equipamento: Evaporador rotativo a vcuo
(condensador vertical) e o Banho ultratermostatizado com bomba de circulao
(temperatura da gua para o condensador do evaporador de 16C 0,1C), cedidos pelo
Laboratrio de Sementes do Departamento de Engenharia Florestal, Universidade
Federal de Viosa. O processo est descrito no Anexo II. Este processo demorou cerca
de 2h30 por bateria de extrao e garantiu aproximadamente 100% de eficincia na
retirada do solvente do leo bruto.
Em seguida, procedeu-se a etapa de borbulhar a amostra com nitrognio. O
objetivo desta etapa consiste em expulsar o restante de solvente ainda presente e
tambm retirar o mximo do oxignio da amostra. Com isso, minimiza-se a oxidao
dos cidos graxos do leo. A metodologia est descrita no Anexo III. Ao fim desta etapa
encontramos o leo puro, que foi armazenado em frasco mbar a -20C. Foram
realizadas seis baterias de extrao, num total de 778ml de leo bruto obtido.
2.
Eficincia do processo de extrao
Para obter os valores da eficincia de extrao de cada sequncia, foi utilizada a
seguinte relao:

3.
Obteno dos steres de cidos graxos do leo de sacha kiruma
Para traar o perfil lipdico do leo de sacha kiruma no tocante ao teor de cidos
graxos livres, foi preciso realizar a saponificao e esterificao da amostra. Este
mtodo foi realizado no Laboratrio de Bioqumica Nutricional, do Departamento de
Nutrio e Sade da Universidade Federal de Viosa.
A extrao dos lipdeos seguiu o mtodo proposto por Folch et al. (1957)
utilizando 30mg de leo e, em seguida, as amostras foram esterificadas pela tcnica de
Hartman & Lago (1973). As metodologias foram adaptadas para a amostra seguindo
modificaes apresentadas no Anexo IV.
3.1. Avaliao do perfil lipdico do leo de sacha kiruma utilizando a
cromatografia gasosa
A determinao do perfil de cidos graxos do leo de sacha kiruma foi feita por
meio da cromatografia gasosa. O aparelho utilizado foi cedido pelo Laboratrio de
Nutrio Experimental, do Departamento de Nutrio e Sade da Universidade Federal
de Viosa. Foi utilizado um cromatgrafo a gs Shimadzu, com detector por ionizao
em chama (FID - Flame Ionization Detector) equipado com uma coluna capilar de slica
fundida (100m x 0,25mm id).
As condies de anlise foram: programao da temperatura: 80C com rampa
de aquecimento de 10C/min at alcanar 150C e 4C/min at alcanar a temperatura
22

de 250C, temperatura do injetor mantida a 240C e detector a 260C; gs de arraste

hidrognio ultra puro, razo split: 5 e fluxo da coluna de 1,6mL/min.
A amostra obtida da extrao descrita anteriormente estava acondicionada em
frascos mbares a -20C. Foi retirada dessa condio e mantida em temperatura
ambiente por 5min. A amostra foi recuperada com 200L de n-hexano para
cromatografia gasosa (Sigma). Foi armazenada em vial para posterior injeo no
aparelho. Foi realizada injeo de 0,2L de amostra para a leitura. Os metil steres dos
cidos graxos mais abundantes foram identificados por comparao com o tempo de
reteno dos padres de steres metlicos dos cidos graxos C-4 a C-22.
O padro utilizado foi estabelecido a partir de uma mistura de padres
comerciais (Sigma, EUA), de proporo de massa conhecida, contendo os steres
metlicos dos seguintes cidos graxos: butrico (4:0); caprico (6:0); caprlico (8:0);
cprico (10:0); undecanico (11:0); lurico (12:0); tridecanico (13:0); mirstico (14:0);
miristolico (14:1); pentadecanico (15:0); cis-10-pentadecanico (15:1); palmtico
(16:0); palmitolico (16:1); heptadecanico (17:0); cis-10-heptadecanico (17:1);
esterico (18:0); eladico (18:1n9t); olico (18:1n9c); linoleladico (18:2n6t); linolico
(18:2n6c); araqudico (20:0); -linolnico (18:3n6); cis-11-eicosenico (20:1);
linolnico (18:3n3); heneicosanico (21:0); cis-11,14- eicosadienico (20:2); behnico
(22:0); cis-8,11,14- eicosatrienico (20:3n6); ercico (22:1n9); cis-11,14,17eicosatrienico (20:3n3); araquidnico (20:4n6); tricosanico (23:0); cis-13,16docosadienico (22:2); lignocrico (24:0); cis-5,8,11,14,17- eicosapentaenico
(20:5n3); nervnico (24:1); cis-4,7,10,13,16,19- docosahexaenico (22:6n3). Os picos
cromatogrficos dos steres metlicos dos cidos graxos do padro foram utilizados
como referncia para determinar quais componentes estavam presentes na amostra
(VIDAL, 2009).
A quantificao dos cidos graxos presentes na amostra foi calculada mediante a
porcentagem da rea de cada pico correspondente ao cido graxo identificado pelo
padro correspondente (VIDAL, 2009). A partir dos valores percentuais dos cidos
graxos foi calculada a relao poliinsaturados/ saturados. Para tal, os cidos graxos
poliinsaturados utilizados foram linolico, linolnico e araquidnico e os cidos graxos
saturados foram palmtico e mirstico (FOLEGATTI ROMERO, 2007; HAMAKER et
al, 1992; VIDAL, 2009).
4.
Ensaio biolgico
4.1. Origem e manuteno dos animais
Foram utilizados 40 camundongos (Mus musculus) Black, sendo 20 da linhagem
C57BL/6 knockout para o gene Apo-E e 20 da linhagem C57BL/6 normal, dos dois
sexos e provenientes do Biotrio Central do Centro de Cincias Biolgicas e da Sade
da Universidade Federal de Viosa. Os animais foram distribudos em oito grupos
(Tabela 2) de acordo com a linhagem, o sexo e o tratamento (dieta com ou sem o leo
extrado de sacha kiruma).

23

Tabela 2: Caracterizao dos grupos experimentais.

Identificao
Nmero de
Caracterizao do grupo
indivduos
5
Animais Apo-E -/-; dieta controle, machos
ACM
5
Animais Apo-E -/-; dieta controle, fmeas
ACF
5
Animais Apo-E -/-; dieta tratada com o leo de sacha kiruma,
ATM
machos
5
Animais Apo-E -/-; dieta tratada com o leo de sacha kiruma,
ATF
fmeas
5
Animais BlackC57/6; dieta controle, machos
BCM
5
Animais BlackC57/6; dieta controle, fmeas
BCF
5
Animais BlackC57/6; dieta tratada com o leo de sacha
BTM
kiruma, machos
5
Animais BlackC57/6; dieta tratada com o leo de sacha
BTF
kiruma, fmeas

Os animais foram mantidos em gaiolas coletivas de polietileno, com ventilao

natural. Cada gaiola representava um grupo, com cinco indivduos, em um total de oito
grupos. As gaiolas foram mantidas no Biotrio do Departamento de Nutrio e Sade da
Universidade Federal de Viosa, localizado no Laboratrio de Nutrio Experimental,
sala de Experimentao II- Setor de Camundongos. A sala possui controle de
fotoperodo com ciclos de claro/escuro de 12 horas, e temperatura variando entre 18 e
22C.
Os animais iniciaram o tratamento com 44 dias de idade, o que caracteriza
indivduos juvenis. O tratamento teve durao de 90 dias e os animais foram submetidos
eutansia com 134 dias de idade.
As gaiolas foram cuidadosamente higienizadas duas vezes por semana, no
momento em que se processava a troca da maravalha por outra previamente
autoclavada. A gua do bebedouro tambm era renovada, assim como a rao.
O experimento foi aprovado pelo Comit de tica do Departamento de Medicina
Veterinria da Universidade Federal de Viosa (Processo n 29/2010).
4.2. Dieta com o leo de sacha kiruma
Antes de iniciar o tratamento, os animais foram tratados com dieta comercial
para murinos e passaram 12 horas em jejum, para a retirada de sangue, antes da oferta
da nova rao. Esta foi elaborada de acordo com determinaes AIN-93G formulada
para roedores em fase de crescimento, gestao e lactao (Tabela 3).
As dietas foram calculadas e adequadas para que a ingesto dos nutrientes no
fosse desigual entre os grupos. Foram preparadas no Laboratrio de Nutrio
Experimental, Departamento de Nutrio e Sade da Universidade Federal de Viosa,
manualmente e devidamente acondicionadas a -20C at o momento de ofertar aos
animais.

24

Tabela 3: Formulao das dietas controle e experimental. Em acordo com determinaes AIN93G formulada para roedores em fase de crescimento, gestao e lactao.
Ingredientes
Dieta controle (%) Dieta experimental (%)
Casena
20
20
Amido dextrinizado
13,2
13,2
Sacarose
10
10
leo de soja
7
leo de sacha kiruma 7
Fibras
5
5
Mistura de minerais
3,5
3,5
Mistura de vitaminas 1
1
L-cistina
0,3
0,3
Bitartarato de colina
0,25
0,25
Amido de milho
39,75
39,75

O consumo alimentar foi verificado duas vezes por semana em cada grupo. O
clculo se baseou na rao restante no comedouro, em relao quantidade de rao
inicial. Inicialmente foi considerado um consumo de 10g/ animal por dia. Ao longo das
semanas essa oferta foi ajustada de acordo com o consumo dos grupos, numa mdia de
4g/animal por dia.
4.3. Desenvolvimento dos animais
Ao longo do tratamento, os animais tiveram livre acesso a gua e alimento. O
peso corporal individual foi obtido quinzenalmente. Para a avaliao do crescimento dos
animais, foi utilizado tambm o ndice hepatossomtico (IH):

4.4. Eutansia
Ao final do experimento, todos os animais foram submetidos eutansia para a
coleta dos rgos, utilizando-se a inalao com gs carbnico. Este procedimento foi
realizado no Laboratrio de Nutrio Experimental, do Departamento de Nutrio e
Sade da Universidade Federal de Viosa. A massa final de cada camundongo foi
obtida minutos antes do procedimento.
5.
Avaliao dos efeitos do tratamento no duodeno
5.1. Obteno dos fragmentos do duodeno
O intestino delgado foi identificado em sua poro inicial e cuidadosamente
distendido para que os contedos permanecessem em posio (MARQUES, 2006). Para
a localizao do duodeno, foi utilizado como referncia o esfncter pilrico e a
interseo duodeno/jejuno. Incluindo o esfncter pilrico, extraiu-se um fragmento com
aproximadamente dois centmetros de comprimento. As amostras foram colhidas e
25

lavadas rapidamente em soluo salina. Os fragmentos foram fixados em soluo de

paraformaldedo-glutaraldedo (KARNOVSKY, 1965). O material permaneceu por 24
horas no fixador e foi posteriormente transferido para soluo de lcool 70% at a
incluso em glicol-metacrilato (Historesin, LEICA).
5.2. Microtomia, Colorao e Histoqumica
Os procedimentos de microtomia, colorao e histoqumica foram realizados no
Laboratrio de Biologia Estrutural e Histofisiologia Reprodutiva e Digestiva, do
Departamento de Biologia Geral da Universidade Federal de Viosa. Os fragmentos do
duodeno foram seccionados em micrtomo rotativo (Reichert-Jung 2045 Multicut,
Germany) para a obteno de cortes transversais semi-seriados. O material foi
seccionado na espessura de 2m e intervalo entre cortes de 40m.
Os cortes foram submetidos aos seguintes mtodos: colorao com Azul de
Toluidina-Borato de Sdio 1% e tcnica combinada do Azul de Alcian (AB) pH 2,5
com o cido Peridico de Schiff (PAS) (AB+PAS).
5.2.1. Azul de Toluidina-Borato de Sdio 1%
As preparaes foram imersas na soluo de Azul de Toluidina-Borato de Sdio
1% por 30 segundos em uma cuba de colorao. Os cortes foram posteriormente
lavados em gua corrente, as preparaes foram secas em temperatura-ambiente e
montadas em Entellan (Merck). Com essa colorao evidenciou-se regies
metacromticas, ncleos celulares e a estrutura histolgica geral da parede do duodeno.
Nestas preparaes foi feita a morfometria da mucosa e da tnica muscular.
5.2.2 Tcnica combinada AB+PAS modificada de Bancroft & Stevens (1996)
As preparaes foram tratadas inicialmente com soluo tampo por 15 minutos
em temperatura ambiente. Na sequncia, com soluo de Azul de Alcian pH 2,5 por
cerca de duas horas em estufa a 60C. Aps esse tempo, o material recebeu banhos
sucessivos em gua corrente e depois em gua destilada. A prxima etapa envolveu
tratamento do material com soluo aquosa de cido peridico 1% por 45 minutos. Os
cortes foram expostos ao Reativo de Schiff durante cerca de 60 minutos, com a cuba
envolvida por uma folha de papel alumnio, a fim de proteger o material da luz. O
material foi ento novamente banhado em gua corrente durante cinco a dez minutos.
Os ncleos foram contracorados com hematoxilina de Mayer durante dois minutos. O
material foi novamente lavado em gua corrente. As lminas foram secas em
temperatura ambiente e montadas em Entellan (Merck).
Com esta tcnica foi possvel evidenciar em azul o mucopolissacardeo cido e,
na cor magenta, o mucopolissacardeo neutro. Quando houve mistura de ambos, a cor
dependeu do mucopolissacardeo dominante, podendo variar do azul prpura ao violeta.
Nestas preparaes foram feitas as quantificaes das clulas caliciformes e das clulas
de Paneth.
5.3. Captura de imagens
As imagens das seces histolgicas foram capturadas a partir do microscpio
de luz (Olympus AX 70) por meio de uma cmera de captura acoplada a um sistema
26

computadorizado (o programa SPOT, verso 3.5.9 para Windows) no Laboratrio de

Anatomia Vegetal, do Departamento de Biologia Vegetal da Universidade Federal de
Viosa.
Foram capturadas 40 imagens das preparaes coradas com Azul de ToluidinaBorato de Sdio 1% e 10 imagens das preparaes submetidas tcnica combinada
AB+PAS. Foram capturadas imagens de, pelo menos, cinco cortes transversais do
duodeno do mesmo animal utilizando-se objetiva de 10X e zoom de 1,25 para as
preparaes coradas com Azul de Toluidina e objetiva de 20X e zoom de 1,25 para as
preparaes submetidas tcnica combinada AB+PAS.
5.4. Anlise histomorfomtrica
Estas anlises foram feitas no Programa Image Pro Plus verso 4.5 para
Windows.
5.4.1 Morfometria dos vilos
A morfometria dos vilos envolveu a determinao do dimetro basal, mediano e
apical, e altura de 50 vilos por animal. A altura do vilo foi determinada pelo trao desde
o pice at a linha do dimetro basal (PIRES et al, 2003). Foram feitas cinco medidas
de cada parmetro em 10 campos diferentes. Com estes dados encontramos tambm a
relao altura do vilo/ largura do vilo para cada animal.
A morfometria do vilo envolveu, ainda, avaliar a altura do epitlio absortivo. Em
30 vilos aleatrios foram obtidos cinco valores para esta altura.
5.4.2. Quantificao de entercitos e linfcitos intraepiteliais no vilo
Em seis vilos bem delineados em corte longitudinal e em campos aleatrios,
foram quantificados os entercitos e linfcitos intraepiteliais. Com esses dados, foi
obtida a relao entercito/ linfcito intraepitelial para cada animal.
5.4.3. Morfometria da cripta de Lieberkhn
Esta morfometria envolveu determinar os dimetros da base, meio e pice, e o
comprimento de 50 criptas por animal. Com esta anlise, foi possvel obter, ainda,
relao altura do vilo/altura da cripta de cada animal.
5.4.4. Morfometria da mucosa
Foram determinadas as espessuras da mucosa basal (epitlio da base do vilo at
o incio da muscular) e da mucosa total (pice do vilo at o incio da muscular). Foram
feitas 10 medidas por animal para cada parmetro, em fotos aleatrias.
5.4.5. Morfometria das tnicas musculares
Foram determinadas as espessuras da subcamada muscular longitudinal externa,
a subcamada muscular circular interna e a espessura total da tnica muscular. Foram
obtidas 50 medidas de cada parmetro por animal, cinco medidas por campo, em dez
campos diferentes.

27

5.4.6. Quantificao das clulas caliciformes por mm de mucosa

Em dez campos por animal, foi determinada a rea da mucosa a ser analisada.
Nesta rea, foram quantificadas as clulas caliciformes, de acordo com a colorao do
muco evidenciado pela tcnica. Os valores foram convertidos para uma rea de 1mm
de mucosa a fim de padronizao.
5.4.7. Quantificao da clula de Paneth por mm de mucosa
Nos mesmos campos utilizados para a anlise anterior tambm foram
quantificados as clulas de Paneth. Sua evidenciao foi possvel, pois os grnulos em
seu citoplasma so evidenciados na tcnica, alm de sua localizao basal. Os valores
foram convertidos para uma rea de 1mm de mucosa a fim de padronizao.
5.4.8. Obteno da superfcie de absoro (SA) do duodeno:
Para obteno destes valores, foi utilizada a seguinte frmula (HARDIN et al.,
1999):

6.
Avaliaes dos efeitos do tratamento no fgado
6.1. Obteno dos fragmentos de fgado
O fgado foi extrado, lavado imediatamente com soluo salina e pesado. Na
sequncia, parte da amostra foi fixada em soluo de paraformaldedo-glutaraldedo
(KARNOVSKY, 1965). O material permaneceu por 24 horas no fixador e foi
posteriormente transferido para soluo de lcool 70% at a incluso em glicolmetacrilato (Historesin, LEICA).
6.2. Microtomia e Colorao
Os procedimentos de microtomia e colorao foram realizados no Laboratrio
de Biologia Estrutural e Histofisiologia Reprodutiva e Digestiva, Departamento de
Biologia Geral da Universidade Federal de Viosa. O fragmento de fgado foi
seccionado em micrtomo rotativo (Reichert-Jung 2045 Multicut, Germany) para a
obteno de cortes transversais semi-seriados. O material foi seccionado na espessura de
2m e intervalo entre cortes de 20m e corado com Hematoxilina-Eosina para melhor
interpretao da morfologia do parnquima e estroma heptico.
No mtodo de colorao, as preparaes foram mergulhadas na soluo de
Hematoxilina por trs minutos. Na sequncia foram lavadas com gua corrente e
mergulhadas em soluo de Eosina por 30 segundos. Novamente, banho em gua
corrente. As preparaes foram secas em temperatura ambiente, sendo a montagem
realizada com o meio Entellan (Merck).
6.3. Captura de imagens
As imagens das seces histolgicas foram capturadas a partir do microscpio
de luz (Olympus AX 70) por meio de uma cmera de captura acoplada a um sistema
28

computadorizado (o programa SPOT, verso 3.5.9 para Windows) no Laboratrio de

Anatomia Vegetal, do Departamento de Biologia Vegetal da Universidade Federal de
Viosa. Foram capturadas 10 imagens para cada animal com objetiva de 20X e zoom de
2,00.
6.4. Anlise histomorfomtrica
Esta anlise foi feita no Programa Image Pro Plus verso 4.5 para Windows. Em
dez campos diferentes para cada animal, foi aplicada uma grade com 266 interseces,
totalizando 2.660 pontos por animal. Foram contabilizadas as intersees em hepatcito
binucleado, hepatcito mononucleado, citoplasma, sinuside, macrfago, gotcula
lipdica, necrose e vaso sanguneo. Nestes mesmos campos foram obtidos valores para o
dimetro celular e nuclear de 30 hepatcitos.
Hepatcitos binucleados e mononucleados foram considerados quando a
interseo se encontrava sobre estes ncleos. Interseces em outras regies do
citoplasma, salvo ncleo ou gotcula lipdica, foram consideradas na classificao
citoplasma. As gotculas lipdicas foram reconhecidas pela imagem negativa, o espao
branco. A necrose foi reconhecida pela morfologia disforme do ncleo e citoplasma,
colorao diferenciada e presena de ncleos picnticos.
7.
Anlise Estatstica
Para a comparao entre as mdias obtidas na observao do duodeno e fgado
foi aplicado, inicialmente, o teste de Kolmogorov-Smirnov, que verifica a normalidade
das variveis. Para verificar a diferena entre dois grupos independentes com
distribuio normal, foi utilizado o teste paramtrico de T- Student Newman-Keuls e
para os grupos que no seguiram a distribuio normal, foi utilizado o teste no
paramtrico U de Mann-Whitney.
Todos estes testes foram realizados com o software SigmaStat 3.5 com nvel de
significncia igual a 5% (p<0,05).
8.
Interpretao dos resultados
Os grupos foram comparados dois a dois considerando o tratamento (T) com o
controle (C), as linhagens knockout (A) com a selvagem (B), e machos (M) com fmeas
(F) (Tabelas 2 e 4).
Tabela 4: Combinao de grupos utilizada para a interpretao dos resultados.

Considerando o
tratamento
proposto
ATM X ACM
ATF X ACF
BTM X BCM
BTF X BCF

Considerando a
linhagem
ATM X BTM
ATF X BTF
ACM X BCM
ACF X BCF

Considerando o
sexo
ATM X ATF
BTM X BTF
ACM X ACF
BCM X BCF

29

Resultados
Extrao e avaliao do leo das sementes de sacha kiruma
1.

Rendimento da extrao de leo

A tabela 5 apresenta os resultados de eficincia da extrao do leo. A mdia de

extrao foi de 38,08%.
Tabela 5: Rendimento das seis baterias de extrao do leo de sacha kiruma.
Baterias
Cartucho
Total de
leo bruto
Eficincia na
Resduo no
amostra (g) extrado (ml)
extrao (%)
cartucho (g)
6 de 50g
300
134
44,66
191
1
6 de 100g
600
220
36,67
424,10
2
3 de 100g
300
101
33,66
215,5
3
6 de 50g
300
121
40,33
198,30
4
6
de
50
300
106
35,33
205,64
5
4 de 50g + 1 239,38
96
40,10
159,21
6
de 39,38g
TOTAL
2.039,38a
778
38,08
1.396,45
a
O total de amostra inserida no extrator foi menor que a obtida aps a moagem das sementes
devido as perdas durante a pesagem e preparo dos cartuchos.

2.
Perfil de cidos graxos do leo de sacha kiruma
Os resultados preliminares da cromatografia gasosa indicaram steres de cidos
graxos de cadeia longa (Tabela 6). Os resultados mostraram presena de intermedirios
da cadeia de biossntese dos cidos graxos linolico e linolnico, indicando a presena
inicial destes cidos graxos. O cido graxo com maior porcentagem na amostra
(50,61%) foi o eicosadienico (C20:2n6), produto direto da elongao do cido graxo
linolico (C18:2n6), da famlia -6, muito encontrado em leos vegetais.
Foi encontrada neste leo alta concentrao de poliinsaturados, 95,48% e baixa
concentrao de cidos graxos saturados (4,42%). Outros cidos graxos encontrados
foram da famlia -9, o cido olico (C18:1n9) (6,37%), o cido eladico (C18:1n9t)
(2,42%) e o cido ercico (C22:1n9) (0,02%).

30

Tabela 6: cidos graxos (% de rea) do leo extrado das sementes de sacha kiruma.

steres de cidos graxos

Saturados
Mirstico (C14:0)
Palmtico (C16:0)
Heptadecanico (C17:0)
Behnico (C22:0)
Lignocrico (C24:0)
Insaturados
Monoinsaturados
cis-10-heptadecenico (C17:1)
Nervnico (C24:1)
Poliinsaturados
mega 3
Linolnico (C18:3n3)
Eicosatrienico (C20:3n3)
mega 6
Linolico (C18:2n6)
-linolnico (C18:3n6)
Eicosadienico (C20:2n6)
Araquidnico (C20:4n6)
Docosadienico (C22:2n6)
Linoleladico (C18:2n6t)
mega 7
Palmitolico (C16:1n7)
mega 9
Eladico(C18:1n9t)
Olico (C18:1n9)
Ercico (C22:1n9)
Saturados
Insaturados
Monoinsaturados
Poliinsaturados

% de rea
0,0252
4,2853
0,0700
0,0273
0,0094

0,0273
0,0066

0,0092
0,0109
34,9018
0,0643
50,6126
0,0090
0,0169
1,0473
0,0672
2,4156
6,3744
0,0196
4,4172
95,5827
0,1011
95,4816

31

3.

Relao de cidos graxos poliinsaturados/saturados no leo

Nessa relao foram considerados os cidos graxos poliinsaturados, linolico,

linolnico e araquidnico e os cidos graxos saturados, palmtico e mirstico, obtendo-se
o valor de 8,10 (Tabela 7).
Tabela 7: Principais cidos graxos encontrados no leo de sacha kiruma e a relao
poliinsaturados/saturados.

cidos graxos
Concentrao (%)
Linolico (C18:2n6)
34,9018
Linolnico (C18:3n3)
0,0092
Araquidnico (C20:4n6)
0,0090
Poliinsaturados
34,92
Mirstico (C14:0)
0,0252
Palmtico (C16:0)
4,2853
Saturados
4,3105
Relao poliinsaturados/ saturados
8,10

32

Ensaio Biolgico
1.
Consumo alimentar
Nas duas primeiras semanas do experimento, que corresponderam ao perodo de
adaptao dos animais quanto dieta e acomodao, no se observou reduo no
consumo alimentar. Durante o experimento o consumo se manteve com pouca
oscilao, com mdia de 3,5g/animal/dia (Figura 11).

Figura 11: Consumo alimentar dos grupos tratados, controles e consumo geral ao longo do
tratamento.

33

2.
Evoluo ponderal
A massa corporal inicial dos animais variou entre 16 e 25g e, ao longo das
quinzenas (Q) oscilou entre 18 e 25g (Figura 12).

Figura 12: Evoluo ponderal dos camundongos ao longo das quinzenas (Q).

3.
Variao da massa corporal, consumo alimentar e ndice
hepatossomtico
Foram encontradas diferenas relacionadas a linhagem e ao sexo dos
camundongos para as mdias de massa corporal inicial, em que foram encontrados
machos e indivduos da linhagem BlackC57/6 com maiores valores em relao as
fmeas, ou a linhagem knockout. A mdia do grupo BTM foi maior em relao a BTF;
ACM maior em relao a ACF; BCM maior em relao a BCF; BCM maior em relao
a ACM e BTM maior em relao a ATM. Considerando as mdias de massa corporal
final, foram encontradas diferenas relacionadas ao sexo dos camundongos. A mdia
dos grupos com camundongos machos foram maiores em relao aos grupos com
camundongos fmeas, similar ao que foi obtido para a massa corporal inicial. Assim,
ATM maior em relao a ATF; ACM maior em relao a ACF; BTM maior em relao
a BTF e BCM em relao a BCF. Observando a variao de massa nestes grupos, foram
encontradas diferenas relacionadas a linhagem e ao sexo dos camundongos. A mdia
encontrada para o grupo ATM foi maior em relao a ATF, como tambm com relao
a BTM (Tabela 8).
Outra informao que foi utilizada para evidenciar o crescimento e
desenvolvimento dos camundongos foi o ndice hepatossomtico. Apenas a mdia do
34

grupo ATF apresentou diferena estatstica em relao aos demais. A mdia de ATF foi
maior em relao a ACF, em relao a ATM e em relao a BTF (Tabela 8).
Tabela 8: Dados de massa corporal, consumo alimentar e ndice hepatossomtico.
Grupo
Massa
Massa
Variao da
Consumo
ndice
corporal
corporal
massa
alimentar
hepatossomtico
inicial (g)
final (g)
corporal (g)
(g/dia/animal)
25,562,65b 5,0422,289c
3,896
0,0470,001a
ATM 20,522,14a
23,421,60b 2,6302,778ac
3,560
0,0430,005a
ACM 20,792,33a
18,751,35ab 19,710,81a 0,9571,590ab
3,641
0,0530,003b
ATF
b
a
ac
16,811,84
19,150,86
2,3341,225
3,538
0,0470,013a
ACF
25,591,09c
23,550,64b -2,0360,596b 3,278
0,0410,002a
BTM
24,852,22b -1,0323,928ab 3,590
0,0420,003a
BCM 25,893,08c
18,930,80ab 18,910,45a -0,0201,147ab 3,182
0,0430,002a
BTF
ab
a
ab
19,561,15
18,591,16
-0,9751,422
3,177
0,0470,002a
BCF
Mdias desvio padro. Mdias na coluna seguidas por mesma letra no diferem entre si ao
nvel de significncia de 5% pelo Teste de Newman-Keuls.

35

Avaliao histomorfomtrica do duodeno

1.
Morfologia do duodeno
Com este tratamento no foram encontrados indcios de que o leo extrado das
sementes de sacha kiruma possa alterar a integridade da mucosa do duodeno seja em
animais knockout para o gene Apo-E, seja em animais selvagens BlackC57/6.
Observando as preparaes histolgicas do duodeno, foi encontrada uma mucosa
ntegra com vilosidades preservadas e submucosa com caractersticas consideradas
normais para os mamferos (Figuras 13 e 15). As subcamadas musculares
apresentavam-se, da mesma forma, com morfologia normal.
2.
Morfometria dos vilos
A morfometria dos vilos no duodeno no mostrou diferenas entre os grupos nas
mdias obtidas para altura, largura do vilo e dimetro apical do vilo. Considerando o
dimetro basal do vilo, foi encontrada diferena na mdia de BCM, maior em relao a
BCF. O tratamento proposto tambm no alterou a relao entre altura do vilo/largura
do vilo (Tabela 9; Figuras 13 e 15).

Tabela 9: Dados da morfometria dos vilos do duodeno.

Grupo Altura do vilo
Dimetro da
Dimetro do
(m)
base do vilo
meio do vilo
(m)
(m)
99,116,78a
ATM 352,1963,96ab 100,7910,06a
106,2213,71ab
102,4510,95a
ACM 324,8736,71a
364,576,75ab
110,5012,36ab
105,605,63a
ATF
ab
ab
372,3773,03
112,2810,54
108,008,84a
ACF
378,6075,38ab 110,6411,34ab
103,619,61a
BTM
111,4113,78a
BCM 356,4759,06ab 122,4910,72b
389,1424,73ab 103,9211,52ab
97,357,72a
BTF
b
a
452,8944,61
99,954,61
98,345,12a
BCF
Mdias desvio padro. Mdias na coluna seguidas por mesma
nvel de significncia de 5% pelo Teste de Newman-Keuls.

Dimetro do Altura vilo/

pice do vilo largura vilo
(m)
(m)
77,008,17a
3,550,62a
78,668,94a
3,200,52a
76,912,53a
3,470,24a
a
83,959,37
3,470,77a
76,236,27a
3,710,93a
78,408,94a
3,280,89a
74,094,80a
4,020,39a
a
73,645,62
4,620,54a
letra no diferem entre si ao

3.
Superfcie de absoro
No foram encontradas diferenas entre as mdias de superfcie de absoro no
duodeno entre os grupos considerando o tratamento, o sexo e as linhagens. Na relao
altura do vilo/altura da cripta, a mdia do grupo BCF foi maior em relao a BCM
assim como em relao a ACF, diferenas estas relacionadas a linhagem e ao sexo dos
camundongos.
Quanto ao epitlio absortivo foram encontradas diferenas relacionadas ao
tratamento, em que a mdia para o grupo ACM foi maior em relao a ATM, e ACF
maior em relao a ATF. Outras diferenas encontradas foi com relao a linhagem dos
camundongos. A mdia de BTM, maior em relao a ATM; BTF maior em relao a
ATF (Tabela 10; Figuras 13 e 15).
36

Tabela 10: Morfometria da superfcie de absoro do duodeno.

Grupo
Superfcie de absoro
Altura do vilo/ Altura da
Altura do epitlio
(m)
cripta
absortivo (m)
ab
a
2,830,30
27,862,20b
ATM 35003,847075,65
2,840,24a
33,931,17a
ACM 33268,644909,77b
ab
a
38470,881389,32
2,980,33
28,371,55b
ATF
40180,778198,84ab
2,990,81a
34,452,56a
ACF
38894,806589,39ab
2,930,50a
32,682,77a
BTM
2,920,63a
36,192,92a
BCM 39204,023674,15ab
ab
ab
37906,344084,68
3,460,19
32,921,41a
BTF
44539,424868,16a
3,860,26b
34,041,35a
BCF
Mdias desvio padro. Mdias na coluna seguidas por mesma letra no diferem entre si ao
nvel de significncia de 5% pelo Teste de Newman-Keuls.

4.
Morfometria da mucosa
A morfometria da mucosa do duodeno no revelou diferenas entre os grupos,
considerando o tratamento proposto, a linhagem ou o sexo dos camundongos (Tabela
11; Figuras 13 e 15).
Tabela 11: Morfometria da mucosa do duodeno.
Grupo Espessura da mucosa basal (m) Espessura da mucosa total (m)
449,13139,80a
ATM 122,6245,16a
458,2743,24a
ACM 113,379,57a
a
132,1311,40
526,6423,96ab
ATF
124,6819,02a
506,8447,33ab
ACF
119,249,59a
495,9093,54ab
BTM
482,4843,41ab
BCM 113,7318,85a
113,8111,17a
505,6854,20ab
BTF
a
121,5815,35
604,4369,52b
BCF
Mdias desvio padro. Mdias na coluna seguidas por mesma letra no diferem entre si ao
nvel de significncia de 5% pelo Teste de Newman-Keuls.

5.
Morfometria da tnica muscular
A morfometria da tnica muscular e das subcamadas musculares no revelou
diferenas entre os grupos, considerando o tratamento proposto, a linhagem ou o sexo
dos camundongos (Tabela 12; Figuras 13 e 15).

37

Tabela 12: Morfometria das camadas musculares do duodeno.

Grupo
Espessura da muscular
Espessura da muscular
Espessura total da
externa (m)
interna (m)
muscular (m)
a
a
26,629,35
49,2914,19a
ATM 24,527,02
a
a
24,702,89
47,625,09a
ACM 22,972,47
27,512,37a
32,185,05a
60,727,28a
ATF
29,156,11a
32,684,43a
62,7412,66a
ACF
24,093,23a
27,532,79a
51,696,01a
BTM
a
a
29,224,82
54,208,09a
BCM 26,044,41
23,772,35a
28,053,07a
51,474,65a
BTF
25,472,33a
29,823,91a
56,868,31a
BCF
Mdias desvio padro. Mdias na coluna seguidas por mesma letra no diferem entre si ao
nvel de significncia de 5% pelo Teste de Newman-Keuls.

6.
Morfometria da cripta de Lieberkhn
A morfometria da cripta no mostrou alterao entre os grupos para as mdias de
comprimento, dimetro da base e largura das criptas. Foi observada diferena
estatisticamente significante nas mdias do dimetro do pice das criptas. A mdia foi
maior nos grupos ACM em relao ATM, ACF em relao ATF e BCM em relao
BTM (Tabela 13; Figuras 13 e 15).
Tabela 13: Morfometria da cripta de Lieberkhn no duodeno.
Comprimento da
Dimetro da base
Largura da
Dimetro do pice
cripta (m)
da cripta (m)
cripta (m)
da cripta (m)
a
a
a
38,441,65
40,782,74
38,402,44a
ATM 125,2525,27
37,303,39a
42,313,40a
44,122,81b
ACM 114,378,04a
124,1010,68a
35,731,48a
39,322,23a
38,741,25a
ATF
127,0915,34a
37,502,46a
41,422,41a
44,974,23b
ACF
a
a
a
130,0121,93
34,551,87
38,372,59
37,081,25a
BTM
37,183,13a
39,204,81a
44,374,35b
BCM 123,6715,03a
112,688,34a
35,431,71a
39,411,78a
41,391,95ab
BTF
117,3810,34a
36,450,71a
39,150,75a
41,821,35ab
BCF
Mdias desvio padro. Mdias na coluna seguidas por mesma letra no diferem entre si ao
nvel de significncia de 5% pelo Teste de Newman-Keuls.
Grupo

7.
Linfcitos intraepiteliais e entercitos
Na freqncia de entercitos no vilo, foram encontradas diferenas relacionadas
ao sexo e a linhagem dos camundongos. A mdia do grupo BCF foi maior em relao a
BCM e tambm em relao a ACF. No foram observadas diferenas entre as mdias
para a freqncia de linfcitos intraepiteliais ou na relao entre estas frequncias
(Tabela 14, Figuras 13 e 15).

38

Tabela 14: Frequncia de entercitos e linfcitos intraepiteliais no duodeno.

Grupo
Entercitos
Linfcitos intraepiteliais Entercito/ Linfcito intraepitelial
7,243,85a
ATM 103,3719,19a 16,675,84a
11,503,30a
7,531,05a
ACM 84,4014,94a
a
a
100,289,31
14,393,37
7,250,90a
ATF
100,8818,23a 13,923,45a
7,400,90a
ACF
96,7711,96a
15,501,69a
6,381,57a
BTM
17,176,05a
5,661,65a
BCM 91,1722,23a
111,7119,34ab 18,383,36a
6,201,15a
BTF
b
a
130,004,09
18,674,57
7,482,21a
BCF
Mdias desvio padro. Mdias na coluna seguidas por mesma letra no diferem entre si ao
nvel de significncia de 5% pelo Teste de Newman-Keuls.

8.
Quantificao das clulas caliciformes e clulas de Paneth por mm2
de mucosa
No foram encontradas clulas secretoras apenas de mucinas cidas (AB+) nas
preparaes histolgicas analisadas. A quantificao no mostrou diferena nas mdias
de clulas secretoras de mucinas neutras (PAS+) entre os grupos (Tabela 15; Figuras 14
e 16).
Em relao s clulas cuja secreo uma mistura de mucinas neutras e cidas
+
(AB PAS+), foram encontradas diferenas relacionadas ao tratamento proposto, em que
a mdia de BTM foi maior em relao a BCM, e BTF maior em relao a BCF.
Tambm foram encontradas diferenas relacionadas a linhagem e ao sexo dos
camundongos. A mdia de BTM encontrada foi maior em relao a BTF; BTM foi
maior em relao a ATM; e BTF foi maior em relao a ATF (Tabela 15; Figuras 14 e
16).
A freqncia de clulas de Paneth foi maior no grupo BCM em relao ao grupo
BCF; em ACF foi maior em relao a BCF; e em BTF foi maior em relao a BCF
(Tabela 15; Figuras 14 e 16).
Tabela 15: Tipos celulares secretores e clula de Paneth por mm de mucosa no duodeno.
Grupo
PAS+
AB+PAS+
Clula de Paneth
a
a
14,7615,72
172,9032,38
28,3516,39b
ATM
220,3214,24a 48,2313,31b
ACM 3,401,77a
6,772,48a
207,5728,13a 53,7714,75b
ATF
7,581,90a
216,7325,10a 31,1015,05b
ACF
a
10,056,56
267,8654,99c 33,2913,23b
BTM
BCM 11,7313,83a 226,6427,16a 27,705,80b
11,468,18a 265,2211,31b 32,166,34b
BTF
6,673,09a
192,1230,56a 15,942,72a
BCF
Mdias desvio padro. Mdias na coluna seguidas por mesma letra no diferem entre si ao
nvel de significncia de 5% pelo Teste de Newman-Keuls.

39

Figura 13: Seco transversal do duodeno com destaque para o vilo, cripta, mucosa e tnica
muscular (camada muscular externa (E) mais camada muscular interna (I). Azul de Toluidina
Borato de Sdio 1%. Barra: 100m.

40

Figura 14: Seco transversal do duodeno com destaque para as clulas caliciformes localizadas
ao longo das criptas e vilos, com o muco evidenciado pela tcnica (a), e clula de Paneth,
localizadas na base das criptas e cujos grnulos so evidenciados pela tcnica (b). O quadro
delimitando a base da cripta apresenta-se em destaque mostrando as clulas de Paneth, com
maior visualizao de seus grnulos, localizao basal e morfologia (b). Tcnica combinada de
Azul de Alcian e PAS. Barra: 50m

41

Figura 15: Seces transversais do duodeno representando os oito tratamentos. Azul de

Toluidina Borato de Sdio 1%. Barra: 100m.

42

Figura 16: Seces transversais do duodeno representando os oito tratamentos. Tcnica

combinada de Azul de Alcian e PAS. Barra: 50m.

43

Avaliao histomorfomtrica do fgado

1.
Morfologia do fgado
Com este tratamento, no foram encontrados indcios de que o leo extrado das
sementes de sacha kiruma possa alterar a estrutura histolgica do tecido heptico seja
em animais knockout para o gene Apo-E, seja em animais selvagens BlackC57/6. Foi
observado que em animais knockout as gotculas lipdicas eram mais frequentes. Os
cordes de hepatcitos possuam a morfologia encontrada entre os mamferos, assim
como os componentes do meio intercelular (Figuras 17 e 18).
2.
Morfometria dos hepatcitos
Na observao da freqncia de hepatcitos mononucleados foram encontradas
diferenas relacionadas ao sexo e a linhagem dos indivduos, mas no relacionadas ao
tratamento proposto. A frequncia de hepatcitos mononucleados foi maior em ACF em
relao a ACM; foi maior em BCM em relao a ACM; e foi maior em BCF em relao
a ACF (Tabela 16; Figuras 17 e 18).
Na freqncia de hepatcitos binucleados, por outro lado, foram encontradas
diferenas ligadas a linhagem dos animais. As mdias no grupo BCF foram maiores em
relao a ACF; e em BTF foram maiores em relao a ATF. No foram observadas
diferenas em relao a reas correspondendo ao citoplasma de hepatcitos.
Considerando a quantificao de gotculas lipdicas, foram observadas maiores
mdias no grupo ACF, em relao a BCF (Tabela 16; Figuras 17 e 18).
Tabela 16: Quantificao dos componentes celulares no fgado.
Hepatcito
Grupo Mononucleado Binucleado
Citoplasma
Gotculas lipdicas
4,141,61ad 197,2219,00ab 24,6616,05ac
ATM 13,601,60ab
4,962,64bd 188,8424,69ab 22,746,08ab
ACM 10,841,35b
ab
13,931,33
4,270,18ad 198,675,56ab 21,874,00acd
ATF
14,721,32a
4,321,29d 177,028,34b
31,148,06a
ACF
14,362,67ab
6,801,88cd 193,0013,97ab 10,046,60bc
BTM
7,121,64bc 193,588,17ab 13,508,23bc
BCM 15,964,06ac
16,680,92ac
7,700,87c 203,523,88a
8,064,24bd
BTF
c
c
ab
18,581,63
9,150,96
190,754,88
10,932,94bc
BCF
Mdias desvio padro. Mdias na coluna seguidas por mesma letra no diferem entre
si ao nvel de significncia de 5% pelo Teste de Newman-Keuls.

3.
Morfometria de outros componentes do fgado
Na freqncia de reas com sinusides, foram observadas maiores mdias no
grupo BCF em relao a BCM; BCF em relao a ACF; e BCF em relao a BTF. Na
freqncia de macrfagos, as mdias encontradas em BCM foram maiores em relao a
BCF; ACF em relao a BCF; em BTM tambm foram maiores em relao a ATM e
tambm maiores em BTF em relao a BCF (Tabela 17; Figuras 17 e 18).
Nas reas com necrose e na freqncia de vasos sanguneos no foram
observadas diferenas entre os grupos (Tabela 17; Figuras 17 e 18).
44

Tabela 17: Freqncia dos componentes intercelulares no fgado.

Grupo Sinuside
Macrfago
Necrose Vasos sanguneos
1,342,67a 5,182,87a
ATM 12,943,86a 6,342,62ac
ACM 15,705,39ab 9,462,98ab 0,982,19a 4,480,72a
17,205,18ab 7,432,38ab 0,000,00a 2,631,90a
ATF
19,803,47ab 10,744,15ab 0,200,31a 8,062,44a
ACF
20,826,35ab 11,501,68b 3,326,15a 6,165,05a
BTM
BCM 22,943,41b 7,062,05ab 0,560,58a 5,283,00a
14,483,25a 7,900,91ab 1,142,22a 6,522,12a
BTF
28,831,49c 3,102,08c
0,850,78a 3,830,96a
BCF
Mdias desvio padro. Mdias na coluna seguidas por mesma letra no diferem entre
si ao nvel de significncia de 5% pelo Teste de Newman-Keuls.

4.
Dimetro celular e nuclear de hepatcitos
Na morfometria dos hepatcitos, no foram encontradas diferenas entre os
grupos para os dimetros nuclear e celular, e nem na relao entre estes valores (Tabela
18; Figuras 17 e 18).
Tabela 18: Dimetros nuclear e celular dos hepatcitos.
Grupo
Dimetro nuclear de
Dimetro celular de
hepatcitos (m)
hepatcitos (m)
97,9511,84
ATM 43,982,82
44,811,63
98,967,19
ACM
45,372,21
97,884,76
ATF
46,463,83
91,927,25
ACF
42,312,84
89,965,02
BTM
91,161,88
BCM 45,913,41
45,492,26
93,886,03
BTF
45,502,68
94,762,40
BCF
Mdias desvio padro. Mdias na coluna seguidas por mesma
nvel de significncia de 5% pelo Teste de Newman-Keuls.

Relao dimetro celular/

dimetro nuclear
2,240,33
2,210,10
2,160,02
1,980,08
2,130,16
1,990,16
2,070,13
2,090,08
letra no diferem entre si ao

45

Figura 17: Seco transversal do fgado com destaque para o cordo de hepatcitos delimitado
(a), hepatcito mononucleado (b), hepatcito binucleado (c) e poro de citoplasma de
hepatcito rica em gotculas lipdicas (d). Hematoxilina- Eosina. Barra: 50m.

46

Figura 18: Seces do fgado representando os oito tratamentos. Hematoxilina- Eosina. Barra:
50m.

47

Discusso dos resultados

1.
Extrao e avaliao do leo de sacha kiruma
Com a metodologia empregada, foi obtido neste trabalho 38,08% de eficincia,
sendo preciso salientar que o hexano extrai toda a frao lipdica (FOLLEGATTI
ROMERO, 2007). Segundo Axtell & Fairman (1992), o teor lipdico destas sementes
varia entre 35 a 60%, o que corrobora o resultado obtido neste trabalho (Tabela 5). Nas
mesmas condies, segundo Hamaker (1992), o teor lipdico das sementes de sacha
kiruma cerca de 54% e de acordo com Follegatti Romero (2007) foi de 54,32%, que
segundo este autor concordante com os valores obtidos em estudos anteriores.
A composio e o perfil de cidos graxos do leo de sacha kiruma foram
determinados por Hamaker et al. (1992), em trabalho pioneiro. O grupo encontrou a
seguinte composio: 45,2% de cido -linolnico (-3), 36,8% de cido linolico (6), 9,60% de cido olico (-9) e 7,7% de cidos graxos saturados. Destes mesmos
cidos, foram encontrados na amostra deste estudo os seguintes percentuais: 34,90% de
cido linolico, 6,37% de cido olico e 4,42% de cidos graxos saturados (Tabela 6).
No leo obtido para este estudo no encontramos o cido graxo -linolnico, apenas o
-linolnico (0,06%) (Tabela 6). Segundo Follegatti Romero (2007), a extrao por
solventes pode gerar a deteriorao de -linolnico na extrao e refino devido ao uso
de altas temperaturas. A condio deste leo concorda com a literatura neste aspecto. O
que torna este leo especial sua alta concentrao de cidos graxos insaturados,
destacando o -3 (cido linolnico) e o -6 (cido linolico). Como j exposto, os
cidos graxos das famlias -6 e -3 so obtidos por meio da dieta ou produzidos pelo
organismo a partir dos cidos linolico e -linolnico, pela ao de enzimas elongase e
dessaturase (MARTIN, 2006).
Os cidos graxos das famlias -6 e -3 encontram-se relacionados com a
preveno de doenas cardiovasculares, por meio da reduo dos nveis de triglicerdeos
e colesterol sanguneo, aumentando a fluidez sangunea e reduzindo a presso arterial
(ANJO, 2004). O leo extrado das sementes de sacha kiruma uma excelente fonte de
cidos graxos poliinsaturados, compostos principalmente pelo linolnico (C18:3n3) e
linolico (C18:2n6), e seus subprodutos. No leo obtido para este estudo, foram
encontrados 95,48% de cidos graxos poliinsaturados. Segundo Hamaker et al. (1992),
esta porcentagem foi 82%. Segundo o mesmo autor, o leo de sacha kiruma possui
cerca de 91,6% de cidos graxos insaturados, tornando-o o leo com maior
concentrao de insaturados conhecida. A quantidade de cidos graxos poliinsaturados
encontrados no presente estudo concorda, ento, com os dados da literatura consultada.
A extrao por Soxhlet tem alto rendimento, em torno de 54,3% mas, pode reduzir a
quantidade de cidos graxos poliinsaturados no leo devido a oxidao pela exposio
as altas temperaturas (PRADO et al., 2011). Esta situao no foi encontrada neste
ensaio, como comprovado pela alta concentrao de poliinsaturados encontrada,
95,48%.
Segundo as recomendaes de rgos da sade, a razo entre as somatrias dos
cidos graxos poliinsaturados e saturados deve ser maior que 0,45, para serem
consideradas saudveis em relao s doenas cardacas (CALDERELLI et al., 2008;
YUNES, 2010). O leo de sacha kiruma apresentou razo poliinsaturados/saturados
48

igual a 8,10 (Tabela 7). Este dado indica que este leo manteria os benefcios em
relao a preveno de doenas cardiovasculares j descritos na literatura consultada.
2.
Evoluo do consumo alimentar e massa corporal dos camundongos
durante o ensaio biolgico
Nas primeiras duas semanas aceitvel uma alterao do padro de alimentao
devido adaptao dos animais as novas acomodaes. Os camundongos neste estudo
no apresentaram problemas com adaptao dieta, mantendo mdias semelhantes de
consumo dirio de dieta ao longo das semanas de ensaio, desde o incio da oferta da
mesma (Figura 11). A dieta foi armazenada seguindo recomendaes, o que foi
importante para evitar a oxidao dos cidos graxos. Os animais apresentaram um
desenvolvimento e comportamento semelhante ao longo das semanas.
O ndice hepatossomtico foi utilizado para avaliar o crescimento dos animais,
uma vez que o fgado o principal rgo do metabolismo lipdico, de formao das
lipoprotenas e de armazenamento de vitaminas (BRITO, 2008; GUYTON, 1992). O
seu aumento sugere um comprometimento no desenvolvimento normal desses animais,
bem como ndice de hepatotoxicidade (BRITO, 2008). A alterao encontrada neste
valor para um dos grupos no pode ser atribuda ao tratamento proposto. Os resultados
para o ndice hepassomtico entre os grupos tratados e controles est de acordo e
complementa os dados expostos (Tabela 8).
Em trabalho com leo de aroeira vermelha (Schinus terebinthifolius Raddi)
realizado por Silva et al. (2010), frangos de corte foram tratados com o leo essencial
extrado dos frutos, acrescido de antibiticos e tambm no encontraram diferenas no
consumo alimentar entre os grupos. Estes dados esto de acordo com os dados do
desenvolvimento ponderal ao longo do ensaio. A proporo se manteve ao longo das
semanas, em acordo com o consumo da rao (Tabela 8). No mesmo experimento,
Silva et al. (2010) encontraram ganho de massa e massa final superiores nos grupos
tratados com o leo de aroeira vermelha em relao aos controles. Segundo os autores,
a maximizao nesses ndices zootcnicos parece indicar uma melhoria nos processos
de digesto e absoro de nutrientes, tornando-os mais eficientes.
Alguns estudos sobre o consumo de nozes e amendoim em humanos, fontes de
cidos graxos poliinsaturados e monoinsaturados, respectivamente, verificaram que,
embora esses alimentos sejam altamente energticos, os voluntrios estudados no
aumentaram a massa tanto quanto o consumo energtico (ALMARIO et al., 2001; HU
et al., 1998; KRIS-ETHERTON et al., 1999; OBYRNE et al., 1997; ZAMBN et al.,
2000). Em outro estudo, Cintra (2003) tambm encontrou resultado semelhante em ratos
(SALES et al., 2005).
3.
Avaliao dos efeitos do tratamento no duodeno
A mucosa intestinal deve apresentar caractersticas morfofuncionais adequadas,
pois os processos de absoro so dependentes da integridade do epitlio. Inmeros
agentes infecciosos ou no infecciosos podem lesar a mucosa intestinal, alm de
comprometer os processos digestrios (SILVA et al., 2010). De acordo com Macari et
al. (2002), a capacidade absortiva do intestino proporcional ao nmero de vilosidades
ali presentes. A manuteno do tamanho dos vilos garante a manuteno da capacidade
49

digestiva e de absoro intestinal (PELICANO et al., 2003). As observaes da

morfometria das vilosidades indicam que o leo de sacha kiruma no alterou a
capacidade absortiva do duodeno (Tabela 9, Figuras 13 e 15). Para complementar esta
informao, tem-se os dados de superfcie de absoro, em que no foram encontradas
diferenas entre os grupos (Tabela 10, Figuras 13 e 15).
A relao altura do vilo/ largura do vilo tambm no mostrou diferenas entre os
tratamentos (Tabela 10, Figuras 13 e 15). Silva et al. (2010), no trabalho realizado com
o leo de aroeira vermelha e antibiticos em frangos de corte encontraram maior altura
de vilosidades em frangos tratados com o leo, confirmando que o aumento do ganho de
massa e massa final estavam condicionados ao aumento da superfcie de absoro
considerada, corroborando a literatura. Este grupo verificou, entretanto, que no houve
diferena significativa entre os tratamentos (P>0,05) para a relao vilo/cripta do jejuno
dos animais.
Segundo Macari (1999), a relao desejvel entre vilosidades e criptas intestinais
quando as vilosidades se apresentam altas e as criptas rasas. Neste trabalho, o
tratamento com o leo das sementes de sacha kiruma no alterou esta relao. Foram
encontrados vilos com altura de duas a trs vezes maiores em relao altura das
criptas, confirmando Macari (1999). Se o processo de reposio celular for adequado, o
valor da relao altura da vilosidade e profundidade de cripta maior, indicando
presena de maior nmero de entercitos maduros e funcionais (TUCCI, 2003). Sabe-se
ainda que o aumento da perda celular nas vilosidades resulta em aumento da
profundidade de criptas (TUCCI, 2003), que devem assegurar uma adequada taxa de
renovao celular e garantir a reposio das clulas na regio apical dos vilos (PLUSKE
et al., 1997). Desta forma, quanto maior a altura das vilosidades e menor a profundidade
das criptas, mais eficientes sero os processos de digesto e absoro de nutrientes e
menores as perdas energticas com o turnover celular (AUGUSTO, 2009). Os dados
deste trabalho concordam com aqueles presentes na literatura. No foram encontradas
diferenas entre os grupos para a morfometria das criptas de Lieberkhn que possa ser
diretamente atribuda ao tratamento proposto. A diferena encontrada para o dimetro
do pice das criptas no interfere na funo de reposio celular, atribuda a esta
estrutura (Tabela 13; Figuras 13e 15). Silva et al. (2010) em seu trabalho com jejuno de
frangos tratados com antibiticos e leo de aroeira vermelha no encontraram alterao
neste parmetro.
De acordo com Boleli et al. (2002) a taxa de digesto e absoro intestinal esto
diretamente relacionados com as taxas de proliferao e diferenciao celular, pois
quanto maiores os vilos e sua densidade, maiores sero as reas de digesto e absoro
(ANTUNES, 2008). Como se sabe, a altura de vilos est diretamente relacionada ao
nmero dos diferentes tipos de clulas presentes no epitlio intestinal. Considera-se que
o nmero de entercitos assim como a altura e o nmero de microvilos e estrutura da
membrana determinam a dimenso da superfcie da digesto e absoro intestinal
(ANTUNES, 2008; UNI, 2000).
Na quantificao dos entercitos nos vilos no foram encontradas diferenas que
sugerem uma atuao do leo de sacha kiruma neste aspecto (Tabela 14, Figuras 13 e
15) resultado concordante com dados de superfcie de absoro e morfometria de vilos
j apresentados. A observao da freqncia de linfcitos intraepiteliais tambm no
50

mostrou diferenas entre os grupos, sugerindo ausncia de processos inflamatrios no

duodeno. Outro tipo celular analisado, a clula de Paneth, teve sua freqncia
aumentada no grupo BTF em relao BCF (Tabela 15; Figuras 14 e 16). Entretanto,
este resultado isolado no permite afirmar que seja devido ao uso do leo de sacha
kiruma. As clulas de Paneth contribuem para a funo da barreira intestinal pela
liberao de grnulos contendo diversas substncias antimicrobianas (CARLOS, 2006).
Com relao s clulas caliciformes, no foram encontradas clulas secretoras
apenas de mucinas cidas no sulfatadas (AB+) nas preparaes histolgicas analisadas
e no foram encontradas diferenas entre os grupos na freqncia de clulas secretoras
apenas de mucinas neutras (PAS+) (Tabela 15; Figuras 14 e 16). Considerando que os
mucopolissacardeos cidos protegem contra a translocao bacteriana (FONTAINE et
al, 1996), a ausncia deste tipo celular no duodeno pode estar ligada ao fato de que a
concentrao de microorganismos nesta regio ser muito baixa. Quando se observa a
freqncia de clulas secretoras de uma mistura de mucinas cidas e neutras (AB+PAS+)
foram encontradas diferenas ligadas a linhagem selvagem. Animais da linhagem
selvagem tiveram mdias maiores em relao a linhagem knockout, e em grupos que
receberam o leo de sacha kiruma foram encontradas maiores mdias para a freqncia
deste tipo celular, em relao aos controles (Tabela 15; Figuras 14 e 16). Segundo
Carlos (2006) os cidos graxos de cadeia curta estimulam secreo das clulas
caliciformes. O leo utilizado neste ensaio no apresentou concentrao de cidos
graxos de cadeia curta, mas estas diferenas podem ser atribudas a um possvel
potencial estimulador dos cidos graxos de cadeia longa, assim como acontece com os
de cadeia curta. Battistelli et al. (2010) trabalharam com camundongos tratados durante
24 meses com soja geneticamente modificada e encontraram diferenas ligadas a dieta.
A frequncia de clulas secretoras de mucinas neutras e cidas foram maiores nos
grupos tratados, enquanto a freqncia daquelas secretoras de mucinas neutras no
alterou entre os grupos. A anlise das clulas caliciformes se torna importante para se
avaliar efeitos de diversos tipos de dietas, pois a quantidade e a qualidade das clulas
caliciformes podem ser alteradas em funo destas dietas, influenciando no processo de
translocao bacteriana (CARLOS, 2006; FRANKEL et al, 1995).
Na mucosa intestinal do rato, a relao entercito/ linfcito intraepitelial
esperada de 10:1 (ANTUNES, 2007). Neste trabalho com sacha kiruma esta relao
variou entre aproximadamente 5:1 a 7:1 e no foram encontradas diferenas entre os
grupos. Apesar destes dados, no foram valores suficientes para alterar a morfometria
dos vilos e das criptas (Tabela 14, Figuras 13 e 15).
O tipo de alimentao determina variaes na morfologia intestinal. Yasar &
Forbes (1998) relataram que as caractersticas fsicas e qumicas das dietas modificam a
integridade das clulas epiteliais da mucosa do tubo digestivo. A morfometria da
mucosa complementa a morfometria do epitlio absortivo. Para este tratamento no
encontramos diferenas entre os grupos, indicando que o leo de sacha kiruma, no
altera os constituintes da mucosa do duodeno (Tabela 10; Figuras 13 e 15).
Outro ponto importante a se considerar a motilidade intestinal. O trnsito do
alimento no lmen pode variar dependendo da qualidade deste alimento ou devido a
problemas na musculatura ou inervao da mesma. Tanto a espessura das subcamadas
musculares quanto a tnica muscular no foram alteradas com o tratamento (Tabelas 11
51

e 12; Figuras 13 e 15). Silva et al. (2010) com o trabalho com leo de aroeira vermelha
tambm no encontraram diferena significativa entre os tratamentos para a espessura
da tnica muscular do jejuno.
4.
Avaliao dos efeitos do tratamento no fgado
O fgado o principal rgo responsvel pela manuteno da homeostase
metablica, participa da biotransformao de metablitos circulantes e na
desintoxicao e excreo de resduos metablicos e de contaminantes externos. um
rgo muito susceptvel a potenciais leses por substncias farmacuticas e qumicas,
que podem provocar hepatotoxicidade (ALVARADO-RICO & CASTRO, 2010).
Diante de possveis leses a que o fgado submetido, os hepatcitos contam
com mecanismos eficientes para enfrentar as modificaes ao seu entorno. Para manter
a homeostase, o fgado responde, seja aumentando seu tamanho (hipertrofia) ou
incrementando o nmero de clulas, por meio da diviso celular (hiperplasia), como
resposta adaptativa ao estresse (ALVARADO-RICO & CASTRO, 2010).
Os hepatcitos tm como caracterstica a presena de dois ou mais ncleos, e
geralmente apresentam tamanho uniforme. A hipertrofia acontece quando estas clulas
aumentam consideravelmente de tamanho, podendo ocorrer tambm o aumento do
ncleo. A hipertrofia, tumefao ou aumento de clulas so achados morfolgicos
comuns em vrias doenas inflamatrias do fgado, resultando de alteraes funcionais
na bomba de sdio com reteno citoplasmtica deste e de gua (LORA, 2007). A
hiperplasia celular pode ser identificada com a maior frequncia de hepatcitos
binucleados, um indicativo da etapa final da diviso. Aumento na frequncia de
hepatcitos binucleados tambm pode indicar maior atividade metablica do tecido.
Neste ensaio no foram observadas diferenas entre a frequncia de hepatcitos
mononucleado e binucleado, entre os grupos que receberam o tratamento e seus grupos
controles (Tabela 16; Figuras 17 e 18). No foram encontradas, ainda, diferena nos
dimetros celular e nuclear ou na relao entre os dimetros citoplasma/ ncleo,
indicando que o tratamento no provoca alterao no volume celular ou nuclear dos
hepatcitos (Tabela 17; Figuras 17 e 18).
Segundo Lora (2007), tanto o aumento do volume de hepatcitos e de seus
ncleos quanto a necrose j foram verificados em quadros de intoxicao por
Arrabidaea bilabiata L. (Bignoniaceae) (chibata) em coelhos; com frutos de Melia
azedarach L. (Meliaceae) (cinamomo) em sunos e intoxicao por Mascagnia sp.
(Malpighiaceae) (timb). No presente trabalho, no foram observados indcios
morfolgicos de que o leo extrado de sacha kiruma, oferecido na dose de lipdios
diria recomendada para estes camundongos, possa causar dano na morfologia do
fgado. Lora (2007) afirma ainda que, segundo Sherlock (1978), a hepatotoxicidade
relacionada com dose-dependncia. Lora (2007) trabalhou com extrato hidroalcolico
de Eugenia uniflora L. (Myrtaceae) (pitanga) em camundongos de ambos sexos e
encontrou sinais de hepatotoxicidade dose-dependente. Encontrou alteraes em
hepatcitos e necrose nos grupos tratados em relao aos controles.
Batista et al., (2006) trabalharam com infuso de razes de Cayaponia tayuya
(Cucurbitaceae) (abbora-danta) em camundongos swiss machos e encontraram vasos
sanguneos e sinusides volumosos e congestos e reas com necrose. No ensaio com
52

sacha kiruma no foram encontradas alteraes na frequncia e morfologia dos vasos

sanguneos e nem na freqncia de reas com necrose (Tabela 17; Figuras 17 e 18). Este
resultado corrobora os resultados anteriores e indicam que nas condies deste ensaio, o
leo extrado das sementes de sacha kiruma no teria efeito hepatotxico.
A esteatose a forma inicial de leso heptica sendo diagnosticada quando a
gordura representa mais de 5% do peso do fgado (AGUIAR, 2008; STOUT et al.,
2011). Caracteriza-se pelo acmulo de triglicerdeos no citoplasma celular, na forma de
gotculas de lipdeos, geralmente com a manuteno da funo heptica. De acordo
com Aguiar (2008), a esteatose heptica decorre de um conjunto de alteraes:
diminuio da oxidao dos lipdeos pelo fgado; aumento da lipognese heptica;
diminuio da sntese e liberao de lipoprotenas; aumento da mobilizao de tecido
heptico e aumento da entrada heptica dos lipdeos circulantes. Neste trabalho com
sacha kiruma foi observada diferena na frequncia das gotculas lipdicas no
citoplasma entre os grupos que receberam o tratamento e os grupos controles. Foram
encontradas diferenas relacionadas a linhagem dos camundongos. Camundongos da
linhagem knockout do grupo controle apresentaram maior freqncia de gotculas
lipdicas no citoplasma em relao aos selvagens (Tabela 16; Figuras 17 e 18). Nestes
indivduos, a inflamao precoce do fgado e maior frequncia de reas com gotculas
lipdicas j seriam esperadas devido ao defeito na sntese da apoprotena E (WOUTERS
et al., 2008). A ausncia de dado semelhante relacionado ao grupo tratado pode indicar,
por outro lado, um efeito protetor do leo de sacha kiruma neste aspecto.

53

Concluses
1.
O mtodo de extrao utilizando o hexano como solvente orgnico foi
considerado eficiente para a extrao de leo das sementes de sacha kiruma; sendo que
o rendimento de extrao foi maior utilizando cartuchos com menor massa de amostra;
2.
A composio de cidos graxos do leo extrado das sementes cultivadas
em Viosa (MG) foi similar quela encontrada na literatura;
3.
O consumo das dietas e a evoluo ponderal dos grupos de camundongos
controle e tratado com o leo de sacha kiruma foi similar durante o ensaio biolgico;
4.
A estrutura histolgica do duodeno e do fgado no mostrou alteraes
devido ao tratamento com o leo.
Neste ensaio no encontramos sinais de toxidez do leo extrado de sacha
kiruma que pudesse inviabilizar seu consumo. Estudos futuros relacionando seu uso
com a estrutura do sistema cardiovascular de animais deficientes em apoprotena E
sero necessrios para agregar novas informaes. Alm disso, seria interessante o
desenvolvimento de estudo com dose-dependncia, a fim de determinar uma faixa
segura de consumo do leo de sacha kiruma.

54

Anexos
Anexo I
Mtodo de extrao do leo das sementes de sacha kiruma por Soxhlet
utilizando o hexano como solvente
Foi utilizado um Extrator de gordura Soxhlet de 500ml. Inicialmente a amostra
foi dividida em cartuchos de extrao com 50g ou 100g cada, a fim de verificarmos se
haveria diferena de rendimento no processo de extrao. Cada bateria comportava seis
cartuchos e foram necessrias seis baterias de 24 horas. Os cartuchos foram
confeccionados com papel de Germinao de Sementes (28x38 cm com 65 g) e seu
tamanho foi padronizado de acordo com o tamanho do Soxhlet. Os cartuchos foram
acomodados no Soxhlet e o volume completado com Hexano. A temperatura da chapa
aquecedora foi controlada durante todo o processo mantendo-se prximo a 69C, dentro
da faixa para a ebulio do hexano, que varia entre 68C e 70C. A temperatura da
gua do condensador tambm foi controlada durante todo o processo mantendo-se
prximo a 16C 1C.
O volume de solvente utilizado foi o suficiente para completar o volume do
Soxhlet e permitir duas sifonagens, quando o solvente passa por toda a amostra e se
deposita no balo de fundo chato acoplado, em torno de 400ml de hexano.
Principio do mtodo de extrao: O hexano presente no balo de fundo chato,
em contato com a placa aquecedora evapora, passando ao longo do Soxlet. Em contato
com a gua mais fria este vapor condensa e retorna ao balo de fundo chato. Neste
percurso, o solvente lava a amostra contida no cartucho levando parte do leo. Assim,
ao final das 24 horas temos uma mistura do hexano com o leo de Sacha kiruma no
balo, e uma amostra livre de leo nos cartuchos. Estes cartuchos foram recolhidos e
armazenados em estufa a 45C por 12 horas para posterior pesagem.

Anexo II
Descrio da destilao com Rotavapor a vcuo da amostra aps o processo de
extrao por Soxhlet utilizando o hexano como solvente
Inicialmente, foi preciso padronizar todo o sistema com um balo de fundo
redondo contendo apenas hexano. O sistema funcionou desta forma por cerca de 30
minutos e, posteriormente o balo foi trocado por um contendo nossa amostra. Como
trabalhamos em um ambiente com vcuo, a evaporao do solvente ocorreu em uma
temperatura abaixo de seu ponto de ebulio. Vale ressaltar que para o hexano, o ponto
de ebulio 69C.
Iniciamos a etapa com uma temperatura de 30C e, vagarosamente, foi
aumentada para 40C, 50C e, finalmente, 55C, mantendo-se at o final do processo. O
balo de fundo redondo com a amostra ficava girando constantemente o que facilitou a
evaporao do solvente.
O hexano evaporava da amostra, passava pelo condensador e, em contato com a
gua resfriada, condensava e caa no balo de fundo redondo para este fim. Tal solvente
considerado puro podendo ser novamente utilizado. Para a nossa extrao foi utilizado
apenas hexano novo.
55

Anexo III
Descrio da etapa de borbulhar nitrognio na amostra obtida do processo de
destilao com Rotavapor a vcuo
Aps a destilao, a amostra de leo foi retirada do balo de fundo redondo e
armazenada em um kitasato. Este foi colocado em um banho-maria com temperatura
controlada em 55C por 10 minutos. Um cateter com uma seringa, adaptado a partir de
um balo de nitrognio foi introduzido nesse kitasato e, em constante e delicado
movimento, borbulhou-se nitrognio na amostra.

Anexo IV
Extrao de lipdeos do leo de sacha kiruma e obteno dos steres dos cidos
graxos.
Mtodo de Folch (1957) modificado:
1)
Pesar a amostra em tubo de ensaio fresco e identificado. Para o leo, utilizou-se
30mg,
2)
Adicionar 1,0ml de clorofrmio: metanol e macerar com basto de vidro,
acrescentar 0,9ml de clorofrmio:metanol, lavando o basto de vidro e retirando-o do
tubo de ensaio,
3)
Homogeinizar em vrtex por 3min,
4)
Adicionar 0,4ml de metanol puro,
5)
Centrigufar por 3min a 3000 RPM. Foi utilizada a centrfuga para 16 tubos de
ensaio da Quimis,
6)
Passar o sobrenadante para um tubo de ensaio rosquevel seco, pesado e
identificado,
7)
Acrescentar 0,8ml de clorofrmio puro,
8)
Adicionar 0,64ml de soluo de NaCl a 0,73%,
9)
Homogeneizar em vrtex por 30seg,
10)
Centrifugar por 10 min a 3000 RPM,
11)
Desprezar a fase superior com pipeta de Pasteur,
12)
Lavar trs vezes a parede interna do tubo de ensaio com 0,3ml de soluo de
Folch de cada vez sem afetar a parte superior,
13)
Desprezar a fase superior,
14)
Secar em estufa semi- aberta a 40C, sugesto overnight, mas verificar se o
solvente evaporou por completo antes de prosseguir.
As etapas envolvendo os solventes foram realizadas em capela de exausto.

56

Mtodo de Hartman & Lago (1973) modificado:

Aps a etapa anterior, procede-se com a saponificao e esterificao desses
cidos graxos, com as seguintes etapas:
1)
Pesar os tubos com a amostra da etapa anterior,
2)
Para as etapas seguintes, utilizar uma alquota de 15mg de amostra,
3)
Adicionar 1,2ml de reagente de saponificao,
4)
Rosquear os tubos de ensaio e levar ao banho-maria por 15min,
5)
Adicionar 3ml de reagente de esterificao no tubo de ensaio que saiu do banhomaria,
6)
Rosquear os tubos de ensaio e levar novamente ao banho-maria por 15min,
7)
Deixar resfriar at 40C,
8)
Adicionar 0,5ml de hexano,
9)
Adicionar 1,5ml de NaCl a 20%,
10)
Homogeneizar em vrtex por 30seg,
11)
Retirar a fase superior e transferir para um frasco mbar previamente
identificado,
12)
Adicionar novamente no restante do tubo de ensaio 0,5ml de hexano,
13)
Retirar a fase superior e colocar no mesmo frasco mbar,
14)
Borrifar nitrognio at evaporar todo o hexano, fechar o tubo de ensaio,
15)
Armazenar em 20C.
As etapas envolvendo os solventes foram realizadas em capela de exausto.

57

Preparo de Solues

Extrao de lipdeos e obteno dos steres dos cidos graxos

1.

Soluo de Folch

- 3% de clorofrmio,
- 48% de metanol,
- 47% de gua destilada,
- 2% de NaCl 29%
Misturar os componentes. Agitar no agitador magntico por 10min e reservar em frasco
mbar.
2.

Reagente de esterificao

-2g de cloreto de amnio,

-60mL de metanol,
-3mL de cido sulfrico concentrado
Adicionar o cloreto de amnio e o metanol em balo volumtrico, prprio para refluxo.
Adicionar, pelas paredes do balo e vagarosamente o cido sulfrico. Colocar a mistura
em refluxo por trs horas, at a dissoluo total do cloreto de amnio.

3.

Reagente de saponificao

- 2g de NaOH,
- 100Ml de metanol
Adicionar o hidrxido de sdio no balo volumtrico de 100mL, completar o volume
com metabol, dissolver o NaOH. Reservar em recipiente de plstico.

Soluo fixadora

4.

Fixador Karnovsky

Soluo A:
-Paraformaldedo 4%
100 ml de paraformaldedo 40%
900 ml de tampo fosfato de sdio 0,1M pH 7,3 (450ml de gua destilada + 450ml de
tampo fostato 0,2M)

58

Soluo B:
-Glutaraldedo
160ml de glutaraldedo 25%
420ml de tampo fosfato de sdio 0,2M pH 7,3
420ml de gua destilada
Manter as duas solues na geladeira e misturar na hora do uso.

Corantes

5.

Eosina

Eosina yellowish (Eosina y)--------------- 2g

Bicromato (dicromato de potssio)------- 1g
Soluo aquosa saturada de cido pcrico---- 20,0ml
lcool absoluto---------- 20,0ml
gua destilada------- 160,0ml
Dissolver a eosina no lcool (soluo A) e o bicromato de potssio na gua (soluo B).
Misturar A e B e adicionar a soluo de cido pcrico.

6.

Hematoxilina de Harris

Hematoxilina ------ 0,5g

lcool absoluto---- 5,0ml
Sulfato de alumnio e potssio (almen de potssio)--- 10,0g
xido vermelho de mercrio --------- 0,25g
gua destilada------ 100,0ml
Dissolver a hematoxilina no lcool e o sulfato de alumnio e potssio na gua quente.
Misturar as duas solues e aquecer at a fervura. Remover do fogo, adicionar o xido
de mercrio e mergulhar o frasco (contendo a soluo) em gua fria. Essa soluo
envelhece no prazo de 2 a 3 meses, poca em que se forma um precipitado no seu fundo
e o corante passa a corar os tecidos fracamente. Nestas condies, preparar nova
soluo.
7.
Azul de Toluidina- Borato de sdio
- 0,5g de azul de toluidina
-1 g de borato de sdio
-99ml de gua destilada
Dissolver 1g de borato de sdio em 99ml de gua destilada e, em seguida, acrescentar
0,5g de azul de toluidina. Agitar e filtrar em papel filtro. Conservar em frasco mbar.

59

8.
Reativo de Schiff
Fucsina bsica-------- 1g
gua destilada------- 200ml
cido clordrico 1N------ 20ml
Bissulfito de anidro------ 1g
Ferver a gua destilada e adicionar a fucsina bsica. Esfriar at 50C e filtrar. Adicionar
o cido clordrico 1N, esfriar at 25C e acrescentar o bissulfito de sdio. Guardar a
soluo em ambiente escuro durante pelo menos 12 horas ( a recomendao de 48
horas). Em seguida, adicionar 2g de carvo ativado, misturar e filtrar.
Obs: Soluo HCL 1N:
HCl concentrado------- 8,5ml
gua destilada------- 91,5ml
9.
Azul de Alcian pH 2,5
gua destilada----------------------------97ml
cido actico glacial--------------------3ml
Alcian Blue 8 GX--------------------------1g
Dissolver o Alcian Blue na gua destilada e cido actico. Agitar por 15 min no agitador
magntico e filtrar em papel filtro. Conservar em frasco mbar.

60

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