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Objetivo.
Introduccin.
El mtodo de Bradford es una tcnica colorimtrica utilizada para medir la
cantidad de protena contenida en una muestra por medio de su absorbancia
midindola con espectrofotmetro. Con ayuda de una curva de calibracin
sabremos la cantidad de protena que tiene cada uno de los tubos que
preparemos, con lo cual podemos comparar las absorbancias obtenidas en la
curva de calibracin con las absorbancias obtenidas en los tubos problema. El
mtodo de Bradford utiliza el azul brillante de comassie G-250, este colorante
forma un complejo con protenas que contengan aminocidos aromticos y
bsicos tal es el caso de la arginina, histidina y lisina, por lo tanto podemos
decir que es selectiva y puede ser ms funcional para las protenas que tengan
mayoritariamente estos aminocidos. Esta unin del colorante con las
protenas provoca un cambio en el mximo de absorcin del colorante desde
470 a 595 [nm]. Ya que el colorante azul brillante de comassie G- 250 depende
de la carga que tenga en ese momento, ya que si se encuentra en forma
catinica el color se tornara de una tonalidad caf rojizo que es posible
medirse a una longitud de onda de 470 [nm], si se encuentra en forma neutra
el colorante tornara a una tonalidad verde la cual es posible medirse a una
longitud de onda de 650 [nm], en cambio cuando se encuentra en forma
anionica se puede observar que el colorante torna a una tonalidad de azul la
cual es posible medir a 595 [nm], en el mtodo de Bradford el colorante al
ponerlo en contacto con los tubos de protena se torna azul, esto sucede por
las energas de enlace implicados. Mientras que los grupos sulfnicos ionizados
pueden experimentar interacciones electrostticas con la protena existe la
posibilidad de que se encuentre cargada grupos funcionales de la protena 1
Resultados
1) Curva de calibracin
Cantidad de
protena [g]
25
50
75
100
125
Promedio A
595[nm]
595[nm]
0.094
0.209
0.355
0.415
0.553
0.100
0.232
0.296
0.382
0.531
0.097
0.2205
0.3255
0.3985
0.542
40
60
80
100
120
140
f(x) = 0x - 0
R = 0.99
40
60
80
100
120
140
1.4
Pendiente: nos indica la sensibilidad que tiene el mtodo de Bradford.
Ordenada al origen: nos indica la absorbancia mnima que puede llegar a
detectar el mtodo de Bradford.
Coeficiente de correlacin: Es la precisin que existe entre los valores de
absorbancia dependientes de la cantidad de protena, en cuanto el valor se
encuentre ms cercano a la unidad es porque existe una mayor precisin en
nuestro mtodo.
X=
y (0.0037) [ ]
[ g]
0.0043
2) Anlisis estadstico.
2.1 Con la ecuacin para conocer x se calcul la cantidad de protena para
cada uno de los tubos del anlisis estadstico.
Tubo
A595[nm]
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
0.22
0.281
0.196
0.24
0.255
0.256
0.299
0.26
0.235
0.26
Cantidad de protena
[g]
61.3255814
52.0232558
66.2093023
46.4418605
56.6744186
60.1627907
60.3953488
70.3953488
61.3255814
55.5116279
Tabla 2. Obtencin de la cantidad de protena en cada uno de los tubos en el anlisis estadstico.
Xi-Media
7.83023256
-1.472093
12.7139535
-7.0534884
3.17906977
6.66744186
6.9
16.9
7.83023256
2.01627907
S=
728.0351
=8.99404186
101
S
8.9940
(100 )=
( 100 )=16.812676
Media
53.4953488
=(MEDIA)
Tv , NCS
n
Donde Tv,NC = valor t de student critica o de tablas, Tv,NC para n=10 y n-1= 9 con
un 95% de confiabilidad es de 2.262, entonces para calcular los lmites de
confianza tenemos que
=53.4953488
2.262 ( 8.994044186 )
=53.4953488 6.433502
10
T ==
Di
n
X prueba (Bradford)
61.3255814
52.0232558
66.2093023
46.4418605
56.6744186
60.1627907
60.3953488
70.3953488
61.3255814
55.5116279
X prueba X referencia
-12.358619
-35.345144
0.4199023
-24.08444
-13.851881
9.1101907
9.3427488
4.6059488
4.4834814
-8.6988721
-75.075556
Tabla 4. Datos para la obtencin del promedio de la diferencia de los datos de Lowry y Bradforf.
Di 75.075556
=
= -7.5075556
n
10
(Di-D)2
23.5328123
-27.837589
7.92745789
-16.576884
-6.3443258
16.6177463
16.8503044
12.1135044
11.991037
-1.1913165
(Di-D)2
774.93134
62.8445886
274.79308
40.25047
276.149492
283.932758
146.736989
143.784968
1.41923503
2028.37573
Tabla 5. Datos para la obtencin de T calculada.
2028.77573
=
101
15.0124975
Ahora se calcula el valor de T
10
F=
varianza de b
121.0711
=
varianza de a 80.89278888 =1.49668
3) Interferencias
3.1 y 3.2
Tubo
Sustancia
A595[nm]
Cantidad de
protena
Interferenci
a
Tris pH=7
Glicerol 1%
0.425
Detergente
1%
Dodecil
sulfato de
sodio 1%
cido tricoloro
actico 5%
Fenol 1%
Mercaptoetan
ol 0.1%
Tris pH= 10
0.059
Urea 5%
Sulfato de
amonio
0.384
0.334
5
6
7
8
9
10
0.46
0.01
[g]
107.837209
3
99.6976744
2
14.5813953
5
3.18604651
2
Positivo
Positivo
Negativo
Negativo
0.412
96.6744186
Positivo
0.451
0.461
105.744186
108.069767
4
95.0465116
3
90.1627907
78.5348837
2
Positivo
Positivo
0.405
Positivo
Positivo
Positivo
Comparacin.
Nos damos cuenta que el mtodo de Bradford es ms rpido, tiene
demasiadas interferencias que pueden afectar en nuestro anlisis como los
compuestos con cationes, detergentes o los compuestos con un pH alcalino,
en el mtodo de lowry es un mtodo lento en el que se pueden tener como
interferencias los detergentes o sustancias reductoras.
Discusiones.
a) El mtodo de Bradford puede debe de utilizarse preferentemente en
protenas que tengan un alto contenido de aminocidos como arginina,
lisina o histidina para que as se forme la carga necesaria para que
podamos ver la coloracin azul y podamos medir la absorbancia a una
longitud de onda de 595[nm].
b) En nuestro caso se perdi la linealidad en el penltimo punto
correspondiente a la cantidad de protena de 100 g esto se puede
deber a un descuido o falta de precisin por parte de los analistas, ya
que hubo la posibilidad de que no se adicionara la cantidad correcta en
ese tubo.
c) Se encontr que existe una desviacin estndar mayor en el mtodo de
Lowry, esto puede deberse a que en este mtodo se utilizan 3 reactivos
ms la protena, generando as ms posibilidades de error por la
Bibliografa.
1