REPORTE DE LABORATORIO

PRACTICA 3: EXTRACCION DE ARN

INTRODUCCION
Para la extraccin de ARN a partir de leucocitos obtenidos de sangre perifrica existen varios
mtodos con diferentes principios, caractersticas, ventajas y desventajas que influyen en la calidad
y cantidad del ARN recuperado, y consecuentemente en el estudio molecular a efectuarse.

OBJETIVOS
1. Emplear tcnicas de laboratorio caseras y comerciales para la correcta
extraccin y purificacin de ARN a partir de sangre perifrica.
2. Familiarizar al estudiante con los pasos bsicos de la extraccin de ARN.
3. Valorar el proceso de la extraccin del RNA.
4. Determinar la integridad del ARN por electroforesis en gel de agarosa.
5. Realizar un anlisis comparativo de tcnicas comerciales y caseras, as
como determinar las diferentes ventajas y desventajas.

METODOLOGIA
La extraccin de ARN se realiz mediante dos tcnicas. La tcnica comercial
basada en la metodologa de Chirgwin et al., 1979; y Chomczynski&Sacchi,
1987, la cual consiste en la ruptura de las clulas utilizando una solucin que
contiene Tiocianato de guanidinio, como agente desnaturalizante. Se llev a
cabo la ruptura de las clulas agregando la solucin de lisis a la muestra y
empleando vigorosamente la fuerza del agitador vrtex, para proceder a
mezclarlo con una solucin de 64% etanol. La mezcla lisado/etanol se aplic a
un filtro, donde el ARNm y ARNr se unieron selectivamente; luego, tras varios
pasos de lavado para remover restos de ADN, protenas desnaturalizadas y
otros contaminantes, el ARN fue eludo en agua libre de nucleasas, listo para
ser utilizado. Se realiz el tratamiento opcional del ARN con la DNasa 1 para
garantizar la completa eliminacin de ADN que hubiese permanecido en la
muestra de inters.
La tcnica casera, al igual que la tcnica comercial, se bas en el mtodo de
paso nico desarrollado por Chomczynski&Sacchi, 1987. Se realiz un paso
nico de extraccin que combina la accin del Triocinato de guanidinio y el
Fenol-Cloroformo, solubilizando el material biolgico y desnaturalizando las
protenas. Despus de la solubilizacin, se adicion cloroformo generando tres
partes, una fase acuosa, una fase orgnica y una interfase; albergando ARN,
protenas y ADN, respectivamente.

La integridad y distribucin en base al tamao molecular del ARN fue

determinada por medio de la electroforesis en gel de agarosa desnaturalizante,
cuya preparacin fue similar al mtodo convencional, pero agregando
formaldehido para observar Las bandas correspondientes al ARN ribosomal,
28S y 18S en Eucariotas, de manera intensa y definida en el gel, con una
movilidad aproximada de 5kb y 2kb, respectivamente. Se realiz adems, la
cuantificacin del ARN a travs del mtodo de fluorometra para verificar la
presencia del producto obtenido y su concentracin dentro del rango ideal, que
indica una buena integridad del ARN para proceder a la utilizacin del mismo
en otros procesos como una amplificacin.

Objetivos 1 y 2
Existen varios mtodos para extraer e identificar un ARN en particular, dentro
de la poblacin total de RNA de la clula, lo cual tiene como objetivo la
utilizacin del ARN para una determinacin posterior especfica, como la
realizacin de una PCR, la construccin de cDNA library, entre otros.
Para la extraccin de ARN tanto con la tcnica casera como con la tcnica
comercial, se tuvo en cuenta algunas consideraciones especiales, como el
hecho de que el RNA es degradado por ARNsas, que estn presentes en una
diversidad de lugares, como superficiens, en las manos; adems las ARNsas
son mucho ms poderosas que las ADNAsas: Son termorresistentes, no
requieren cationes divalentes (as que EDTA no tiene efecto, a diferencia de lo
que pasa con DNAsas). Por esta razn lo primero que se realiz en el
laboratorio antes de iniciar la extraccin, fue realizar una cuidadosa limpieza
de superficies y asegurar en todo momento la utilizacin de guantes.
Para ambas tcnicas, se procedi a homogeneizar la muestra para obtener
ARN, ya que la lisis libera ARNasa endgenas y las pone en contacto con ARN
endgenos. Adems, hay ARNasas exgenas, este paso fue crtico para el
rendimiento y la integridad del ARN obtenido. As que se busc hacer una lisis
rpida y completa. Una lisis lenta habra permitido que ARNasas endgenas se
contactaran con ARN endgeno, mientras que una lisis incompleta habra
provocado que mucho ARN quedara atrapado lo cual habra disminuido el
rendimiento final.

En la metodologa comercial, despus de la elucin del ARN en agua libre de

nucleasas, se realiz el tratamiento opcional del ARN con la DNasa 1 para
garantizar la completa eliminacin de ADN que hubiese permanecido en la
muestra de inters y as obtener un producto con la mayor pureza posible. En
la metodologa casera, la realizacin de un paso nico de extraccin (Triocinato
de guanidinio + el Fenol-Cloroformo), solubiliz el material biolgico y
desnaturaliz las protenas. Luego, con la adicin del cloroformo se gener

una fase acuosa que permiti visualizar el ARN y una fase orgnica, que
alberg las protenas desnaturalizadas; el ADN qued en una especie de
interfase.

Objetivo 3
El ARN es un molcula compuesta por solamente una cadena, lo cual le
proporciona menor estabilidad en comparacin con el ADN, que este ltimo por
poseer doble hlice los puentes de hidrogeno que forman entre bases
complementarias, lo hacen mucho mas estable. El ARN es un moleculalabil,
que fcilmente se degrada si no se tiene cuidado en su manipulacin. Existen
tres formas de ARN en las clulas nucleadas, ARN ribosomal, mensajero,
transferencia.
Existen numerosos mtodos de extraccin de ARN, en la practica de laboratorio
se llevaron a cabo por medio de extraccin orgnica, y extraccin en fase
slida.
Cuantificacin del ARN extrado (no tengo estos clculos)
Se obtuvo 112. 25 ng/L por medio de la metodologa casera, y 68.1 ng/L por
medio de la metodologa comercial por membrana. Una buena concentracin
para posteriores tcnicas de biologa molecular como PCR, se considera
40ng/L en un rango de 40 80 ng/L, es importante la cuantficacin del ARN
extraido, ya que si se procede a una amplificacin, no habr inconveniente,
pero si no se cuantifica se corre el riesgo que no se amplifique ya que
necesitara masDNTPs para todo el ARN en la muestra.
Se diluy por la linealidad del equipo
Al igual que la tcnica comercial, la tcnica casera tambin se basa en el
mtodo de paso nico desarrollado por Chomczynski&Sacchi, 1987. La claver
de la purificacin del ARN radica en evitar su degradacin por accin de las
ribonucleasas, las cuales son abundantes en las muestras biolgicas y se
encuentran presentes en las manos y en general por toda la superficie de
nuestros cuerpos.
El mtodo consiste en un paso +nico de extraccin que combina la accin del
Triocianato de guanidinio y el Fenol-Cloroformo, solubilizando el material
biolgico y desnaturalizando las protenas. Despus de la solubilizacin, la
adicin del cloroformo genera una fase acuosa, que contiene ARN y una fase
orgnica, que alberga las protenas desnaturalizadas; el ADN queda en una
especie de interfase. El mtodo de extraccin con TRIzol es altamente
efectivo para el aislamiento de pequeos ARNs, como los microARNs

La pureza del ARN un parmetro fundamental en el momento de elegir un mtodo de extraccin.

Se discuten tambin otros parmetros relacionados a las caractersticas inherentes de cada
mtodo pero que deben ser tomados en cuenta, como son: el mximo volumen de sangre
permitido, directamente relacionado con la cantidad de glbulos blancos del paciente al momento
de la toma de muestra y la presencia de ARN carrieren algunos mtodos de extraccin, ambos
factores crticos en la optimizacin y aplicacin de los mtodos de extraccin.

Objetivo 4
Para determinar la integridad el ARN se utiliz la electroforesis en gel de
agarosa. El marcador de peso molecular que se utiliz fue de 1000 pb,
mientras que las bandas de eucariotas que esperamos son bandas
correspondientes al ARN ribosomal, 28S y 18S en eucariotas
debern
presentarse como bandas intensas y definidas en el gel con una movilidad
aproximada de 5kb y 2kb, respectivamente, que corresponden a 5000 pb y
2000 pb, por lo que con el marcador de peso molecular, determinar la
medicin.
Sin embargo se observaron las bandas tanto por la metodologa
comercial como por la metodologa casera.
En la parte superior del ARN extrado con la metodologa comercial se observa
una banda bien definida (posicin 1 y 2), a diferencia del ARN extrado a travs
de la metodologa casera; esto probablemente a la mayor manipulacin a la
que fue sometida la muestra con la ltima metodologa, en la cual el proceso
de extraccin suele ser ms violento y por lo tanto tiende a comprometer la
integridad del material gentico, ya que el RNA puede degradarse por accin
de las ribonucleasas, las cuales son abundantes en las muestras biolgicas y se
encuentran presentes en las manos y en general por toda la superficie de
nuestros cuerpos.
FALTA AGREGAR LA FOTOGRAFIA DE LA ELECTROFORESIS EN GEL DE AGAROSA

Bibiliografa: Respuesta9_Lisis amonio1

La integridad y distribucin en base al tamao molecular del ARN fue
determinada por medio de la electroforesis en gel de agarosa desnaturalizante,
cuya preparacin fue similar al mtodo convencional, pero agregando

formaldehido para observar Las bandas correspondientes al ARN ribosomal,

28S y 18S en Eucariotas, de manera intensa y definida en el gel, con una
movilidad aproximada de 5kb y 2kb, respectivamente. Se realiz adems, la
cuantificacin del ARN a travs del mtodo de fluorometra para verificar la
presencia del producto obtenido y su concentracin dentro del rango ideal, que
indica una buena integridad del ARN para proceder a la utilizacin del mismo
en otros procesos como una amplificacin.

Objetivo 5
Cuadro 1. Diferencias entre las tcnicas de laboratorio caseras y comerciales
para la correcta extraccin y purificacin de ARN a partir de sangre perifrica
Diferencias
Extraccin de RNA
Extraccin orgnica
fase slida
de RNA
Protocolo para
desarrollo del
procedimiento
Tipo de muestra
para la prueba
Condiciones para la
utilizacin de la
muestra
Mtodo para la
extraccin
Contaminantes /
interferentes en el
material biolgico
Pasos para la
realizacin de la
prueba
Tiempo de
procesamiento

Kit comercial

Prueba casera

Sangre perifrica

Sangre perifrica

Fase slida

Pocos pasos ya que es

un reactivo listo para
su utilizacin
Alrededor de 15
minutos

Mayor cantidad de pasos

lo cual lo convierte en un
proceso bastante
laborioso
Alrededor de una hora

CONCLUSIONES
1. Emplear tcnicas de laboratorio caseras y comerciales para la correcta
extraccin y purificacin de ARN a partir de sangre perifrica.
2. Se logr extraer ARN a partir de las dos tcnicas empleadas para
extraccin de ARN, con la tcnica comercial se obtuvo ng/L y con la
casera ng/L.
3. Familiarizar al estudiante con los pasos bsicos de la extraccin de ARN.

4. Se adquirieron los conocimientos bsicos para el manejo y cuidado del

ARN, durante la realizacin de las dos tcnicas de extraccin.
5. Valorar el proceso de la extraccin del RNA.
6. Determinar la integridad el ARN por electroforesis en gel de agarosa.
7. La integridad del ARN solo se observ en la extraccin con el mtodo
comercial.
8. Realizar un anlisis comparativo de tcnicas comerciales y caseras, as
como determinar las diferentes ventajas y desventajas.
9. Aunque se logr extraer ARN empleando las dos tcnicas, la tcnica
comercial posee mas ventajas para obtener un ARN con mejor
integridad.
REFERENCIAS
1. https://biologiamolecularinteractiva.files.wordpress.com/2013/01/practic
a-no-3-extraccion-de-arn.pdf
2. https://www.google.com.gt/search?
q=ARN&espv=2&biw=1517&bih=741&source=lnms&sa=X&ei=9gJVVau
XHZbfsASrqoGADw&ved=0CAUQ_AUoAA&dpr=0.9#q=arn+definicion&t
bm=bks Libro gentica Humana.
4.
5.
6.
7.

8.

3. EVALUACIN DE DIFERENTES MTODOS DE EXTRACCIN DE RNA PARA LA

DETECCIN DEL TRANSCRIPTO BCR-ABL EN LA LEUCEMIA MIELOIDE CRNICA
Snchez, S1; Jolly, V1; Martnez de Nuez, I2,3; Molas, C3, Quiroz, A3; Rodrguez, S1;
Ayala-Lugo, A1. email de contacto: anaayalalugo@gmail.com
1. Laboratorio de Gentica. Departamento de Biologa Molecular y Gentica. Instituto de
Investigaciones en Ciencias de la Salud. Universidad Nacional de Asuncin. Asuncin,
Paraguay
2. Departamento de Hematologa de la Segunda Ctedra de Clnica Mdica. Hospital de
Clnicas. FCM-UNA. Asuncin, Paraguay.
3. Departamento de Hematologa. Hospital Central Del Instituto de Previsin Social.
Asuncin, Paraguay.