INTRODUCCION A LA BIOLOGIA

CELULAR Y MOLECULAR

Replicacin, reparacin y
recombinacin de ADN

Empaquetamiento del ADN

Cada molcula de ADN se empaqueta en un cromosoma

El total de informacin gentica contenida en los cromosomas de un organismo
constituye su genoma.
El genoma de E. Coli est formado por 4.7 x 106 pares de bases, en una nica
molcula de ADN de doble hlice (un cromosoma).
El genoma humano est formado por 3 x 109 pares de bases, en 24 cromosomas
(22 autosomas y 2 cromosomas sexuales diferentes), es decir est formado por
24 molculas de ADN distintas, cada una de las cuales contiene entre 50 x 106 y
250 x 106 pares de bases.
En los organismos diploides, existen dos copias de cada tipo de cromosoma, uno
heredado de la madre y otro del padre (con la excepcin de los cromosomas
sexuales en los machos, en los que el cromosoma Y procede del padre y el X de
la madre). As una clula humana tpica presenta contiene 46 cromosomas y 6 x
109 pares de bases.

Divisin celular

Cariotipo humano

Cada molcula de ADN que forma un cromosoma ha de contener

un centrmero, dos telmeros y varios orgenes de replicacin

El ADN de todos los cromosomas se encuentra empaquetado en una estructura

muy compacta con la ayuda de protenas especficas.
Las protenas de los eucariotas que se unen al ADN se clasifican en dos grupos:
las histonas y las protenas cromosmicas no-histonas.
El complejo formado por el ADN cromosmico y las dos clases de protenas se
denomina cromatina.
Las histonas son protenas relativamente pequeas, con una proporcin muy
elevada de aminocidos cargados positivamente (Lisina y Arginina). La carga
positiva ayuda a las histonas a unirse firmemente al ADN, el cual est cargado
negativamente, independientemente de su secuencia de nucletidos. Es probable
que las histonas no se disocien del ADN; influiran sobre cualquier reaccin que
ocurriese en los cromosomas.
Los cinco tipos de histonas de las clulas eucariotas se clasifican en dos grupos
principales: las histonas nucleosmicas y las histonas H1. Las histonas
nucleosmicas (H2A, H2B, H3 y H4) son pequeas protenas (102-135 aa)
responsables del plegado del ADN en los nucleosomas. Las histonas H1 son de
mayor tamao (220 aa) y han sido menos conservadas evolutivamente que las
histonas nucleosmicas.

La asociacin de las histonas con el ADN conduce a la

formacin de los nucleosomas, las partculas unitarias
de la cromatina

Cada nucleosoma est compuesto 8 histonas nucleosmicas (el

octmero de histonas). La partcula tiene una forma de disco, con un
dimetro de alrededor de 11 nm y contiene dos copias de cada una de
las cuatro histonas nucleosmicas (H2A, H2B, H3 y H4). Este octmero
de histonas forma un ncleo proteico alrededor del cual la hlice de ADN
de doble cadena da dos vueltas.

El nucleosoma est formado por dos vueltas

completas de ADN (83 pb por vuelta)
alrededor de un ncleo octamrico de
histonas ms el ADN separador adyacente.
La parte del nucleosoma que se denomina
cuenta contiene alrededor de 146 pb
(alrededor de 1.8 vueltas) luego de ser
digerido por una DNAasa.

Existen zonas del ADN que se encuentran

libres de nucleosomas por accin de
protenas de regulacin gnica.

Generalmente los nucleosomas

se empaquetan con la histona
H1
formando
estructuras
regulares de orden superior

Las molculas de histona H1 son responsables del empaquetamiento de los

nucleosomas formando la estructura de la fibra de 30 nm. En la molcula de la
histona H1 se puede diferenciar una regin globular central, muy conservada
evolutivamente, unida a los brazos amino y carboxilo terminales, menos
conservados.
Cada molcula de H1 se une a travs de su regin globular a un lugar nico del
nucleosoma, mientras que los brazos entran en contacto con otros lugares de las
histonas del ncleo o de los nucleosomas adyacentes, permitiendo que se
empaqueten de forma repetida regularmente.

Desde el eje del cromosoma se

extienden grandes bucles de
cromatina descondensada.

Los cromosomas plumulados

son un buen ejemplo de una
caracterstica recurrente de la
cromatina:
cuando
la
cromatina
se
transcribe
activamente se encuentra en
una estructura extendida,
cuando est condensada es
inactiva.

Algunos experimentos indican que la cromatina activa es bioqumicamente

diferente:
1- La histona H1 se une con menor fuerza a la cromatina activa.
2- Las histonas de la cromatina activa presentan mayor grado de acetilacin
3- La histona H2B parece estar menos fosforilada en la cromatina inactiva
4- La cromatina activa se encuentra enriquecida en una forma variante menor de
la histona H2A
5- Los nucleosomas de la cromatina activa se unen selectivamente a dos
pequeas protenas cromosmicas similares, denominadas HMG 14 y HMG 17.

Heterocromatina:
altamente
condensada, 10% del genoma
se encuentra empaquetado bajo
esta forma
Eucromatina
activa:
10% del genoma, es la
forma de cromatina
menos condensada

Cromatina

Eucromatina:

Eucromatina inactiva:
80% del genoma, se
encuentra
ms
condensada que la
eucromatina
activa
pero menos que la
heterocromatina

Los cromosomas mitticos estn

formados por cromatina en su
forma ms condensada

Video

El conjunto de los 46 cromosomas humanos en

mitosis se denomina cariotipo. Tincin de
Giemsa para bandas G (A-T).

cidos nucleicos
Una cadena de ADN es un largo
polmero no ramificado, compuesto
nicamente por cuatro tipos de
subunidades. Estas subunidades son
los
desoxirribonucletidos
que
contienen las bases adenina (A),
citosina (C), guanina (G) y timina (T).
Los nucletidos est unidos por
enlaces covalentes fosfodister entre el
carbono 5 de un grupo desoxirribosa
y el carbono 3 del siguiente.

10

La molcula de ADN es un polmero helicoidal

formado por dos hebras.
Todas las bases nitrogenadas de la molcula de
ADN se hallan en el interior de la doble hlice,
mientras que la regin azucar fosfato se dispone
en el exterior de la misma.
Las bases nitrogenadas se aparean entre A y T por
un lado y entre C y G por otro.

Como
consecuencia
directa
del
mecanismo de apreamiento de bases,
resulta evidente que el ADN contiene
informacin gracias a la secuencia lineal
de sus nucletidos.
Cada nucletiido, A, T, C, o G, puede ser
considerado como una letra de un alfabeto
sencillo de cuatro letras que es utilizado
para escribir los mensajes biolgicos en
forma lineal. Los organismos se diferencian
entre s porque sus respectivas molculas
de ADN poseen diferentes secuencias de
nucletidos, y por consiguiente, diferentes
mensajes biolgicos.

11

El nmero de posibles secuencias

diferentes en una cadena de DNA de n
nucletidos es de 4n. La variedad biolgica
que se puede generar utilizando una
modesta longitud de ADN es enorme. Una
clula animal tpica contiene un metro de
ADN (3 x 109 nucletidos).
La informacin gentica existente en una
clula humana permitira llenar un libro de
ms de 500.000 pginas.

La enzima DNA polimerasa cataliza la

adicin de un desoxirribonucletido al
extremo 3 de una cadena de ADN. Cada
nucletido aadido a la cadena es, en
realidad,
un
desoxirribonuclesido
trifosfato, la liberacin del pirofosfato de
este nucletido activado y su hidrlisis
posterior proporcionan la energa para la
reaccin
de
replicacin
del
ADN,
convirtindola de forma efectiva en una
reaccin irreversible.

12

La replicacin semiconservativa del

ADN. En cada ciclo de replicacin, cada una
de las dos hebras de ADN son utilizadas
como patrn para la formacin de una hebra
complementaria de ADN. Por lo tanto, las
hebras originales permanecen inalteradas a lo
largo de muchas generaciones celulares.

Mecanismos de replicacin del ADN

La replicacin del ADN supone unas

velocidades
de
polimerizacin
de
aproximadamente 500 nucletidos por
segundo en las bacterias y de unos 50
nucletidos por segundo en los mamferos.
Las enzimas de replicacin son exactas y
rpidas para cumplir con este proceso.
La rapidez y la exactitud se consiguen
mediante un complejo multienzimtico de
varias protenas que dirige el proceso y
constituye una complicada mquina de
replicacin.

13

En la horquilla de replicacin se sintetiza el ADN de las dos hlices

hijas mediante un complejo multienzimtico que contiene la DNA
polimerasa.

Nunca se ha encontrado una DNA polimerasa que acte

en direccin 3a 5.

14

Las horquillas de replicacin se inician en el origen de

la replicacin. En las bacterias, levaduras y en varios
tipos de virus, las burbujas de replicacin se generan
en secuencias especiales del ADN que reciben el
nombre de orgenes de replicacin. Estos pueden
tener una longitud de 300 nucletidos.

Una horquilla de replicacin tiene una estructura asimtrica.

La cadena hija de ADN que se sintetiza de manera continua recibe el
nombre de cadena conductora y se sintetiza antes que la cadena
hija que se sintetiza en forma discontinua y recibe el nombre de
cadena retrasada.
La sntesis de la cadena retrasada es ms lenta debido a que debe
esperar a que la cadena conductora exponga la cadena patrn sobre
la que se sintetizar cada uno de los fragmentos de Okazaki.
La sntesis de la cadena conductora mediante un mecanismo
discontinuo de punto hacia atrs significa que para la replicacin
del ADN nicamente se necesite la DNA polimerasa.

15

En la horquilla retrasada la DNA primasa

utiliza ribonuclesidos trifosfato para sintetizar
cebadores
de
aproximadamente
10
nucletidos de longitud en eucariotes.
La sntesis de cada fragmento de Okasaki
acaba cuando la DNA polimerasa se encuentra
con el RNA cebador unido al extremo 5 del
fragmento anterior de DNA.
Un sistema especial de reparacin del ADN
acta para eliminar el ARN cebador y lo
substituye por ADN. Posteriormente la ligasa
une el extremo 3 de cada fragmento de ADN
con el extremo 5 del fragmento anterior.

Reaccin catalizada por la DNA ligasa. Esta enzima suelda un enlace

fosfodister roto. La DNA ligasa utiliza una molcula de ATP para activar el
extremo 5 de la muesca (paso 1) antes de formar el nuevo enlace (paso 2). De
esta forma, la reaccin energticamente desfavorable de soldadura de la
muesca est desplazada por el proceso energticamente favorable de la
hidrlisis de ATP.

16

Mltiples
copias
de
unas
protenas iniciadoras se unen a
lugares especficos del origen de
replicacin enrollando el ADN a
su alrededor y formando un gran
complejo ADN-protena. Luego,
este complejo une la DNA
helicasa y la coloca sobre una
zona de ADN de una sola cadena
en una regin adyacente a la
hlice.

Para la replicacin de E. Coli , la

protena de iniciacin es la
protena dnaA y el primosoma
est
compuesto
por
las
protenas dnaB (DNA helicasa) y
dnaG (RNA primasa)

Para abrir la doble hlice y poner al descubierto la

cadena patrn del ADN que ser copiada por la
DNA polimerasa, son necesarias protenas
adicionales. Dos tipos de protenas de replicacin
contribuyen con este proceso: las DNA helicasas y
las protenas de unin al DNA monocatenario
(SSB).

17

Las protena SSB se unen a cadenas abiertas, sin recubrir las bases
de la cadena. Colaboran con las helicasas estabilizando la
conformacin desenrollada de las cadenas sencillas.
Su unin cooperativa recubre completamente las regiones de ADN de
cadena sencilla de la cadena retrasada previniendo as la formacin
de cortas hlices en forma de horquilla que impediran la funcin de
la DNA polimerasa.

La molcula de DNA polimerasa se mantiene unida al DNA mediante

un anillo deslizante. Esta protena forma una amplio anillo alrededor
de la hlice de ADN. Un lado del anillo se une a la DNA polimerasa, y
el anilllo completo se desliza libremente a medida que la polimerasa
se desplaza a lo largo de la cadena de ADN. El ensamblaje de la
abrazadera alrededor del ADN requiere hidrlisis de ATP por protenas
accesorias que se unen a la abrazadera y al ADN.

18

Protenas de la horquilla de replicacin

La molculas de primasa se une directamente a la DNA helicasa,

formando una unidad denominada primosoma.

Las protenas de replicacin se mantienen unidas entre s formando una

gran unidad (masa total > 106 daltons) que se desplaza rpidamente a lo
largo del ADN, permitiendo la sntesis de ADN en las dos direcciones de la
horquilla de una forma coordinada y eficiente.

19

Las DNA topoisomerasa evitan que el ADN se enrede durante la replicacin

Cada 10 pares de bases replicadas en la

horquilla corresponden a una vuelta completa
del ADN que se replica alrededor del eje de la
doble hlice. Por consiguiente, para que la
horquilla de replicacin pueda desplazarse, todo
el cromosoma que se halla por delante de la
horquilla tendra que girar rpidamente.
Durante la replicacin del ADN se utiliza una
estrategia alternativa que utiliza unas protenas
conocidas como DNA topoisomerasas que
forman un eslabn giratorio en la hlice de ADN.

La DNA topoisomerasa es una especie de nucleasa

reversible que se une covalentemente a un fosfato
del ADN rompiendo un enlace fosfodister de una
cadena de ADN.
La topoisomera 1 genera una rotura en una sola
cadena (nick) que permite a las dos secciones de la
hlice del ADN a cada lado de la muesca girar
libremente una respecto a otra utilizando como lugar
de giro el enlace fosfodister de la cadena opuesta a
la que se ha producido la muesca.
Cualquier tensin que se genere en la hlice de ADN
dirigir la rotacin en la direccin en la que esta
tensin se disipe.

20

La topoisomerasa II forma una unin covalente

con ambas cadenas de la hlice de ADN al mismo
tiempo, generando transitoriamente una rotura en
las cadenas de ADN.
Estas enzimas se activan por determinadas zonas
del cromosoma en la que dos hlices se cruzan
entre s.
La reaccin de la Topo II evita que se generen los
graves problemas de embrollamiento, que de otra
forma, apareceran durante la replicacin del
ADN.

El fsico Erwin Schroedinger seal en 1945 que, fuese cual fuese

la naturaleza qumica del material hereditario (desconocida en
aquel momento), un gen tena que ser extremadamente pequeo y
estar formado de pocos tomos. En caso contrario, el elevado
nmero de genes necesarios para generar un organismo no cabra
en el ncleo celular. Por otro lado, y debido a su reducido tamao,
caba esperar que un gen sufriera importantes cambios como
consecuencia de reacciones espontneas inducidas por colisiones
trmicas aleatorias con molculas del disolvente.

21

Mecanismos de reparacin del ADN

El ADN sufre importantes cambios debido a fluctuaciones trmicas. Cada

da se pierden unas 5000 bases pricas (adenina y guanina) debido a la
destruccin trmica de enlaces N-glucosdicos entre estas bases y la
desoxirribosa (despurinacin). Anlogamente, se estima que la
desaminacin de citosina a uracilo en el ADN se produce a una velocidad
de 100 cambios por genoma/da.

Desaminacin de nucletidos de
ADN. En el ADN de vertebrados un
escaso
porcentaje
de
los
nucletidos C estn metilados, lo
cual contribuye al control de la
expresin gnica. Cuando estos 5metil nucletidos C se desaminan
accidentalmente, forman T. Esta T
se aparear con una G de la
cadena opuesta, formando un par
de bases equivocado.

22

Resumen de las alteraciones espontneas que requieren

reparacin del ADN. Se indican los lugares de cada
nucletido que se sabe se modifican por oxidacin
espontnea (flechas rojas), ataque hidroltico (flechas
azules), o metilacin descontrolada por el dador de
grupos metilo S-adenosil metionina (flechas verdes), la
frecuencia de cada proceso se indica por el grosor de cada
flecha.
Detalle de la estructura de un dmero de timina, un
tipo de alteracin generado por la exposicin a la
radiacin ultravioleta (como la luz solar). Se puede
formar un dmero similar entre dos bases de
pirimidina vecinas cualesquiera (residuos C o T) del
ADN.

23

Sntesis de melanina

M
E
L
A
N
I
N
A

Melanina

240

400 nm
290

320

Estructura de la melanina

UV-C

UV-B

UV-A

24

Noviembre

Diciembre

Enero

Radiacin UV-B (290-320 nm)

La exposicin de ratas a la radiacin UV-B genera

la aparicin de tumores slidos
Angel H Roffo
1934.
Cancer et. Soleil. Carcinomes et sarcomes
provoqu par lction du soleil in toto
Bull Assoc Fra tude Cancer
Angel H. Roffo

El primer trabajo que puso el acento

sobre la correlacin entre la
exposicin solar y la mortalidad a
causa de melanoma fue publicado
por Lancaster et al. en 1956.
Some geographical aspects of the
mortality from melanoma in
Europeans. Med J Aust

25

ADN y UV

Reparacin del ADN

Uno de cada mil cambios accidentales de las bases

del ADN provocan una mutacin. Para conservar este
fenmeno, existe una amplia variedad de
mecanismos de reparacin del ADN, cada uno de
ellos catalizados por un conjunto de enzimas
diferentes.
El proceso bsico consta de tres etapas:
1-La porcin alterada de la cadena es reconocida y
eliminada por nucleasas de reparacin del ADN, que
hidrolizan los enlaces fosfodister alterados. Esto
produce un hueco en la regin de la hlice de ADN.
2-La DNA polimerasa se une al extremo 3-OH de la
cadena cortada de ADN
y coloca nucletidos
utilizando la informacin correcta de la cadena
patrn.
3- La DNA ligasa suelda la cadena completando el
proceso.

26

Las alteraciones del ADN son eliminadas por ms de una va

Las enzimas involucradas en el proceso de reparacin del ADN dependen del tipo de
alteracin que se trate.
-La despurinacin, la lesin ms frecuente de las que tienen lugar en el DNA, produce
una azucar desoxirribosa que ha perdido su base. Este azcar es rpidamente
reconocido por la enzima AP endonucleasa, la cual corta el enlace fosfodister del
lado 5del lugar alterado. Luego de la escisin de una residuo azcar-fosfato por una
enzima fosfodiesterasa, se recupera la secuencia de DNA inalterada mediante la accin
de una DNA polimerasa y una DNA ligasa.
-Una ruta de reparacin relacionada, denominada reparacin por eliminacin de bases,
implica la actuacin de una batera de enzimas diferentes llamadas DNA glucosilasas.
Cada DNA glucosilasa reconoce a un tipo de base de ADN alterada y cataliza la
eliminacin hidroltica de la base. Posteriormente el sistema AP reconoce el azucarfosfato y lo elimina por el sistema antes mencionado.
Existen como mnimo seis tipos de estas enzimas, entre las que se encuentran las que
eliminan C desaminadas, A desaminadas, diferentes tipo de bases alquiladas u oxidadas,
bases con anillos abiertos, y bases en las que un enlace doble carbono-carbono se ha
convertido un enlace simple carbono-carbono

La DNA polimerasa acta como una enzima autocorrectora que elimina

sus propios errores de polimerizacin a medida que avanza por el ADN.

27

El elevado grado de fidelidad del mecanismo de replicacin del

ADN requiere la existencia de un mecanismo de correccin de
galeradas o verificacin de lectura.
A diferencia de las RNA polimerasas, las DNA polimerasas no inician
una nueva cadena de nucletidos uniendo entre s dos nucletidos
trifosfato: necesitan de forma absoluta la presencia de un extremo
3-OH de una cadena cebadora sobre la que aadir los nucletidos
siguientes.
Las molculas de ADN que presentan errores de apareamiento (o
con la falta de algn apareamiento), de nucletidos en el extremo
3-OH de la cadena cebadora no son efectivas como cadena
patrn.
Las molculas de DNA polimerasa son capaces de trabajar con
cadenas de ADN defectuosas de este tipo mediante la utilizacin de
una subunidad o dominio cataltico que corta cualquier residuo
desapareado del final de la cadena cebadora.
El proceso de corte mediante esta actividad correctora
exonucleasa 3a 5 contina hasta que se ha eliminado el
nmero de nucletidos necesarios del extremo 3 como para
regenerar un extremo con bases apareadas que pueda cebar la
sntesis de ADN.

Comparacin entre los dos principales sistemas de reparacin del ADN

28

Recombinacin gentica
Una propiedad importante del ADN en las clulas,
es su capacidad de experimentar reordenaciones
que pueden hacer variar tanto las combinaciones
particulares de genes que se hallan presentes en
el genoma de cualquier individuo como el
programa y el nivel de expresin de estos genes.
Estas reordenaciones de ADN estn generadas
mediante la recombinacin gentica.
Se conocen dos grandes tipos de procesos de
recombinacin gentica: la recombinacin general
y la recombinacin especfica.

En la recombinacin general, el intercambio

gnico se produce entre secuencias homlogas
del ADN, generalmente localizadas sobre dos
copias del mismo cromosoma.

Unin heteroduplex. Esta estructura junta dos

molculas de ADN en el lugar donde se han
entrecruzado. Este tipo de unin presenta
generalmente varios cientos de nucletidos de
longitud.
En el lugar de intercambio no se altera la
secuencia de nucletidos, el proceso de rotura
y unin ocurre de una forma tan precisa, que
ni se pierde ni se gana un solo nucletido.

A pesar de la precisin del proceso, se generan

porciones de ADN cuya secuencia es nueva: la
unin heterodplex puede contener un
pequeo
nmero
de
errores
en
el
apareamiento de bases, y lo que es ms
importante, habitualmente los dos DNA que se
entrecruzan no son exactamente el mismo a
cada lado de la unin.

A pesar de esta precisin, la recombinacin

general crea molculas de ADN cuya
secuencia es nueva.
El mecanismo de
recombinacin general asegura que slo se
produzcan intercambios entre dos regiones de
doble hlice de ADN que presenten secuencias
notablemente homlogas.
El proceso de reconocimiento ocurre mediante
interacciones directas de apareamiento de
bases.

29

La recombinacin especfica de lugar no se produce nicamente entre ADN

homlogo. Por el contrario, el intercambio se produce entre cortas
secuencias de nucletidos (sobre una o ambas molculas de ADN que
participan) reconocidas especficamente por una enzima de recombinacin
especfica de lugar. La recombinacin especfica de lugar altera las posiciones
relativas de las secuencias de nucletidos en los genomas.

En la recombinacin conservativa especfica de lugar, enzimas de

recombinacin especfica de lugar ponen y quitan del genoma
secuencias especiales de ADN
-La recombinacin gentica especfica de
lugar est guiada por una enzima de
recombinacin que reconoce secuencias
especficas de nucletidos presentes en una
o en ambas molculas de ADN que se
recombinan.
-Separando y volviendo a unir molculas de
ADN
de
doble
hebra
en
lugares
determinados, este tipo de recombinacin
permite que varios tipos de secuencias de
ADN se desplacen dentro y entre
cromosomas. Se forma una pequea regin
heteroduplex de 6-7 pares de bases.
-El mismo sistema enzimtico que une dos
molculas de ADN tambin puede separarlas
de nuevo, recuperando de forma precisa la
secuencia de ambas molculas originales de
ADN. No se modifica la secuencia
nucleotdica.

30

Recombinacin transposicional especfica de lugar. La recombinacin

transposicional pude insertar un elemento gentico mvil en cualquier
secuencia de ADN
Muchas
secuencias
mviles
de
ADN,
incluyendo
virus
y
elementos
transponibles, codifican
integrasas que insertan
su
ADN
en
un
cromosoma a travs de
un
mecanismo
diferente del que utiliza
el bacterifago lambda.

Estas integrasas no requieren secuencias especficas en el ADN y no forman ninguna unin

heteroduplex.
Introducen cortes en ambos extremos de la secuencia lineal del ADN del elemento gentico
mvil y catalizan un ataque directo de estos extremos de ADN sobre la molcula de ADN
diana, rompiendo dos enlaces fosfodister cercanos de la molcula diana.
Debido a la forma de estos cortes quedan huecos a ambos lados que son rellenados por la
DNA polimerasa generndose una corta duplicacin de la secuencia del ADN diana adyacente

Representatividad en el genoma humano de los

distintos elementos gnicos

Tipos de transposones

31

32