Simbiosis entre la

serologia y mtodos
moleculares en
Inmunohematologia

Lilian Castilho, PhD

Definicin
Simbiosis
Interaccin biolgica entre 2 diferentes
organismos viviendo en asociacin
fsica con ventajas para ambos

Hemaglutinacin
Mistura de hemates lavadas con anticuerpos anti-eritrocitarios especficos (monoclonal o
policlonal) Algunas especificidades no disponibles o limitadas
Teste con mas de 100 aos (Karl Landsteiner 1901, Nobel Laureate)
La rutina de serologa de grupos sanguneos es dirigida para la deteccin de los antgenos
de grupos sanguneos clnicamente significantes: ABO, RH, KEL, FY, JK e MNS
Aloinmunizacin detectada por la PAI y compatibilidad entre receptor y
donante

Esa metodologa posibilit el desarrollo y la prctica de la medicina

transfusional durante el siglo XX

Limitaciones

Hemaglutinacin

Falta de reactivos policlonales y monoclonales:

Dificultades en la fenotipage de donantes y pacientes
Caracterizacin de los reactivos de hemates utilizados para deteccin y
identificacin de anticuerpos

Variabilidad de reactividad de los anticuerpos monoclonales cuando

comparados con los policlonales
Baja reactividad de los anticuerpos clnicamente significantes
Falta de un mtodo nico (universal) para la deteccin y identificacin
de anticuerpos
Subjetividad en la realizacin, lectura y interpretacin de los resultados

Hemaglutinacin
Limitaciones
Dificultades en la:
fenotipage de pacientes poli transfundidos
fenotipage de hemates recubiertas con IgG
identificacin de ags variantes
identificacin de ags de baja y alta frecuencia

Hemaglutinacin
Limitaciones

Que hacer!

Hemaglutinacin
Limitaciones
D homocigoto o
heterocigoto?

A R1r ou R1R0?

Hemaglutinacin
Limitaciones
D dbil o
D parcial?

Hemaglutinacin
Limitaciones: Reactivos de hemates
Dificultad en la inclusin de clulas homocigotas para los
ags D, C, c, E, e, Fya, Jka, S y ags de baja incidencia en los
reactivos para escrutinio

Limitacin en la inclusin y exclusin de aloanticuerpos

debido a fallas en los paneles de hemates

Control de calidad de reactivos de hemates

(determinacin de la zigocidad para D, Fya, Fyb)

Fenotipage de grupos
sanguneos
Limitaciones
Testes y inclusin de dados son trabajosos
Nmeros de donantes que podemos fenotipar
Proveer sangre antgeno-negativo para pacientes con el anticuerpo
correspondiente
Proveer sangre fenotipo compatible para los pacientes poli
transfundidos (ex: falciformes)

El especialista de medicina
transfusional del futuro tendr a su
disposicin tcnicas moleculares
para identificar genotipos eritrocitarios
Jeff McCullough
Transfusion 2003,43:823-28, Editorial

Antgenos de grupos sanguneos:

productos de genes

antgenos cargados en protenas son codificados

directamente por los genes
antgenos carbohidratos son controlados por genes que
codifican glicosiltransferases
polimorfismos de GS definidos al nivel gentico
anlisis molecular de los genes de GS pode ser til en la
clnica

Aplicaciones de los testes moleculares

en donantes de sangre
Genotipage en larga escala para identificacin de
antgenos comunes y raros
Produccin de paneles de hemates complementares
Zigocidad D, Fya, Fyb : control de calidad de reactivos
Determinacin de variantes Rh (D debil, Del, evar )
Proveer sangre antgeno-negativo para pacientes con
aloanticuerpos (ex falciformes)

Aplicaciones de los testes moleculares

en la medicina transfusional

Soporte transfusional de pacientes politransfundidos o aloinmunizados

reduciendo o previniendo la aloinmunizacin

Soporte transfusional de pacientes con teste directo da AGH positivo
Identificacin de fenotipos raros
Identificacin de variantes Rh que presentan riesgo de aloinmunizacin
Confirmacin del genotipo cuando un antgeno es dbilmente expreso
Resolucin de discrepancias ABO, RhD

Aplicaciones de los testes moleculares

en la medicina materno-fetal
La madre tiene un anticuerpo IgG clnicamente
significante
El Padre es heterocigoto para el gene que
codifica o antgeno de interese, o desconocido
Genotipage fetal (plasma materno)

Aplicaciones de los testes moleculares en el

control de calidad de reactivos de hemates
Fenotipo

Probable Genotipo

AA, AO

D+

RHD/RHD or RHD/

Fy(a+b)

FY*A/FY*A or FY*A/FY or FY*A/FY*X

Fy(ab+)

FY*B/FY*B or FY*B/FY or FY*B/FY*X

Testes moleculares utilizados

en la determinacin de alelos
de grupos sanguneos

Testes moleculares para la anlise de

genes de grupos sanguneos
Amplificacin del DNA por PCR
PCR-RFLP
PCR-alelo-especifico
PCR-multiplex

Clonaje y secuenciamiento
Real time PCR
Mtodos automticos
Microarray

Genotipage de grupos sanguneos

Tcnicas actualmente empleadas son
trabajosas y demoradas
AS-PCR

y PCR-RFLP requieren

trabajo manual
anlisis por electroforesis (gel de agarosa, poliacrilamida)
Repeticiones
Diferentes ensayos para la misma muestra
PCR

Real-Time fornece anlisis en un tubo cerrado

trabajo manual

Perspectivas: Genotipage en larga escala

DNA array -Chips
Grande nmero de muestras (buena plataforma
para donantes de sangre)
PCR multiplex
Anlisis pos-PCR rpida, automtica para
numerosos polimorfismos de grupos
sanguneos
Sistema cerrado para prevenir contaminacin
Anlisis computadorizada de los resultados
Download directo de las interpretaciones para la
base de datos

DNA array -BeadChipTM

Genotipage para: C/c, E/e,
Kk, MNSs, Jka /Jkb, Fya/Fyb,
Dia/Dib, Coa/Cob, Lwa/Lwb,
Sc1/Sc2, Lua/Lub Doa/Dob,
Hy, Joa,

Hgb S

Costo es competitivo

BioArray Solutions Ltd

Resultados
degenotipagem
las anlisis
por DNA
Resultados de
em pacientes
PCR-RFLP,
AS-PCR de sangue
falciformes
e doadores

Fenotipo
D C E c e

Genotipo mas
probable

Genotipo atual
[n]

+ + - - +

R1R1

R1R1 12

+ ++ ++

R1R2

R1R2 4

+ - + + -

R2R2

R2R2 11

+ ++ - +

RzR1

RzR1 3

+ + - ++

R1r

R1r

+ - + ++

R2r

R2r

+ - - + +

R0r

R0r

R1r 2
R2r 1

R0 R0 1
Total: 41 muestras

Resultados de
em pacientes
Resultados
degenotipagem
las anlisis
por DNA
falciformes e doadores de sangue
PCR-RFLP

Fenotipo

Genotipo

Fy(a+b-)

FY*A/FY*A

30

FY*A/FY*X

FY*B/FY*B

24

FY*B/FY*0

Fy(a-b+)

Total: 59 muestras

Resultados de la genotipage en la
clnica
Caso Clnico-Histrico
Paciente femenina descendente de Asiticos, 56 aos
4 embarazos, transfusiones previas?
Paciente en dilisis, atendida para ciruga
Solicitado 2 unidades de sangre
PAI positiva 2+ en AGH
Panel positivo 2+ en AGH con todas las clulas, negativo con
DTT
Autocontrol negativo

Fya

Fyb

Jka

Jkb

Lua

Lub

Doa

Dob

Jo(a)

Hy

LWa

LWb

Dia

Dib

Coa

Cob

Sc1

Sc2

Fyx[Fy(b+w)

HgbS

No

Silencing FY

Resultados de la genotipage en la clnica

Caso Clnico-Genotipagem

HEA04961_1

A1

HEA04961_2

A2

HEA04961_3

A3

No

HEA04961_4

A4

HEA04961_5

A5

ChipName

Sample WarnMsg

Cmmnt

No No

Fenotipo de la paciente: O, Ro, K-k+, Fy(a-b-), Jk(a+b-), M+NS-s+, Lu(a-b+), Do(a-b+), Hy+, Jo(a+), Di(a+b-), Co(a+b-), Sc1,-2

Paciente con anti-Dib

Confirmacin serolgica en gel con anti-Dib

Alelos raros encontrados en la genotipage en larga escala

DNA array
Genotipos

Fenotipos deducidos

Donantes

KEL*1/1
GYPB* S-s-

Kk+
SsU

FY*A/B (265)
LU*A/B

Fy(a+bx)

1
5
6

Lu(a+b+)

Lu(a+b)

Co(a+b+)

GYPB* S-sHY 323 T

S-s-Uvar

Hy-

JO 350 T

Jo(a)

DI*A/B
DI*A/A

Di(a+b+)

Di(a+b)

LU*A/A
CO*A/B

Total

46/1000(4.6%)

Resultados de la genotipage en la clnica

Caso Clnico-Genotipage
Paciente aloinmunizado con anti-c, anti-K, anti-Jka y otro
aloac? Recibiendo sangre fenotipo compatble
Fenotipage del paciente: R0r, K-k+, Fy(a+b-), Jk(a-b+)
Genotipage del paciente:
RHD+ RHCE*cc RHCE*ee, KEL*2/KEL*2, FY*A/FY*A, JK*B/JK* B

Resultados de la genotipage en la clnica

Caso Clnico-Genotipage

Anlisis molecular complementar:

DO*A/DO*A

Anlisis serolgica complementar

adsorcin con hemates R1r, K+, Jk(a+), Do(b-) : anti-Dob

Conclusin: Paciente portador de anti-c, -K, -Jka, Dob

Posibilidad de utilizacin de sangre con

compatibilidad mas exacta
DNA array

Pacientes que necesitan de transfusin

Especialmente fenotipos Rh raros (hrB, hrS, etc.)
Poseen anticuerpos contra antgenos de baja o alta
incidencia para los cuales no hay anticuerpos
Presentan mltiplos anticuerpos

Caso Clnico
Paciente Afro brasileira, sexo femenino, 36 aos
con sangramiento vaginal
Solicitado 2 unidades de sangre
2 embarazos
Tipaje como O RhD+
Anti-D dbil detectado en el suero
Sin historia de profilaxis Rh (obvio!)

Caso Clnico
Suero testado con panel de 6 monoclonales
para detectar D parcial
Anti-D

DIII

DIV

DV

DVI

DVII

DAR

DFR

Paciente

+/-

3+

3+

+/-

+/-

3+

3+

+/-

3+

3+

Caso Clnico
Sospechas:

D Normal pero por que el anticuerpo?

DIII?
DVII?
Otro D parcial?

Anlisis Molecular screening de rutina mostr

RHD normal
Ninguno gene hbrido presente

Anlise del DNA

PCR-SSP para DVII: negativo
PCR-RFLP para DIIIa: positivo
DIIIa!
Paciente tendra el fenotipo D parcial
Anti-D era un aloanticuerpo
Paciente quedose muy nervosa porque su tipo
de sangre tenia un error!

Caso Clnico
Paciente Caucasoide, sexo masculino, sospecha
de AHAI
PAI positiva, Auto y TDA positivos
Anti-D detectado en el suero y eluato
Paciente tipado como D+
Anti-D: auto o alo?
Genotipage!!!!

Caso Clnico
Anlisis molecular de rutina demostr un gene
RHD normal
Ninguno gene hbrido presente, no era DIII y
tampoco DVII
Secuenciamiento del gene RHD: normal
Conclusin: auto-anti-D

Caso Clnico
Donante con 9 donaciones prvias
Fenotipado como O RhD-neg en todas las
donaciones
En la 100 donacin: Sospecha de D dbil o Del?
Genotipage!!!!

Caso Clnico
Anlisis molecular demostr un gene RHD
delectado
Ninguno D dbil, DEL y D parcial detectado
Conclusin: Donante RhD-negativo

Caso Clnico
Donante con 15 donaciones previas
Fenotipado como O RhD-neg en todas las
donaciones
En la 150 donacin: Genotipage RHD
Genotipo: RHD+

Caso Clnico
Anlisis molecular inicial demostr un gene
RHD normal
Analice complementar demostr alteracin
compatible con DEL = RHD(K409K)
Conclusin: Donante RhD+ (DEL)

Goodbye to agglutination and all that

*Anstee DJ.
Transfusion 2005;
45:652-3

El fin de la serologa est prximo?

Un genotipo no es un fenotipo
Genotipage molecular para el complejo RH no es todos los
alelos aun descritos
Validacin y ensayos clnicos con los chips deben asegurar la
confiabilidad de los resultados de la genotipage
Interpretacin de un grupo ABO incorrecta pode ser desastrosa
Nuevas mutaciones con genes de grupos sanguneos
continuaron a surgir y, poden ser necesarias actualizaciones de
los chips

Simbiosis
Programas para fenotipar pacientes que sern
transfundidos regularmente: pacientes con Anemia
Falciforme y Talasemia
Tipaje y confirmacin de antgenos de grupos sanguneos
en las hemates de donantes de sangre:
screening para aumentar los estoques de antgenos negativos

Testes moleculares caminan lado a

lado con la hemaglutinacin
Muestra del paciente
Anlisis serolgica
Solucionado?

No

Si

Resultado Final

Anlisis
molecular
Solucionado?

Si

No

DNA:Microarray

Evolucin de la
Inmunohematologia

Hemaglutinacin

DNA: PCR

Conclusin: Simbiosis!!!!!

Fenotipo

Genotipo

Testes serolgicos

Testes moleculares