Poder analtico de LLE-HPLC-PDA-MS / MS em estudos do

metabolismo de drogas: Identificao de um novo metabolito

nabumetona.
Nabumetone um pr-frmaco anti-inflamatrio no esteride no-cido.
Aps a administrao oral, o
pr-frmaco convertido no fgado em 2-metoxi-6-cido naftilactico (6MNA), que se verificou ser
o metabolito principal responsvel pelo efeito AINE. A via de transformao
nabumetone
para 6-MNA no foi clarificada, sem intermedirios entre nabumetona e 6MNA tendo sido
identificados at o momento.
Neste estudo, uma nova, fase ainda no declarada como metabolito que foi
descoberto no mbito da avaliao de
nabumetone metabolismo, fraes microssomais de fgado humano e de
rato. Excertos dos Biomatrizes
foram sujeitas a HPLC quiral LLE-PDA-aquiral e LLE-UHPLC-MS / MS para
anlise elucidar o
estrutura qumica deste metabolito. Experimentos UHPLC-MS / MS detectou
a presena de uma estrutura
correspondente a composio elementar C15H16O3, que foi tentativamente
identificado como um hidroxilado
nabumetone. Nabumetona idnticos e espectros de UV HO-nabumetona
obtida a partir do detector de PDA
excluda a presena do grupo hidroxi no radical aromtico de nabumetona.
Assim, o
mais provvel estrutura do novo metabolito era 4- (6-metoxi-2-naftil) -3hidroxibutan-2-ona (3nabumetona hidroxi). Para confirmar essa estrutura, o padro deste
metabolito nabumetone foi
sintetizados, a sua espectrais (UV, CD, RMN, MS / MS) e propriedades de
reteno sobre cromatogrfica quiral e aquiral
colunas foram avaliadas e comparadas com as do metabolito nabumetona
autntica.
Para elucidar a biotransformao subsequente de nabumetona 3-hidroxilo, o
composto foi usado

como um substrato em incubao com fraco microssmica de fgado

humano e de rato. Um nmero de 3-hidroxi
metablitos nabumetona (produtos de conjugao com cido glucurnico,
O-desmetilao, carbonilo
reduo e sua combinao) foram descobertos nos extratos dos
microssomas incubados usando
Experimentos LLE-HPLC-PDA-MS / MS. Por outro lado, quando o 3-hidroxi
nabumetona foi incubada
com hepatcitos de rato isolados, 6-MNA foi detectado como o metabolito
principal de 3-hidroxi nabumetona.
Assim, 3-hidroxi nabumetone poderia ser o elo perdido na nabumetone
biotransformao a 6-MNA
(Isto , nabumetona
3-hidroxi nabumetona

6-MNA).

Introduo
O nabumetone pr-frmaco anti-inflamatrio no esteride possui
apenas uma fraco da ciclo-oxigenase 2 (COX-2) actividade inibidora
[1]. A originalidade da estrutura nabumetona neutro surge
a partir de uma relativamente baixa incidncia de irritao gstrica,
hemorragia,
ulceraes e perfuraes at gastrointestinais, que eram
freqentemente observado na sequncia de um uso a longo prazo de vrios
AINE ativa
cidos arylalkane. Faltando os efeitos adversos mencionados, neutro
nabumetona bem absorvido a partir do GIT, e transportada no
fgado, onde se submete a uma extensa biotransformao de primeira
passagem.
Clivagem oxidativa de nabumetone cadeia lateral conduz ao principal
farmacodinamicamente metablito ativo, a COX muito forte

2 inibidor,-2-naftilactico 6-metoxi cido (6-MNA). Semelhante

para outros cidos arylalkane, 6-MNA exibe anti-inflamatria
e efeitos analgsicos. -desmetilao e reduo carbonil
Tambm tm sido relatados como converses metablicas adicionais de
nabumetona [2,3]. Hidroflicos fase II metablitos nabumetona,
nomeadamente acil-glucuronido de 6-MNA, glucuronides ter de
O-desmetil e fase I nabumetone metabolitos com reduzida
carbonil foram encontrados na urina, na blis e de mucosa duodenal
miniporcos, bem como em urina humana [4].
Uma viso geral das abordagens analticas para a determinao de
nabumetone em aplicaes farmacuticas e nabumetone biotransformao
produtos em estudos bioanalticas foi fornecida
na nossa comunicao anterior [3]. Mtodos analticos recentes
para a determinao de nabumetona com base em tcnicas voltamtricas
[5], pesado fosforescncia induzida por tomo de [6], espectrofotomtrica
mtodos [7], TLC ou HP TLC densitometria [8,9] ou HPLC [10-13]
Tambm tm sido relatados na ltima dcada. Caracterizao do
enzimas envolvidas na biotransformao de nabumetona de 6MNA [14] e em O-desmetilao de 6-MNA a 6-HNA [15] tem
j sido realizada.
muito surpreendente que nenhum biotransformao intermedirio (s)
entre nabumetona e 6-MNA foram descobertos desde
1984, quando Haddock et al. publicou uma viso geral de nabumetone
metablitos para o primeiro tempo [2]. A perda de dois tomos de carbono
indica
uma converso inicial de nabumetona de produto oxidante (s),
a identificao de que poderia ajudar a elucidar a detalhada
curso de converso nabumetona para 6-MNA.
A nossa tentativa de encontrar o elo perdido (s) em nabumetone


6Converso MNA iniciada por avaliao in vitro da nabumetone
biotransformao utilizando fraes subcelulares de fgado humano e de
rato
(microssomas e citosol) e de ratos isolados hepatcitos. Este
xenobiochemical abordagem combinada com LLE-HPLC-PDA-MS / MS
permitiu a deteco e identificao de novos nabumetona
metabolito (s).

3.2. Identificao de um novo metabolito nabumetona atravs quiral e

HPLC aquiral-PDA- (MS / MS)
Quando nabumetona foi incubada com a fraco microssomal
de rato e tecidos de fgado humano, anlises cromatogrficas de
Os extractos de microssomas revelou a presena de um novo, como
ainda no descrita, metabolito nabumetona com o tempo de reteno
tR = 27,5 min (ver o pico denotado como "desconhecido 1, 2" na Fig. 2).
Como este metabolito nabumetona foi encontrado nos extractos de
a fraco microssomal, mas no nos extractos de citoslica
fraces, um produto de oxidao nabumetona, provavelmente hidroxi
nabumetona (HO-nabumetona) foi antecipado.
O metabolito recentemente detectado teve tempo de reteno diferente
dos de nabumetona e todos os seus metabolitos de fase I.
Os espectros UV idnticos e de novo metabolito todos nabumetona
derivados de excluir a presena de um grupo hidroxi fenlico
na poro aromtica de nabumetona. Uma hidroxi auxochromic
grupo ligado ao anel de naftaleno de alterar tanto o comprimento de onda
mximos e intensidade da absoro do naftaleno

poro. No entanto, nenhum deslocamento batocrmico foi observada na

regio do UV
espectro de novo metabolito, da, a biotransformao oxidativa
teve lugar na cadeia aliftica do frmaco.
Nabumetone oxidao levando a recm-encontrada metabolito must
foram realizados na cadeia aliftica da molcula,
com C1, C3 e C4 sendo disponvel. A deteco de dois separvel
Enantimeros HO-nabumetona (ver seco 3.4) no quiral
Os cromatogramas (Fig. 3) excludos hidroxilao em C1 (1-HOnabumetone
aquiral). Porque HO-nabumetona foi encontrado para sofrer converso
metablica de cido 6-metoxi-2-naftilactico
(6-MNA), cuja estrutura se preserva o grupo metileno C4
intacto, C3 era quase certamente o site hidroxilao.
O UHPLC / ESI-MS / MS anlises dos extratos das nabumetone
a incubao com a fraco microssomal revelou a
presena de uma estrutura que corresponde composio elementar
C15H16O3 (ver Tabela 1). Fragmentos caractersticos (ver seco
3.5) confirmou a oxidao da cadeia aliftica. Alm disso,
a formao final de 6-MNA de nabumetona requer
que o vnculo C3 C2 ser clivada. Assim, a estrutura de recmmetabolito encontrada foi confirmado como 4- (6-metoxi-2-naftil) 3-hidroxibutan-2-ona (ou seja, 3-HO-nabumetona).
Um padro sinttico de nabumetona racmica de 3-hidroxi foi
preparado (ver Seco 2.2. para experimentais, ea Seo 3.3 para
discusso) para corroborar a estrutura proposta e para permitir
estudos adicionais xenobiochemical e farmacocintico. 3-Hidroxi
nabumetona um composto quiral; o comportamento cromatogrfico
de seus enantimeros aparente a partir da Fig. 3.
Separao quiral de todos os derivados nabumetona (ver Fig. 1)

sob as condies experimentais mencionadas na Seo 2.7

(Coluna Chiralcel OD-R, fase mvel A) est demonstrada no
Figo. 3 (cromatograma superior). A identificao de ambos um grupo 3HOnabumetone
enantimeros descrito na Seo 3.4. Como evidente
a partir dos cromatogramas na Fig. 3, o acima mencionado "desconhecido
2 "nabumetona metabolito (tr = 27,5 min na Fig. 2) foi identificado
como (+) - 3-hidroxi nabumetona. O segundo enantimero, (-) - 3nabumetona hidroxi (TR = 22 min, denotada como "desconhecido 1" em
Figo. 2) foi parcialmente co-eluda com 6-MNA. Felizmente, estes dois
metabolitos possuem diferentes propriedades acidobasic, que permite
sua separao fcil. Enquanto (-) - 3-hidroxi nabumetona neutro,
6-MNA cida e, portanto, bem ionizvel em meios bsicos.
Duas abordagens foram usadas para separar estes dois co-eluio
metablitos nabumetona.
Abordagem 1: Quando quiral fase mvel B [metanol - 1 M aquoso
NaClO 4, pH = 6,85 (75:25, v / v)] foi utilizado, em vez do rotineiramente
fase mvel cido empregada A (ver seco 2.7), 6-MNA foi ionizado,
e a sua forma polar tinha um tempo de reteno mais curto do que o de
(-) - 3-hidroxi nabumetona, as caractersticas de reteno dos quais
em ambas as fases mveis (A e B) manteve-se praticamente o mesmo.
Mtodo 2: extraco dependente do pH e da reextraco
biomatriz (ver o ltimo pargrafo do ponto 2.6).
Separao aquiral de I metablitos seis fases, o pai nabumetone
naproxeno e dentro de 12 minutos apresentada na Fig. 4. O
recm-descoberto metabolito, nabumetona 3-hidroxi (tR = 3,9 min), foi bem
separada dos dois produtos de biotransformao mais prximas
(6-MNA e naproxeno). Alm disso metabolismo de 3-hidroxi
nabumetona (atravs de reduo de carbonilo e O-desmetilao) foi

tambm antecipou. Como evidente a partir do cromatograma na Fig. 4,

a capacidade de pico no tempo de intervalo de 1,4-3,9 min limitado, e
(Como ainda descoberto) possveis metabolitos de 3-hidroxi nabumetona
em conjunto com aqueles no cromatograma (Fig. 4) pode ter
sido insuficientemente separados nas condies cromatogrficas
descrito na Seco 2.7 e no nosso trabalho anterior [3]. Para
esta razo, UHPLC-MS / MS foi empregue na pesquisa para posterior
metablitos derivados de nabumetone 3-hidroxi (ver Seces 2.9
e 3.5).