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Documentos

ISSN 0102-0110
Setembro, 2006

METABOLMICA: aplicaes e perspectivas

189

ISSN 0102 0110


Setembro, 2006
Recursos Genticos e
Biotecnologia

Documentos 189

METABOLMICA: aplicaes e perspectivas

Thales Lima Rocha


Raphael Garcia de Sousa Evaristo
Luciano Paulino da Silva
Djair dos Santos de Lima e Souza
Brener Magnabosco Marra
Paulo Henrique Alves da Costa
Jos Cesamildo Cruz Magalhes
Maria Cristina da Silva Mattar
Maria Ftima Grossi-de-S

Braslia, DF
2006

Exemplares desta edio podem ser adquiridos na


Embrapa Recursos Genticos e Biotecnologia
Servio de Atendimento ao Cidado
Parque Estao Biolgica, Av. W/5 Norte (Final)
Braslia, DF CEP 70770-900 Caixa Postal 02372 PABX: (61) 3348-4739 Fax: (61)
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Vera Tavares de Campos Carneiro
Supervisor editorial: Maria da Graa S. P. Negro
Normalizao Bibliogrfica: Maria Iara Pereira Machado
Editorao eletrnica: Maria da Graa S. P. Negro
Fabrcio Lopes dos Reis Rodrigues

1 edio
1 impresso (2006):
M 587 Metabolmica: aplicaes e perspectivas. / Thales Lima Rocha ... [et. al.].
Braslia: Embrapa Recursos Genticos e Biotecnologia, 2006.
38 p. (Documentos / Embrapa Recursos Genticos e Biotecnologia,
0102 0110; 189)

1. Metabolmica. 2. micas - plataformas tecnolgicas. I. Rocha, Thales


Lima. II. Srie.
620.82 CDD 21.

Autores

Thales Lima Rocha

Raphael Garcia de Sousa Evaristo

Luciano Paulino da Silva

Djair dos Santos de Lima e Souza

Brener Magnabosco Marra

Paulo Henrique Alves da Costa

Jos Cesamildo Cruz Magalhes

Maria Cristina da Silva Mattar

Maria Ftima Grossi-de-S

Sumrio
As micas ................................................................................................................. 6
A Genmica............................................................................................................... 6
A Transcriptmica .................................................................................................... 9
A Protemica .......................................................................................................... 10
A Metabolmica ...................................................................................................... 11
Os metablitos........................................................................................................ 13
Metaboloma,

Metabolmica,

Metabolic

profiling

Engenharia

de

metabolismo......................................................................................................... 15
Seqncia de etapas da metabolmica ................................................................ 16
Aplicabilidade da Metabolmica ........................................................................... 21
Farmacologia .......................................................................................................... 22
Nutrio ................................................................................................................... 24
Ecologia e Evoluo............................................................................................... 25
Perspectivas para a metabolmica....................................................................... 27
Consideraes Finais ............................................................................................ 28
Referncias Bibliogrficas..................................................................................... 31

METABOLMICA Aplicaes e Perspectivas

Thales Lima Rocha


Raphael Garcia de Sousa Evaristo
Luciano Paulino da Silva
Djair dos Santos de Lima e Souza
Brener Magnabosco Marra
Paulo Henrique Alves da Costa
Maria Ftima Grossi-de-S
As micas
As plataformas tecnolgicas conhecidas como micas so aquelas que tm
o objetivo de isolar e caracterizar o maior nmero possvel de biomolculas de um
mesmo grupo, como cidos Desoxirribonuclicos (DNA), cidos Ribonuclicos
(RNA), protenas ou metablitos. A primeira mica a ser denominada como tal foi a
genmica. Esse termo vem da palavra Genoma, que por sua vez deriva da juno
das palavras Gene e Cromossoma. Graas a grande aceitao desses termos,
outros como transcriptoma, proteoma e metaboloma (assim como suas respectivas
micas) foram tambm surgindo. Entretanto as suas origens etimolgicas so ainda
mais confusas (ROBERTSON, 2005).
Nos ltimos anos tm surgido vrias micas. Entretanto, aquelas mais
conhecidas so: a genmica, a transcriptmica, a protemica e a metabolmica.
Elas tm como objetivo isolar e caracterizar, respectivamente, o DNA, o RNA, as
protenas e os metablitos (BINNECK, 2004). A integrao das informaes obtidas
por essas plataformas citadas acima so o objetivo principal da Biologia de
Sistemas, tambm conhecida como Genmica Funcional (ROCHFORT, 2005).
A Genmica
Nos ltimos anos, crescente o nmero de seqncias gnicas conhecidas,
assim como a quantidade de dados disponveis para acesso pblico (BINNECK,
2004). Isso certamente est relacionado alta estabilidade das molculas de DNA,
quando comparadas s molculas de RNA ou protenas (PODGORNICK, 2004).
Outro fator que contribuiu bastante para esse aumento foi o grande investimento na
rea da genmica, sobretudo na ltima dcada (BINNECK, 2004).

Alm do crescimento do nmero de dados, ocorre tambm um maior acesso


aos mesmos. A grande facilidade em se explorar os dados de seqncias reside nas
ferramentas de bioinformtica. Essas ferramentas agrupam uma grande quantidade
de informao e permitem a busca de seqncias similares no banco de dados, ou
mesmo a comparao de dados de diferentes genomas (BINNECK, 2004).
Entretanto, tem-se criado uma expectativa excessiva quanto aplicao dos
dados obtidos de seqncias gnicas no que tange a inferncias biolgicas
(BINNECK, 2004). Conhecer essas seqncias no garante que a protena
codificada seja facilmente determinada (HTTENHOFER e VOGEL, 2006).
As predies computacionais efetuadas a partir de dados de seqncias so
complexas e nem sempre garantem resultados aceitveis, principalmente quando se
trata de genomas complexos, como o humano. A razo dessa incerteza reside no
fato de que as predies so derivadas de diferentes mtodos (BINNECK, 2004).
Alguns programas determinam genes pela identificao de parmetros que
definem o incio e o fim de um gene (predio ab inittio). J outros programas
buscam genes pela comparao de fragmentos de seqncias com homologia a
genes conhecidos (predio comparativa). Dessa forma, a predio ab inittio tende a
superestimar o nmero de genes por identificar qualquer fragmento de seqncia
que parea um gene. J a predio comparativa tende a subestimar o nmero de
genes porque s identifica os genes homlogos aos j conhecidos. Portanto, com as
informaes obtidas at hoje, apenas os mtodos computacionais no so
suficientes para gerar o nmero real de genes de um genoma eucaritico complexo
(BINNECK, 2004).
Se no bastasse essa incerteza no nmero total de genes em um genoma
especfico, a identificao de sua funo tambm no fcil (HTTENHOFER e
VOGEL, 2006). O tamanho do genoma por si s no define a complexidade de um
organismo. A tabela 1 mostra que organismos fenotipicamente bem diferentes, como
o nematide Caenorhabditis elegans e a planta Arabidopsis thaliana, possuem
genomas de tamanho prximo. Alm disso, s pela seqncia de nucleotdeos
apresentada por gene no possvel inferir com certeza a protena que ele codifica
(RIGOUTSOS et al., 2006). Isso devido ocorrncia de vrias modificaes ps
transcricionais e ps traducionais (ZANCAN, 2002; BINNECK, 2004).

Tabela 1: Tamanho do Genoma e nmero estimado de genes de vrios organismos


Tamanho do Genoma
Nmero estimado de
Organismo
(pares de base)
Genes
Homo sapiens

3 bilhes

30.000

Mus musculus

2,6 bilhes

30.000

Arabidopsis thaliana

100 milhes

25.000

Caenorhabditis elegans

97 milhes

19.000

Drosophila melanogaster

137 milhes

13.000

12,1 milhes

6.000

Escherichia coli

4,6 milhes

3.200

Vrus da AIDS (HIV)

9700

Saccharomyces
cerevisiae

(Adaptado de BINNECK, 2004).

Sendo assim, a explicao para tantas diferenas entre os fentipos das


espcies em questo depositada nos mecanismos de modificaes ps
transcricionais como o splicing alternativo, nas inmeras transformaes ps
traducionais que ocorrem com as diferentes protenas, na produo e utilizao dos
inmeros metablitos como cofatores enzimticos e nos mecanismos que regulam
esses processos (ZANCAN, 2002; FIEHN, 2002; RIGOUTSOS et al., 2006).
O splicing alternativo consiste em produzir um RNA mensageiro (RNAm)
diferente do esperado a partir de um RNA nuclear heterogneo (RNAnh) comum.
Para tanto, pode ocorrer de se eliminar um dos xons ou mesmo manter um dos
ntrons. dessa forma que a D. melanogaster produz suas trs diferentes cadeias
pesadas de miosina, partindo de apenas um RNAnh (MACHUCA-TZILI et al., 2006).
As modificaes ps traducionais so alteraes na seqncia de aminocidos
recm traduzida (clivagens proteolticas) ou a insero de grupamentos acetil,
fosforil, metil, entre outros, alm da adio de grupos prostticos, como por exemplo,
o grupo Heme na hemoglobina (MDER et al., 2002; ZANCAN, 2002).

Com o intuito de se relacionar as informaes obtidas pela genmica com o


fentipo apresentado pelo indivduo em questo, outras tecnologias esto se
desenvolvendo e ganhando destaque no cenrio cientfico. Dentre essas
tecnologias, ganham destaque a transcriptmica, a protemica e, ultimamente, a
metabolmica (MDER et al., 2002; FRANK e HARGREAVES, 2003; VIVANCO et
al., 2003).
A Transcriptmica
Transcriptoma o termo dado ao produto inicial da expresso gnica de um
organismo. Em outras palavras, o conjunto de RNAs mensageiros (RNAm) que
codificam as informaes que a clula precisa em um determinado momento
(NAKANISHI e NUREKI, 2005).
Qualquer clula recebe seu transcriptoma da clula me que lhe deu origem
por diviso celular. Logo, a transcrio de seus genes no resulta na sntese de seu
transcriptoma, mas sim na manuteno do mesmo e na mudana de sua
composio medida que genes especficos so transcritos ou no (BINNECK,
2004).
O estudo de RNAm tem se beneficiado muito com as tecnologias baseadas
na Reao de Cadeia de Polimerase (PCR). Dessa forma, vrios genes podem ser
estudados paralelamente, ao invs de um s de cada vez. As tcnicas Differential
Display (DD), Serial Analylis of Gene Expression (SAGE) e microarranjo de DNA
apresentam muitas vantagens quando comparadas ao Northern Blotting, tanto em
sensibilidade quanto em nmero de ensaios (BINNECK, 2004). Dentre essas
tcnicas, a que vem sendo mais utilizada tanto no estudo da composio de
transcriptomas quanto na comparao entre transcriptomas diferentes o
microarranjo de DNA (FRANK e HARGREAVES, 2003; NAKANISHI e NUREKI,
2005; RIGOUTSOS et al., 2006).
O microarranjo de DNA consiste em uma coleo de vrios fragmentos
pequenos de genes que so dispostos em locais especficos de uma lmina de vidro
especial de microscopia ou uma lmina de slica. A tcnica se alicera da habilidade
das molculas de RNAm de se ligarem especificamente (hibridizar) ao DNA
complementar do qual foram transcritas. Utilizando uma placa com milhares de
fragmentos de DNA, possvel saber, em um nico experimento, o nvel de

expresso de milhares de genes em uma clula com base na quantidade de RNA


hibridizados em cada stio (BINNECK, 2004). A quantificao dos RNA de cada stio
efetuada com o auxlio de programas computacionais (por exemplo, ArrayVision
software), gerando um perfil de expresso gnica da clula (MDER et al., 2002).
Apesar de informarem que genes esto sendo expressos em maior
quantidade, os dados obtidos pela quantificao do RNAm de uma clula nem
sempre se correlacionam com a expresso das protenas da mesma (CALSA
JUNIOR et al., 2004). Isso porque os RNA menos abundantes, como aqueles que
codificam protenas responsveis pela maturao de leuccitos so mais difceis de
serem quantificados do que aqueles RNAm mais abundantes (PATTON et al., 2006).
Informaes mais precisas sobre o nvel de expresso protica de um organismo
so obtidas pela utilizao da tecnologia protemica (BINNECK, 2004).
A Protemica
O proteoma de um organismo o conjunto de protenas expressas por um
organismo ou tecido em um determinado momento e sob uma condio especfica
(JAMES, 1997; ROCHA et al., 2005). O nmero de protenas produzidas por um
organismo excede e muito o nmero de genes que o mesmo possui. Isso novamente
se explica pelas inmeras modificaes ps transcricionais e ps traducionais
(BINNECK, 2004). O conjunto de tecnologias criadas para analisar a expresso de
protenas conhecido como protemica (ROCHA et al., 2005; VIVANCO et al.,
2003).
A protemica vem se desenvolvendo com o intuito de implementar novas
estratgias para a anlise de protenas em escala genmica. Entretanto, a anlise
das protenas de um organismo depende da extrao, purificao, visualizao,
identificao e quantificao dessas, e em cada uma das etapas h uma srie de
limitaes. Dessa forma, para se conhecer o proteoma completo de um organismo,
se faz necessria a utilizao de diversas estratgias, como: a utilizao de tcnicas
como cromatografias associadas eletroforese, o pr-fracionamento das amostras
por meio de extraes seqenciais, a anlise do proteoma organelar, entre outras.
(ROCHA et al., 2005).
Atualmente, as investigaes protemicas se iniciam principalmente com a
eletroforese bidimensional (2DE). Essa tcnica permite separar as protenas de uma

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amostra pelos seus respectivos pontos isoeltricos e pesos moleculares


(OFARREL, 1975; KLOSE, 1975). As protenas separadas por essa tcnica so,
geralmente, digeridas por proteases e analisadas em espectrmetros de massa. Os
perfis obtidos pelo espectrmetro de massa, contendo todos os fragmentos
resultantes da digesto enzimtica que foram detectados pelo equipamento, so
denominados fingerprinting (MDER et al., 2002). Dependendo da qualidade da
amostra analisada, pode-se chegar ao seqenciamento parcial ou mesmo total da
protena em questo. A partir da comparao das seqncias obtidas em um banco
de dados, pode-se identificar a protena isolada (BINNECK, 2004).
A eletroforese bidimensional apresenta as mesmas limitaes observadas
nas tcnicas transcriptmicas acima descritas. As protenas expressas em baixa
quantidade, ou em um curto perodo, acabam por no serem, s vezes, sequer
visualizadas (MDER et al., 2002). Essas protenas podem estar sendo expressas
para iniciar a resposta a algum estmulo importante, como aquelas relacionadas
cascata de ativao da protena Kinase C, que tem um importante papel na
preveno da isquemia no miocrdio (VIVANCO et al., 2003; BINNECK, 2004).
A Metabolmica
No h dvidas de que conhecer as protenas de um organismo importante.
Mas existe um universo de pequenas molculas orgnicas que interagem
diretamente com as protenas e outras macromolculas (HALL, 2006). Essas
molculas atuam como substratos, inibidores ou ativadores alostricos de uma
enzima. Podem ser precursores de alguma molcula importante nas inmeras rotas
metablicas celulares, ou at mesmo um resduo metablico de alguma via de
sntese ou degradao de macromolculas que por algum motivo estocado e
utilizado como defesa qumica contra algum patgeno (ENGEL et al., 2002; DEMAIN
e VAISHNAV, 2006). Essas pequenas, porm, importantes molculas so
conhecidas como metablitos (DIXON, 2001).
Esses metablitos so divididos em dois grandes grupos: os metablitos
primrios e os secundrios. Os primrios so aqueles que esto diretamente
envolvidos nas rotas de sntese e degradao das macromolculas em qualquer ser
vivo (DIXON, 2001). J os secundrios so mais comuns em plantas e fungos
(CHALLIS e HOPWOOD, 2003; HALL, 2006). Eles atuam como componentes

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estruturais, defesas contra herbvoros e patgenos, atrativos para polinizadores e


agentes nas interaes interespecficas, como a alelopatia (ENGEL et al., 2002;
CHALLIS e HOPWOOD, 2003).
Segundo Challis e Hopwood (2003), o estudo desses metablitos visando
obteno de produtos efetivos contra diversas doenas e passveis de
comercializao j vem sendo feito desde o incio do sculo XX. Entretanto, a idia
de se analisar todo o conjunto de metablitos em qualquer nvel de complexidade
(organismo, rgo, tecido, clula ou mesmo compartimentos celulares) s comeou
a ganhar destaque nos ltimos anos, conforme pode ser observado na figura 1
(HORNING e HORNING, 1971; NICHOLSON et al., 1999; FIEHN, 2002; REO, 2002;
LINDON et al., 2003, 2004a, b; NICHOLSON e WILSON, 2003; WECKWERTH,
2003; BINO et al., 2004; FERNIE et al., 2004; GOODACRE et al., 2004; FUKUSAKI
e KOBAYASHI, 2005; MUNGUR et al., 2005; ROBERTSON, 2005; ROCHFORT,
2005; WECKWERTH e MORGENTHAL, 2005). O nome dado a todas as tecnologias
envolvidas na anlise desses metablitos foi metabolmica.
250

N de artigos publicados

200

150

100

50

0
1975 - 1994

1995 - 1999

2000

2001

2002

2003

2004

2005*

Ano

Figura 1: Nmero de artigos relacionados metabolmica publicados desde 1975 at


Setembro de 2005. Nota-se um grande aumento nas publicaes sobre esse tema nos
ltimos cinco anos. (Adaptado de ROCHFORT, 2005).

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Nos ltimos anos, a metabolmica tem sido empregada em diversas reas e


com inmeros propsitos. Todavia, em qualquer mbito existem vrias dificuldades a
serem superadas tanto na extrao e separao das amostras quanto na anlise
dos resultados (ROCHFORT, 2005; WECKWERTH e MORGENTHAL, 2005;
GIBNEY et al., 2005; FUKUSAKI e KOBAYASHI, 2005; ROBERTSON, 2005;
CHALLIS e HOPWOOD, 2003). Contudo, de senso comum que os resultados
obtidos pela metabolmica facilitaro o entendimento de como o gentipo de um
indivduo est relacionado como o seu fentipo (FUKUSAKI e KOBAYASHI, 2005;
BINNECK, 2004).
O objetivo principal desse estudo mostrar a metabolmica hoje em dia. Isso
inclui todos os avanos j realizados, assim como as dificuldades ainda enfrentadas.
As informaes abordadas aqui podero ser utilizadas em uma possvel execuo
de projetos de pesquisa envolvendo metabolmica e engenharia de metabolismo na
Embrapa Recursos Genticos e Biotecnologia.
Como objetivos especficos, podem ser citados:
- Esclarecer os conceitos bsicos da metabolmica;
- Citar todas as etapas bsicas para a anlise de uma amostra, enfatizando as
dificuldades existentes;
- Apontar as inovaes tecnolgicas geradas ou aplicadas na metabolmica;
- Discutir a aplicabilidade dessa plataforma tecnolgica em vrias reas de
conhecimento, como a farmacologia, a nutrio, a ecologia e a evoluo;
- Comentar sobre as perspectivas dessa plataforma, ressaltando as principais
dificuldades e apontando os benefcios da interao com outras plataformas.
Os metablitos:
Encontram-se dissolvidas no citosol de qualquer clula milhares de pequenas
molculas conhecidas como metablitos primrios. Essas molculas esto
envolvidas nas principais rotas metablicas que ocorrem nas clulas (DIXON, 2001).
Dentre esses metablitos esto: os aminocidos, nucleotdeos, lipdeos,
carboidratos e seus derivados fosforilados, alm de um grande nmero de cidos
mono-, di- e tricarboxlicos. Esses metablitos so altamente polares ou carregados
eletricamente, solveis em gua e presentes nas clulas em concentraes variadas
(entre milimolar e micromolar). Sua reteno dentro das clulas se deve ao fato de a

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membrana plasmtica ser impermevel a eles, embora existam transportadores nas


membranas celulares que possibilitem a entrada e/ou sada desses compostos na
clula, ou em compartimentos subcelulares (clulas eucariticas). A presena
bastante similar dos mesmos grupos de metablitos em qualquer clula viva
demonstra a conservao evolucionria dessas rotas metablicas principais que
surgiram nos organismos mais primitivos e permanecem at os dias de hoje
(SMEDSGAARD e NIELSEN, 2005).
Existe um outro grupo de pequenas biomolculas que, ao contrrio dos
metablitos primrios, so especficas de certos tipos de clulas ou organismos.
Essas molculas so comumente chamadas de metablitos secundrios (DIXON,
2001). Os metablitos secundrios so molculas que geralmente no esto
envolvidas em funes vitais, geralmente no fazem parte do metabolismo bsico e
possuem caractersticas qumicas muito variadas e, s vezes, bem complexas
(HALL, 2006). Durante muito tempo acreditou-se que os metablitos secundrios
fossem produzidos sem uma funo especfica, simplesmente como produtos finais
das reaes, chegando a ser considerados at como anomalias (MARASCHIN e
VERPOORTE, 1999). Essa viso mudou radicalmente e a cada dia descobre-se um
pouco mais sobre a funo destas substncias, sua utilidade para o
desenvolvimento fisiolgico das plantas e seu papel como mediadores das
interaes entre as plantas e outros organismos (MARASCHIN e VERPOORTE,
1999; NEWMAN et al., 2003; ZHANG et al., 2003).
Os principais grupos de metablitos secundrios so os alcalides, terpenos,
taninos, flavonides e glicosdeos (HALL, 2006). Os alcalides so bases
nitrogenadas com grande variao na estrutura molecular. Possuem sabor amargo e
pH alcalino quando em soluo. Nas plantas tm funo de regulao do
crescimento e de proteo. Os terpenos so molculas de estrutura cclica, tambm
conhecidos como leos essenciais. Eles so volteis e por isso so responsveis
pelos odores dos vegetais. Podem ser classificados quanto ao nmero de tomos de
carbono em: mono, sesqui, di e triterpenos. Nas plantas possuem funes na
polinizao, proteo, etc. Os taninos so compostos fenlicos (poli fenis) de
estrutura varivel. Apresentam atividade adstringente, ou seja, precipitam protenas.
Nos vegetais, tm funo de proteo. Os flavonides so heterosdeos, ou seja,

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contm uma poro acar (diferente da glicose) ligada a uma poro no-glicdica
(aglicnio), que neste caso um pigmento. Esses compostos possuem cores de
acordo com o tipo de pigmento presente na molcula, por exemplo, as flavonas so
amarelas e os flavonides antocinicos so azuis. Nas plantas atuam na colorao
dos rgos vegetais e na diferenciao celular. Por fim, os glicosdeos so
compostos que contm um acar ligado a um aglicnio, sendo esse a poro ativa
da molcula. Possuem gosto muito amargo, e so classificados de acordo com o
tipo de aglicnio. Por exemplo: glicosdeos alcolicos (o aglicnio um lcool);
glicosdeos cianognicos (liberam cido ciandrico quando hidrolisados); glicosdeos
esterides (o aglicnio um esteride); glicosdeos antraquinnicos (o aglicnio
uma antraquinona). Nos vegetais, a funo varia de acordo com a poro noglicdica (MARASCHIN e VERPOORTE, 1999; ZHANG et al., 2003).
Metaboloma, Metabolmica, Metabolic profiling e Engenharia de
metabolismo
O conjunto de todas essas pequenas molculas (metablitos primrios e
secundrios) de uma dada clula, fluido corporal ou organismo conhecido como
metaboloma (GOODACRE, 2005). Uma vez conhecida a composio do
metaboloma, pode-se prever que genes e rotas metablicas esto ativos naquele
momento na clula (GOODACRE, 2005; ROBERTSON, 2005).
O interesse em se conhecer melhor os metablitos (primrios ou
secundrios), assim como suas vias de sntese e a regulao das mesmas tem
crescido muito nos ltimos anos (ROCHFORT, 2005). Dessa forma, a Metabolmica,
ou Metabonmica, j figura entre as grandes plataformas tecnolgicas para o estudo
de sistemas biolgicos, como a Genmica, Transcriptmica e Protemica
(BINNECK, 2004). Os dois termos (Metabolmica e Metabonmica) esto corretos.
O que os diferencia so apenas as suas origens etimolgicas (ROBERTSON, 2005).
Para todos os fins, nesse trabalho ser utilizado somente o termo Metabolmica.
A metabolmica tem como objetivo isolar e caracterizar todos os metablitos
de uma dada amostra biolgica em condies normais e sob algum tipo de estresse
(ROCHFORT, 2005; WECKWERTH e MORGENTHAL, 2005). Mesmo utilizando as
mesmas tcnicas, ela se difere da anlise de perfil metablico (Metabolic profiling),

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que busca o isolamento de molculas alvo e a caracterizao das suas vias de


sntese (WECKWERTH e MORGENTHAL, 2005). A linha que divide essas duas
plataformas geralmente muito tnue. Tcnicas como a Ressonncia Magntica
Nuclear de biofluidos ou a Espectrometria de Massa de biofluidos so utilizadas para
os dois propsitos. No entanto, o que se sabe a cerca do biofluido e o conhecimento
prvio de parmetros a serem analisados que vai definir se a anlise se enquadra
na metabolmica ou no metabolic profiling (ROBERTSON, 2005). A metabolmica,
devido ao seu objetivo, no utiliza parmetros, mas sim os determina. Aps serem
determinados, o metabolic profiling os utiliza (ROBERTSON, 2005; WECKWERTH
e MORGENTHAL, 2005).
Aps a descoberta dos metablitos de uma amostra qualquer e a
identificao de algum composto de interesse (farmacutico, por exemplo),
possvel iniciar os estudos de engenharia de metabolismo. Tais estudos primam por
identificar os genes e as rotas metablicas desses compostos, visando aumentar ou
diminuir a sua produo. Alm disso, a engenharia de metabolismo pode ser
aplicada na modificao gentica de um outro organismo, para que este possa
produzir o metablito em questo (AHARONI et al., 2005).
Seqncia de etapas da metabolmica
A metabolmica, aplicada em qualquer rea da cincia, possui uma srie de
etapas. Em cada uma dessas etapas, podem ocorrer erros experimentais
(FUKUSAKI e KOBAYASHI, 2005).
A primeira etapa a seleo do organismo, clula, tecido ou biofluido a ser
analisado. Nesse ponto, o mais difcil manter a uniformidade da amostra. A
variao na idade ou tamanho destas amostras, assim como o tratamento dado ao
organismo de origem (dieta, adubao, exposio luz, etc.) ou mesmo o horrio da
coleta interfere substancialmente na composio da amostra (BOLLARD et al., 2001;
FIEHN, 2002; FUKUSAKI e KOBAYASHI, 2005; ROBERTSON, 2005; ROCHFORT,
2005).
Aps a seleo do organismo, realizado o preparo da amostra. Essa etapa
uma das mais importantes, uma vez que qualquer displicncia pode interferir
drasticamente no resultado da anlise (FUKUSAKI e KOBAYASHI, 2005). Para se

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evitar grandes variaes experimentais, a mesma quantidade da amostra, avaliandose o peso seco do mesmo tipo de rgo deve ser coletada. E tudo isto deve ser feito
no mesmo horrio (ROBERTSON, 2005). O processo de extrao o ponto mais
crtico. A macerao, quando necessria, deve ser realizada obedecendo a
rigorosos padres (FIEHN, 2002; FUKUSAKI e KOBAYASHI, 2005). Se a anlise for
feita com biofluidos, essa etapa mais simples. No entanto, esse um tipo de
amostra muito sensvel s variaes citadas anteriormente, exigindo bastante
cuidado dos responsveis por essa etapa (ROBERTSON, 2005; ROCHFORT,
2005).
Muitas das amostras, antes de serem analisadas, necessitam de um prfracionamento. Isso vai depender, principalmente, dos equipamentos a serem
utilizados no fracionamento (FIEHN, 2002; FUKUSAKI e KOBAYASHI, 2005;
ROBERTSON, 2005; ROCHFORT, 2005; WECKWERTH e MORGENTHAL, 2005;).
Esse pr-fracionamento serve para agrupar os compostos presentes na amostra de
acordo com suas caractersticas moleculares utilizando diferentes solventes (WANT
et al., 2006). Dessa forma, pode-se definir qual ferramenta ser utilizada (FUKUSAKI
e KOBAYASHI, 2005; ROBERTSON, 2005; WECKWERTH e MORGENTHAL,
2005). O ponto mais crtico desse pr-fracionamento a escolha do solvente usado
para a separao (FUKUSAKI e KOBAYASHI, 2005). Deve-se prestar muita ateno
nas possveis interferncias que esse solvente pode causar nos equipamentos de
anlise, assim como nas possveis reaes indesejadas que podem ocorrer entre o
solvente e a amostra, produzindo novos compostos (ROBERTSON et al., 2000;
BECKWITH-HALL et al., 2002; ROBERTSON, 2005; WANT et al., 2006).
Outras consideraes devem ser feitas acerca da utilizao da metabolmica
no que tange estudos com animais (ROBERTSON et al., 2002). Uma vez que essa
tecnologia extremamente sensvel, variaes fisiolgicas ou ambientais que o
animal pode sofrer durante o teste sero detectadas e podem mascarar os
resultados. Por exemplo, uma diferena de apenas quatro semanas na idade pode
resultar em uma notria discrepncia no perfil metablico de ratos (ROBERTSON et
al., 2000).
O fracionamento da amostra a etapa mais importante da metabolmica
(FIEHN, 2002; GERMAN et al., 2005). Embora qualquer ferramenta que permita

17

mensurar os metablitos possa ser usada pela metabolmica, a Espectrometria de


Massa (EM) acoplada a Cromatografia lquida, Cromatografia Gasosa ou
Eletroforese Capilar, juntamente com a Ressonncia Magntica Nuclear (RMN)
dominam a literatura (NICHOLSON et al., 1999; FIEHN, 2002; REO, 2002; LINDON
et al., 2003, 2004a; NICHOLSON e WILSON, 2003; WECKWERTH, 2003; BINO et
al., 2004; FERNIE et al., 2004; GOODACRE et al., 2004; ROBERTSON, 2005;
WECKWERTH e MORGENTHAL, 2005).
No fracionamento de amostras para os estudos de metabolmica, o ideal
que se tenha uma alta resoluo dos diferentes compostos presentes. Essa
resoluo depende, sobretudo, da ferramenta utilizada para o fracionamento
(FUKUSAKI e KOBAYASHI, 2005; WILSON et al., 2005). A EM muito mais
sensvel do que a RMN, muito embora isso nem sempre represente uma vantagem
(ROBERTSON, 2005). Essa maior sensibilidade implica em uma menor
reprodutibilidade da anlise no mesmo equipamento ou em equipamentos
equivalentes (FUKUSAKI e KOBAYASHI, 2005; ROCHFORT, 2005; WECKWERTH
e MORGENTHAL, 2005; WILSON et al., 2005). A tabela 2 (ROBERTSON, 2005)
mostra um comparativo entre essas duas ferramentas com relao aplicabilidade
das mesmas na metabolmica. Equipamentos como o Fourier Transform Ion
Ciclotron Ressonance Mass Spectrometry (FT-ICR-MS) combinam a RMN e a EM,
possibilitando a deteco de um maior nmero de compostos diferentes. Entretanto,
esse tipo de equipamento ainda carece do desenvolvimento de algoritmos mais
efetivos para analisar os resultados obtidos com ele (MUNGUR et al., 2005). Uma
variao da RMN, conhecida como Magic Angle Spinning (MAS), permite a anlise
direta de tecidos, no necessitando das etapas de extrao e pr-fracionamento.
Entretanto essa tcnica necessita de equipamentos especiais e recursos humanos
altamente qualificados, acabando por limitar seu uso (STRAUS, 2004). Devido a
essas peculiaridades, a maioria dos grupos de pesquisa voltados aos estudos de
metabolmica esto usando tanto os equipamentos associados a EM quanto os
associados a RMN (ROBERTSON, 2005).

18

Tabela 2: Comparao entre RMN e EM para a aplicao na metabolmica.


RMN
EM
Logstica
Custo total
sem vantagem
Custos para
sem vantagem
utilizao rotineira
Manuteno
vantagem
Custo por amostra
sem vantagem
Habilidade tcnica
vantagem
requeridaa
Durabilidade
sem vantagem
Consideraes
Analticas
Sensibilidade
muita vantagem
Reprodutibilidade
(em outros
muita vantagem
laboratrios)
Velocidade de
sem vantagem
anlise
Capacidade
sem vantagem
(amostras/dia)
Preparo da amostra
vantagem
Automatizao da
vantagem
anlise
Versatilidadeb
vantagem
Seletividadec
vantagem
Metabolmica
Resoluo de
muita vantagem
estrutura molecular
Identificao de
molculas
vantagem
desconhecidas
Polarizaod da
muita vantagem
amostra
Automatizao da
anlise dos
vantagem
resultados
a. O nmero de analitos qualificados por RMN muito menor do que por EM.
b. Geralmente, qualquer equipamento de RMN pode ser configurado para a maioria das
aplicaes, enquanto diferentes equipamentos de EM podem ser necessrios para aplicaes
especficas.
c. A EM prima pela identificao seletiva da identidade molecular, enquanto a RMN prima pela
identificao de todos os tomos que contm prtons na amostra. Entretanto, a seletividade
pode ser uma vantagem ou uma desvantagem, dependendo da aplicao.
d. Potencial para gerar sries de dados incompletos ou com baixa reprodutibilidade devido
polarizao inerente a tecnologia (ex: supresso de ons na EM).
(Adaptado de ROBERTSON, 2005).

19

Existem trs requisitos bsicos para a utilizao de qualquer uma das


ferramentas listadas. So eles: o capital de investimento para a compra dos
equipamentos e reagentes necessrios, uma vez que no existam equipamentos
aptos ao uso; o espao fsico, j que esses equipamentos no so pequenos e
necessitam de temperaturas controladas; e, principalmente, pessoas qualificadas
para manipularem-nos (LINDON et al., 2004b; ROBERTSON, 2005). Como em
grandes instituies de pesquisas comum que existam os trs pr-requisitos,
geralmente, a disponibilidade dos equipamentos e de profissionais capacitados para
oper-los que ir determinar a ferramenta que ser usada (ROBERTSON, 2005).
Aps todos os passos de fracionamento, se faz necessria a converso dos
valores obtidos por diferentes equipamentos para uma unidade padro. Contudo,
isso nem sempre fcil, ainda mais se forem utilizados muitos passos para o
fracionamento (FUKUSAKI e KOBAYASHI, 2005; ROBERTSON, 2005; ROCHFORT,
2005). A converso de dados obtidos por cromatografias, eletroforeses ou mesmo
RMN necessitam de ser convertidos em uma linguagem digital que possa ser
utilizada em anlises multivariadas utilizando ferramentas de estatstica (FIEHN,
2002; DURAN et al., 2003; STEUER et al., 2003; FUKUSAKI e KOBAYASHI, 2005;
MUNGUR et al., 2005; ROBERTSON, 2005; ROCHFORT, 2005; WECKWERTH e
MORGENTHAL, 2005).
As ferramentas de estatstica so muito importantes para a metabolmica
(DURAN et al., 2003; FUKUSAKI e KOBAYASHI, 2005; ROBERTSON, 2005;
WECKWERTH e MORGENTHAL, 2005). Um estudo de metabolmica qualquer
pode gerar milhares de espectros de RMN para serem analisados, o que seria uma
tarefa no mnimo exaustiva, mesmo para um espectroscopista experiente
(ROBERTSON, 2005). Dessa forma, muitas ferramentas tm sido desenvolvidas ou
adaptadas de outros estudos para analisar um grande nmero de dados
rapidamente (FUKUSAKI e KOBAYASHI, 2005; ROBERTSON, 2005; WECKWERTH
e MORGENTHAL, 2005). Entretanto, assim como nos outros passos dos estudos de
metabolmica, as ferramentas de anlise dos dados obtidos ainda so limitadas
(FIEHN, 2002; STEUER et al., 2003; FUKUSAKI e KOBAYASHI, 2005; MUNGUR et
al., 2005; WECKWERTH e MORGENTHAL, 2005).

20

A escolha do tipo de anlise estatstica a ser utilizada nos dados obtidos


pelas tcnicas de fracionamento varia de acordo com a estrutura dos dados e da
inteno da anlise. Entretanto, a Anlise de Componente Principal (ACP) a mais
utilizada na metabolmica (NICHOLLS et al., 2001; NICHOLSON et al., 2002).
A ACP uma anlise muito til para se reduzir grupos de dados muito
grandes e identificar sinais importantes nesses grupos, sobretudo se o
fracionamento no foi bem sucedido. A partir de uma srie de clculos conhecidos
por anlise dos vetores de Eigen, a ACP permite identificar os compostos mais
abundantes e, a partir disto, visualizar as diferenas dentro da amostra e agrupar os
compostos hierarquicamente (FUKUSAKI e KOBAYASHI, 2005).
Associando-se todo esse conhecimento gerado pela metabolmica queles
obtidos pelas outras micas, possvel determinar quais so as rotas metablicas e
os genes que possivelmente estejam envolvidos na produo dos compostos de
maior destaque (FUKUSAKI e KOBAYASHI, 2005). Essa integrao entre as
diferentes plataformas tecnolgicas chamada de Biologia de Sistemas
(ROCHFORT, 2005). A figura 2 mostra um esquema tpico dos passos a serem
seguidos em anlises metabolmicas utilizando plantas, da seleo da amostra at
a determinao dos genes envolvidos na produo dos compostos mais relevantes
(FUKUSAKI e KOBAYASHI, 2005).
Aplicabilidade da Metabolmica
As informaes obtidas pela metabolmica, assim como aquelas obtidas pelo
metabolic profiling, tm sido freqentemente usadas em pesquisas de diversas
reas. Exemplos especficos para indicar o alcance dessa tecnologia incluem a
correlao entre perfis metablicos dos biofluidos e doenas em animais, na
influncia da dieta no padro metablico do indivduo, na investigao dos efeitos
causados pela insero de um gene em um organismo transgnico, entre outras
(BRINDLE et al., 2003; FUKUSAKI e KOBAYASHI, 2005; GIBNEY et al., 2005;
ROBERTSON, 2005; ROCHFORT, 2005; WECKWERTH e MORGENTHAL, 2005).

21

Escolha do organismo

Fracionamento
Converso de

Preparo da
amostra

Prfracionamento
Anlise estatstica

Identificao dos genes e rotas metablicas envolvidos na produo de


metablitos especficos
Figura 2: Esquema tpico de anlises metabolmicas utilizando plantas. 1- escolha do
organismo a ser estudado; 2- preparo da amostra; 3- pr-fracionamento; 4- fracionamento;
5- converso dos resultados para uma unidade comum; 6- anlise estatstica dos dados; 7elucidao funcional de genes. (Adaptado de FUKUSAKI e KOBAYASHI, 2005).

Farmacologia
A metabolmica tem uma gama de aplicaes na rea farmacutica (figura 3),
tendo grande destaque as pesquisas para seleo de frmacos efetivos e seguros, a
identificao de marcadores biolgicos de toxicidade e doenas e o entendimento
dos mecanismos de toxicidade (ROBERTSON, 2005).
Na seleo de frmacos efetivos e seguros, tem-se utilizado bastante os
ensaios in vitro. Isso porque este tipo de ensaio mais rpido e mais fcil de ser
executado. Entretanto, por mais que se use no ensaio clulas do mesmo tecido onde
o frmaco ir atuar, essas linhagens celulares cultivadas no respondem da mesma
maneira do que as clulas que esto no organismo. Com isso, muitos dos frmacos
bem sucedidos nos ensaios in vitro acabam por fracassar nos ensaios in vivo por
provocarem efeitos colaterais indesejados, no observados anteriormente
(ROBERTSON, 2005).

22

Seleo
Ensaios de toxicidade in
vitro e in vivo

Sntese

Industrializao

Busca de marcadores
de toxicidade

Mecanismos de
toxicidade

Figura 3: Esquema padro de desenvolvimento de frmacos indicando as principais etapas


seguidas. Em cada etapa esto indicados os locais onde a metabolmica pode ser aplicada.
(Adaptado de ROBERTSON, 2005).

Os ensaios in vivo certamente trazem resultados mais concisos quanto


eficincia e segurana dos frmacos. Entretanto, a sua utilizao como mtodo
primrio para a identificao de frmacos promissores ainda uma esperana para
um futuro prximo (ROBERTSON, 2005). Seguindo essa idia, espera-se utilizar a
metabolmica como uma tcnica padro para diferenciar os efeitos colaterais
causados pelo frmaco daqueles causados por outros fatores. Outra vantagem
reside no fato de que a metabolmica permite a deteco de problemas causados
por frmacos de uma forma no invasiva atravs da utilizao de biofluidos como
a urina e sangue facilitando a sua aceitao (ROBERTSON et al., 2002).
A identificao de marcadores biolgicos de toxicidade utilizando-se a
metabolmica tem mostrado bons resultados (ROBERTSON, 2005; ROCHFORT,
2005). Essa aplicao teve seu incio com a busca de marcadores biolgicos para
doenas renais e hepticas (ROBERTSON et al., 2000; NICHOLLS et al., 2001).
medida que esses estudos foram avanando, foi constatado que uma srie de
compostos sempre variavam, no importando a natureza do composto txico, seu
mecanismo de ao, ou mesmo seu alvo (ROBERTSON, 2005). Entretanto, a busca
por marcadores biolgicos utilizando a metabolmica vai alm desses compostos
comuns. A partir de anlises comparativas foram detectados uma srie de
compostos que esto relacionados toxicidade renal e nervosa (ROBERTSON,
2005; ROCHFORT, 2005). Certamente, a maior parte do esforo em prol da
utilizao da metabolmica para esse fim realizada pelo COMET (Consrcio de
Metabolmica aplicada a Toxicologia). Esse consrcio visa montar um banco de

23

dados com milhares de espectros de RMN utilizando biofluidos de animais tratados


com toxinas modelo (ROBERTSON, 2005). Esse grupo formado pela Imperial
College de Londres e mais seis companhias farmacuticas que investem milhes de
dlares na seleo e produo de frmacos (ROCHFORT, 2005).
A outra grande aplicao da metabolmica dentro da farmacologia, seno a
maior, no entendimento dos mecanismos de toxicidade, uma vez que
compreendendo esse mecanismo, os marcadores biolgicos sero identificados
(ROBERTSON, 2005). Todavia, para a identificao de um marcador biolgico, no
necessrio conhecer o mecanismo de toxicidade do frmaco. A maioria dos
trabalhos de metabolmica relacionados aos mecanismos de toxicidade tem
comparado os perfis obtidos pelas anlises de biofluidos de animais submetidos
utilizao da toxina estudada aos perfis obtidos de animais no submetidos,
observando os efeitos provocados por essa toxicidade (HOLMES et al., 1998;
ROBERTSON et al., 2000; NICHOLSON et al., 2002; LENZ et al., 2003).
Nutrio
Assim como na farmcia, a metabolmica tem varias aplicaes na rea
nutricional. Como a dieta influencia diretamente no desenvolvimento do indivduo, a
metabolmica possibilita conhecer os arranjos e desarranjos metablicos causados
pela alimentao (GERMAN et al., 2005). Dessa forma, o papel que os componentes
alimentares desempenham na sade e na doena, assim como os efeitos causados
pela falta ou excesso de determinados nutrientes podem muito bem ser conhecidos
pela metabolmica (WATKINS et al., 2001; GERMAN et al., 2003).
Nos alimentos, o nmero de compostos que no so nutrientes muito maior
do que o nmero daqueles que so. Muitos desses compostos no nutrientes so
aqueles j descritos acima, os chamados metablitos secundrios (GIBNEY et al.,
2005). Alm dos compostos advindos dos alimentos, deve-se considerar ainda
queles produzidos pela microbiota intestinal e queles produzidos ou adicionados
aos alimentos durante o cultivo ou o preparo (GERMAN et al., 2005; GIBNEY et al.,
2005). Essas molculas possuem diversas atividades biolgicas e, sem dvida,
interagem de diversas formas dentro do organismo, alterando o metaboloma desse
indivduo (ROCHFORT, 2005). Exemplos simples disso so: a deteco de vrios
metablitos oriundos do caf em alta concentrao na urina seis horas aps a

24

ingesto; o aparecimento de vinte e trs tipos de quercitinas (flavonides) no sangue


aps a ingesto de cebolas fritas, sendo que dezoito delas j so detectadas em
menos de quatro horas aps a ingesto; entre outros (AHARONI et al., 2005;
GIBNEY et al., 2005). Muitas dessas molculas possuem efeitos positivos ou
negativos sobre algumas doenas importantes, como o cncer (GIBNEY et al.,
2005). Como exemplos disso, podem ser citados: o lcool de perila, um
monoterpeno extrado do morango (Fragaria sp.), que tem atividade anticarcinognica e alguns anlogos do estrgeno encontrados em leguminosas que
podem interferir no tratamento do cancer de mama (CASSIDY, 2003; AHARONI et
al., 2005). A figura 4 mostra a distribuio dos compostos oriundos dos alimentos em
nutrientes e no-nutrientes e suas respectivas subdivises.
De posse dessas informaes acerca de como o organismo reage, na esfera
metablica, aos diferentes compostos adquiridos pelo consumo dos alimentos, em
um futuro prximo ser possvel determinar a quantidade correta a ser ingerida de
cada alimento, sem incorrer em problemas causados pela falta ou excesso dos
diversos componentes que esses alimentos possuem (ASZTALOS et al., 2000;
PARKS e HELLERSTEIN, 2000; GERMAN et al., 2005).
Alimento

Nutrientes

Macro-nutrientes

No-nutrientes

Micro-nutrientes

Contaminantes

Insumos agrcolas

Fitoqumicos

Defensivos

Figura 4: Esquema da diviso dos compostos oriundos dos alimentos em nutrientes e nonutrientes, assim como suas respectivas subdivises. (Adaptado de GIBNEY et al., 2005).

Ecologia e Evoluo
Outro campo de notria aplicabilidade da metabolmica a ecologia
(ROBERTSON, 2005; ROCHFORT, 2005). A utilizao dessa plataforma nos
estudos com vegetais tem sido constante nos ltimos anos (FIEHN et al., 2000;

25

ROBERTS, 2000; FIEHN, 2002; VIANT et al., 2003; WECHWERTH, 2003;


FUKUSAKI e KOBAYASHI, 2005; RISCHER e OKSMAN-CALDENTEY, 2006). A
realizao desses estudos visa entender, sobretudo, o mecanismo de ao de
compostos bioativos e a diferenciao de variedades selvagens daquelas
modificadas geneticamente (OTT et al., 2003; FUKUSAKI e KOBAYASHI, 2005;
MUNGUR et al., 2005; RISCHER e OKSMAN-CALDENTEY, 2006).
A metabolmica permite identificar os efeitos de compostos bioativos, como
os herbicidas, em plantas de interesse agronmico (ARANIBAR et al., 2001; OTT et
al., 2003). A partir de espectros de RMN realizados com extratos obtidos de
exemplares de milho (Zea mays) tratados com diversos compostos bioativos, como
o Glyphosate, entre outros, demonstraram a interferncia desses compostos em
processos biolgicos importantes, como a mitose, a fosforilao oxidativa e o
transporte de auxina (OTT et al., 2003).
A anlise de organismos geneticamente modificados (OGM) pela
metabolmica tem sido extensamente utilizada (MUNGUR et al., 2005; KRISHNAN
et al., 2005; RISCHER e OKSMAN-CALDENTEY, 2006). Esse tipo de estudo prima
por detectar as diferenas imprevistas existentes entre a cultivar selvagem e a
transgnica. Essas diferenas imprevistas so explicadas pelas interaes
randmicas ou desconhecidas que ocorrem entre os genes, assim como a
participao dos metablitos em diversas rotas metablicas (RISCHER e OKSMANCALDENTEY, 2006). A insero de genes pode provocar um nmero elevado de
modificaes no perfil metablico de uma planta. De acordo com Mungur et al.
(2005), a insero do gene oriundo da bactria Escherichia coli que codifica a
enzima Glutamato desidrogenase em plantas de tabaco (Nicotiana tabacum) alterou
o perfil metablico de duzentos e oitenta e trs metablitos nas razes e noventa e
oito nas folhas da planta. Nesse estudo foi utilizada a ferramenta de fracionamento
FT-ICR-MS. Mesmo com a confirmao dos metablitos correspondentes a apenas
42% dos ons detectados, foi comprovado o aumento da concentrao de: alguns
aminocidos, como a arginina, fenilalanina, triptofano, asparagina, glutamina e
histidina; alguns acares e derivados, sobretudo alguns intermedirios na
regenerao da ribulose-5-fosfato no ciclo de Calvin; alguns metablitos secundrios
e compostos nitrogenados, como fenis, alcalides e aminas; entre outros. Alm

26

disso, foi detectada a presena de cerca de trinta e dois compostos de importncia


farmacutica, entre eles nove compostos carcinognicos e quatorze frmacos em
potencial (MUNGUR et al., 2005).
Outra aplicao da metabolmica na botnica reside no entendimento da
relao planta-patgeno. Ao serem parasitadas por insetos ou nematides, por
exemplo, as plantas produzem e liberam uma srie de compostos como fenis,
terpenos ou alcalides. Esse aumento de produo induzido pelo contato com
sinalizadores qumicos oriundos dos patgenos. Contudo, apesar de todas as
plantas reagirem ao parasitismo, nem todas produzem os metablitos necessrios
para o controle do patgeno. Dessa forma, a metabolmica pode ser aplicada na
identificao dos metablitos diferenciais entre variedades resistentes e susceptveis
a uma determinada praga. Esse tipo de trabalho j largamente efetuado a nvel
transcriptmico e protemico. Entretanto, em se tratando de metabolmica, isso j
bem mais incomum (FORST, 2006).
Adicionalmente, a utilizao da metabolmica para a diferenciao de
organismos tambm vem sendo usada fora da botnica. Challis e Hopwood (2003)
compararam algumas espcies do gnero Streptomyces, organizando-as
evolutivamente a partir da presena de metablitos secundrios com efeito
antibitico. Em outro exemplo, Viant et al. (2003) conseguiram diferenciar os
mariscos (Haliotis rufescens) normais dos portadores da sndrome de withering
utilizando espectros de RMN de diversos biofluidos.
Perspectivas para a metabolmica
Recebe o nome de repetitivo aquele resultado que obtido mais de uma vez,
sob as mesmas condies, com os mesmos equipamentos e no mesmo laboratrio.
chamado de reproduzvel aquele resultado que obtido em condies parecidas,
com equipamentos similares e em um outro laboratrio (FUKUSAKI e KOBAYASHI,
2005). A metabolmica atualmente tropea em um problema que, de certa forma,
comum a outras plataformas tecnolgicas, como a protemica ou a transcriptmica.
Esse problema a falta de um protocolo padro (ROCHFORT, 2005). Como cada
laboratrio utiliza uma determinada seqncia de procedimentos com seus prprios
equipamentos, fica difcil de manter a reprodutibilidade, ou at mesmo a
repetitividade (ROBERTSON, 2005).

27

A falta de um protocolo padro existe hoje porque as prprias ferramentas de


fracionamento da amostra e anlise dos resultados necessitam ser melhoradas
(FUKUSAKI e KOBAYASHI, 2005; WECKWERTH e MORGENTAL, 2005). No
fracionamento, as ferramentas de maior sensibilidade esbarram na baixa resoluo
dos resultados, enquanto aquelas que primam pela resoluo, exigem uma grande
quantidade de amostra, limitando a sua utilizao (ROBERTSON, 2005). Contudo, o
principal desafio a ser enfrentado pela metabolmica desenvolver ferramentas
para comparar, entender e aplicar todo o conhecimento gerado por ela. Uma boa
parte dos dados obtidos simplesmente rejeitada pela falta de uma tecnologia que o
entenda (MUNGUR et al., 2005; KRISHNAN et al., 2005; ROBERTSON, 2005).
Conhecer o perfil metablico de um organismo por si s importante, mas
no suficiente. Faz-se necessria a integrao das informaes obtidas pela
metabolmica, protemica, transcriptmica e genmica (ROBERTSON, 2005;
ROCHFORT, 2005, KLENO et al., 2004). Dessa forma seria possvel prever como
uma supresso ou uma super expresso gnica influenciaria no perfil protico e
metablico, assim como tambm prever a influncia de metablitos inseridos no
organismo (alimentos e remdios, principalmente) na expresso gnica (FUKUSAKI
e KOBAYASHI, 2005; GIBNEY et al., 2005; ROBERTSON, 2005). Essa unio de
esforos o objetivo da Biologia de sistemas (ROCHFORT, 2005).

Consideraes Finais
O desenvolvimento destas plataformas tecnolgicas conhecidas como
micas tem trazido uma srie de conhecimentos para a cincia. Sem dvida, a
genmica a mais desenvolvida. Isso porque ela j tem protocolos determinados e
ferramentas de fracionamento e anlise dos resultados bem desenvolvidos.
Entretanto, ainda h muito que se descobrir e melhorar na genmica (BINNECK,
2004).
Contudo, muitas das reaes e interaes que definem um processo
biolgico, a diferenciao de um organismo ou mesmo a interao entre vrios seres
est fora da esfera genmica (GOODACRE, 2005; HTTENHOFER e VOGEL,
2006). Por isto que existe a necessidade de se desenvolver as outras plataformas
(HTTENHOFER e VOGEL, 2006; BINNECK, 2004).

28

Nem todos os fragmentos de DNA de uma clula representam um gene,


assim como nem todo gene vai dar origem a apenas um RNAm. A transcriptmica
tem a funo de descobrir que genes esto sendo transcritos sob uma determinada
condio (NAKANISHI e NUREKI, 2005). Entretanto, as tcnicas utilizadas para
esse fim no conseguem detectar todos os RNAm, deixando de fora aqueles
encontrados em concentraes muito baixas. Muitos desses podem estar
relacionados a processos regulatrios importantes, sendo responsveis por codificar
as protenas que iniciaro alguma importante modificao fisiolgica da clula
(RIGOUTSOS et al., 2006; NAKANISHI e NUREKI, 2005; FRANK e HARGREAVES,
2003). Por isso os dados obtidos pela transcriptmica, apesar de muito importantes
e teis, nem sempre refletem a expresso protica da clula (BINNECK, 2004;
FEDER e WALSER, 2005).
O nmero de protenas diferentes produzidas por um organismo excede e
muito o nmero de genes do mesmo. Isso se deve s vrias modificaes ps
transcricionais e traducionais que ocorrem com o RNAm e a seqncia de
aminocidos produzida, respectivamente. Devido a esse aumento das variaes
possveis, torna-se mais trabalhoso conhecer o proteoma completo de um
organismo (VIVANCO et al., 2003). As tcnicas utilizadas na protemica, pelo
mesmo motivo, acabam por Ter problemas similares quelas da transcriptmica. As
baixas concentraes de protenas regulatrias e iniciadoras de processos
biolgicos impedem, s vezes, a deteco destas (ROCHA et al., 2005; VIVANCO et
al., 2003). Mesmo com o desenvolvimento de novas estratgias, como por exemplo,
o pr-fracionamento da amostra ou a utilizao de corantes altamente especficos,
ainda muito difcil detectar tais protenas (ROCHA et al., 2005; MDER, 2002).
A metabolmica foi criada para analisar um outro grupo de molculas ainda
mais diversificado que o das protenas. Estas molculas so chamadas de
metablitos (ROBERTSON, 2005; FIEHN, 2002). De acordo com a sua presena em
diferentes organismos, assim como a sua participao em rotas metablicas
importantes, esses metablitos so classificados em primrios e secundrios
(CHALLIS e HOPWOOD, 2003; HALL, 2006). Os primrios so aqueles comuns a
qualquer clula e que participam de processos celulares importantes e que se
conservaram ao longo da evoluo (SMEDSGAARD e NIELSEN, 2005). Os

29

secundrios so aqueles encontrados somente em algumas famlias ou gneros de


plantas e fungos e que esto relacionados s processos especficos, como a defesa
contra patgenos, ou mesmo estrutura da clula (DIXON, 2001; CHALLIS e
HOPWOOD, 2003). As dificuldades para se conhecer todo o metaboloma de um
organismo, clula ou biofluido ainda maior do que quelas encontradas nas
anlises de RNAm ou protenas. Os metablitos so estruturalmente muito diversos,
por isso necessitam da utilizao de vrios equipamentos de fracionamento (FIEHN,
2002). Alm disto, eles so encontrados em concentraes muito variadas entre si,
tornando a deteco e a resoluo de suas estruturas um processo muito difcil,
mesmo com equipamentos muito sensveis (MUNGUR et al., 2005). Por fim, a
concentrao deles muito sensvel a qualquer modificao fisiolgica ou ambiental.
Isso faz com que os protocolos de preparo e fracionamento das amostras possuam
baixa reprodutibilidade, ou mesmo, repetibilidade (FUKUSAKI e KOBAYASHI, 2005).
Assim como as outras plataformas referidas anteriormente, a metabolmica
possui uma srie de etapas. Em todas elas, uma srie de fatores pode causar erros
experimentais que afetariam diretamente o resultado da pesquisa. Alm disto, os
trabalhos de metabolmica exigem uma srie de equipamentos muito caros e,
principalmente, profissionais altamente capacitados para manipul-los (FUKUSAKI e
KOBAYASHI, 2005; ROCHFORT, 2005; WECKWERTH e MORGENTHAL, 2005).
Estes fatores limitam os trabalhos de metabolmica aos grandes centros de
pesquisa, onde j existem esses pr-requisitos (ROBERTSON, 2005).
A metabolmica tem sido empregada em vrias reas da cincia e para
diversos fins. Na farmacutica, sobretudo na parte de toxicologia e desenvolvimento
de frmacos, a metabolmica est sendo empregada para se identificar marcadores
biolgicos de toxicidade ou doenas, no entendimento do mecanismo de ao de
vrias toxinas e na seleo de frmacos efetivos e seguros (ROBERTSON, 2005;
WECKWERTH e MORGENTHAL, 2005). Na rea nutricional, a metabolmica pode
ser aplicada para se conhecer os efeitos que os compostos no nutrientes que esto
presentes no alimento causam no indivduo, assim como entender os efeitos
causados pela falta ou excesso de determinado nutriente na manuteno da sade
ou no desenvolvimento de doenas (GERMAN et al., 2003; GIBNEY et al., 2005;
WATKINS et al., 2001). Na rea ecolgica, a metabolmica tem sido aplicada,

30

sobretudo, na deteco de alteraes imprevistas em OGM, demonstrando que a


insero de apenas um gene pode alterar a concentrao de centenas de
metablitos, assim como levar produo de dezenas de compostos de importncia
farmacutica (MUNGUR et al., 2005). Alm disso, essa plataforma tecnolgica pode
ser aplicada na identificao dos metablitos que diferenciam variedades de uma
planta de interesse agronmico que so resistentes a uma determinada praga
daquelas que so susceptveis. Entretanto, a aplicao da metabolmica na ecologia
ainda abrange outros campos, como por exemplo, a diferenciao de espcimes
normais daqueles portadores de doenas, de uma forma no invasiva (CHALLIS e
HOPWOOD, 2003) ou o efeito de compostos bioativos em plantas de interesse
agronmico (OTT et al., 2003; ARANIBAR et al., 2001). Na evoluo, a
metabolmica pode ser aplicada na organizao evolutiva de diferentes espcies de
um mesmo gnero a partir do perfil metablico (VIANT et al., 2003).
Na metabolmica ainda h muito que se desenvolver. A primeira coisa a ser
feita estabelecer um protocolo padro (FUKUSAKI e KOBAYASHI, 2005). Uma vez
que cada laboratrio desenvolve seus projetos a sua maneira, fica complicado
reproduzi-los. Porm, o mais importante a ser melhorado, tanto para a metabolmica
quanto para as outras plataformas tecnolgicas, so as ferramentas de
fracionamento e anlise das amostras, principalmente as do segundo grupo
(ROBERTSON, 2005).
As informaes obtidas pela metabolmica so de grande valia em qualquer
das reas j citadas. Entretanto, a integrao dessas informaes com aquelas
obtidas pelas outras plataformas tecnolgicas (protemica, transcriptmica e
genmica, principalmente) trar muito mais avanos no que tange relacionar o
gentipo e o fentipo dos organismos (ROCHFORT, 2005; BINNECK, 2004).

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