Com o mundo atual globalizado e a tecnologia se desenvolvendo na
direo da incluso e de estar ao alcance de todas as pessoas, os mais variados setores indstriais vem crescendo e tomando propores antes no imaginveis desde a sua escala de produo at a demanda por matria prima. E no mbito das indstriais qumicas no tem sido diferente, j que na situao atual inmeros produtos utilizados pelos seres humanos tem sua origem ligada a processos qumicos, o que causa um alerta nas autoridades governamentais ligadas a preservao do meio ambiente, pois com a crescente demanda na fabricao de novos produtos oriundos de atividades laboratoriais surge tambm uma crescente gerao de resduos que podem vir a contaminar bens naturais como a gua e o solo, assim como os animais e a prpria humanidade. Levando em conta este cenrio descrito acima, plausvel que tambm aja um maior incentivo das autoridades e esforo da comunidade cientifica no desenvolver de novas tcnicas aplicadas aos processos realizados que vsem uma reduo dos impactos ambientais gerados pelas atividades industriais considerando toda a sua linha de produo at o uso do produto final. Neste trabalho o enfoque foi nas industrias farmacuticas onde os remdios criados so constitudos de substncias ativas que atualmente esto sendo classificadas como uma classe emergente de contaminantes afetando organimos terrestres e principalmente aquticos 2. Pesquisas recentes documentam a ocorrncia destes compostos farmacuticos em guas naturais e em efluentes de tratamento de esgoto urbano, onde a de concentrao de tais substncias estaria na escala de g/L e ng/L.[ref] Dentro dessa classe ampla de compostos farmacuticos, podemos denominar os antibiticos como sendo aqueles de maior periculosidade quando se encontram presentes no meio ambiente, pois quando em contato com organimos vivos podem acabar gerando uma resistncia ao uso desses medicamentos, diminuindo assim a efetividade no combate a diversos tipos de doenas. Isto resultado do aumento no uso dessas drogas por atividades ligadas a criao de rebanhos, aves e peixes assim como fruto do hbito das pessoas de se automedicarem fazendo uso sem orientao de tais substncias que podem resistir as reaes das vias metablicas sendo escretadas com at 90% da quantidade inicalmente ingerida, acarretando em uma seleo de carter gentico onde apenas as bactrias mais perigosas se reproduzem, causando preocupao e necessidade de que se tenha legislaes e procedimentos para monitorar, medir e controlar este tipo de resduo gerado 2,3.
Inclusa nessa gama de agentes antibacterianos, est a classe das
sulfonamidas, que so utilizadas desde a dcada de 1930 para tratamento de doenas em seres humanos devido ao seu grande expectro de ao que se mostra eficaz contra bactrias gram positivas e gram negativas, alm de ser considerado um remdio de baixo custo para a linha de produo e comercializao, fato que tambm faz com que essa classe de frmacos seja utilizada no uso veretinrio. Abaixo na figura 1, tem-se um esquema dos possveis fatos responsveis pela contaminao de sulfonamidas no meio ambiente.
Figura 1 - possveis causas de contaminao das sulfonamias no meio ambiente. Fonte:
Esta classe de antibiticos sintticos deriva-se da substncia conhecida
como sulfonilamida5 e existem diversos compostos antimicrobianos que contm o grupo sulfonamida como uma espcie de radical similar formando ento um conjunto de cerca de 150 SNs diferentes. A estrutura molecular com propriedades bacteriostticas a que nos referimos esta representada na figura 2 abaixo, sendo composta por um radical (-N4H2) em uma das extremidades, seguido de um anel benznico unido a um grupo sulfonil ligado a outro grupo amida que serve como stio para ligao de outros radicais, gerando ento as diversas sulfonamidas que tem sido reportadas ao longo da histria6.
Figura 2 - estrutura geral das sulfonamidas
Olhando para a parte farmacolgica, podemos salientar que as
sulfonamidas tem estrutura semelhante a de um composto importante para reaes de sntese de cido flico por parte das bactrias, este o cido paminobenzico tambm conhecido como PABA, sendo assim sulfonamidas agem como agentes competidores pelos stios ativos de uma enzima denominada dipropteroato sintetase, o que impede a sntese de cido flico por parte das bactrias impedindo assim a sua proliferao 7. Devido a diversidade de sulfonamidas existentes e seus diferentes modos de ao, elas so largamente utilizadas nos dias atuais tanto para uso humano quanto veterinrio e como no h tratamento espcifico para tais resduos que so deixados no meio ambiente, a contaminao inevitvel, causando resistncia por parte das bactrias e mutaes da enzima dipropteroato sintetase, o que dificulta a ao das sulfonamidas no mecanismo de inibio da sntese do cido flico diminuindo sua eficcia no combate as enfermidades8. Sendo assim preciso que trabalhos atuais estudem e criem novos mtodos que identifiquem e quantifiquem a presena desses antibiticos em nosso ambiente, o problema que tais agentes bacterostticos se encontram em quantidades minmas em matrizes complexas com diversos tipos de interferentes que podem prejudicar uma determinao final de sua concentrao, logo se faz necessrio o uso de mtodos que limpem e preparem tais amostras para posterior uso de tcnicas de separao e quantificao desses contaminantes. Por isso quando se trata de amostras de origem ambiental de extrema importncia que os processos de preparo de amostras sejam efetivos e eliminem quaisquer impurezas presentes, por isso so requeridos processos que alm de realizarem a limpeza amostral tambm permitam que se concentre os analitos de interesse para melhorar o sinal dos mesmos em uma anlise final da presena destes contaminantes. Atualmente com polticas de preservao do meio ambiente, o contexto da qumica verde e os interesses financeiros dos setores industriais, so exigidos cada vez mais mtodos que executem o processo de clean-up amostral de maneira rpida, usando o mnimo de reagentes e gerando pouco resduo. Tcnicas como a SPE (solid phase extractation), MEPS (microextractation by packed sorbent), SPME (solid phase micro-extractation) e QuEChERS tem sido usadas revelando nveis satisfatrios de desempenho no processo de preparo da amostra, trazendo como resultado taxas de recuperao dos analitos e de reduo de efeitos de matriz cada vez melhores frente a mtodos anteriormente utilizados, vale ressaltar que cada uma dessas tcnicas tem suas particularidades porm no geral elas se assemelham por serem processos limpos, econmicos e simples de serem executados, fatos que as tornam mais viveis do ponto de vista industrial e ambiental.[ref] Dentre os locais onde esto se tem encontrado a maior parte dos contaminantes de origem farmacutica podemos destacar o solo, que tem caractersticas porozas contendo matria inorgnica e orgnica favorecendo assim interaes adsortivas dessa matriz com os mais diversos tipos de
compostos incluindo os frmacos10.Outra importante matriz atingida por este
tipo de contaminao so as guas subterrneas e de rios, levando em conta que o solo desencadeia papel fundamental na preservao de ecossistemas adjacentes por realizar a filtragem de substncias, podemos dizer que estas duas matrizes esto relacionadas e o lodo de esgoto, tambm conhecido como bioslido, proveniente de estaes de tratamento est incluso tanto no solo onde usado como adubo orgnico ou nos efluentes de guas residurrias onde gerado, sendo assim houve a escolha deste bioslido como matriz de estudo devido ao mesmo apresentar altas probabilidades de adsoro de resduos dos mais diversos tipos de frmacos, incluindo as sulfonamidas 11. Considerando ento a fora das interaes de adsoro entre o lodo de esgoto e os resduos de interesse, o processo de identificao e quantificao de tais analitos tem certo grau elevado de difilcudade pois para extra-los de uma matriz complexa como esta necessrio um mtodo efetivo que garanta confiabilidade na limpeza da amostra. Levando em conta estes fatores, o mtodo escolhido para realizar o processo de determinao das nove sulfonamidas foi o ento denominado: quick, easy, cheap, effective, rugged and safe, criado inicialmente por Anastassiades et al. no ano de 2003 que at os dias atuais vem sendo utilizado e aprimorado revelando altos nveis de recuperao, baixo consumo de reagentes e geraes de resduos, mostrando-se adequado para o estudo proposto 12. Inicialmente a metodologia QuEChERS foi desenvolvida com o objetivo de ser aplicada em amostras de origem alimentar com a finalidade de extrair e isolar algumas classes de pesticidas e inseticidas como: os organiclorados, organofosforados e os organonitrogenados. Portanto o mtodo deveria ter uma ampla faixa de atuao sendo classificado como um mtodo MRMs (Multiclass and Multiresidue methods), a necessidade de se desenvolver uma nova metodologia de sucesso na identificao dessa classe de contaminantes provm da concincia ambiental que vinha se criando durante a dcada de 90, j que os pesticidas so uma classe de resduos com mais de 50 anos de estudos e desenvolvimentos de diversas metodoligas, porm nenhuma capaz de cobrir toda a faixa de contaminantes polares e apolares nos reportando uma faixa de recuperao e repetibilidade aceitvel 12. Sendo a flexibilidade uma das principais vantagens do mtodo escolhido para esse estudo, pois desde a sua criao em 2003, inmeras pesquisas reportam adaptaes do processo de extrao QuEChERS para torn-lo mais adequado e reprodutivo para determinado tipo de matriz 13(diana),14,15. O processo original criado por Anastassiades et al em 2003 est ilustrado na figura 3, abaixo:
Figura 3 - Procedimento geral para a metodologia "QuEChERS"
10,0 g de amostra (sem clean up)
10,0 mL de acetonitrila
Vortex (1,0 min)
4,0 g de MgSO4 anidro + 1,0 g de NaCl
Vortex (1,5 min)
Centrfugaa Pega uma alquota e adiciona 150 mg/mL MgSO4 + 25mg/ ml adsorvente (PSA) Vortex (1,0 min) Centrfugaa Pega uma alquota para anlise em GC/MS ou LC/MS
Como era de se esperar a metodologia QuEChERS inicial contempla
poucos passos de extrao, sendo considerada simples e de fcil execuo podendo ser conduzida por pessoas com um treinamento mnimo aceitvel no manuseio laboratoral. Porm para este presente trabalho onde se procura otimizar tal procedimento, faz-se nessesrio entender cada um dos passos, as interaes e efeitos gerados pelos reagentes usados, sendo assim uma explicao mais terica da metodologia em geral deve ser feita. O mtodo original de preparo de amostra QuEChERS pode ser dividido em algumas etapas como: i)
Fragmentao e homogenizao: Como a massa da matriz
utilizada no mtodo menor em relao a outras tcnicas tradicionais de extrao, existe a necessidade de se fragmentar a amostra inicial (geralmente na ordem de kilogramas) e homoneizar a mesma para se obter uma maior superfcie de contato na hora de extrair os componentes.
ii)
iii)
iv)
v)
vi)
Extrao e partio: Devido a natureza das matrizes utilizadas
nesse mtodo serem alimentares ou ambientais, sempre h uma grande porcentagem de gua nas mesmas, por isso necessrio a adio de um solvente orgnico como etapa de extrao, para que haja a separao entre a fase aquosa e a orgnica com posterior migrao dos analitos de interesse para a fase orgnica. Logo este o papel exercido pelo solvente utilizado no mtodo, geralmente acetonitrila, podendo ser tambm acetona ou acetato de etila. Adio do sal: nesta etapa da extrao so feitas as adies de NaCl e MgSO4 afim de induzir a separao das fases aquosa/orgnica e o ajuste da polaridade atravs do efeito denominado salting-out, o qual auxlia promovendo a secagem da fase aquosa aumentando o coeficiente de distribuio de determinado analito na fase orgnica diminuindo a presena do mesmo na gua, aumentado assim a eficincia do mtodo de extrao. Adio de padro interno: adiciona-se uma soluo de padro interno visando minimizar possveis erros provenientes das etapas de extrao do mtodo, est soluo pode ser usada em uma etapa inicial do procedimento, porm se a matriz apresenta uma concentrao significativa de gordura ( 0,3 g/10,0 mL de acetonitrila) que pode criar uma camada adicional para onde parte dos analitos podem migrar, recomendvel a adio deste padro somente no final do procedimento analitico de extrao. Utilizao de composto adsorvente: etapa onde uma alquota da amostra movida para um tubo extrator vazio onde uma pequena quantidade de composto adsorvente, geralmente PSA (primary secondary amine), C18 ou Grafite adicionada e homogeneizada com a soluo para que o material adsortivo se distribua por toda a alquota retendo compostos interferentes provenientes da matriz, realizando assim um clean up adicional do extrato a ser analisado. Anlise da amostra: dependendo da origem do extrato, aps a execuo do quinto passo a amostra j pode ser inserida em um equipamente GC ou HPLC para identificao e quantificao dos analitos, porm em alguns casos necessrio passos adicionais como: adio de protetores de analitos em sistemas GC ou a prconcentrao dos analitos em solvente, antes da injeo em sistemas HPLC, no entanto como o intuito era explicar o mtodo de uma maneira geral mais abrangente estes passos ficam citados aqui na etapa de anlise amostral.
Depois de realizado todo o processo de estudo da matriz, da classe dos
analitos em questo e do processo de preparo da amostra, possvel realizar a quantificao e identificao dos compostos atravs de tcnicas cromatogrficas.
No ramo da cromatografia os processos de separaes so regidos por
interaes entre uma fase mvel (onde est contido o analito) e uma fase estacionria, nesta estapa de separao e identificao dos analitos diferentes variveis podem influenciar em uma melhor separao cromatogrfica. Atualmente existem vrias tcnicas de cromatografia sendo utilizadas em anlise de rotina tanto em laboratrios industriais quanto nos de pesquisa cientfica. Esses tipos de cromatografia diferem entre si pelo mecanismo utilizado na separao dos analitos, assim como na natureza da fase mvel e estacionria a serem utilizadas.