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2013

I. INTRODUCCIN
En el presente informe de laboratorio se muestra como se realiza la
preparacin de muestras para la observacin de microorganismos en
freso. Tambin observamos la importancia y ventajas
coloracin

simple

para

la

visualizacin

de la

diferenciacin

de

bacterias.

II. MARCO TERICO


TINCIN DE BACTERIAS
La coloracin se da de acuerdo con a la accin de los iones complejos
del colorante y los sitios activos de la superficie o del interior de la
clula.
Entre los diversos tipos de coloracin de bacterias, estn la coloracin
simple, diferencial y la tincin negativa.
Coloracin Simple:
Este tipo de coloracin consiste en inundar con un colorante cualquiera
la lmina donde se tienen las bacterias, luego lavarlas con agua, y
algunas clulas retendrn el colorante, por reaccin con el mismo.
Coloracin diferencial:
Este tipo de coloracin es sumamente importante, ya que discrimina
entre un tipo de bacterias y otro de acuerdo con su susceptibilidad ante
uno u otro colorante.
Entre estos mtodos se encuentra:

La coloracin de Gram: Este mtodo discrimina entre clulas


grampositivas y clulas gramnegativas, es generalmente utilizado
debido a que muchas de las clulas patgenas son del tipo
gramnegativo, aparte de esta diferencia las clulas grampositivas
son ms susceptibles a la penicilina y ms resistentes a la accin
mecnica y exposicin a algunas enzimas que las gramnegativas.
La forma en que se realiza este mtodo es aplicando cristal
violeta a la laminilla, luego se aplica yodo como colorante, luego
se lava con alcohol, para finalmente aadirle un colorante de
contraste. En general, se obtienen bacterias de color rojo y
violeta. Las clulas gramnegativas pierden el cristal violeta
durante el lavado, por lo tanto aparecen rojas ante el contraste de
la safranina, las clulas grampositivas retienen el cristal violeta,
por lo tanto se observan violeta profundo.

Mtodo de cidoresistencia: Se usa ampliamente para el


gnero Mycobacterium. Esta es la tincin que se realiza con
fucsina fenicada (calentada), cido-alcohol y azul de metileno. Las
bacterias que obtienen cierta coloracin con este mtodos son
acidorresistentes, toman un color rojo, las que lo pierden se
coloran con azul de metileno y no son acidorresistentes.

Mtodo de Giemsa: Se usa para determinar la presencia de


rickettsias dentro de clulas huspedes. Esta prueba se utiliza
para pruebas con sangre y para pruebas de protozoos.

Tincin Negativa
Esta prueba consiste en la visualizacin de bacterias en una pelcula
oscura, se realiza aadiendo tinta china o nigrosina a la suspensin
bacteriana, se coloca en un portaobjetos como una pelcula y se deja

secar, luego al observar en el microscopio, se observar que los


microorganismos aparecen transparentes.

TINCIN

TINCIONES
SIMPLES

TCNICAS DE TINCIN PARA BACTERIAS


USO
TCNICAS
Un colorante;
Se tie con un colorante bsico (azul de
proporciona
metileno, cristal violeta, o fucsina bsica)
contraste para
durante unos 5 minutos. Aclarar
observar mejor
brevemente con agua. Se tien casi todas
un organismo
las bacterias; la mayora de los tejidos no
completo
se tien.

TNCIONES
DIFERENCIA
LES

Tincin de
Gram

Tincin de
cidoalcohol
resistencia
(ZiehlNeelsen)

Dos o ms
colorantes;
distingue entre
bacterias Gram
positivas y Gram
negativas

Dos colorantes;
distingue entre
las micobacterias
(cido-alcohol
resistentes) y el
resto de las
bacterias

Se cubre la preparacin de bacterias


fijadas con cristal violeta y despus con
una solucin de iodo (mordiente). Todas
las clulas quedan tenidas de color violeta
oscuro. Se decolora con acetona al 95%.
Las clulas Gram positivas permanecen
tenidas, pero las negativas pierden el
colorante. Se tie con safranina
(contraste). El color violeta de las Gram
positivas se vuelve ms oscuro y las Gram
negativas se tien de rosa.
Se tien las clulas con fucsina bsica y se
calienta a emisin de vapores durante 5
minutos. Todas las bacterias se tien de
rojo. Se decolora brevemente con una
mezcla de alcohol-HCl. Las bacterias
resistentes permanecen teidas de rojo;
todas las dems se decoloran. Se trata con

el colorante de contraste azul de metileno.


Las bacterias cido-alcohol resistentes
continan tenidas de rojo, las otras se
tien de azul.
Tinciones
especificas
Tincin de
esporas de
WirtzCortitlin

Tie
selectivamente
las endosporas

Tincin de
flagelos de
Leifson

Permite observar
los flagelos

Tincin
negativa

Revela la
presencia de
cpsulas

Se cubre la preparacin con verde de


malaquita y se calienta a emisin de
vapores durante 60 segundos. Se lava con
agua durante 30 segundos y se tie con
safranina. Las endosporas retienen el color
verde; el resto de la clula toma el color
rosa.
A las clulas previamente fijadas, se le
aade una mezcla de cido tnico
(mordiente) y del colorante rosanilina. El
mordiente engruesa los flagelos y el
colorante los fine.
Se utiliza tinta china o nigrosina para tenir
una preparacin en fresco del espcimen.
Las particulas de colorante no pueden
penetrar en la cpsula, que se observa
como una regin clara alrededor de la
clula.

COLORANTES
Lugol
Es una disolucin de yodo molecular I2 y yoduro potsico KI en
agua destilada.
Este
producto
se
emplea
frecuentemente
como desinfectante y antisptico, para la desinfeccin de
agua en emergencias y como un reactivo para la prueba del
yodo en anlisis mdicos y de laboratorio.
Tambin se ha usado para cubrir deficiencias de yodo; sin embargo, se
prefiere el uso de yoduro de potasio puro debido a la ausencia de yodo
diatmico, forma molecular cuyo consumo puede resultar txico.

Frmula: Consiste en 5 gr de I2 y 10 gr de KI diluidos con 85 mL de agua


destilada, obtenindose una disolucin marrn con una concentracin
total de yodo de 150 mg/ml.
Azul de metileno
Cuyo nombre cientfico es Cloruro de Metiltionina, es un colorante que
se usa para tratar una enfermedad llamada metahemoglobinemia.
Es
un compuesto
molecular: C16H18ClN3S.

qumico heterocclico aromtico con frmula

Uso:

Antisptico y cicatrizante interno, en Medicina.

Colorante en las tinciones para la observacin en el microscopio,


y para teir resultados en los laboratorios.

En acuacultura de

peces

tropicales

para

tratar

las infecciones fngicas


Propiedades:
Esta sustancia tiene forma de cristales o polvo cristalino y presenta un
color verde oscuro, con brillo bronceado. Es Inodoro y estable al aire.
Sus soluciones en agua o en alcohol son de color azul profundo. Es
fcilmente soluble en el agua y en cloroformo; tambin es
moderadamente soluble en alcohol.

III.

OBJETIVOS
Aprender a preparar muestras en fresco.
Aprender a preparar muestras coloreadas (Coloracin Simple)

Identificar

microorganismo

mediante

la

observacin

de

muestras en el microscopio.

IV.

MATERIALES Y REACTIVOS

MATERIALES
Microscopio
Lamina PortaObjeto
Lamina CubreObjeto
Mechero Bunsen

REACTIVOS
Azul de Metileno
Lugol
Aceite de Inmersin
Agua
Chica de Jora
Yogurt natural

V. PROCEDIMIENTO
1. Preparacin en fresco y fijacin con un mordiente
a. Observacin de microorganismos en agua estancada y/o
fermento
En una lmina portaobjetos colocar una gota de la
muestra
Colocar una laminilla cubre objetos y observar con
objetivo de 10x y 40x
Dibujar los microorganismos que observa.
Aadir una gota de Lugol en la presentacin,
observar con objetivo de 10 y 40X y dibujar el
nuevo aspecto de los microorganismos.
b. Observacin de levaduras
Colocar en una lmina portaobjetos una gota de un
fermento (chicha) o de una suspensin acuosa de
levaduras.

Colocar una laminilla cubre objetos y observar con


objetivo de 10X y 40X.
Dibujar las levaduras.
Aadir una gota de Lugol en la preparacin,
observar con objetivo de 10X y 40X y dibujar el
nuevo aspecto de las levaduras.
2. Coloracin Simple
Observacin de levaduras y bacterias coloreadas
En una lmina porta objetos, con la ayuda de
una asa de siembra extender una gota de
fermento o suspensin de levaduras y dejar
secar en el ambiente.
En otra lmina realizar el extendido de una gota
de yogurt y dejar secar en el ambiente.
Luego, realizar la fijacin de las muestras,
pasando por la llama del mechero el lado que no
contiene la muestra (3 veces).
Cubrir las muestras con azul de metileno al 0.1%
durante un minuto. Luego de este tiempo,
descartar el exceso del colorante y lavar con un
chorro de agua.
Dejar secar y observa las coloraciones con el
objetivo de inmersin.
Dibujar la forma de las levaduras y bacterias.
VI.

RESULTADOS Y ANLISIS DE RESULTADOS

Preparacin en fresco y fijacin con un mordiente

MUESTRA DE CHICHA

MUESTRA DE YOGURT

3. Coloracin Simple

MUESTRA DE CHICHA
YOGURT

MUESTRA DE

MUESTRA DE CHICHA (Con Lugol)


DE YOGURT (Con Lugol)

VII.

CONCLUSIONES

VIII.

BIBLIOGRAFA

MUESTRA

http://books.google.com.pe/ : Introduccin a la Microbiologa,

TORTORA/ FUNKE/ CASE


http://es.scribd.com/doc/2747420/Tecnicas-de-tincion

http://quimicoclinico.wordpress.com/2008/08/06/tecnicas-de-tincion-

en-microbiologia-fundamentos/
http://aulavirtual.usal.es/aulavirtual/demos/microbiologia/unidades/d
ocumen/uni_02/56/cap306.htm

ANEXOS
Preparacin de colorantes

1. Acido-Alcohol: (decolorante para tincin Ziehl-Neelsen)


o

cido clorhdrico concentrado ..........................................................


ml

Etanol 95% ....................................................................................


ml

2. Azul de metileno: Colorante de contraste para tincin de flagelos.

97

Azul de metileno............................................................................... .
g

Agua destilada...............................................................................
ml

100

3. Azul de metileno de Loeffler: Tinciones simples.


o

Solucin de hidrxido potsico al 1%.................................................


ml

Azul de metileno, sol. saturada en etanol al 95%...............................


ml

30

Agua destilada...............................................................................
ml

100

4. Colorante para esporas:


o

Solucin acuosa saturada de verde malaquita

5. Colorante para flagelos de Leifson:


o

Solucin A

Fucsina bsica ......................................................................... 1,2


g

Etanol 95%............................................................................. 100


ml

Solucin B

cido tnico................................................................................
g

Agua destilada......................................................................... 100


ml

Solucin C

Cloruro sdico..........................................................................
g

1,5

Agua destilada......................................................................... 100


ml
Para preparar la solucin de uso, se mezclan cantidades iguales
de las soluciones A, B y C y se guarda en frasco cerrado

hermticamente en la nevera donde es estable durante varias


semanas.
6. Cristal violeta: Para tincin Gram y tincin simple.
o

Cristal violeta (violeta de genciana)....................................................


g

Agua destilada.................................................................................
ml

0,5

100

7. Eosina: Para observacin de clulas sanguneas.


o

Eosina...............................................................................................
g

0,3

cido actico glacial......................................................................


ml

Agua destilada................................................................................... 100


ml

0,025

8. Fucsina diluida: Para tincin Gram y tincin simple.


o

Fucsina fenicada de Ziehl-Neelsen...................................................... 10


ml

Agua destilada.................................................................................
ml

100

9. Fucsina fenicada de Ziehl-Neelsen: Para tincin cido-alcohol resistente.


o

Fucsina bsica......................................................................................
g

Etanol 95%........................................................................................
ml

Fenol 5% en solucin acuosa............................................................ 100


ml

10

10. Hematoxilina: Para observacin de clulas sanguneas.


o

Hematoxilina.........................................................................................
g

Agua destilada......................................................................................
l

11. Lactofenol: Para preparaciones microscpicas en fresco de mohos.


o

cido lctico.....................................................................................
ml

100

Fenol................................................................................................
g

Glicerol.............................................................................................
ml

200

Agua.................................................................................................
ml

100

100

12. Lactofenol al Azul Algodn: Para preparaciones en fresco y tinciones de mohos.


o

Solucin de azul algodn

Sol. saturada de azul algodn (azul anilina soluble)...................10


ml

Glicerol..................................................................................... 10
ml

Agua......................................................................................... 80
ml
Mezclar esta solucin con lactofenol a partes iguales

13. Lugol: Solucin de yodo para tincin Gram.


o

Yodo...................................................................................................
g

Yoduro potsico..................................................................................
g

Agua destilada.................................................................................
ml

300

14. Orcena A: Tincin de cromosomas.


o

Orcena................................................................................................
g

cido actico..................................................................................... 45,8


ml

cido clorhdrico 1 mol/l...................................................................... 8,3


ml

Agua.................................................................................................. 45,8
ml

15. Orcena B: Tincin de cromosomas.


o

Orcena................................................................................................
g

cido actico.....................................................................................
ml

55

Agua..................................................................................................
ml

55

16. Safranina: Colorante de contraste para tincin Gram (preferible a la fucsina) y


esporas.
o

Safranina.........................................................................................
g

0,25

Agua destilada..................................................................................
m

100

17. Sudn III: Tincin especfica de grasas.


o

Alcohol etlico...................................................................................
ml

Sudn III...................................................................................hasta
saturacin

18. Verde de metilo actico: Igual composicin que la eosina (num. 7)

100