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GENTICA MICROBIANA

Cualquier organismo est determinado por su material gentico y su interaccin


con el medio ambiente que selecciona, activa, reprime o cambia el material
gentico.
Las bacterias poseen un genotipo que transmiten por herencia y un fenotipo que
depende de las circunstancias que les rodean. Las bacterias sufren variaciones en
sus
caracteres
y
son
de
dos
tipos; fenotpicas
o
adaptaciones y genotpicas (mutaciones, fenmenos de transferencia, elementos
transponibles, integrones).
El estudio de la gentica bacteriana, atendiendo a los dos aspectos anteriores,
permite entender mejor las funciones esenciales de su material gentico y las
caractersticas que rigen su comportamiento, su capacidad de adaptacin al medio
ambiente, la expresin de mecanismos de virulencia que les permite colonizar,
invadir, y daar clulas eucariotas, y como consecuencia, el desarrollo de un gran
espectro de enfermedades clnicas.
7.1 El genoma microbiano
El genoma bacteriano est compuesto por un nico cromosoma de ADN circular
cerrado. Adems poseen estructuras denominadas plsmidos constituidas tambin
por ADN, que se encuentran en nmero variable en la clula bacteriana.
Su conocimiento permite una mejor comprensin de la patogenia, con aplicaciones
en la prevencin, en el diagnstico y en el tratamiento de las enfermedades
infecciosas.
Conocidas la dinmica de los mecanismos de invasin, produccin de toxinas,
capacidad de adaptacin a ecosistemas adversos y otras mltiples posibilidades
de variacin, pueden disearse nuevas vacunas ms especficas, as como
establecer combinaciones interespecies, o utilizarse bacterias avirulentas de muy
fcil cultivo para producir en forma industrial antgenos de grmenes de
crecimiento fastidioso.
En el campo de los antibiticos, se abren perspectivas hacia lneas
absolutamente distintas, con drogas capaces de bloquear determinados pasos en
cadenas metablicas vitales.

Ya existen mltiples aplicaciones de la gentica en diagnstico microbiolgico, con


tcnicas que indudablemente se irn simplificando y perfeccionando con el
conocimiento de la entera secuencia del genoma bacteriano: hibridacin, reaccin
de polimeras en cadena, etc.
Por ltimo, el conocimiento del genoma tambin permitir la utilizacin benfica, a
escala industrial, de algunos microorganismos en la produccin de hormonas,
vitaminas, aminocidos y antibiticos.
7.1.1 Organizacin de los genes diferencias entre procariotas y eucariotas
Los procesos de deteccin y modelado de genes son aquellos mediante los que
se identifican, en el ADN, regiones codificantes y elementos reguladores
asociados,, con los objetivos de deducir la organizacin o estructura de los genes
y predecir la secuencia de los productos gnicos correspondientes, sean ARNs o
protenas, y los mecanismos controladores de su expresin.

PROCARIOTAS

ADN localizado en una regin: Nucleoide, no rodeada por una membrana.

Clulas pequeas 1-10 m

Divisin celular directa, principalmente por fisin binaria.

No hay centrolos, huso mittico ni microtbulos.

Sistemas sexuales escasos, si existe intercambio sexual se da por


transferencia de un donador a un receptor.

Escasas formas multicelulares

Ausencia de desarrollo de tejidos

Formas anaerobias estrictas, facultativas, microareroflicas y aerobias

Ausencia de mitocondrias: las enzimas para la oxidacin de molculas


orgnicas estn ligadas a las membranas

Flagelos simples formados por la protena flagelina.

En especies fotosintticas, las enzimas necesarias estn ligadas a las


membranas.

Exitencia de fotosntesis aerobia y anaerobia, con productos finales como


azufre, sulfato y Oxgeno.

EUCARIOTAS

Ncleo rodeado por una membrana. Material gentico fragmentado en


cromosomas formados por ADN y protenas.

Por lo general clulas grandes, (10-100 m), Algunos son microbios, la


mayora son organismos grandes.

Divisin celular por mitosis, presenta huso mittico, o alguna forma de


ordenacin de microtbulos.

Sistemas sexuales frecuentes.

Alternancia de
Fecundacin .

Los organismos multicelulares muestran desarrollo de tejidos

Casi exclusivamente aerobias.

Las enzimas estn en las mitocondrias.

Las enzimas para la fotosntesis se empaquetan en los cloroplastos.

Flagelos compuestos, (9+2) formados por tubulina y otras protenas.

fases

haploides

diploides

mediante

Meiosis

7.1.2 Plsmidos: tipos y funciones


Los plsmidos son molculas de ADN extracromosmico circular o lineal que se
replican y transcriben independientes del ADN cromosmico. Estn presentes
normalmente en bacterias, y en algunas ocasiones en organismos eucariotas
como las levaduras. Su tamao vara desde 1 a 250 kb. El nmero de plsmidos
puede variar, dependiendo de su tipo, desde una sola copia hasta algunos cientos
por clula.
Una forma de agrupar plsmidos es por su habilidad de transferirse a otra
bacteria. Los plsmidos conjugativos contienen tra-genes, los cuales ejecutan
complejos procesos de conjugacin, como la transferencia sexual de plsmidos a
otra bacteria. Los plsmidos no-conjugativos, son incapaces de iniciar una

conjugacin, de all que ellos pueden transferirse nicamente con la asistencia de


los plsmidos conjugativos y lo hacen por accidente.
Una clase intermedia de plsmidos son los movilizables los cuales llevan solo un
subtipo de genes requeridos para la transferencia. Ellos pueden parasitar un
plsmido conjugativo, transfirindose a una alta frecuencia solo en su presencia.
Es posible para plsmidos de diferentes tipos el coexistir en una celular simple.
Siete tipos diferentes de plsmidos han sido encontrados en la E.Coli. Pero
normalmente plsmidos relacionados son incompatibles, en el sentido de que solo
uno de ellos sobrevive en la lnea celular, debido a la regulacin de las funciones
vitales de los plsmidos. Por lo tanto, los plsmidos pueden ser diferenciados de
acuerdo a grupos de compatibilidad.
Algunos plsmidos determinan resistencia antibitica, se le han denominado
"plsmidos R".
Bacterifagos.
-

Son elementos que pueden invadir bacterias y llevar material gentico


exatrcromosmico.
Son agentes infecciosos que se replican como parsitos intracelulares
obligados dentro de las bacterias.
El genoma del fago codifica para funciones necesarias para su replicacin
intracelular, pero tambin codifican para la sntesis de las protenas
necesarias para el ensamblaje del fago.
El genoma del fago puede codificar para caractersticas bacterianas no
relacionadas a su replicacin, fenmeno conocido como CONVERSIN, el
cual es responsable de algunas caractersticas de virulencia bacteriana
como la produccin de toxinas.

Transposones.
Son secuencias de ADN que llevan informacin para una transposasa y en los
extremos secuencias repetidas conocidas como de Insercin, y en medio de esta
secuencia puede encontrarse la insercin de genes de virulencia, como toxinas o
genes de resistencia a antibiticos.
stos se pueden integrar en el cromosoma de las bacterias o insertarse en fagos.

Integrones.

Son elementos de ADN mviles que pueden capturar genes de resistencia o


virulencia , los cuales estn en "casates" y como acarrean una integrasa, pueden
introducirse en el cormosoma, los transposones y los plsmidos de bacterias; de
esta manera , pueden replicarse y expresar la informacin que llevan.
7.2 Variabilidad gentica en microorganismos
La variabilidad gentica es interesante desde el punto de vista de que muchas de
estos cambios genticos aportan resistencia a estas bacterias a ciertos medios,
antibiticos.
La mutacin; es un cambio transmisible en el genoma bacteriano, que es
transmisible. Estas mutaciones pueden ser puntuales y suficientes para dar lugar,
por ejemplo, a una resistencia por el cambio en la transduccin de una protena.
Pueden ser mutaciones de segmentos del DNA, sustituciones de nucletidos, y
micro inserciones, o por el contrario provocar alteraciones en regiones ms
grandes (inserciones y deleciones).
El requisito indispensable para llevar a cabo cualquier anlisis gentico es la
existencia de variabilidad gentica, la mutacin es la fuente primaria de
variabilidad gentica. Otra caracterstica importante del material hereditario es la
recombinacin. La recombinacin consiste en la produccin de nuevas
combinaciones genticas a partir de las generadas inicialmente por la mutacin.
Dos molculas de ADN que posean distintas mutaciones pueden intercambiar
segmentos y dar lugar a la aparicin de nuevas combinaciones genticas.
Las bacterias y los virus, al igual que los organismos eurcariticos tambin tienen
mecanismos de recombinacin. En el caso de las bacterias existen tres
mecanismos de recombinacin: transformacin, conjugacin y transduccin. La
existencia de estos mecanismos permite la construccin de mapas genticos en
bacterias.
Los mecanismos de transmisin horizontal; transformacin, conjugacin, y
transduccin.

7.2.1 Mutacin.
Durante la replicacin del genoma bacteriano, a veces ocurren cambios, ya sea en
forma espontnea o artificial. Estos cambios heredables en la secuencia de bases
del ADN, se denominan mutaciones. El organismo resultante de una mutacin

tendr una constitucin gentica diferente a la de la cepa progenitora y se


denomina cepa mutante.
Las mutaciones pueden implicar solamente el cambio en un solo par de bases en
el ADN de la clula o pueden producir un cambio que se extiende a un cierto
nmero de pares de bases o hasta genes completos.
El cambio en genoma bacteriano puede modificar, o no, la apariencia o
funcionalidad de la cepa mutante respecto de su progenitora. En la mayora de los
casos las mutaciones producen individuos que no pueden adaptarse y
desaparecen.
Una mutacin puede tener efectos diferentes segn cmo se produzca.
Por ejemplo:
La sustitucin de una base por otra en la cadena de ADN, no significa
necesariamente un cambio en el aminocido que codificar dicha porcin del
genoma y por lo tanto no producir ningn cambio en la apariencia o funcin.
Las mutaciones producidas por deleciones o inserciones de fragmentos de ADN
pueden afectar la capacidad de formar una protena y por lo tanto producir una
alteracin en la apariencia o funcionalidad de la clula.
Las mutaciones se dan en forma espontnea con una frecuencia muy baja.
Normalmente una de cada 108 clulas de una poblacin contiene una mutacin
detectable en un gen determinado. Sin embargo esta frecuencia puede aumentar
notablemente por accin de agentes denominados mutgenos o mutagnicos.
Estos agentes pueden ser qumicos, fsicos o biolgicos.
Los mutgenos qumicos son sustancias semejantes a las bases pricas o
pirimidnicas y las reemplazan originando el cambio en la secuencia de ADN.
Dentro de los mutgenos fsicos se encuentran las radiaciones ionizantes (rayos x,
rayos gamma y csmicos) y las no ionizantes (radiacin ultravioleta).

7.2.2 Recombinacin
La recombinacin consiste en la creacin de nuevas molculas de DNA, tanto en
eucariotas como en procariotas, por intercambio de secuencias ms o menos
largas entre dos molculas preexistentes. La recombinacin es especialmente
frecuente en presencia de dos cromosomas o molculas de DNA homlogas, es
decir, las que contienen genes semejantes en la misma posicin. Los seres que se
producen sexualmente poseen una dotacin gentica duplicada (diploide), pues

poseen parejas de cromosomas homlogos, de procedencia paterna y materna


respectivamente. Entre esas parejas, se dan numerosos procesos de
recombinacin durante la formacin de los gametos o clulas germinales, en la
meiosis. En estos casos, la recombinacin se observa al microscopio ptico como
sobrecruzamiento o entrecruzamiento (crossing-over) de cromosomas. La ventaja
definitiva de la produccin sexual se debe a la facilidad de obtencin de nuevos
genomas por recombinacin.
A escala molecular, la recombinacin requiere:
a) La hidrolisis de los dplex de DNA homlogos
b) El emparejamiento de hebras terminales
c) La reposicin de las bases adecuadas en los (huecos), por la DNA
polimerasa I
d) La soldadura de las hebras por la DNA ligasa.

Recombinacin homloga
A travs de la recombinacin las bacterias pueden adquirir varias caractersticas a
un tiempo y evolucionar as ms rpido que mediante mutaciones.
Para hacer posible la recombinacin homloga previamente han de transferirse
los fragmentos de una bacteria donadora al citoplasma de la receptora que se
convierte en parcialmente diploide.

En todo caso estas recombinaciones son la excepcin y no la regla porque cada


especie posee sus sistemas de seguridad para protegerse de la entrada de fagos
y plsmidos y mantener as su identidad. Se trata de enzimas que introducen
modificaciones qumicas para marcar y proteger el ADN propio y destruyen toda
molcula ajena que no est marcada por ellas. Estos sistemas restringen el rango
de transferencias o intercambios de informacin entre especies y se denominan
enzimas de restriccin.

7.2.3 Secuencias de insercin, transposones e integrotes


Los elementos de secuencias de insercin (IS) son segmentos de DNA que
pueden moverse de una posicin cromosmica a otra del mismo cromosoma o a
otro cromosoma diferente. Cuando los IS se insertan en medio de los genes,
pueden interrumpir la secuencia codificante e inactivar la expresin del gen.
Fueron descubiertos por primera vez en E.Coli en el operon gal y son los
transposones ms simples.
Tienen entre 700 y 1500 pb y se han encontrado en eubacterias y arqueo
bacterias. Tambin son frecuentes en bacterifagos y plsmidos.

Las secuencias de insercin tienen un gen codificante para la transposasa y estn


flanqueadas por repeticiones invertidas. Las repeticiones directas se originan
cuando se insertan en el hospeda

Transposicin:
Cambio de posicin de un elemento mvil en el genoma Existentes en todos los
organismos Sus duplicaciones es hacen que su representatividad en el genoma
aumente muchos de ellos han perdido su capacidad de moverse movimiento
guiado por enz

TRANSPOSONES BACTERIANOS
Aparecen tanto en el cromosoma principal de bacterias como en los plsmidos o
plasmidios.

Estos elementos pueden transponerse dentro del cromosoma principal o pasar a


los plsmidos.

7.3 Transmisin de caracteres genticos entre bacterias


Se denomina transferencia gentica al intercambio de genes entre dos molculas
de ADN, para formar nuevas combinaciones de genes en un cromosoma.
Si llamamos a dos bacterias A y B y consideramos cromosomas, para identificar; si
estos dos cromosomas se rompen y se vuelven a unir, algunos de los genes que
portan se mezclaran. Los cromosomas originales se han recombinado, de modo
que ahora cada uno lleva una porcin de los genes del otro.
Para comprender ms sobre mecanismos de transferencia gentica primero
tendremos que definir algunos trminos bsicos, como los que presentamos a
continuacin:
- Gentica: Estudio de los genes, de la informacin que estos llevan y como se
replica dicha informacin.
- Gen: Es un segmento de ADN que tiene una codificacin, es decir lleva
informacin para la formacin de macromolculas, generalmente protenas.
Los procesos genticos requieren de 3 polmeros (ADN, ARN, Protenas), el
material gentico de las bacterias se encuentra en el citoplasma, por lo cual habr
algunos mecanismos para la transmisin de caracteres genticos en bacterias, los
cuales nombraremos a continuacin:
Transformacin
Transduccin
Conjugacin

7.3.1 Restriccin y modificacin del DNA


El mecanismo de corte de DNA se realiza a travs de la ruptura de dos enlaces
fosfodister en la doble hebra, lo que da lugar a dos extremos de DNA. stos
pueden ser romos (cuando los enlaces rotos coinciden) o Cohesivos/escalonados.
Estos ltimos tienen tendencia a volver a unirse de modo espontneo, ya que los
extremos se pueden unir a otros extremos coincidentes que pueda haber en la
cercana (Apareamiento de Watson & Crick).
Los fragmentos de ADN obtenidos de este modo pueden unirse por otras enzimas
llamadas ligasas.
Las enzimas de restriccin que a pesar de ser distintas y provenir de distintas
especies, tienen la misma secuencia de reconocimiento y dejan el mismo extremo
cohesivo, pero no cortan en el mismo sitio, son llamadas isoesquizmeros. Por
ejemplo, estn los isoesquizmeros Asp718 y KpnI.
El Premio Nobel de Medicina de 1978 fue concedido a los microbilogos Werner
Arber, Daniel Nathans y Hamilton Smith por el descubrimiento de las
endonucleasas de restriccin lo que condujo al desarrollo de la tecnologa de ADN
recombinante. El primer uso prctico de su trabajo fue la manipulacin de la
bacteria E. coli para producir insulina humana para los diabticos.

Uno de los campos en los que las enzimas de restriccin han tenido mayor
implicacin ha sido el diagnstico de enfermedades genticas relacionadas con
cambios en la secuencia del ADN, ya sean mutaciones puntuales, inserciones o
deleciones de fragmentos. Si stas se producen en un sitio de reconocimiento de
la enzima de restriccin, al producirse eliminarn o agregarn nuevos sitios de
corte. Al aplicar esta enzima al gen de una persona sana y una enferma se
deberan observar distintas cantidades de fragmentos para cada caso en una
electroforesis.

El sistema de restriccin-modificacin (M-R) es usado in vivo por bacterias para


protegerse de ataques de DNA exgenos (normalmente vricos) que ingresen en la
bacteria, eliminando las secuencias ajenas al genoma de estas. El ADN propio no
sufre delecin por parte de las enzimas de restriccin del organismo que las
produce, puesto que previamente ha sido modificado por metilacin a travs de la
accin de una metiltransferasa, enzima que transfiere grupos metilo desde Sadenosil-metionina (SAM) a bases especficas. Este sistema fue descubierto en
1968, a resultas de una serie de estudios sobre la infeccin del fago l en dos

cepas diferentes de Escherichia coli (las llamadas cepas K12 y B). Este sistema
consta de dos partes:
Restriccin: Este sistema le permite a la bacteria protegerse de DNA exgenos
para evitar la promiscuidad en los intercambios genticos. Esto le confiere
inmunidad frente a bacterifagos que pudieran poner en peligro la individualidad
gentica o incluso la vida de la bacteria, lo que se realiza a travs de cortes
mediante endonucleasas de restriccin a los DNA exgenos que ingresen a la
bacteria.
Modificacin: Consiste en la introduccin de grupos metilo (CH3-) en determinadas
bases dentro de determinadas secuencias del ADN, lo cual est catalizado por una
metilasa especfica.
Existen varios mecanismos de accin generales de estos sistemas, de los cuales
destacan el tipo I y el tipo II:
M-R tipo I: Fueron los primeros en ser descritos. Lo caracterstico de los sistemas
M-R de tipo I es que las actividades de modificacin y las de restriccin estn
producidas por un complejo multiproteico, que realiza los dos tipos de actividades.

Algunas caractersticas son:


Reconocen secuencias relativamente grandes que no presentan simetras.
La actividad de restriccin (de las subunidades R) corta lejos del sitio de
reconocimiento (del orden de unos 1000 pb), y en lugares inespecficos.
La restriccin requiere de ATP.
La actividad metilasa del complejo hace uso de S-adenosil-metionina (SAM) como
donador de los grupos metilo.
M-R tipo II: Aqu cada subunidad del dmero reconoce la misma secuencia,
presente en cada una de las partes especulares del palndromo, y realiza un corte
en un lugar especfico, que obviamente tiene su correspondiente en la otra cadena
de la otra mitad del palndromo. Ms de la tercera parte de las cepas bacterianas
presentan al menos un sistema M-R de tipo II. Muchas de ellas son codificadas a
partir de genes situados en plsmidos. Algunas caractersticas que tiene este
mecanismo son:
Las dos actividades las realizan dos protenas distintas que no forman complejos
multiproteicos.

No utilizan ATP. Slo necesitan iones Mg++ para funcionar. La metilasa usa SAM
como donador de metilos.
Cada miembro de la pareja de modificacin y restriccin reconoce la misma
secuencia especfica de ADN.
El sitio de reconocimiento consta de 4 6 pb que constituyen una secuencia
palindrmica.
La metilasa suele ser una protena monomrica, que introduce grupos metilo en
una A o en una G (segn la metilasa en cuestin), en ambas cadenas, dentro del
sitio de reconocimiento.
La enzima de restriccin suele ser una protena formada por dos subunidades del
mismo tipo, ensambladas simtricamente. Pueden dejar extremos cohesivos o
extremos romos. Algunas enzimas de restriccin dejan extremos sobresalientes,
mientras que otras dejan extremos sobresalientes.

7.3.2 Transformacin: incorporacin del DNA


TRANSFORMACIN
Es un proceso por medio del cual las bacterias adquieren informacin gentica. Se
produce una incorporacin por parte de una bacteria viva de fragmentos de ADN
(desnudo) extracelulares, lo cual causa una recombinacin del fragmento nuevo
con el genoma bacteriano. Este proceso se lleva a cabo en la bacteria receptora.
El ADN logra entrar a la clula a travs de receptores de superficie, para lo cual se
requiere de energa, como el ADN tiene doble cadena cuando este entra, una de
las cadenas es digerida por endonucleasas, la otra se alinea con el cromosoma
bacteriano. Tras la replicacin uno de los cromosomas adquiere la informacin
original y la otra contiene los genes transformados. Para que la transformacin sea
evidente el ADN transformante debe provenir de una bacteria diferente a la
receptora.
Existen dos formas distintas de competencia las cuales con:
1) Natural
2) Artificial.

7.3.3 Transduccin: generalizada y especializada


TRANSDUCCIN
La transduccin se refiere a un proceso en el cual se transfiere el material
gentico de una bacteria (ADN) a otra, mediante la participacin de un
bacterifago (virus que infecta bacterias) [figura 1]. El bacterifago posee un
cubierta que protege al DNA del medio ambiente, y de esta manera, la
transduccin a diferencia de la transformacin, no se ve afectada por las
nucleasas en el exterior. No todos los bacterifagos pueden mediar la
transduccin. La capacidad del fago para mediar la transduccin, est relacionada
con el ciclo de vida del mismo.
Este proceso fue desubierto por Ledeberg y Zinder al estudiar la recombinacin de
cepas distintas de Salmonella typhimurium.

Cuando el profago pasa al ciclo litico, los virus son capaces de lisar e infectar otras
bacterias. En una infeccin, el ADN de la bacteria, se degrada en pequeos
fragmentos, y asi el ADN virico se replica.

Existe ocaciones en que en lugar de que se empaquete el ADN virico en la


capside, se empaquetan los fragmentos del ADN bacteriano. Despus de que
ocurre la lisis, los fagos que contienen el ADN bacteriano, son liberados al medio,
lo que incita a la infeccin de otras clulas. Cuando el ADN foraneo no se inserta
en el cromosoma de la clula receptora, se da una transduccin abortiva, este
ADN foraneo slo se transmite a una clula hija. Por el contrario, si el ADN, se
inserta con su homlogo en la clula receptora, los genes transducidos se
replican, con el cromosoma y pasan a todas las clulas hijas. Todo este proceso
requiere de un par de entrecruzamientos para que se lleve a cabo la
recombinacin, el mismo que lleva el nombre de transduccin completa. Las
transducciones abortivas y completas son dos subtipos de la transduccin
generalizada, aunque la mayor parte de transducciones generalizadas son
abortivas. La transduccin generalizada se caracteriza por la naturaleza aleatoria,
de los genes que sufren la transduccin, ya que cada fragmento tiene probabilidad
limitada de ser empaquetado en la capside del fago.

Transduccin Generalizada: La transduccin generalizada es el mecanismo por el


cual potencialmente cualquier gen bacteriano de la donadora puede ser transferido
a la clula receptora.

Transduccin especializada o restringida: La transduccin especializada es la


transduccin en la cual solo ciertos genes del donador pueden ser transferidos al

receptor. Diferentes fagos pueden transferir diferentes genes pero un fago


individual solamente puede transferir unos pocos genes. La transduccin
especializada est mediada por fagos lisognicos o fagos temperados y los genes
que se llegan a transferir dependern del lugar donde el profago queda insertado
en el cromosoma.
Durante la escisin (separacin) del profago, un error llega a ocurrir
ocasionalmente en el cual un poco del DNA del husped escinde (se separa del
cromosoma) junto con el DNA del fago. Solo puede ser transferido el DNA del
husped que est flanqueando cada lado del sitio donde el profago se ha
insertado, (ej. transduccin especializada). Despus de la replicacin y la
liberacin del fago y a travs de la infeccin de la clula receptora, puede ocurrir
una lisogenizacin de la receptora dando como resultado la transferencia estable
de los genes de la donadora. La receptora ahora tendr dos copias de los genes
que le fueron transferidos. Tambin es posible que se lleve a cabo una
recombinacin legtima entre los genes de la donadora y de la receptora.

7.4 Conjugacin bacteriana: plsmidos conjugativos y transferencia de genes


cromosmicos
Para conjugar tiene que existir contacto fsico entre la bacteria donadora de ADN y
la receptora. La capacidad de donar la proporciona el poseer un plsmido
conjugativo que tambin se denomina factor de fertilidad o plsmido sexual.

La conjugacin entre bacterias Gram negativas suele ocurrir a travs de pili


sexuales codificados por el plsmido conjugativo (figura 2.4.). Entre stos el mejor
estudiado es el plsmido F de Escherichia coli. Las bacterias que lo poseen (F+)
sintetizan 2 o 3 pili con los que contactan con bacterias receptoras y se acercan a
ellas. Entonces el plsmido F se rompe por un lugar fijo (el origen de
transferencia), y una de sus cadenas pasa a travs del puente citoplsmico creado
por el Pili, hasta el citoplasma de la clula receptora. Mientras tanto la otra gira en
el citoplasma de la donadora (mecanismo del crculo rodante). En ambos
citoplasmas se van sintetizando las cadenas complementarias de forma que al
final del proceso ambas bacterias poseen un plsmido F completo.
Por tanto la conjugacin convierte a la bacteria receptora (F-) a su vez en
donadora (F+), lo que acelera el proceso de extensin del plsmido, y puede
ocurrir entre bacterias de la misma o de diferentes especies relacionadas. Por eso
cuando los genes que proporcionan resistencia a los antibiticos estn en
plsmidos conjugativos se extienden muy rpidamente a travs de diversas
especies patgenas.

El plsmido F, como otros plsmidos conjugativos, puede integrarse en el


cromosoma en forma de episoma Hfr (high frequency of recombination). Si
estando integrado se inicia un proceso de conjugacin, el episoma se abre por su
origen de transferencia y comienza a pasar a travs del Pili sexual arrastrando a
su vez los genes cromosmicos prximos a su punto de integracin. Como estos
puntos (integracin y transferencia) no coinciden, pasan primero una parte del
plsmido y para que este se complete en la bacteria receptora debera pasar antes
el cromosoma completo, lo que tardara unos 100 minutos en ocurrir. Los puentes
citoplsmicos suelen romperse mucho antes por lo que cuando una bacteria Hfr
conjuga con una F- no suele convertirla en F+. Sin embargo las donadoras Hfr
transfieren genes cromosmicos, con mayor frecuencia cuanto ms cerca estn
del punto de integracin. Este hecho ha permitido realizar mapas cromosmicos
basados en experimentos de conjugacin interrumpidos en diferentes tiempos.

Cuando un episoma Hfr se libera del cromosoma a veces el proceso es impreciso


e incluye algn gen cromosmico prximo al punto de integracin del plsmido.
As se forman los denominados plsmidos F' que en procesos de conjugacin se
auto transfieren y transfieren siempre los genes cromosmicos arrastrados.

7.5 Manipulacin gentica de microorganismos y mejora de cepas industriales


Manipulacin gentica de seres vivos se crean nuevas especies. En el caso de los
microorganismos se podran estar construyendo nuevos patgenos y con ello
nuevas enfermedades.
Proliferacin de nuevos microorganismos con caractersticas peculiares y los
consecuentes peligros para la especia human. Entre ellos figura la introduccin de
genes productores de neoplasias malignas.
Es previsible la formacin de microorganismos de una virulencia extraordinaria y
resistente a la teraputica conocida.
La fuente inicial de un microorganismo es el ambiente y en general, estas cepas
producen sus metabolitos en niveles muy bajos, por lo tanto, se hace necesario
incrementar estos rendimientos para lograr una mayor rentabilidad de los
procesos.

Una forma de mejorar el rendimiento es mediante la optimizacin del medio de


cultivo y de las condiciones de operacin, pero esto est limitado por la capacidad
de sntesis mxima del producto deseado que tiene el microorganismo. La otra
posibilidad es el mejoramiento gentico de la cepa.
La productividad potencial de un organismo es controlada por su genoma,
pudiendo el mismo ser modificado para incrementar los rendimientos. Con el
organismo modificado, se reexaminan las condiciones del cultivo para lograr
nuevamente la mxima productividad.

Por lo tanto los programas de desarrollo involucran una continua modificacin


gentica del microorganismo, seguida por una readaptacin del medio de cultivo a
los nuevos requerimientos, mejoras de las condiciones de operacin y tambin de
los procesos de extraccin y purificacin. La obtencin de cepas modificadas
genticamente se puede realizar por:

7.5.1 Mtodos clsicos

7.5.1.1 Mutagnesis: aislamiento de mutantes

Cada vez que una clula microbiana se divide existe una pequea probabilidad de
que se produzca un cambio heredable. Una cepa que manifiesta un cambio
caracterstico se denomina mutante y el proceso que lo ha ocasionado mutacin.
La probabilidad de que esto ocurra puede incrementarse exponiendo el cultivo a
agentes mutagenticos fsicos como la luz UV radiacin ionizante o a agentes
qumicos como la nitrosoguanidina y cido nitroso.
Habitualmente el procedimiento de mutacin mediante el empleo de un agente
determinado implica someter a la poblacin a una dosis de mutgeno elegido que
ocasiona la muerte para la mayora de las clulas.
Posteriormente se realiza el aislamiento de los mutantes (supervivientes) para su
posterior ensayo y seleccin de los mutantes adecuados que presentan superior
capacidad de produccin.

7.5.1.2 Recombinacin

La recombinacin se define, como el proceso que contribuye a originar nuevas


combinaciones de genes que ya estn presentes, al principio, en individuaos
distintos. In vitro, la recombinacin puede lograrse en los hongos asexuales, como
Penicillum chrysogenum, utilizando el ciclo parasexual.
En este procedimiento se involucran los protoplastos, que son clulas carentes de
pared, las cuales son sometidas a la accin de enzimas (lisozima) degradantes
especficas en soluciones isotnicas.
Posteriormente, de los cultivos que se desea fusionar, que de otro modo no se
fusionaran, se mezclan y fusionan en presencia de un agente inductor
(polietilenglicol 50%) y de dimetil sulfxido en algunos casos, luego se siembran
rpidamente en un medio completo para regenerar las clulas.

La incubacin de protoplastos resulta en regeneracin de la pared celular y


reversin a una clula de morfologa normal, lo cual es una propiedad crtica, ya

que despus de la fusin se desea recuperar un organismo, el cual pueda ser


cultivado normalmente en pequea y gran escala.

La fusin celular es seguida por fusin nuclear y protoplastos mixtos resultantes


pueden regenerar la pared celular y crecer como una clula normal.

7.5.1.3 Seleccin

Se debe tener en cuenta que en cada divisin celular hay una pequea
probabilidad de que ocurra un cambio gentico, por lo cual no es sorprendente
que en una gran masa celular la poblacin sea heterognea.
Estos cambios definitivos (mutaciones) se deben distinguir de las variaciones
fenotpicas que dependen de las condiciones ambientales y que tienen lugar en
todas las clulas de la poblacin que expresan la misma modificacin fisiolgica,
dentro de las variaciones permitidas por su genotipo.
En las mutaciones espontneas el elemento responsable de la mutacin no es
conocido, pero igual que las inducidas (el factor mutagnico se conoce) son
estables y hereditarias y tienen una frecuencia estadsticamente medible (tasa de
mutacin).
El ejemplo ms espectacular, es el de la penicilina, el antibitico producido por el
hongo filamentosos Penicillum chrysogenum. Cuando se produjo por primera vez
a gran escala se obtuvieron 1-10 g/ml.
A los largo de los aos, como resultado de la mejora de las cepas acopladas a los
cambios en el medio y en las condiciones de cultivo, el rendimiento de penicilina
aument hasta 50.000 veces. Fenmeno atribuido a la mutacin y seleccin; no
estuvo implicada ninguna manipulacin gentica.