Monoclonal Antibodies

from Pichia
Biotecnologia Microbiana

Leticia Gomes
01 de junho de 2015

Mestrado em Microbiologia Aplicada

ndice

Vantagens da utilizao de Pichia relativamente a outros sistemas de expresso2

Alternativas utilizao de Pichia3

Viso Geral Pichia e Fragmentos scFv.......3

Produto Final.....4

Pichia pastoris caractersticas diferenciadoras...5

Promotor AOX1........6

Porqu um fragmento de anticorpo?..................................................................................7

Produo de fragmentos de anticorpos..9

Bioprocesso Fermentao Fed-Batch.9

Condies de operao do Bioreator...12

Purificao do fragmento scFv....13

Processo downstream de scFv14

Vantagens da utilizao de Pichia relativamente a outros sistemas de

expresso:

Gentica
Produo

Mais simples de manipular do que clulas de

mamferos e insetos; tm genoma sequnciado.
Possvel expressar grandes
proteinas com custo reduzido.

quantidades

de

Purificao

Leveduras fornecem vias que direcionam as

protenas heterlogas para o meio extracelular.

Segurana

Considerado seguro: no produz endotoxinas, no

possui oncognes e no contaminado por
bacterifagos.

Comercial

Grande disponibilidade de estirpes e plasmdeos

em forma de kits.

Alternativas utilizao de Pichia

S. cerevisiae: as principais limitaes esto relacionadas principalmente ao seu

metabolismo fermentativo. Em geral o rendimento dos produtos muito baixo, com
reteno de proteinas no espao periplasmtico; os seus plasmdeos so instveis e
tm menos capacidade de secreo que outras leveduras.
E. coli: as principais limitaes so relativamente a proteinas mais complexas,
que requerem modificaes ps-traducionais (no possui maquinaria intracelular
apropriada); incapaz de produzir proteinas solveis e de secret-las para o
sobrenadante de cultivo (so normalmente armazenadas de forma insolvel em
corpos de incluso).
Vrios fragmentos de anticorpos que foram produzidos atravs da expresso em E.
coli, com conformao inadequada ou em corpos de incluso insolveis em P.
pastoris foram obtidos corretamente.

 Mamferos e Insetos: em comparao com estes sistemas, Pichia no precisa de

transfeo viral, no requer condies complexas de cultivo, e fcil de manipular
genticamente. As clulas de mamferos tornam-se menos desejveis pelo seu
bioprocessamento e scale-up dado o tempo que demora e os elevados custos que
implica.

Viso Geral Pichia e Fragmentos scFv

Uma das principais vantagens/caractersticas de P. pastoris a existncia de um

importante promotor AOX1 que derivado do gene que codifica a enzima alcool
oxidase 1. por isso que neste sistema o metanol utilizado como fonte de carbono e
indutor de produo de proteinas heterlogas. Uma das desvantagens est ligada a este
facto embora o metanol seja essencial para a induo de produo das proteinas
desejadas, por ser um lquido inflamvel, se no for corretamente manuseado pode ser
um potencial perigo para a sade e segurana a maior preocupao prende-se ao
armazenamento de grandes quantidades de produto. A descrio e utilizao de outros
promotores poderia contornar estas desvantagens.

Figura 1. Pichia pastoris: Aspeto macroscpico (A) - cultivadas em Agar YPD e microscpico (B) por colorao de Gram
observadas em microscpio tico com aumento de 400 vezes.

A produo de fragmentos relativamente a anticorpos completos, facilita a sua

expresso em Pichia. Os fragmentos de scFv (single-chain fragment variable) podem
ser utilizados quando se deseja o reconhecimento do antignio, sem desencadear uma
resposta imunologica. O tamanho varia de 27 a 30 kDa o que lhes permite tambm uma
maior capacidade de penetrao e menor reteno na circulao. Tem aumentado o
interesse da produo destes fragmentos no apenas para aplicaes teraputicas, como
tambm para diagnstico in vitro ( ex: ELISA) e in vivo (radioimunodeteo), em
processos de biosseparao (ex: citometria de fluxo) e purificao (ex: cromatografia de
afinidade).

Figura 2. Representao esquemtica de anticorpo IgG e dos seus fragmentos. IgG (Imunoglobulin F); Fc (Cristalizable Fragment);
Fab (antigen-biding fragment); Fv (variable fragment); Vh (Heavy variable); Vl (Light variable);

Produto Final

Entre os vrios biofrmacos j produzidos por este mtodos, o produto final do trabalho
Nanobody ALX-0061 (anti-IL6) aprovado utilizando esta tecnologia, para
tratamento de artrite reumatide.

Objetivo: desenvolver ALX-0061 como um anti-inflamatrio para tratamento de

Artrite Reumatide.

Alta afinidade e especificidade de ligao a IL-6R (inibe interao com IL-6)

Com um tamanho de 26kD tem grande capacidade de penetrao nos tecidos. A grande
capacidade que tem devida potente interao monovalente no nanobody com o alvo e a
4

grande especificidade, que diminui a possibilidade de errar o alvo. Desde setembro 2013 que
a Ablynx e AbbVie obteram a licena para produo desde produto.

Figura 3. Esquema do desenvolvimento de ALX-0061 base diferenciadora do produto

BASE CIENTFICA

Hoje, os anticorpos monoclonais so utilizados em vrias vertentes da

investigao, diagnstico e teraputica. Nas ultimas dcadas foram desenvolvidos
anticorpos monoclonais para aplicaes clnicas, como o caso de teraputica de
doenas inflamatrias. Em 2010, as vendas aprovadas de anticorpos monoclonais e
fragmentos recombinantes de anticorpos para aplicaes teraputicas nos USA e EU
atingiram os 50 bilies de dlares.

Pichia pastoris caractersticas diferenciadoras

Pichia pastoris um sistema amplamente utilizado e reconhecido pela sua
capacidade de produzir uma grande variedade de protenas recombinantes. Esta
capacidade deve-se a vrios factores, cujos mais importantes incluem:

Promotor derivado do lcool oxidase I (AOXI) especfico para o

controlo da expresso de genes estranhos ao microrganismo

Sistema simples de manipulao gentica, semelhantes a

Saccharomyces cerevisiae

2
3

Preferncia de P. pastoris por crescimento respiratrio, caracterstica

que facilita a cultura em densidades celulares altas

P. pastoris um microrganismo fcil de manipular e cultivar, sendo capaz de vrias

alteraes ps-traducionais tpicas de clulas eucariticas superiores tal como a
capacidade proteoltica, a formao de ligaes dissulfureto e a glicosilao. Estas
caractersticas de P. pastoris associadas ao facto de ser considerado um sistema mais
rpido e que envolve menos custos que os sistemas de expresso de eucariotas
superiores (como insetos e mamferos), aliadas ao facto de obterem nveis de expresso
mais elevados que o habitual torna estes organismos vantajosos para a expresso de
protenas como o caso dos anticorpos monoclonais.
Uma das caractersticas que torna P. pastoris mais vantajoso o facto de os
anticorpos produzidos serem secretados para o meio, esta uma caracterstica dos
sistemas Fungi que facilita a extrao e subsequente purificao do anticorpo. Esta
caracterstica esta ausente em E. coli, tornando-se uma das desvantagens deste sistema
relativamente ao estudado.

Promotor AOX1
um dos promotores mais conhecidos, deriva do gene que codifica a enzima
lcool oxidase 1 (AOX1), trata-se de um promotor fortemente regulado e estimulado
pela presena de metanol. Esta uma via especfica para o metabolismo do metanol, na
qual esto envolvidas vrias enzimas das quais: lcool oxidase (AOX), catalase e di6

hidroxiacetona sintase. A primeira enzima catalisa o primeiro passo chave desta via que
a oxidao do metanol a formaldedo (HCOH) e perxido de hidrognio (H2O2),
seguidamente, a catalase degrada o perxido de hidrognio a oxignio e gua. O
formaldedo gerado no primeiro passo libertado do peroxissoma para o citoplasma
onde oxidado em formiato e dixido de carbono, atravs de enzimas desidrogenases.
esta reao que fonte de energia para o crescimento celular em metanol.

Figura 4 Fluxograma da transformao do Metanol.

A enzima AOX fortemente inibida por vrias fontes de carbono tais como a
glicose e o glicerol, assim como pela falta de fonte de carbono. O passo limitante na
utilizao de metanol como fonte de carbono a converso do metanol em formaldedo
pela AOX presente na clula. Este promotor permite a expresso de protenas
recombinantes a nveis elevados, mesmo com uma nica cpia integrada da cassete de
expresso.

Porqu um fragmento de anticorpo?

Anticorpos ou imunoglobulinas (Ig) so molculas proteicas responsveis pelo
reconhecimento de antignios e por ativar o sistema imunolgico efetor contra o
antignio reconhecido. Em 1999 foi relatado pela primeira vez a produo em P.
pastoris de um anticorpo completo (IgG) totalmente funcional. Sabe-se no entanto que
difcil alcanar um anticorpo completo e funcional devido necessidade de
glicosilaes especficas, semelhantes ao padro humano. neste sentido que tm sido
elaborados vrios trabalhos de grupos de investigao em glicoengenharias.
7

Os fragmentos scFV so as maiores

unidades funcionais dos anticorpos,
formados por duas cadeias, uma leve e
uma pesada responsveis pelo
reconhecimento do antignio. Estes
fragmentos de anticorpos podem ser
expressos sozinhos, ligados entre si ou
ainda

conjugados

com

outras

molculas. Os fragmentos scFV tm

grande interesse clnico pois podem
ligar-se e neutralizar antignios e tm
menor tamanho relativamente aos
anticorpos

completos,

esta

ltima

caracterstica permite que estes sejam

rapidamente removidos de circulao,
apresentando rpida difuso no tecido
e melhor eliminao dos complexos
estranhos indesejveis. O facto de no possuir o fragmento Fc do anticorpo faz com que
no existam funes citotxicas pelo que se torna tambm uma mais valia.

TECNOLOGIA
A necessidade de uso clnico de anticorpos monoclonais e fragmentos dos
mesmos tem aumentado o interesse na pesquisa e procura de vrias formas de expresso
deste tipo. So, em vrios casos, necessrio vrias doses deste tipo de produto, em
alguns casos mais de uma grama por paciente por ano. esta necessidade que tem
levado procura de diferentes sistemas de produo, para tornar estas molculas mais
eficientes e mais acessveis econmicamente.
Ao contrrio do que acontece com os anticorpor monoclonais, que tem um
bioprocesso industrial bem estabelecido, a produo e purificao de fragmentos scFv

continua com algumas limitaes que so impostas pela tecnologia, pelos equipamentos
ou facilidade de disponibilidade de informao.

Produo de fragmentos de anticorpos

As proteinas com origem em Pichia pastoris so secretadas para o subernadante
da cultura, uma grande vantagem para a purificao das mesmas, a proteina expressa
est normalmente entre 30-80% do total de protenas secretadas. Usam-se combinaes
de clones otimizados de vrias glicotransferases para humanizar a linha de glicolizao
de Pichia, uma vez que um dos problemas neste tipo de sistema de expresso seria a
diferena das glicosilaes em comparao com o sistema dos mamferos, que podia
causar respostas imunolgicas ou uma diminuio na resposta terapeutica dos pacientes.
Esta abordagem pode ser combinada com um alto nvel de expresso de anticorpos,
podendo ser superior a 1,2 g/L, permitindo-lhes ento competir com os sistemas
existentes de cultura em mamferos.
A identificao do promotor AOX1 controlado pela enzima alcool oxidase
permitiu o desenvolvimento de sistemas induzidos por metanol. O metanol, neste
sistema para expresso do fragmento de anticorpo scFV, usado tanto para a expresso
da proteina, como para fonte de carbono para o crescimento celular depois da induo.
Durante a fase de produo, a concentrao do metanol um ponto de controlo
importante, visto que acima de certas concentraes (3,65 g L-1) o crescimento inibido
por ele.

Bioprocesso Fermentao Fed-Batch

Fermentadores Fed-Batch so mais utilizados pois permitem atingir densidades

celulares maiores e mais fcil de controlar que os fermentadores continuous.

Figura 6: Diagrama das trs principais fases do processo de fermentao por P. pastoris para obteno de fragmentos scFv.

As duas primeiras fases so conhecidas como fases de produo de biomassa dado

que o objetivo destas fases produzir biomassa antes da fase de induo pelo metanol.
Isto acontece pois as clulas que crescem em glicerol tm uma velocidade de
crescimento maior que as que crescem em metanol (0.18 L/h e 0.14 L/h
respetivamente).
1. Numa primeira fase (Glycerol Batch phase) e apesar do glicerol ser
necessrio e benfico ao crescimento da biomassa, tambm este tem de ser controlado,
no podendo ultrapassar as concentraes iniciais de 40 g/L sob pena de se tornar
txico. Pode durar por volta de 9 h para o plano proposto (volume final de 20L).
2. Quando o glicerol inicial consumido, inicia-se o Feed-Batch de
glicerol, que pode ser feito de forma constante ou exponencial nesta fase o importante
evitar a acumulao de glicerol. Trata-se tambm de uma fase de transio para a
seguinte, a induo pelo metanol. Esta fase dura at se atingir a densidade celular
pretendida.
3. Metanol Induction phase inicia-se com uma adio crescente de metanol
de forma a permitir s clulas uma fase de adaptao, iniciando-se a sintese da proteina
desejada fragmento scFv. Esta fase tem de ser muito bem controlada, uma vez que a
concentrao de metanol residual influencia diretamente a produo dos fragmentos
10

desejados, principalmente quando o objetivo produzir em larga escala. A fase de

adaptao ao metanol pode durar entre 2 a 5 horas aps a induo.

Figura 7: esquema do fluxo da fermentao de P. pastoris. Dia 1 preparao e inoculao do primeiro meio de cultura e
preparao do bioreator; Dia 2 inoculao do segundo meio de cultura; Dia 3 inicio da fermentao (glicerol); Dia 4/5
obteno do produto com recolha de amostras e monitorizao da fermentao.

Proposta:

Um balo de Erlenmeyer contendo 40 mL de meio BMGY (meio de glicerol)

inoculado com uma colnia de P. pastoris e incubado a 30 C durante dois dias,
com agitao a 250 rpm;

usado 10 mL do inculo obtido anteriormente para inocular um recipiente de

2L com 1L de meio BMGY. Deixa-se crescer durante trs dias a 30C a 250
rpm.

usado o inculo anterior para inocular (1%) de 30 L com um volume inicial de

20 L.

Recentemente foram otimizadas condies para ser possvel utilizao em escala

industrial (1200 L) o rendimento de produo neste caso superior a 1,6 g/L,
semelhante ao obtido no bioreator de 30 L.

A temperatura da fermentao tem de ser mantida por volta dos 30C com o pH
controlado a 5%. O ar mantido constante a 1.800 L/H, e o oxignio dissolvido
mantido a cima de 30%. No caso de ser necessrio reduzem-se as alimentaes de
glicerol e metanol de forma a controlar a concentrao de oxignio dissolvido.
11

No final espera obter-se um crescimento como se verifica na figura seguinte:

Figura 8: velocidade de alimentao de glicerol e metanol em comparao com o peso seco da biomassa, ao longo da fermentao.

Condies de operao do Bioreator

Concentrao de Oxignio Dissolvido (OD)

No processo de fermentao de Pichia pastoris normalmente benfico manter a

concentrao de OD entre 20 e 30%, com agitao constante. A concentrao necessria
depende da quantidade de biomassa presente. oxignio necessrio, como j foi
demonstrado, no primeiro passo do catabolismo do metanol. Pode tornar-se txico em
quantidades elevadas e o preo do produto relevante para a rentabilidade final
desejada.

pH

Este processo precisa de um controlo do pH, normalmente entre 5.0 e 5.5. O pH tem
um papel importante no processo fermentativo uma vez que a velocidade do
crescimento celular, a atividade enzimtica e a degradao proteoltica esto
dependentes do pH da cultura.

Concentrao de Metanol
12

A fase de induo de metanol tem de ser muito bem controladapelas razes

enunciadas anteriormente (pg.10). Para o caso especfico de scFv estudos demonstram
que importante manter a concentrao de metanol volta de 3.9 g/L.
Escolheu usar-se um processo onde o oxignio o fator limitante da reao, pois
tem sido descrito como mais vantajoso (relativamente a usar o metanol como fator
limitante) uma vez que h reduo das alteraes ps-traducionais, aumento da pureza
das proteinas secretadas para o meio e reduo da lise (principalmente no caso de
scFV). Estima-se que a transcrio iniciada pelo promotor AOX1 em clulas expostas
ao metanol como fator limitante pode ser 3-5 vezes maior do que o crescimento
existente em excesso de etanol.

Purificao do fragmento scFv

importante, para este tipo de produtos, cujo objetivo final a utilizao na
indstria farmacutica, que a seleo do processo downstream selecionado conduza a
um nvel de pureza e rendimento muito elevado elevado. Nos fragmentos de scFv apesar
do alto rendimento inicial de expresso, o rendimento das protenas purificadas
geralmente baixo. Os protocolos de purificao devem continuar a ser desenvolvidos de
forma a atingir melhores resultados, combinados com custos acessveis. A seleo das
tcnicas de extrao dependem dos equipamentos disponveis, da dimenso da operao
e do tipo da amostra.

Processo downstream de scFv

Normalmente ocorre em trs fases como representado na figura seguinte:

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Figura 9: Fluxograma que representa os passos gerais de um processo downstream tpico de protenas scFv.

1. Estado inicial Recuperao primria: clarificao e tratamento das amostras

recolhidas.
2. Purificao Intermdia: atingindo-se um grau de purificao entre os 40 e os
80%.
3. Polishment: onde se atinge o grau de pureza desejado e as condies timas
para a estabilidade da protena.

Recuperao primria de scFv

Geralmente o primeiro passo aps a colheita da cultura celular a centrifugao
seguido de vrios passos de filtrao. Na sucesso de passos possvel remover-se
partculas cada vez mais pequenas. Apesar deste ser um processo importante, a
existncia de diversos passos pode conduzir a uma substancial perda de material de
interesse. Na utilizao de leveduras comum realizar-se microfiltrao, por se tratar
de fermentaes com alta densidade celular.
Purificao Intermdia
O primeiro passo desta fase parece ser o ponto crtico do processo downstream.
Ao contrrio do que acontece para os anticorpos monoclonais a purificao no
compreende apenas um processo para purificao de fragmentos scFv, acrescenta-se a
fase de Polishment onde em casa uma destas fases se podem conjugar vrias tcnicas de
purificao dependendo, da viabilidade financeira do produto final optido. Numa
primeira fase utilizada geralmente a cromatografia de afinidade. Esta tcnica confere
uma interao especfica entre a molcula de anticorpo e o ligando complementar. um
mtodo que reduz interaes no especficas, aumentando o rendimento da operao,
facilitando a eliminao de contaminantes. Apesar de ser a maioria das vezes, a primeira
escolha para a purificao, este um mtodo que ainda no descrito como passvel de
fazer em grande escala principalmente devido elaborao da tcnica e dos custos
adjacentes.
esperado atingir, nesta fase uma purificao acima de at 80%.

14

Polishment
frequente que neste fase ainda hajam contaminantes a remover,
independentemente da metologia anterior aplicada. Estes contaminantes restantes
podem ser sais, componentes orgnicos, DNA e molculas com propriedades
semelhantes s da protena que se pretende purificar. Nesta fase ocorre tambm
concentrao do produto final. A filtrao uma das tcnicas mais utilizadas,
permitindo novamente a separao de contaminantes com pesos moleculares diferentes
do fragmento scFv, aumentando tambm a concentrao do produto.
Outra tcnica comum a cromatografia de troca inica, utilizando um gradiente de
NaCl com um pH entre 4.5 e 6 para remover as impurezas restantes. dado como o
ltimo passo que tem a capacidade de reduzir contaminantes tais como nucletidos e
vrus, assim como endotoxinas que podem ter entrado no processo por contaminao
cruzada ao longo do processo.
Espera atingir-se nesta fase uma purificao mxima.

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