Evaluacin no invasiva de

carotenoides drmicos como un

biomarcador de la ingesta de frutas y
verduras
Antecedentes: Resonancia espectroscopia Raman (RRS) ha sido sugerido
como un mtodo factible para la medicin no invasiva de carotenoides de la
piel humana. Sin embargo, antes de las medidas RRS de carotenoides
drmicos pueden ser utilizados como un biomarcador, se necesitan datos
sobre la variabilidad y la validez intra e interindividual.

Objetivo: El propsito de este estudio fue evaluar la reproducibilidad y

validez de las medidas de RRS drmicos carotenoides totales y licopeno en
los seres humanos.

Diseo: En el estudio 1, se contrat a 74 hombres y mujeres con diversa

pigmentacin de la piel. Se obtuvieron medidas RRS de la palma, parte
interna del brazo, y el brazo exterior al inicio del estudio, 1 semana, 2
semanas, 1 mes, 3 meses y 6 meses (para maximizar la variacin
estacional). El dispositivo utilizado RRS luz visible a 488 nm para estimar los
carotenoides totales y en 514 nm para estimar el licopeno. Reproducibilidad
se evalu mediante los coeficientes de correlacin intraclase (CCI). En el
estudio 2, reclutamos 28 sujetos y se evalu la ingesta de carotenoides en
la dieta, obtuvimos la sangre para los anlisis de HPLC, realiz medidas RRS
de estado carotenoide drmica, y realizamos biopsias drmicas (biopsia
punch de 3 mm) con carotenoides drmicos evaluados por HPLC.

Resultados: CCI de carotenoides totales a travs del tiempo fueron 0,97

(palma), 0,95 (parte interna del brazo) y 0,93 (brazo exterior). Total de
carotenoides drmicos evaluados por RRS se correlacionaron
significativamente con los carotenoides totales drmicos evaluados por
HPLC de biopsias drmicas (r = 0,66; p = 0,0001). Del mismo modo, el
licopeno evaluado por RRS se correlacion significativamente con el
licopeno evalu mediante HPLC de biopsias drmicas (r = 0,74; p <0,0001).

Conclusin: RRS es un mtodo factible y vlida para la evaluacin no

invasiva carotenoides drmicos como un biomarcador para el estudio de la
nutricin y la salud.

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INTRODUCCIN
Los carotenoides son pigmentos de las plantas que los humanos ingieren
habitualmente sobre una base diaria. Concentraciones particularmente altas
se encuentran en frutas y verduras. Los carotenoides ms prevalentes
consumidos en las dietas de Amrica del Norte incluyen los siguientes: caroteno, -caroteno, licopeno, lutena, zeaxantina, y -criptoxantina (1).
Estos carotenoides comunes de la dieta se pueden medir por mtodos
bioqumicos en la sangre y en otros tejidos despus de la extraccin, y se
sabe que las concentraciones de carotenoides en sangre / tejido se
correlacionan con la ingesta diettica (2). Adems, las concentraciones
plasmticas de carotenoides aumentan significativamente en respuesta a
las intervenciones conductuales de frutas / hortalizas (3, 4). Dada su amplia
distribucin de frutas y hortalizas, los carotenoides han sido de gran inters
como un biomarcador objetivo de la ingesta de frutas y verduras. La
Academia Nacional de Ciencias concluy que "las concentraciones en
sangre de carotenoides son los mejores marcadores biolgicos para el
consumo de frutas y verduras" (1).

Autovaloracin del estado de la ingesta de frutas y verduras ha sido

inversamente asociado con el riesgo de varias enfermedades crnicas,
sobre todo con diversos tipos de cncer (5) y la enfermedad cardiovascular
(6), y tambin con otras enfermedades del envejecimiento (7). Sin embargo,
investigaciones recientes han puesto de relieve las preocupaciones sobre la
validez de los datos subjetivos, la percepcin subjetiva de la dieta de
admisin (8). Esto ha motivado el desarrollo de biomarcadores fiables y
objetivos como indicadores de la ingesta alimentaria para los estudios sobre
la salud humana. Del mismo modo, los ensayos de intervencin diettica
suelen evaluar los cambios en la percepcin subjetiva de la dieta, pero es
bien sabido que la informacin puede ser parcial, en particular en el
contexto de ensayos aleatorios donde los participantes pueden querer
complacer a los investigadores con respecto a su adhesin a la intervencin
(sesgo de deseabilidad social ). Una vez ms, la validacin objetiva de que
el cambio de comportamiento en la dieta ha tenido xito es fundamental
para la interpretacin de los ensayos de intervencin dieta.

Hasta la fecha, los estudios de la ingesta de frutas y verduras se han basado

en los anlisis de carotenoides en plasma o suero mediante el uso de HPLC.

Este enfoque se ha demostrado y se ha relacionado con los resultados de

salud importantes, incluyendo la mortalidad total (9), pero tiene algunas
desventajas importantes, especialmente el costo de la flebotoma, muestra
la transformacin / almacenamiento, anlisis de muestras, y la necesidad de
venopuncin, que pueden introducir sesgo de participacin ya que algunas
personas no estn dispuestas a donar sangre. Como desventaja, las
concentraciones de carotenoides en sangre fluctan en respuesta a la
ingesta diettica reciente, con una vida media estimada de <12 d de caroteno (10).

Resonancia Raman espectroscopia de dispersin de luz (RRS) es una forma

de espectroscopia lser que detecta los niveles vibracionales /
caractersticos de rotacin de energa de una molcula. Los carotenoides
son particularmente adecuados para RRS, como todos tienen una estructura
de molcula de cadena principal de carbono conjugado fuertemente
absorber, proporcionando la base para una eficiente excitacin lser de
resonancia de las molculas. La columna vertebral consiste en alternar
doble carbono-y enlaces sencillos, con la longitud de conjugacin diferentes
entre las especies de carotenoides particulares. Las frecuencias de vibracin
de estiramiento de los enlaces dobles y sencillos de carbono se pueden
detectar con RRS. En sistemas de disolventes homogneos, la intensidad de
la resonancia Raman dispersa la luz est relacionada linealmente con la
concentracin de carotenoides, sirviendo as como una medida ptica para
el contenido de carotenoides.

Estas propiedades de dispersin de luz nos han llevado a explorar el uso de

RRS para la medicin ptica cuantitativa no invasiva de carotenoides y sus
distribuciones espaciales en tejido vivo humano, inicialmente en la mcula
humana (retina) (11-14). En sujetos sanos, los carotenoides son tpicamente
muy altamente concentradas en esta rea de la retina (11) y se cree que
proteger esta regin de tejido a travs de filtrado ptico y la accin
antioxidante. Deteccin basada en RRS de carotenoides en la mcula
humana se ve facilitada por su nivel relativamente alto, su ubicacin justo
por debajo de una regin pticamente transparente del sistema de capas de
la retina, y la ausencia de dispersores no Raman en la trayectoria de la luz
de excitacin de la retina. Por otra parte, las contribuciones de fluorescencia
a la luz de la respuesta general se originan solamente de capas de la retina
distal y, por tanto, se pueden restar fcilmente.

Posteriormente Propusimos que RRS podra ser un mtodo factible para la

medicin no invasiva de carotenoides para la piel humana (15-18),
reconociendo que la piel es mucho ms difcil para la evaluacin del RRV.
Las dificultades surgen aqu porque los niveles de carotenoides son 2

rdenes de magnitud inferior en relacin con la mcula humana, y la piel

contiene otros cromforos en la excitacin y la luz de deteccin caminos
pticos adems de carotenoides (incluyendo el colgeno, la melanina,
porfirinas, hemoglobina, etc). Adems, la morfologa de los tejidos de las
capas de tejido de la piel exterior pticamente accesibles es heterognea,
causando no Raman de dispersin de luz efectos fuertes, difusivos, en la
respuesta espectral total. Algunas de las influencias de confusin debe
minimizarse mediante la eleccin de sitios de tejido de la piel con una capa
de estrato crneo relativamente gruesa, tales como la palma de la mano o
de la planta del pie.

Siguiendo nuestro ejemplo, otros grupos estn empezando a utilizar RRS en

la piel humana (19-21). Estos estudios sugieren que los niveles de
carotenoides drmica, medido por RRS se correlacionan con la ingesta de
frutas y verduras y aumento de la respuesta a la suplementacin de
carotenoides, y que hay variabilidad en este biomarcador a travs de temas.
Esto apoya que los carotenoides drmicas segn la evaluacin de RRS son
un prometedor biomarcador de la ingesta de frutas y verduras para la
investigacin humana. Sin embargo, antes RRS pueden ser aceptados como
un biomarcador fiable para la investigacin humana, el mtodo necesita ser
examinado ms a fondo en vista de los desafos sealados anteriormente.
Algunos de los cromforos cutneos y dispersores existentes en las
trayectorias de luz pticas pueden variar entre los sujetos en su
concentracin y tambin entre los sitios de tejido y por lo tanto puede variar
en sus contribuciones relativas a la respuesta global luz. Por lo tanto, los
datos se necesitan crticamente sobre la variabilidad intraindividual, la
variabilidad interindividual, y, lo ms importante, la validez (en comparacin
con el anlisis qumico de los tejidos extirpados) en los seres humanos.

A diferencia de todos los dems carotenoides dietticos importantes que se

distribuyen ampliamente en frutas y verduras, el licopeno se encuentra en
relativamente pocos alimentos, con la mayora de licopeno en la dieta
proviene de tomates y productos de tomate (22). Fuentes de alimentos Top
de licopeno incluyen alimentos como la pizza, espaguetis, lasaa y la salsa
de tomate (23). Por lo tanto, el licopeno no se considera un biomarcador de
la ingesta de frutas y hortalizas, pero total y el consumo de productos en
lugar de tomate. El licopeno tambin es de considerable inters como un
posible agente quimiopreventivo para la prstata y otros tipos de cncer
(24). Debido a su menor longitud de conjugacin en comparacin con otros
carotenoides en la piel, el espectro de absorcin para el licopeno se
desplaza 20 nm hacia longitudes de onda ms largas en comparacin con
otros carotenoides. Esto permite evaluar el potencial de licopeno por
separado con RRS mediante el uso de una longitud de onda de excitacin
diferente con mejorado selectivamente Raman seccin transversal de
dispersin (15).

Aqu, 1) evalu la variabilidad intra e interperson en el estado total de

estado de carotenoides y licopeno segn la evaluacin de RRS, en el mismo
sitio del cuerpo, en diferentes partes del cuerpo, y con el tiempo; 2)
determin la correlacin entre el nivel de carotenoides totales de la piel
humana segn la evaluacin de RRS y otras medidas del estado de
carotenoides, incluyendo los niveles de carotenoides en plasma y los niveles
de carotenoides en las biopsias drmicas; y 3) determin la correlacin
entre el estado de licopeno de la piel humana segn la evaluacin de RRS y
otras medidas del estado de licopeno, incluidos los niveles de licopeno en
plasma y los niveles de licopeno en biopsias drmicas.

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Sujetos y mtodos
Estudio de reproducibilidad

Sujetos
Nuestra meta para el estudio de reproducibilidad era reclutar una muestra
de 75 adultos sanos de entre 21 y 65 y. Hemos tratado de reclutar a los
hombres y las mujeres, los fumadores y los no fumadores [concentraciones
de carotenoides en plasma de los fumadores se sabe que son ms bajos que
los de los no fumadores (25)], y los sujetos con un amplio espectro de la
pigmentacin de la piel. Algunos participantes en el estudio fueron
reclutados de personas afiliadas a la Universidad de Yale (New Haven, CT),
incluyendo estudiantes graduados, profesores, trabajadores administrativos
y tcnicos, trabajadores de la planta fsica, y los trabajadores de custodia.
Tambin hemos publicado folletos en otros lugares adyacentes a Yale para
contratar de manera ms amplia. Asistentes de investigacin entrenados
explicaron el propsito del estudio y luego obtenido por escrito el
consentimiento informado. El asistente de investigacin, entrevist a los
participantes en persona para obtener informacin bsica demogrfica
(edad, sexo, altura, peso, tabaquismo actual, el uso de suplementos
nutricionales, etc.). Se pidi a los participantes que auto-identificar la raza,
y, bajo la gua del asistente de investigacin, color de la piel (parte interna
del brazo) con el uso de una rueda de color de las muestras de tono de piel
se utilizan para los dispositivos protsicos. Todos los procedimientos fueron
aprobados por la Junta de Revisin Institucional de la Escuela de Medicina
de la Universidad de Yale, con este primer estudio en humanos abierto para
la contratacin en noviembre de 2004.

Para las mediciones de biomarcadores, desarrollamos y utilizamos un

instrumento adecuado para mediciones RRS en tejido humano in vivo (ver
mtodos descritos a continuacin para ms detalles). Se evalu el estado de
carotenoides drmica en la palma de la mano, el antebrazo interno, y el
antebrazo exterior. Se sabe que los carotenoides se concentran en la palma
(vegetarianos suelen tener las palmas de color amarillo-naranja), por lo que
la palma de la mano era una eleccin obvia para las mediciones. Los otros 2
sitios fueron seleccionados por conveniencia, uno de los cuales es ms
probable (brazo exterior) expuesta al sol que la otra (parte interna del
brazo). Los participantes regresaron a la oficina de estudios para nueva
evaluacin en los siguientes puntos de tiempo: 1 semana, 2 semanas, 1
mes, 3 meses y 6 meses. Los ltimos puntos de tiempo, en particular,
fueron elegidos para examinar las posibles influencias dietticas
estacionales en los niveles de carotenoides drmica (este estudio se realiz
en un clima con variaciones estacionales marcadas).

Espectroscopia Raman
Los detalles de la instrumentacin RRS han sido reportados en otra parte
(15, 17). En pocas palabras, hemos desarrollado y utilizado un instrumento
adecuado para mediciones RRS en tejido humano in vivo, que consiste en
un pequeo lser de argn multilnea refrigerado por aire para producir luz
simultneamente azul a 488 nm (para los carotenoides totales) y la luz
verde a 514 nm ( para el licopeno; vase tambin la Figura Suplementario
en "datos suplementarios" en la edicin en lnea). La salida del lser se
dividi en 2 haces separados, monocromticas con el uso de un divisor de
haz dicroico. Cada viga se filtr con un filtro dielctrico pase lnea, enviado a
travs de un componente variable de densidad ptica, acoplada a una fibra
ptica, y derrot en un mdulo de la entrega y la sonda de captacin de luz.
En cada haz se utiliz un obturador controlado por ordenador para exponer
secuencialmente el sitio del tejido de la piel con cada longitud de onda de
excitacin. Para cada medicin tejido, los atenuadores se ajustaron para
proporcionar idnticas intensidades de excitacin lser para cada canal, y la
sonda se llev a cabo en continuo contacto con el sitio de tejido
seleccionado para asegurar mediciones de exactamente el mismo volumen
de sonda tejido bajo de excitacin azul y verde luz. Luz retrodispersada de la
piel se encamina a travs del haz de fibras a un espectrgrafo,
espectralmente dispersa, grabado con una cmara de dispositivo de carga
acoplada, digitalizada, analizado por resonancia carotenoide respuesta
Raman, y se muestra, en tiempo casi real en un monitor de ordenador, con
el uso de rutinas de software desarrollado en casa.

La caracterstica ms fuerte de la respuesta ptica de la piel es la dispersin

de Rayleigh, que es particularmente dominante debido a la morfologa del
tejido en bruto de la capa externa de la piel (estrato crneo). Este

componente se filtra a cabo con el uso de 2 filtros de muesca hologrficas

en la trayectoria de deteccin. Adems, un amplio espectro respuesta
fuerte, la fluorescencia de fondo se produce esto es debido a la
autofluorescencia de la piel. Bajo las condiciones de excitacin anteriores,
que se origina principalmente de cromforos relacionados con colgeno.
Esta contribucin de fluorescencia (y su correspondiente absorcin) no
pueden ser evitados. Superpuesta en el fondo de autofluorescencia, con 2
rdenes de magnitud menor intensidad, son tpicamente los picos de
intensidad Raman de resonancia 2 de carotenoides, que se caracterizan
tanto por sus posiciones espectrales distintas y sus anchos de banda
estrechos. Los 2 picos se recuperan con resolucin optimizada y la relacin
seal-ruido mediante el uso de un detector de luz con alto rango dinmico
mediante el ajuste de la fluorescencia de fondo con un polinomio de cuarto
orden y restarlo de la espectro original. La intensidad de la carbono-carbono
doble enlace (C = C) estirar intensidad Raman, que se producen con un
desplazamiento de frecuencia de 1524 cm-1, es ms fuerte y por lo tanto se
utiliza como una medida cuantitativa (puntuacin) del nivel de carotenoides
drmica.

Se utiliz un lser de potencia de <10 mW y un tiempo de exposicin de 30

s con un tamao del punto elptico de 2 mm por 3 mm. Algunas
exploraciones sujetos tenan alta autofluorescencia (aunque poco comn en
la palma) de modo que el detector se satura y no puede obtener una seal
Raman clara; para estas exploraciones, redujimos el tiempo de exposicin a
15 s, y duplicamos la puntuacin de Raman en consecuencia. Este enfoque
(reduciendo el tiempo de exposicin, la duplicacin de respuesta) se verific
mediante el uso de sujetos con autofluorescencia normal (26). Las medidas
se tomaron por triplicado, y se utiliz la media de las medidas para el
anlisis de datos. Una muestra de diamantes externo con respuesta Raman
en el entorno espectral de la frecuencia de C = C estiramiento se utiliza a
diario para corregir las posibles desviaciones en la sensibilidad del detector
y salida del lser durante los meses necesarios para el reclutamiento y la
recoleccin de datos (6-mo de seguimiento) .

El RRS utiliza un lser clase 2-B (Laser Inc Nacional, Salt Lake City, UT) y con
el tamao de la potencia del lser y punto utilizado en estos estudios, es
seguro para exponer la piel para 30,000 s. Sin embargo, como es el caso
de los punteros lser, el contacto visual directo debe ser evitado. As, tanto
el (RRS) operador de lser y el participante llevaban gafas de proteccin
(Kentek Corporation, Pittsfield, NH) durante los procedimientos de RR.

Datos de ingesta diettica

Se pidi a los participantes que completaran un cuestionario de frecuencia

de alimentos (FFQ) al inicio del estudio ya los 6 meses. El cuestionario fue
desarrollado y validado en el Centro de Investigacin del Cncer Fred
Hutchinson. Esta FFQ ha sido utilizado en varios estudios en los
carotenoides eran una exposicin primaria de inters, como el Estudio de
Vigilancia Post-Mercadeo olestra (27). Se realiz un estudio de validez de
comparar la ingesta de nutrientes estimado de este FFQ en comparacin
con la de los 8 das de registros de alimentos y recuerda. El coeficiente de
correlacin para -caroteno a partir del estudio de validez era 0,57 (28). Los
datos de frecuencia fueron vinculados con la Universidad de Minnesota
Nutricin Coding System Center de Datos de Nutrientes para la estimacin
de la ingesta de nutrientes. Esta base de datos contiene el contenido de
carotenoides actual de alimentos, segn lo evaluado y actualizado por el
Departamento de Agricultura de Estados Unidos. Participantes se les pidi
que informe su frecuencia habitual de consumo de frutas y verduras
seleccionadas en el ltimo 2 meses. Aunque la vida media de carotenoides
en la piel no se ha estudiado y necesita ms evaluacin, es plausible que es
ms larga que la vida media de carotenoides en sangre, que es 2 sem
(10), lo que sugiere que Raman cuenta en la piel responder a los cambios en
la ingesta de carotenoides en los ltimos 2 meses.

Se pidi a los participantes que traigan en botellas de cualquiera de los

suplementos nutricionales que estaban consumiendo, ya que algunos
suplementos nutricionales, tales como ciertos multivitaminas contienen caroteno como fuente de vitamina A, o, posiblemente, otros carotenoides. Si
los participantes utilizaban suplementos en la entrada, se les pidi que
contine tomando el mismo suplemento para el perodo de estudio de 6
meses. Si los participantes no estaban tomando suplementos al ingreso, se
les pidi continuar abstenindose de suplementos nutricionales para el
perodo de estudio.

Estudio de validez

Sujetos
Para esta parte de la investigacin, hemos contratado a un total de 30
adultos sanos normales entre las edades de 21 y 65 y (2 sujetos se
utilizaron para poner a prueba y revisar los procedimientos; 28 eran sujetos
de prueba y se utiliza en este anlisis) con la contratacin a partir de
noviembre 2005. Los participantes tenan que estar dispuestos a someterse
a la flebotoma y drmica biopsia. Despus de obtener el consentimiento
informado firmado, los participantes fueron entrevistados para obtener
datos demogrficos y se les pidi que completar la FFQ descrito
anteriormente. Entonces RRS se utiliz para evaluar los niveles de

carotenoides drmica (como se describe ms arriba), pero esta vez en el

rea de la cadera posterior (un sitio poco visible en una pequea cicatriz de
biopsia no sera perceptible incluso con un traje de bao). El rea de
evaluacin estuvo marcado en la piel para que el cirujano dermatolgico
podra biopsia de esa regin. Los sujetos se les dio anestsico inyectado
(lidocana; Hospira Inc, Lake Forest, IL) en el sitio de la biopsia. Una vez que
la piel estaba entumecido, un cirujano dermatolgico extrae una biopsia en
sacabocados de 3 mm de la piel. Tejido adiposo residual se elimin de la
muestra antes de colocarlo en un criovial. Muestras de biopsia fueron snapcongelado inmediatamente con el uso de nitrgeno lquido. Sitios de biopsia
se suturaron para facilitar la curacin rpida.

Muestras de sangre (10 ml) se obtuvieron por puncin venosa por un

flebotomista capacitado y se recogieron en tubos heparinizados. Los tubos
se protegen de la luz, pero no refrigerados congelados, y luego se centrifuga
para obtener plasma. Se obtuvieron alcuotas de plasma y se almacenaron a
-70 C antes del anlisis HPLC.

Anlisis de extraccin y HPLC

Las extracciones se llevaron a cabo como se describe en otra parte (29). En
primer lugar, se aadieron 280 l de solucin salina tamponada con fosfato al
tejido punzn piel. Luego, 35 solucin de colagenasa l (50 mg / ml;. Sigma
n de catlogo E -1644) se aadi, vrtice mezclado, y se incubaron a 37 C
durante 1 h. Los tejidos se homogeneizaron en hielo, y 35 l de solucin de
proteasa (20 mg / ml;. Sigma n de catlogo 11360) se aadieron,-vrtice
mezclado, y se incubaron a 37 C durante 0,5 h. Se aadieron cuatro
mililitros de solucin de hidroxitolueno butilado dodecil-sulfato de sodioetanol y agitaron en vrtex durante 60 s. Las muestras se extrajeron
entonces dos veces con hexano (2 x 500 l) y se secaron antes de la
inyeccin hacia abajo HPLC.

Las muestras de plasma (100 l) se trataron con etanol y hexano que

contiene 0,1% (peso: vol) de hidroxitolueno butilado y se centrifug para
eliminar las protenas. Las protenas se vuelven a extraer con hexano (3 x
300 l), y el extracto combinado se evapor a sequedad bajo presin
reducida a <40 C. Despus de la evaporacin del disolvente, el residuo se
reconstituy en 200 l de fase mvil de HPLC y se centrifug durante 5 min a
2000 g antes del anlisis.

Las condiciones cromatogrficas para la separacin y cuantificacin de

carotenoides fueron similares a los reportados anteriormente (30). La fase

mvil fue una mezcla isocrtica de acetonitrilo: isopropanol: acetato de etilo

(50:40:10 vol: vol) a una velocidad de flujo de 0,7 mL / min. El anlisis se
realiz en una fase inversa Luna C18 [30] columna analtica, [250-mm
longitud x 4,6 mm id (Phenomenex, Torrance, CA); tamao de partcula = 5
m; tamao de poro = 100 Angstroms]. La columna se mantuvo a
temperatura ambiente, y el detector de HPLC se oper a 450 nm.
Identidades Peak fueron confirmados por espectros fotodiodo-array,
espectros de masas y coelucin con patrones autnticos como sea
necesario. Para evitar la sobrecarga del espectrmetro de masas con
molculas eluidas, 50% del eluyente fue dirigida a los residuos con la ayuda
de una vlvula de desvo. La lutena y la zeaxantina coeluy pero no se
cuantifica en base a un solo mtodo de monitoreo de iones (31).

Equipos de espectrometra de masas y anlisis

Anlisis de espectrometra de masas se realiz mediante el uso de un
Thermo Electron MSQ cuadrupolo nico espectrmetro de masas (San Jose,
CA) equipado con una fuente de ionizacin qumica a presin atmosfrica.
Los iones moleculares precursoras protonada fueron adquiridas inicialmente
en 2 modos de escaneo completos (A: 200 a 500 Da, B: 500-800 Da) con 0,2
tamao de paso y 2 ms de tiempo de permanencia. Seguimiento de iones
seleccionados se realiz usando un tiempo de permanencia de 200 ms para
cada canal. En el modo de control de iones seleccionado la relacin canalmasa-carga utilizada fue 551 2 para la lutena (forma deshidratada), 569
2 para zeaxantina, 552 2 para -criptoxantina, y 537 2 para caroteno y licopeno. Las condiciones tpicas fueron de descarga de corona
actuales = 5 mu, voltaje de polarizacin de la lente RF = 0,1 V, voltaje de
cono = 80 V, y la temperatura del calentador = 500 C. Los parmetros de
la fuente de iones y lentes de sintona se optimizan automticamente
mediante la infusin de las normas de carotenoides mediante el inyector
integrado de accionamiento manual. Para el anlisis cuantitativo de rutina,
se utiliz el NAVEGADOR ThemoElectron MSQ QUAN (Xcaliber). El software
proporciona una integracin pico de la intensidad de iones para cada uno de
los rangos de masa programadas. El anlisis automatizado fue seguido por
la confirmacin manual de los patrones de fragmentacin en fuente. Para la
calibracin, soluciones estndar se inyectaron en volmenes diferentes para
alcanzar concentraciones inyectadas finales que van de 1 a 1000 pg y 1 a 8
ng. Exactitud y precisin del mtodo se determinaron mediante la
generacin de datos de variabilidad intra e interdiaria de una serie de
muestras en el intervalo de 1-1000 pg inyecta 5 veces en un solo da.

Los anlisis estadsticos

Se utiliz estadstica descriptiva para describir la distribucin de las

puntuaciones de carotenoides Raman en la poblacin de estudio y comparar
distintos subgrupos en su estado media carotenoide drmica. Coeficientes
de correlacin intraclase (CCI) se utilizaron para evaluar la reproducibilidad
de las medidas en el tiempo y en los 3 sitios del cuerpo. Para evaluar la
validez, los coeficientes de correlacin de Pearson por pares se calcularon a
partir de los datos. Todos los clculos estadsticos se realizaron utilizando
SAS versin 9.1 (SAS Institute Inc, Cary, NC) con un valor de p de 0,05
considerado estadsticamente significativo. Un sujeto fue identificado como
un valor atpico (Raman medir fuera 3 unidades SD) as que no fue incluido
en el anlisis de correlacin de Pearson de los carotenoides totales.

Ir:
RESULTADOS
Para examinar la reproducibilidad de las medidas RRS biomarcadores del
total de los niveles de licopeno carotenoide y drmica drmicos, hemos
contratado un total de 75 adultos sanos. Uno de los participantes fue objeto
de una exploracin de la lnea de base, pero no complet el cuestionario de
referencia o cualquier otra exploracin as fue excluido de todos los anlisis.
De los 74 sujetos restantes, la edad media fue de 37 aos (mediana: 33
aos), el 62% eran mujeres, el 84% eran blancos, y el 15% eran fumadores
actuales (Tabla 1).

TABLA 1
TABLA 1
Resonancia espectroscopia Raman (RRS) de carotenoides totales por las
caractersticas basales de la poblacin de estudio (n = 74)
La distribucin de las intensidades Raman para los carotenoides totales en
la palma de la mano en la visita basal se muestra en la Figura 1 .. Los datos
parecen estar aproximadamente una distribucin normal, segn lo
confirmado por la prueba de Kolmogorov-Smirnov. La mediana de las
intensidades Raman para carotenoides totales (unidades normalizadas
Raman) fueron consistentemente ms alta en la palma, a continuacin,
parte interna del antebrazo, y la ms baja en la parte externa del antebrazo
(relacin de 3,7 y 1,8 en comparacin con 1,0 en unidades Raman
normalizados, respectivamente; datos no mostrados). Del mismo modo, la
mediana de las intensidades de licopeno fueron ms altas en la palma de la
mano, a continuacin, parte interna del antebrazo, y la ms baja en la parte
externa del antebrazo (relacin de 2,6 y 1,6 en comparacin con 1,0 en
unidades Raman normalizados, respectivamente; datos no mostrados). El

licopeno represent, en promedio, 32% de las intensidades totales de

Raman en la palma de la mano.

FIGURA 1.
FIGURA 1.
Histograma que muestra la distribucin de los carotenoides totales en la
palma como se evalu al inicio del estudio mediante el uso de la
espectroscopia Raman de resonancia (RRS) (estudio de la reproducibilidad;
n = 74). Nota apariencia en forma de campana de histograma que indica
una distribucin normal.
Se evalu la reproducibilidad del biomarcador carotenoide drmica en el
tiempo con los CCI a travs de los 3 sitios del cuerpo (Palm, parte interna
del antebrazo, y el antebrazo exterior) y sobre cada uno de los 6 puntos de
tiempo para los carotenoides totales y licopeno. CCI para carotenoides
totales para cada uno de los 6 puntos de tiempo a distancia desde 0,85
hasta 0,89, lo que indica que los participantes que tenan alta Raman
cuenta para un sitio del cuerpo eran igualmente altos en las otras partes del
cuerpo evaluados. CCI para carotenoides totales dentro de cada parte del
cuerpo a travs del tiempo ha sido el siguiente: palma = 0,97, parte interna
del antebrazo = 0,95, y el antebrazo externo = 0,93, mostrando que los
niveles de biomarcadores fueron consistentes con el tiempo dentro de cada
parte del cuerpo, con la ms alta reproducibilidad se muestra para la palma
de la mano . CCI de licopeno por cada uno de los 6 puntos de tiempo a
distancia 0,83-0,92, lo que indica que los participantes que tenan alta
licopeno Raman que cuenta en un sitio del cuerpo eran igualmente altos en
las otras partes del cuerpo evaluados. CCI de licopeno en cada parte del
cuerpo con el tiempo fueron los siguientes: palma = 0,93, parte interna del
antebrazo = 0,94, y el antebrazo externo = 0,93.

Examinamos los CCI estrato especfico para los carotenoides totales y de

licopeno por sexo, edad, raza, tono de piel, y el consumo de tabaco; no hubo
evidencia de que los CCI variar constantemente a travs de cualquiera de
estos estratos (datos no mostrados).

Estaban disponibles para todos menos uno de los participantes los datos
dietticos Alimentos frecuencia; la ingesta de carotenoides totales fue
significativamente (r = 0,52; p <0,001) predictivo de carotenoides drmicos,
al igual que el consumo de frutas y hortalizas totales y (r = 0,39; p = 0,008;
coeficientes de correlacin son ajustados por la energa).

Tenemos un promedio de las mediciones totales de carotenoides drmica 6

para cada sujeto tomado con el tiempo y luego examinado cmo promedio
Estado carotenoide drmica variaba en funcin de variables / estilo de vida
demogrficas (Tabla 1). Ninguna de las comparaciones fueron
significativamente diferentes, aunque se observ una tendencia a un mayor
reconocimiento de carotenoides en temas, las mujeres, los sujetos ms
jvenes ms educados, los que fumaban menos o nada en absoluto, el
ndice de sujetos delgados (de masa corporal, en kg / m2: <25 ), y sujetos
con tono de piel ms clara.

Para verificar que las medidas RRS de carotenoides totales y licopeno eran
vlidas, hemos contratado a una muestra de 28 adultos sanos que acord
proporcionar datos dietticos y someterse a flebotoma y drmica biopsia de
la cadera posterior (biopsia en sacabocados de 3 mm) y se va a escanear en
el lugar de la biopsia con el uso de RRS. Por ltimo, comparamos las
correlaciones entre los biomarcadores RRS (carotenoides totales y licopeno)
y sus niveles relativos en las biopsias de piel y drmicas en la sangre
mediante el uso de HPLC. El nivel total de carotenoides en la piel por RRS se
correlacion significativamente con el nivel de carotenoides totales en la
piel por HPLC (r = 0,66, p = 0,0001; Figura 2). El nivel total de carotenoides
en la piel (de palma RRS) tambin se correlacion significativamente con el
nivel de carotenoides totales en el plasma (HPLC; r = 0,62; p = 0,006).

FIGURA 2.
FIGURA 2.
Drmicos carotenoides totales en la piel como evaluaron mediante anlisis
de HPLC de la biopsia cutnea en comparacin con drmicos carotenoides
totales en la piel tal como se evalu mediante resonancia espectroscopia
Raman (RRS) (estudio de validez; n = 28). De Pearson coeficiente de
correlacin r = 0,66 (P = 0,0001). ...
Las estimaciones de concentracin de licopeno se puede abordar de 2
maneras. Una manera es medir la seal de RRS licopeno con excitacin 514
nm y asumir que 100% de la seal es debido a licopeno. Un enfoque
alternativo es correcta la seal obtenida con excitacin 514 nm para la
pequea cantidad de seal que se esperara que venir de otros
carotenoides, como se describe en otra parte (15), al cual nos referimos
como la puntuacin de Raman licopeno ajustado. Comparamos estos 2
estimaciones de drmica RRS licopeno contra las medidas de HPLC; ambos
fueron fuertemente correlacionada y significativamente con medidas de
HPLC [r = 0,74 para el licopeno ajustado por RRS en comparacin con HPLC,
P <0,0001 (vase la Figura 3), y r = 0,68 para el licopeno no ajustado por

RRS en comparacin con HPLC, P <0,0001]. Nivel de licopeno en la piel

(RRS) tambin se correlacion significativamente con el nivel de licopeno en
el plasma (HPLC; r = 0,42; p = 0,03 para el licopeno ajustado; r = 0,41; p =
0,04 para el licopeno no ajustado).

FIGURA 3.
FIGURA 3.
Licopeno drmica en la piel como se evalu por anlisis de HPLC de la
biopsia cutnea en comparacin con licopeno drmica en la piel tal como se
evalu por espectroscopia de Raman de resonancia (RRS) (estudio de
validez; n = 28). De Pearson coeficiente de correlacin r = 0,74 (P <0,0001).
Nuestros 2 estudios en humanos no fueron diseados para medir
directamente y evaluar el efecto de la melanina en las medidas RRS
carotenoides piel; sin embargo, en el estudio de reproducibilidad,
examinamos cmo RRS puntajes carotenoides variaron segn la raza y el
tono de la piel. Como se muestra en la Tabla 1, los valores RRS fueron
mayores en los no blancos (que inclua los asiticos y afroamericanos) en
comparacin con los blancos, pero inferior en la palma de los 3 sujetos con
la piel ms oscura. Si la melanina estaban teniendo un efecto de filtrado de
la luz que dio lugar a una subestimacin de los recuentos de RRS
carotenoides drmica, entonces la relacin del brazo a la palma RRS
puntuaciones totales de carotenoides debe ser menor en los participantes
de piel oscura (por ejemplo, una mayor proporcin de melanina en brazo
exterior en comparacin con la palma). Hemos examinado-brazo-a palma
proporciones de carotenoides totales en los participantes con oscuro en
comparacin con la luz de la pigmentacin de la piel y vieron diferencias
significativas, aunque tuvimos un poder limitado para ver estas diferencias
dado nuestro tamao de la muestra.

Ir:
DISCUSIN
Nuestros resultados indican que el RRS carotenoide drmica biomarcador es
reproducible y vlida y se correlacion con la ingesta diettica de frutas y
hortalizas, y por lo tanto es prometedor para su uso en estudios en
humanos. Niveles de carotenoides en la piel (carotenoides totales al inicio
del estudio) fueron aproximadamente una distribucin normal, en contraste
con las concentraciones de carotenoides en la sangre, que son conocidos
por ser muy sesgada con valores promedio superior a las medianas de todos
los principales carotenoides [por ejemplo, vase Nacional de Salud y
Nutricin de datos Encuesta (1)] debido a la vida media relativamente corta

de carotenoides en sangre, y por lo tanto la influencia de los ltimos

comidas que contienen carotenoides.

En trminos de viabilidad de uso, los sujetos respondieron bien al escner,

con cada medicin piel tomando slo 1 min para completar, incluyendo la
adquisicin de datos y el tiempo de procesamiento. El dispositivo RRS
utilizado en estos estudios no era fcil de transportar;