INTRODUCCIN

La contaminacin por los metales pesados es un serio problema

ambiental. Los metales pesados un efecto obvio o son potencialmente
perjudiciales para la biota. Entre los metales pesados, cadmio,
comnmente asociados con la contaminacin del suelo, se que es
considera particularmente txico y responsable de las significativas
disminuciones en las actividades biolgicas en el suelo (Smith et al.
1997).
La descarga de metales pesados tiene efectos perjudiciales en la salud
la salud humana y el ambiente.
Minas de plomo y zinc son las fuentes principales que liberan cantidades
significantes de Cd, pb, y Cr hacia el ambiente natural.
Recientemente el el efectyo de la toxicidad de los metales pesados en
microorganismos
ha
recibido
especial
atencin
porque
los
microorganismos
son los componentes claves para el reciclaje de nutrientes. El efecto de
los metales pesados en el suelo alrededor de las minas de plomo y zinc
son complejos y muy difciles de estudiar debido a la diversidad de
microorganismos presentes en los suelos. Algunos microorganismos
pueden pueden tolerar la toxicidad de metales pesados, mientras otros
no. Sin embargo los microorganismos que tienen la habilidad de resistir
la toxicidad todava no son conocidos. Estudios anteriores solo muestran
que algunos microorganismos tienen la habilidad de remover metales
pesados de ambientes contaminados. Sin embargo, a una concentracin
dada, un metal para alguna espece, mientras que puede servir como un
estimulante del crecimiento a los dems ( Filiz et al., 1996). Hasta la
fecha, la influencia de los metales sobre las comunidades microbianas
no se conoce con precisin.
En suelos, los metales pesados estn presentes en varias formas como
un resultado de su interaccin con varios componentes del suelo; por lo
tanto la concentracin total de metales pesados en suelos no puede
proporcionar un ndice preciso para evaluar su influencia sobre los
microorganismos de suelos ( welp and brummer, 1997; kunito et al.,
1999). Hasta la fecha, pocos intentos han sido realizados para estudiar
la relacin entre metales pesados en suelos y su influencia sobre las
propiedades microbianas (kunto et al., 1999), y actualmente hay muy
poca informacin disponible en la literatura publicada sobre este tema.
En este estudio, cinco ejemplos de suelos de toda una mina de plomo y
zinc situado en los suburbios de la ciudad de Beijing en el norte de China
se recogieron y se us un enfoque polifsico, incluyendo mtodos de
cultivo basados y tcnicas moleculares, para analizar la comunidad
bacteriana en los ejemplos. Las comunidades
microbianas se
caracterizan usando el sistema biolgico y la electroforesis en gel de
gradiente desnaturalizante (DGGE) de 16SrRNA fragmentos de genes
que se amplificaron a partir del ADN bacteriano total extraido del suelo
( Miller et al., 1999; Picard et al., 1992; Torsvik et al., 1990; Tsai and

Olson, 1992; Zhou et al., 1996) el objetivo ms importante de este

estudio fue para obtener informacin sobre la diversidad microbiana de
suelos que fueron contaminados por la mezcla de metales pesados de
la mina de plomo y zinc. Adems, un estudio de patrones de distribucin
microbiana en los ejemplos de suelos fueron estudiados tambin. Esto
proporcion una valiosa muestra bsica, para investigaciones
posteriores de resistencia bacteriana sobre metales pesados.
1) Materiale y mtodos
1.1) Muestras de suelo
La muetra de suelo se recogio de la superficie (0-10cm) de una mina de
plomo y zinc localizado en los suburbiosde Beijing en el norte de china
(4007N; 11638). Esta mina habas ido continuamente explotada por
20 aos. Cinco muestras individuales de suelo fueron recolectados del
interior de la mine (S1), un sitio apilado de cenizas a una distancia de
20m desde la mina (S2), un huerto a una distancia de 60m desde la
mina (S3), un arroyo a una distancia de 40m desde la mina (S4), y en la
entrada de la mina(S5). La profundidad de muestreo fue de 0-20cm. Las
muestras fueron recogidas en bolsas plsticas y transportadas sobre
hielo hacia el laboratorio, donde e almacenaron a 4C.
1.2) determinacin de la concentracin de metales.
Un total de 0.4g de muestra de suelo seco fue usado para la
determinacin de plomo, cadmio y cromo. La muestra se digiere-hmedo
con 5ml de cido ntrico concentrado en un recipiente cerrado de
politetrafluoroetileno en un horno microondas. La digestin se diluyo en
25ml con agua bidestilada y filtrada. Un aparato de espectros se utilizo
para las mediciones de espectrometra de absorcin atmica.
1.3)

Enumeracin y examinacin morfolgica de unidades formadoras

de colonias.

100ul de diluciones de suelo apropiadas se extendieron sobre placas LB

que fueron complementados con fungicida (25ug nystatin/ml) e
incubados a 25C por 14 d. las colonias visibles fueron enumeradas y
marcados diariamente a travs de un periodo de incubacin. Para la
tipificacin de la morfologa de las colonias en platos LB, las 30-100
colonias que han desarrollado en cada plato despus de 4 o 5 d de
incubacin fueron agrupados en morfotipos en base a sus caractersticas
visuales como color de colonia, dimetro, edad, superficie y otras
caractersticas especiales. Toda la examinacion morfolgica que se llevo
a cabo sobre tres muestras replicadas de cada suelo. Miestras se analiza
el cultivo hetertrofo y diversidad gentica, riqueza(S), ndices de
Shonnon-wiener (H), y el ras (EH) fueron empleados de acuerdo a la
siguiente ecuacin:

Donde Pi es la proporcin entre el numero en un grupo especifico (Ni) y

el numero total (N), S es el numero total de morfotipos en la diversidad
de hetertrofos cultivables.
1.4)

Mtodos de extraccin de DNA

Se uso el mtodo cetiltrimetilamonio (CTAB) para la extraccin de ADN

de la biomasa bacteriana que se cultiva en las placas (Mette and Heil,
2002). Este mtodo fue adaptado para la extraccin de ADN de los
suelos. La muestra de suelo (250mg) se aadi a 250mg de perlas de
vidrio lavados con acido (0.4-0.52mm de dimetro) en tubo de
microcentrifuga de 2ml. buffer A (1ml de 100mmol/L, tris-HCL,
100mmol/L EDTA (ph=8.0), 100mmol/L buffer de fosfato (ph=8.0), 1.5
mol/L NaCl, 1% CTAB) se aadi a una mezcla de 175ug de protena k y
1mg de lisozima. Entonce se agito en un agitador de plataforma a la
velocidad mxima durante 20min. Despus 120 ul de 20% dodecil
sulfato de sodio e aadi, y las muestras fueron incubada a 65C
durante 30min. Despues las muetras fueron centrifugadas a 2800g por
2min. El sobrenadante e trasfiri a un tubo nuevo, y el sedimento se
volvi a extraer con 300ul de buffer A y se centrifugo nuevamente. El
conjunto sobrenadante se retir con un volumen igual al de alcoholcloroformo isoamlico (24:1, v/v). se precipito la fase acuosa con 0.6
volumen de isopropanol a -20C por 30min. El sedimento se lav en
300ul de 70% (V/V) etanol y se secaron al aire antes de resuspender en
100ul de 10mmol/L trithydroxymethyl aminometano (tris) ( ph=8.5). la
preparacin de ADN se purificaron con electroforesis en gel el cual sirvi
para separar el acido hmico del ADN. Alcuotas (50ul) se ejecutaron en
0.7% gel de agarosa en 60v por 2h. Las bandas de ADN de
aproximadamente 10-30kb fueron extirpados del gel, y el ADN se extrajo
usando el sistema de recuepracion de gel de ADN del grano de plata.
Esencialmente, la rebanada de gel fue solubilizada y con destino a las
partculas de vidrio en solucin con ph=7.5. despus lavada y eluida en
10mmol/L Tris (ph=8.5). esto, entonces se uso directamente para la
subsiguiente amplificacin PCR.
1.5)

Amplificacin PCR de genes 16S rRNA del ADN extraido.

Los parciales genes bacterianos 16S rRna (los fragmentos de 16S rDna
son alrededor de 230 bp) que fueron amplificados con el cebador directo
F357 (5-CCT ACG GGC AGC AG-3) Y el cebador reverso R518 (5-ATT
ACC GCG GCT GCT GG-3) ( Zhou et al., 1996). Como cebador directo,
una base de 40 GC abrazadera ( 5-CGC CCG CCG CGC GCG GCG GGC

GGG GCG GGG GCA CGG GGG G-3) se aadieron al extremo 5 para
estabilizar el comportamiento de fusin de los fragmentos de ADN. Las
PCR se presentaron con la aplicacin del biosistema gen al sistema PCR
amp 2700. Las siguientes condiciones del ciclo fueron usadas por el par
de cebadores: 95C por 15 min ( para la activacin enzimtica y la
desnaturalizacin del destino), seguidos por 20 ciclos de 95C por un
minuto, 65C (reducido por 0.5C cada ciclo) por 45s, y 72C por 1min;
10 ciclos de 95C por 1 min, 55C por 45s, y 72C por 1min, y una
extensin final a 72C por 5min.
1.6)

Anlisis DGGE

El sistema Dcode para DGGE( bio rad laboratorio) fue esado. Se cargaron
muestras en 10% polyacrylamide-bisacrylamide (37.5:1) geles,
teniendo gradientes de desnaturalizacin de 35% a 60% ( donde el
100% es 7mol/L urea y 40% (v/v) formamida desionizada) en 1xTAE
tampn de electroforesis. La electroforesis se llevo a cabo en 180V a una
T de 60C para 4.5h. los geles se tiieron con EB en 1Xtae durante 30
min a temperatura ambiente y observados bajo iluminacin ultravioleta.
Las bandas de inters fueron extirpados y el ADN fue eludido con un
volumen igual de tampn de difusin (0.5 mol/L acetato de aminio,
10mmol/L acetato de magnesio, 1 mmol/L EDTA (ph=8) y 0.1% (wt/v)
dodecil sulfato de sodio) a 50C por 30min. La solucin resultante (1ul)
se utilizo ADN objetivo para la siguiente amplificacin PCR con
cebadores F357 y R518. La pureza y la posicin correcta de ejecucin se
confirmaron por un anlisis DGGE adicional.
1.7)

Analisis biolgico

Los patrones de diversidad metabolica se analizaron BIOLOG (BIOLOG,

Hayward, CA). Las muestras de suelo (20g) se agitaron por 15 min con
tampn fosfato esteril. Las partculas de suelo se removieron en la
centrifuga durante 10min en 2600g. las microplacas se cubrieron e
incubaron a 30C. se leyeron las placas con el lector BIOLOG de
microplacas (590nm) en intervalos de 4h, iniciando cuando el color se
hacia visible en la microplacas (18+-2.4h depues de inocular) y
finalizando cuando los pozos ya no cambian de color (36+-5.2h despus
de inocular). El desarrollo promedio del pozo y el color (AWCD) se calculo
para cada microplaca. El AWCD para cada microplaca se calculo
restando la densidad ptica (OD) de control de pozos desde el OD de la
resta ( sustrato en blanco), los pozos de sustrato no establecen ningn
resultado con valores negativos a cero y tomando la media de los 95
pozos de sustrato blanco.la media de la AWCD para cada conjunto de
placas triplicadas fue calculada. Un punto de referencia de 0.25 AWCD
se uso para comparar lo patrones biolgicos. La lectura obtenida de las

microplacas BIOLOG seleccionadas con 0.25 AWCD se analizaron

adicionalmente y comparadas utilizando el principal componente de
anlisis (PCA).
2) Resultados
2.1) anlisis espectroscpico de absorcin atmica
Los principales metales pesados toxicos en las muestras de suelo se
estimaron mediante espectroscopia de absorcin atmica (AAS). Los
resultados se muestran en la tabla 1.
En base a la informacin dada en la tabla 1, se puede observar que la
cantidad de pb y cd en lo suelos era extremadamente alta y se
distribuyo de manera que el contenido diminuyeron con el aumento de
distancia desde la mina. En la mina de pb y zinc, el contenido de pb en
el suelo fue 204ug/g. fuera de la mina, el contenido de pb de suelos
distribuidas medianamente. Esto muestra que el pb ya ha penetrado en
los suelos alrededor del relave de la mina de pb y zinc, incluyendo el
suelo de arroyos, la cual estuvo a una distancia de 40m desde la mina, y
el suelo de huertos, el cual estuvo a una distancia de 60. Desde la mina.
La distribucin de cd coincidio con la distribucin del mineral, con
concentraciones en el suelo, empezando altas en la mina y alrededor de
la ceniza, y baja en los suelos de arroyos, el cual estuvo a una distancia
de 40m desde la mina, el suelo de huerto estuvo a una distancia de
60m desde la mina. La concentracin de cr aument gradualmente con
el aumento de la distancia desde la mina.
2.2) enumeracin y examen morfolgico de unidades formadoras de
colonia (cfu)
El numero de bacteria hetertrofas que fueron capaz de formar colonias
en cinco muetras de suelo en medio hmedo se enumeraron sobre
placas con agar LB.
La diversidad de la fraccin cultivable hetertrofa de la comunidad
bacteriana se examin de acuerdo a la diferencia en la morfologa de la
colonia ejemplo: color, forma, medida, etc. Sobre las placas con agar lb.
Diversamente el anlisis se bas en que la morfologa de la colonia
mostr diferencias significativas entre las 5 muestras de suelo.
2.3) anlisis de bandas DGGE

Discusin de Resultados
la contaminacin del suelo con metales pesados puede tener un efecto
perjudicial sobre la actividad y funcin microbiana. contaminacin de metales
pesados disminuye la respiracin del suelo y la biomasa microbiana y dificulta
la descomposicin de la hojarasca en el suelo. en este estudio, los suelos
contaminados de la muestra alrededor de la mina de plomo y zinc haban sido
objeto de contaminacin durante un largo perodo de tiempo. los cambios en la
estructura de la comunidad microbiana alrededor de la mina de plomo y zinc
de relaves podran ilustrar los cambios reales en las tesis comunidades de
organismos microbianos en suelos contaminados con Cd, Pb, y Cr. suelos
alrededor de la mina de plomo y zinc haban recibido altas cantidades de
metales pesados como el Cd y Pb, que fueron consideradas como
contaminantes dominantes en este estudio, la diversidad disminucin
comunidad microbiana fue encontrada usando el mtodo de BIOLOG.
muchos estudios han demostrado que incluso pequeas cantidades de metales
pesados en el medio ambiente tienen efectos perjudiciales en todos los

organismos vivos y disminuyen descomposicin de la hojarasca y el ciclo de

nutrientes posteriormente en todo el ecosistema. la contaminacin de metales
pesados inhibe procesos mcrobial como mineralizacin de N en el suelo y la
hojarasca descomposicin. Por lo tanto, el funcionamiento normal de una
comunidad microbiana en los suelos de todo el plomo y el zinc mina tizn
podra haber sido debilitado. entre todos los perfiles de DGGE en los suelos,
que de S1 fue la ms simple. sin embargo, en este estudio, el anlisis de
conglomerados de los perfiles de DGGE mostr que las bacterias en S1 y S3
pertenecan a la agrupacin. la confirm el resultado que se obtuvo usando el
mtodo del BIOLOG. S1 wasthe suelo muestreado cerca del lugar de
apilamiento de ceniza, que era de 20 metros de distancia de la mina de plomo
y zinc de relaves. mostr thatdischarge la ceniza en el ambiente del suelo
destruira la estructura de la comunidad microbiana.
en el presente estudio, las generaciones de bacterias metlicos resstant
pesados se encontraron en el perfil de DGGE en S1. el aumento de la tolerancia
a metales pesados de la comunidad microbiana podra ser debido a una
tolerancia adquirida por adaptacin, una tolerancia alterada genticamente, o
un cambio en la composicin de las especies. es posible adquirir tolerancia a
metales pesados en el medio ambiente debido a que los genes en la mayora
de los organismos que controlan la resistencia del metal se presentan en
plsmidos.
los resultados tambin indican que algunas bacterias de metal resistente a
fuertes pueden sobrevivir en los suelos con altas cantidades de Pb (204ug / g
de suelo) y Cd (226,9 ug / g de suelo). el nivel apropiate del heavy metal se
debe dar cuando domesticar nuevas bacterias resistentes a los metales
pesados combinados.
en comparacin con el mtodo tradicional de los recuentos de placas, PCRDGGE y mtodos BIOLOG pueden proporcionar informacin ms detallada
sobre el cambio y la diversidad en la estructura de la comunidad microbiana en
el ambiente del suelo.