APLICACION DE LA CROMATOGRAF IA LIQUIDA DE ALTA

RESOLUCION AL ANALISIS DE ACIDOS ORGANICOS EN ZUMOS,

NECTARES Y BEBIDAS REFRESCANTES
HIGH PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHIC APLICATION
BY ANALYSIS OF ORGANIC ACIDS IN JUICES, NECTARS
AND COOLING DRINKS

Por M.a

J.

1PEZ HERNNDEZ,

J.

SIMAL LOZANO y

M.a A.

ROMERO RODRGUEZ

Departamento de Qumica Analtica, Nutricin y Bromatologa.

Laboratorio de Bromatologa. Facultad de Farmacia. Universidad de Santiago
de Compostela. E-15706 Santiago de Compostela
RESUMEN
Se ha desarrollado un mtodo para la determinacin y separac10n por cromatografa lquida
de alta resolucin en fase reversa de cidos orgnicos en zumos, nctares y bebidas refrescantes,
usando un detector UV. Los cidos orgnicos principales (tartrico, mlico y ctrico) requieren
una purificacin previa por resinas de intercambio inico Dowex l. La recuperacin encontrada
es de 89,6% para el cido tartrico, 9,4 % para el cido mlico y 98,6% para el cido ctrico,
siendo los coeficientes de variacin de 2,4; 2,8 y 3,3 respectivamente. Los cidos ascrbico, srbico y benzoico se analizan tras una dilucin previa 20/100 y filtrado a travs de una membrana de 0,22 JLm.
PALABRAS CLAVE : Acidos or gnicos, zumos, nctares, bebidas refrescantes, HPLC .

SUMMARY
A reverse phase high performance liquid chromatographic method using a UV detector has
been developed for the separation and determination of the organic acids in juices, nectars and
cooling drinks, using a cation exchange column Dowex 1 without sample preparation of the
major organic acids (tartaric, malic and citric acids). Mean percent recoveries of each acid were
tartaric 89,6%, malic 94,4% and citric 98,6%. The coefficients of variation are 2,4; 2,8 and
3,3 respectively. Ascorbic, sorbic and benzoics acids have been analiced after 20/100 dilution
and filtration throung 0,22 JLm membrane.
KEv WORDS: Organic acids, juices, nectars, cooling drinks, HPLC.

INTRODUCCION
Los zumos de frutas, nctares y bebidas refrescantes presentan en su compostewn
diferentes cidos orgnicos constituyentes de las frutas de las que se obtienen (cidos
tartrico, mlico, ctrico y ascrbico) o incorporados como aditivos acidulantes (cidos
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tartnco, mlico y ctrico) antioxidantes (cido ascrbico) o conservadores (cidos srbico y benzoico).
La aplicacin de la cromatografa lquida de alta resolucin al anlisis cuali y cuantitativo de estos compuestos, es recogida por diferentes autores, como CoPPOLA et al.
(1978), GOIFFON et al. (1985), YASEK (1985), PICHA (1985), BADUD y FRATZ (1986),
FRAYNE (1986) y los Mtodos Oficiales de Anlisis de Zumos de frutas y sus derivados,
B. O. del E. (1988).
El objeto de este trabajo es efectuar el anlisis de cidos orgnicos presentes en las
muestras anteriormente citadas mediante cromatografa lquida de alta resolucin de
fase reversa, utilizando un detector UV /viS en el que se selecciona la longitud de onda
de acuerdo con el tipo de cido. As, los cidos orgnicos mayoritarios (tartrico, mlico
y ctrico) se leern a 214 nm, el cido ascrbico a 254 nm, mientras que para los cidos
srbico y benzoico, la longitud de onda utilizada es 230 nm.

MATERIAL Y METODOS

Muestras
Se han analizado un total de 31 muestras, nueve de zumos, siete de nctares y quince
de bebidas refrescantes, todas ellas adquiridas en el mercado.

Preparacin de la muestra
Para el anlisis de los cidos mayoritarios (tartrico, ctrico y mlico) se efecta una
previa neutralizacin de la muestra con NaOH 1 N hasta pH = 10 que asegure la
formacin de las sales correspondientes. Una vez neutralizada, se filtra a travs de
membranas Millipore de 0,22 ;..m (Millipore Corporation, Bedford) pasando 20 ml del
filtrado a la resina de intercambio inico bsica a la forma de CI-, Dowex 1 {Fluka).
La elucin de los cidos se efecta con 50 ml de Cl Na al 5% (P jv).
Para efectuar la separacin y determinacin de los cidos ascrbico, srbico y benzoico, se diluye la muestra 20/100 con agua de grado HPLC filtrndose a continuacin
por membrana Millipore de 0,22 ;..m.

Preparacin de patrones
Los patrones de los cidos analizados (tartrico, mlico, ctrico, ascrbico, srbico
y benzoico) son de grado analtico (Merck). La dilucin de los mismos se ha realizado
con Cl Na al 5% (cidos mayoritarios) y agua de grado HPLC (cidos ascrbico, srbico y benzoico), a niveles similares al valor promedio de cada uno de ellos encontrados
en las muestras.

Anlisis por cromatografa lquida de alta resolucin

El cromatgrafo utilizado en este trabajo, ha sido un Spectra-Physics equipado con
una bomba SP8700XR, inyector 10 ;..1, Rheodyne, detector UV /VIs SP8440XR e integrador SP4290.

67

DE LA CROMATOGRAFA LQUIDA DE ALTA RESOLUCIN ...

La columna empleada en la separacin de los cidos ha sido Spheri 5 RP 18 (Brownlee Labs, USA) con un tamao de partcula de 5 .tm y dimensiones 220 X 4,6 mm.
Como fase mvil se emplea agua de grado HPLC tras ajustar el pH de la misma
a 2,2 con cido sulfrico (Merck), YASEK (1985) a un flujo de 0,4 ml/min.
Las longitudes de onda seleccionadas han sido:
-

214 nm para los cidos tartrico, mlico y ctrico.

254 nm para el cido ascrbico.
230 nm para los conservadores (srbico y benzoico).

Clculos
Se establece el factor de respuesta de cada uno de los cidos inyectando patrones
de concentracin conocida:
F

Factor de respuesta
del patrn de cido,
expresada en mg/100 ml
A 1 = Area del patrn de cido
C = Concentracin de cido en la muestra
expresada en mg/100 ml
A 2 = Area del cido en la muestra
2,5 = Factor de dilucin

el = Concentracin

C = 2,5 X F X A2

Estudio de la recuperacin de la resina de intercambio inico

Se ha efectuado el estudio de la recuperacin tras pasar un patrn de concentracin
conocida de los cidos tartrico, mlico y ctrico, previamente neutralizado con Na OH
a travs de la columna Dowex 1, de la que se eluye con 50 ml de Cl Na al 5%. Los
resultados obtenidos aparecen recogidos en la tabla l.

Tabla 1
Estudio de la recuperacin en las resinas de intercambio catinico
Nmero de determinacin

Acido tartrico

Acido mlico

Acido ctrico

1
2
3
4
5
6
7
8
9

92,6
89,0
86,4
89,7
88,3
87,6
89,7
92,5
88,6

94,2
93,8
92,3
91,8
96,7
92,8
96,7
100,1
94,4

92,1
98,6
93,6
93,9
98,5
99,7
100,6
99,3
98,6

Valor promedio ... .........

CV% ... ........ .... ......

89,6
2,36

94,4
2,79

98,6
3,34

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1
1

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M.'

J.

LPEZ HERNNDEZ,

J. SIMAL

LOZANO y M.' A. ROMERO RODRGUEZ

RESULTADOS Y DISCUSION
La identificacin de cada cido orgnico se realiza por el tiempo de retencin correspondiente a la longitud de onda seleccionada.
La figura 1 recoge los registros grficos de los cidos tartrico, mlico y ctrico en
el que los tiempos de retencin respectivos son 5,96; 6,76 y 10,37 minutos. La longitud
de onda empleada ha sido de 214 nm.
El cromatograma correspondiente al cido ascrbico, a 254 nm, aparece registrado
en la figura 2. El tiempo de retencin obtenido en las condiciones de trabajo descritas
es de 7,13 min.
La figura 3 muestra el cromatograma obtenido a 230 nm de los cidos benzoico y
srbico, que presentan un tiempo de retencin de 6,43 min en el caso del cido benzoico
y de 7,29 m in para el cido srbico.
Los valores encontrados en el anlisis de 31 muestras : 9 de zumos, 7 de nctares
y 15 de refrescos, aparecen recogidos en la tabla Il.
Los resultados se han obtenido de tres inyecciones sucesivas en anlisis efectuados
dentro de los treinta minutos.
En las muestras zumos analizadas, se han encontrado cido tartrico, en una de ellas
79,3 mg/100 ml. )1 contenido de cido mlico varan entre 38,1 mg/100 y 751,1
mg/100 ml. Se ha encontrado cido ascrbico en cinco de los nueve zumos analizados,
oscilando su valor entre 0,5 y 19,6 mg/100 ml. Los valores de cido ctrico estn entre
29 y 1182 mg/100 mi. Ni en las muestras de zumos ni en las de nctares se han encontrado conservadores. Los niveles de cido tartrico encontrados en los nctares, oscilan entre 6,0 y 76,2 en siete de las nueve muestras analizadas. En cuanto al cido
mlico en los nctares, se ha encontrado en todas las muestras analizadas entre 2,8 y
380 mg/100 ml. El contenido de cido ctrico en estas muestras est comprendido entre
116,1 y 477 ,0 mg/100 ml. El cido ascrbico ha podido ser determinado en tres nctares, oscilando sus valores entre 0,1 y 2,2 mg/100 ml.
En el anlisis de las 15 muestras de bebidas refrescantes, se ha encontrado cido
tartrico en dos de ellas (10,6 y 1,8 mg/100 ml). El cido mlico ha dado resultados
positivos en seis de ellas con valores comprendidos entre 16,9 y 659,7 mg/100 ml. El
cido ctrico se ha encontrado en todas las muestras de bebidas refrescantes, oscilando
entre 34,0 y 958,1 mg/100 ml, lo cual corrobora la leyenda de su etiqueta, en la que
se indica la presencia de acidulantes. De igual manera, en siete muestras en las que se
encontr cido ascrbico entre 1,5 y 19,5 mg/100 ml, apareca indicado en su etiqueta
de composicin.
En el anlisis de conservadores, nueve muestras presentan cido benzoico entre 4,0
y 35,1 mg/100 ml, mientras que en tres muestras se han encontrado cido srbico y
benzoico conjuntamente, siendo los niveles encontrados para el cido benzoico entre
24,1 y 26,1, y para el cido srbico entre 3,3 y 17,7 mg/100 ml.

CONCLUSIONES
-

Se sugiere un procedimiento de HPLC que permite el anlisis de cidos naturales

y /o incorporados como acidulantes (tartrico, mlico y ctrico), cido ascrbico natural o incorporado como antioxidante y de conservadores autorizados en este tipo
de muestras (cidos benzoico y srbico).

APLICACIN DE LA CROMATOGRAFA LQUIDA DE ALTA RESOLUCIN .

Fig. 1

Fig. 2

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Fig. 3

r...
( 1

1',

1.()'

'..

..,...

'.

r1..1)

r-...
r,
( ~;; :1

~!

Fig. 1.-Cromatograma de una solucin patrn de cido tartrico, mlico y ctrico (200 mg /
100 mi de Cl Na al 5% de cada uno de ellos). 1. pico = Acido tartrico; 2. pico = cido
mlico; 3. pico = Acido ctrico; Longitud de onda = 214 nm.; Atenuacin = 128; Velocidad del papel = 0,25 cm/min.
Fig. 2.-Cromatograma de una solucin patrn de cido ascrbico de 10,0 mg/ 100 ml. Longitud de onda = 254 nm.; Atenuacin= 128; Velocidad del papel= 0,25 cm/min.
Fig. 3.-Cromatograma de una solucin patrn de cido benzoico y cido srbico (3,0 mg /
roo mi de cada uno de ellos). Longitud de onda = 230 nm.; 1. pico = Acido benzoico ; 2.
pico = Acido srbico ; Atenuacin = 128; Velocidad del papel = 0,25 cm/min .

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M.'

J.

LPEZ HERNNDEZ,

J.

SIMAL LOZANO y M.' A. ROMERO RODRGUEZ

Tabla 11
Determinacin de cidos orgnicos en muestras de zumos, nctares y bebidas
refrescantes
Tipo
de muestra

Zumo
Zumo
Zumo
Zumo
Zumo
Zumo
Zumo
Zumo
Zumo

melocotn
meloc. y uva.
manzana 1 .. .
manzana 2 .. .
naranja 1
naranja 2
naranja 3
pia 1
pia 2 ...

Nctar
Nctar
Nctar
Nctar
Nctar
Nctar
Nctar

melocotn ..
albaric. 1
albaric. 2 .. .
naranja 1 .. .
naranja 2 .. .
naranja 3 .. .
pia .. . .. . .. .

B. R.* cola ........ .

B. R. naranja 1 ..... .
B. R. naranja 2 ..... .
B. R. naranja 3 .. . .. .
B. R. naranja 4 .. .
B. R. naranja S .. .
B.R. limon 1
B. R. limn 2
B. R. limn 3
B. R. limn 4
B. R. manzana 1 . .. .
B. R. manzana 2 ... .
B. R. tnica 1 .. .
B. R. tnica 2 .. .
B . R. pia . ..... .

. tartrico . mlico
. ctrico . ascrbico . benzico . srbico
mg/ 100 ml mg/ 100 ml mg/ 100 ml mg/ 100 ml mg/ 100 ml mg/ 100 ml

79,3
79,2
23,9

65,3
66,8
6,0

10,6
1,8

178,8
79,8
450,0
757,1
109,0
38,1
150,1
308,7
207,0

139,5
220,0
29,0
73,5
695,0
525,0
1.182
438,9
600,6

101,2
51,7
379,8
32,1
2,8
10,6
12,9

119,3
151,5
185,1
395,7
274,5
477,0
116,1

16,9
49,8

51,7

659,7
170,9

18,4

34,0
389,6
331,9
511,0
680,4
412,6
330,2
950,0
633,2
155,5
958,1
189,0
417,5
214,3
536,8

0,5
46,3

19,6
2,8
7,2

2,2
0,1

1,8

1,5
4,4
5,7

4,0
24,1
26,1
35,0
20,7

3,3

19,5
1,7
15,2
2,3

35,1
24,4
9,1
30,4
25,5

14,8

26,1

17,7

B. R. = Bebida refrescante.

Se justifica la utilizacin de diferentes longitudes de onda para efectuar .la carac~

terizacin de cada uno de estos compuestos, ya que a 214 nm los cidos mayoritarios
presentan una alta absorbancia a las concentraciones encontradas en las muestras.
Debido a la neutralizacin previa con NaOH el cido ascrbico se degrada rpidamente, y los cidos srbico y benzoico presentan una absorbancia baja,
A 254 nm el cido ascrbico presenta en solucin acuosa una alta absorcin que
permite su identificacin y cuantificacin.

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-

Para los conservadores (srbico y benzoico) se ha empleado la longirud de onda

recogida por los Mtodos Oficiales de Anlisis de Zumos de frutas y derivados
(1988), 230 nm.
La recuperacin encontrada en el anlisis de los cidos mayoritarios (tartrico, mlico y ctrico), tras pasar la muestra neutralizada por la resina Dowex 1 oscila entre
89,6 y 98,6 %.
Finalmente, del anlisis de las muestras efectuado es de destacar la ausencia de
cido tartrico en la muestra de zumo de melocotn y uva, siendo los restantes resultados obtenidos previsibles segn la composicin de las muestras y los aditivos
indicados en su composicin.

BIBLIOGRAFIA
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of sorne carboxilic acids in food and beberages as their p-nitrobencyl esters. Journal of Chromatography, 360, 119-136.
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FRAYNE, R. F. (1986): Direc analysis of the major organic components in grape must and wine
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GorFFON, J. P.; BLANCHERRE, A. y REMINIAC, C. (1985): Dosage des acides organiques du
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YASEK, E. ( 1985): HPLC. Analysis of Wine and Other Beverages . ETS laboratory, California, USA.

Recibido el 1 de agosto de 1988.

Aceptado el 12 de diciembre de 1988.

Anal. Bromatol. XLI-1 ( 1989), 65-71