Rev Med Exp 2000; 17 (1-4)

ESTUDIO DE VALIDACIN DE LA METODOLOGA PARA LA DETERMINACIN DE VITAMINA A EN ALIMENTOS INFANTILES INSTANTNEOS

POR CROMATOGRAFA LQUIDA DE ALTO RENDIMIENTO (HPLC)
Ruth Prez Caldern.
*

Divisin de Qumica, Centro Nacional de Alimentacin y Nutricin, Instituto Nacional de Salud.

RESUMEN
Con la finalidad de controlar la calidad de alimentos infantiles instantneos se efectu la validacin de la metodologa
para la determinacin de la vitamina A por cromatografa lquida de alto rendimiento (HPLC). Para la precisin del
sistema se evaluaron tres parmetros: tiempo de retencin, rea y altura, hallndose una desviacin estndar relativa
(RSD) mxima de 1,78%. En la linealidad se obtuvo un coeficiente de correlacin r=0,99 y una precisin con un RSD de
2,70%. La exactitud del mtodo se evalu en trminos de recuperacin mediante la adicin de vitamina A al alimento
obtenindose un porcentaje de recuperacin de 97,98%; y para la sensibilidad del mtodo se obtuvo un lmite de
deteccin (LOD) de 0,06 mg/g y un lmite de cuantificacin (LOQ) de 0,58 mg/g. Con los resultados obtenidos se
demuestra que el mtodo en estudio es preciso, exacto, lineal y altamente sensible para ser utilizado en el control de
calidad de alimentos infantiles instantneos para la determinacin de vitamina A.
Palabras claves: Vitamina A; Cromatografa lquida; Alimentos infantiles (fuente: BIREME).

ABSTRACT
Validation of the methodology used to determine Vitamin A through High Performance Liquid Cromatography (HPLC)
was performed to assess instant food for children.Three parameters were assessed in order to determine the systems
accuracy: retention time, area and height and a maximum variation (RSD) of 1.78% was found. A correlative coefficient of
r=0.99 was obtained for the lineal parameter, and an accuracy with 2.70% for RSD. The accuracy of the method was
evaluated in terms of recovery through the addition of Vitamin A to the food, the recovery percentage obtained was
97.98%, and for the sensitivity a limit of detection (LOD) 0,06ug/g was obtained, as well as a limit of quantification (LOQ)
0,58%. The findings demonstrate that the method assessed is accurate, exact, lineal and highly sensitive to be used in
quality control of instant food for children for the determination of Vitamin A.
Key Words: Vitamin A; Liquid cromatography; Infant food (source: BIREME).

INTRODUCCION
Vitamina A es el nombre genrico utilizado para
describir al retinol, sus steres y los correspondientes
ismeros. Slo est presente, como tal, en los alimentos
de origen animal, aunque en los vegetales se encuentra
como provitamina A en forma de carotenos.
Los diferentes carotenos se transforman en vitamina A
en el cuerpo humano, se almacenan en el hgado en
grandes cantidades y tambin en el tejido graso de la
piel (palmas de las manos y pies, principalmente), por lo
que podemos subsistir largos perodos sin su aporte1.
Correspondencia: Ruth Prez Caldern. Centro Nacional de Alimentacin
y Nutricin. Tizn y Bueno 276, Lima 11, Per. Telf.: (0511) 4639588 Fax:
(0511) 4639617.
Email: r_whittembury@yahoo.es

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La principal funcin de la vitamina A es la proteccin de la

piel y su intervencin en el proceso de visin de la retina.
Tambin participa en la elaboracin de enzimas en el
hgado y de hormonas sexuales y suprarrenales. El dficit
de vitamina A produce ceguera nocturna, sequedad en
los ojos (membrana conjuntiva) y en la piel, y afecciones
diversas de las mucosas. En cambio, el exceso de esta
vitamina produce trastornos como alteraciones seas, e
incluso inflamaciones y hemorragias en diversos tejidos.
La vitamina A se encuentra principalmente en productos
animales tales como leche, crema, mantequilla, queso,
huevos, carne, hgado, rin y aceite de hgado de bacalao.
Por lo general, se encuentra como steres de cidos
grasos de cadena larga pero tambin se encuentra como
retinol. Se destruye muy fcilmente con la luz, con la

Determinacin de vitamina A por HPLC

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temperatura elevada y con los utensilios de cocina de

hierro o cobre2.
Los alimentos infantiles instantneos, en su gran mayora,
son fortificados normalmente utilizando formulaciones
especiales que mejoran su estabilidad y valor nutritivo,
siendo la ingesta diaria recomendada (RDA) de 400 700 mg de vitamina A, para nios de 1-10 aos de edad3.
En el Per, los programas de complementacin
alimentaria distribuyen alimentos instantneos a la
poblacin con alto riesgo de desnutricin; en ese sentido,
el desarrollo de tecnologas adecuadas para la
evaluacin de micronutrientes como la vitamina A, son
necesarias para el control de calidad de los productos
designados a los beneficiarios de estos programas.
El anlisis de las vitaminas en los alimentos es un gran
desafo para los analistas dado que se asocia con
problemas significativos. Muchos de estos problemas
han sido eliminados gracias a los recientes avances en
la tecnologa y el desarrollo de nuevos enfoques
analticos. A pesar de ello, no es una tarea fcil analizar
vitaminas y se necesita experiencia y los conocimientos
adecuados para producir resultados reproducibles, que
sean exactos y vlidos.
El primer mtodo vlido para la determinacin de
Vitamina A fue un bioensayo4; luego, se establecieron los
mtodo espectrofotomtrico y fotomtrico5, sin embargo,
ambos mtodos estn expuestos a interferencias, desde
algunas sustancias como carotenos, derivados y
productos de descomposicin de la vitamina A que
podran absorber luz en la misma regin ultravioleta o
dar colores similares con los reactivos utilizados en la
determinacin fotomtrica. Es as, que estos mtodos
no son lo suficientemente especficos para determinar
esta vitamina, adems que la confiabilidad de sus
resultados depende del xito en los pasos de purificacin
y los procedimientos de trabajo.
Como vemos, el problema realmente no son los mtodos
de determinacin, sino ms bien los procedimientos de
extraccin, ya que debido a su inestabilidad, algunos
autores prefieren extraer separadamente cada vitamina
liposoluble 6.
En ese sentido, y buscando una ptima metodologa de
anlisis, en el presente estudio se realiz la validacin
de la metodologa por HPLC para la determinacin de
vitamina A contenida en alimentos infantiles instantneos.

MATERIALES Y METODOS
EQUIPOS
Se utiliz un equipo de cromatografa lquida de alto
rendimiento (HPLC), marca Shimadzu, modelo LC10A,
con inyector automtico, bomba con sistema de degasificacin,
con integrador o sistema de registro, software para el
procesado de datos cromatogrficos, detector de arreglo
de diodos (longitud de onda variable). La columna
cromatogrfica fue de acero inoxidable LC-18 para fase

reversa, de 25 cm x 4,6 mm de dimetro interno, 5mm de

dimetro de partcula, y guarda columna con cartucho
C18, Supelco. Las condiciones tpicas de operacin fueron: sistema isocrtico, flujo 1,2 mL/min, volumen de inyeccin 20 ml, deteccin UV 242 nm, temperatura de horno, ambiente, y tiempo de corrida 7 min. La fase mvil fue
metanol al 100% grado HPLC.

REACTIVOS
Metanol grado HPLC( Merk), estndar all-trans Retinol:
Vitamina A (Sigma), hexano p.a. (Merck), etanol absoluto
p.a. (Merk), solucin de hidrxido de potasio al 50%, BHT
Acido Ascrbico (antioxidantes), y agua tridestilada o
grado HPLC. Solucin stock estndar de vitamina A: Se
disolvieron 100 mg del estndar en 100 mL de etanol
absoluto, con aproximadamente 0,002 g de BHT, y se
guard la solucin en congelacin (-20C), se verific la
pureza del estndar mediante la medicin de su espectro de absorcin (la vitamina A y los correspondientes
steres muestran un espectro de absorcin caracterstico, donde la posicin del pico mximo depende del solvente): en etanol, el retinol a 325 nm, tiene un coeficiente
de extincin (E 1% - 1cm.) de 1843).

PROCEDIMIENTO
Se pesaron 20 g de la muestra de alimento infantil
(papilla) en un baln de base plana, se coloc un magneto y se adicion 70 mL de etanol absoluto. Se colocaron los tubos de reflujo y se agit la mezcla hasta su
ebullicin con corriente de nitrgeno. Luego, se adicion
20 mL de solucin de KOH al 50% y se saponific la
mezcla por 30 minutos con agitacin moderada. Antes
de finalizar esta etapa se enjuag el contenido con 50 mL
de agua en 3 porciones. La solucin se enfri a temperatura ambiente y luego se filtr al vaco. Se coloc inmediatamente el contenido en una pera de separacin de
250 mL y se adicion 50 mL de hexano p.a. para proceder a la extraccin. Se agit la mezcla por 20 segundos y
al separarse las fases se coloc la capa superior (fase
orgnica) en un baln de 250 mL de base redonda que
contena aproximadamente 0,5 g de BHT cido
ascrbico. Se efectu dos veces ms la extraccin y se
juntaron los extractos en el baln de 250 mL. Se evapor
a sequedad el solvente, haciendo uso de un rotavapor
con bao de agua a 40C, se diluy inmediatamente con
metanol grado HPLC el residuo, y se llev a volumen en
un matraz volumtrico de 10 mL. Finalmente, se pas la solucin final por un filtro de 0,2 mm, llenndolos en viales mbar de 2 mL para colocarlos en el inyector del cromatgrafo.

CLCULOS
Concentracin de Vitamina A (mg/g ppm ) =

Am x Cs x D
As
Wm

Donde: Am (Area del pico de vitamina A en la muestra), As

(Area del pico de vitamina A en el estndar), Cs (Concentracin de vitamina A en el estndar, mg/ml), D (Factor de
dilucin), Wm (Peso de la muestra, g).

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DISEO EXPERIMENTAL
Se analizaron muestras de papilla realizndose los
ensayos en las muestras previamente homogenizadas
con 2 analistas en 2 das diferentes para cuantificar la
vitamina A expresada en mg/g. Cada analista realiz 08
ensayos por da, bajo condiciones de repetibilidad y
reproducibilidad. La temperatura en el rea de cromatografa
lquida fue 23C + 2C. La precisin del mtodo analtico
se estudi sobre el sistema, evaluando la dispersin de
4 inyecciones por cada uno de los 5 niveles de concentracin de la solucin estndar de vitamina A; y sobre el
mtodo, evaluando la dispersin de la preparacin de la
muestra. La evaluacin correspondi a todo el procedimiento, desde la preparacin de la muestra hasta la medicin del analito por parte del instrumento.
La exactitud del mtodo se evalu en trminos de recuperacin. El analito se adicion a la matriz, disuelto en el
mismo solvente usado para la extraccin, y se dej en
contacto con sta por muchas horas antes de la extraccin, para permitir su interaccin. Para tal efecto, se trabaj con 3 niveles de concentracin diferentes adicionados a la muestra. Las concentraciones de trabajo adicionadas fueron las siguientes: Nivel 1 = 3 ppm; Nivel 2 = 5
ppm; Nivel 3 = 7 ppm. Se tomaron 0,76 mL, 1,27 mL y
1,78 mL de una solucin estndar de 100 ppm de vitamina A y se adicionaron a 6 muestras de papilla por nivel.
Se dej en contacto la solucin estndar con las muestras durante toda la noche bajo refrigeracin y, al da siguiente, se realiz el tratamiento y se hicieron las lecturas de los resultados de las 18 muestras.

Prez R.

CV de reproducibilidad fue 2,70 % vs el obtenido por el

mtodo oficial (de 9,72%).
Los resultados de la precisin del sistema, basados en
la variacin del tiempo de retencin, rea y altura; se muestran en la Tabla 1. La recuperacin obtenida fue de 97,98%
vs. la obtenida por el mtodo oficial de la AOAC (de 98,8%).

Figura 1. Cromatogramas de la curva de calibracin correspondientes a

5ppm y 15ppm de vitamina A.

La especificidad del mtodo se represent mediante los

espectros y el reporte de su correspondiente pureza con
las muestras empleadas para la evaluacin de la precisin y con la solucin estndar. La evaluacin de la especificidad del sistema se realiz mediante el software
del equipo, trabajndose con la solucin estndar y la
evaluacin. La determinacin de los lmites de deteccin
y cuantificacin se evalu sobre las muestras empleadas para la prueba de precisin. Estos parmetros tambin fueron determinados por el software del equipo6.

RESULTADOS
En la Figura 1 se muestran los cromatogramas representativos de dos concentraciones (mayor y menor)
de vitamina A para la curva de calibracin. El tiempo de
retencin de la vitamina A fue 3,91 0,5 min, siendo el
tiempo total de anlisis para una muestra de 7 min. La
respuesta de deteccin fue lineal en el rango de concentraciones de 5 15 mg/g (Figura 2), obtenindose un
coeficiente de correlacin r=0,99. El lmite de deteccin
del mtodo en base a la seal / ruido (S/N) fue de 0,06 mg/g
y el lmite de cuantificacin de 0,58 mg/g. El perfil de la
precisin que se obtuvo en 16 determinaciones por
analista en dos das diferentes, fue: CV de repetibilidad
de 3,09% para el analista A, y 2,25% para el analista B vs.
en tanto, el mtodo oficial de la AOAC (CV de 3,62%); el
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Figura 2. Curva de calibracin de Vitamina A.

Tabla 1. Precisin del Sistema

%RSD , terico

%RSD, experimental
5 ppm

Tr < 10%
A < 3%
H > 3%

A 0,43
H 1,78
Tr 0,12

Tr: tiempo de retencin.

A: rea.
H: altura.

7 ppm
0,62
1,045
0,061

9 ppm
0,44
0,64
0,061

12 ppm
0,47
0,89
0,032

15 ppm
0,32
0,66
0,064

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La especificidad del mtodo se muestra en la Figura

3, donde se observa la ausencia de interferencias debido a la adecuada extraccin del analito, y adems se
muestra la comparacin del espectro del estndar puro
vs el espectro del analito en la muestra.

Determinacin de vitamina A por HPLC

La muestra y el extracto de la muestra deben protegerse

de la luz y la oxidacin, evitndose la luz solar directa y la
luz brillante. La iluminacin artificial es mejor proporcionada por tubos fluorescentes dorados equivalentes.
En ciertos casos, las diferentes etapas en el procedimiento deberan realizarse en material de vidrio mbar
para prevenir la degradacin.
Dado que el calor tambin contribuye a la isomerizacin o
a una posterior alteracin de las vitaminas, debera evitarse el calor innecesario. Por lo tanto, debe tenerse cuidado que, por ejemplo, la evaporacin de los solventes
se realice lo ms suave posible utilizando un evaporador
rotatorio, con un buen control de la temperatura, un enfriamiento adecuado de los condensadores y un vaco ptimo.
Adems, se debe hacer un control espectrofotomtrico
de la pureza del estndar.

Figura 3. Cromatograma de muestra con espectro del analito.

De acuerdo a los resultados obtenidos, podemos concluir que el Mtodo de ensayo CENAN-DQ.ME.16: Mtodo
para la Determinacin de Vitamina A (retinol) en alimentos infantiles instantneos por HPLC es preciso, exacto,
especfico y sensible para los parmetros evaluados en
este estudio, ya que se encuentran dentro de los rangos
establecidos.

DISCUSION
Varias tcnicas han sido propuestas para la medicin de la vitamina A en alimentos infantiles frmulas
infantiles. Cada una de ellas tiene sus ventajas y limitaciones, pero, comparado con otros mtodos por HPLC,
nuestra metodologa propuesta tiene la ventaja de que el
tratamiento de la muestra se realiza en menos tiempo,
en relacin al mtodo oficial de la AOAC 992.06 Vitamina
A (Retinol) in Milk-Based Infant Formula. Adems, la columna que se utiliza en el mtodo propuesto (C18) es
ms comercial que la columna del mtodo de la AOAC
(ciano), ya que esta ltima trabaja en fase normal siendo,
por tanto, ms difcil de controlar y por la naturaleza no
polar del extracto, se debe usar cromatografa en fase
reversa. El tiempo de corrida por muestra es tambin
ms corto en nuestra metodologa (7 minutos), comparado con el mtodo oficial que es de 10 minutos. Estas
caractersticas contribuyen al menor costo del anlisis.
Es necesario tener presente que tanto la saponificacin,
la isomerizacin y la ruptura de la vitamina A son retardados por la adicin del antioxidante (cido ascrbico) y el
uso de nitrgeno, el cual interfiere con los agentes de
oxidacin presentes. Asimismo, el retinol y sus steres
son rpidamente destruidos por la luz, el oxgeno y los
cidos, por lo que deben almacenarse en frascos mbar
o cubiertos con papel platino o su equivalente.

REFERENCIAS
1.

Curso de Alimentacin y Salud. 1998 Octubre 07; pg.

1. URL disponible en: http://laisla.com/uned/guianutr/
compdt1.htm

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Morn C, Zacaras Y. Produccin y manejo de datos de

composicin qumica de alimentos en nutricin. Universidad
de Chile. Instituto de Nutricin y Tcnica de los Alimentos
(INTA). Santiago de Chile; 1999.

3.

Curso de Alimentacin y Salud. Recomendaciones RDA

1996 sobre vitaminas. URL disponible en: http://laisla.com/
uned/guianutr/tablvita

4.

Jebrell WH, Harris RS. The vitamins. Vol. 1. 2nd ed. New
York: Academic Press; 1967.

5.

Freed M. Methods of vitamin assay. 3ra ed. The Association of vitamins Chemists. New York: Interscience Publishers; 1966.

6.

Rougereau A, Person O, Rougereau G. Determination of

vitamins. In: ROCHE. Analysis of food constituents. Chapter 9.
1987.

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