CAPITULO 5 rauuRa SL istructura de un pentapéptido. wus péptidos se designan comenzando por | resto N-terminal. Los enlaces peptidicos e hallan sombreados en color. Extremo N-terminal Ho- ‘\ " 2 oH Chy—CH chy ‘coo- Extremo C-terminal Serilgliciltirosilalanilleucina (Ger-Gly-Tyr-AlaLeu) Proteinas: esqueleto covalente y secuencia aminoacida Examinaremos en este capitulo diversos aspectos de la estruc- tura primaria de las proteinas, que hemos definido (pag. 62) como estructura del esqueleto covalente de las cadenas poli- peptidicas, incluida la secuencia de restos aminoacidos. Co- menzaremos considerando las propiedades de los péptidos simples. Examinaremos después tres problemas principales: 1) la determinacién de la secuencia aminodcida en las cadenas polipeptidicas; 2) el significado de las variaciones en las se- cuencias aminoacidas de las diferentes proteinas en las diver- sas especies y 3) la sintesis en el Laboratorio de cadenas polipeptidicas. Emplearemos los diferentes términos y concep- tos ya definidos en el capitulo 3, a los que puede remitirse como orientac Estructura de los péptidos Los péptidos sencillos que contienen dos, tres, cuatro o mas restos aminodcidos es decir, los dipéptidos, tripéptidos, tetra- péptidos, etc., que se hallan unidos covalentemente, proceden de la hidrélisis parcial de cadenas polipeptidicas de las pro- teinas mucho mas largas, Centenares de diferentes péptidos se han aislado de tales hidrolizados o han sido sintetizados (pag. 119). Los péptidos se forman también en el tracto gas- trointestinal durante la digestién de las proteinas por las proteasas, enzimas que hidrolizan los enlaces peptidicos. Los péptidos se designan a partir de sus restos aminoacidos com- ponentes en la secuencia que comienza con el resto amino- terminal (abreviadamente N-terminal) (fig. 5-1). Una amplia evidencia experimental apoya la conclusion de que el enlace peptidico es el tinico enlace covalente existente entre los aminoacidos que constituyen el esqueleto de la es- tructura lineal de las proteinas. La evidencia procede no sola- mente de los estudios de degradacién quimica y enzimatica, sino también de diversas medidas de caracter fisico. Por ejemplo, las proteinas muestran bandas de absorcién en la regién del ultravioleta lejano (180 a 220 nm) y en la region del infrarrojo, que son semejantes a las que producen los péptidos auténticos. Ademas, los anélisis por difraccién de rayos X (cap. 6) muestran directamente la presencia de en- laces peptidicos en las proteinas nativas. Solamente existe otro 7PARTE 1 COMPONENTES MOLECULARES DE LAS CELULAS tipo de enlace covalente entre los aminodcidos; es el enlace disulfuro de la cistina (pag. 88), que actéia en algunas pro- teinas como enlace transversal entre dos cadenas polipeptidi- cas separadas (enlace disulfuro intercadenas) o entre curva- turas de una misma cadena (enlaces disulfuro intracadena). Los péptidos pueden considerarse como amidas sustituidas. A semejanza del grupo amida, el enlace peptidico muestra un elevado grado de estabilizacién por resonancia. El enlace simple C-N del enlace peptidico posee alrededor del 40 por ciento de caracter de enlace doble y el enlace doble C=O posee cerca del 40 por ciento de caracter de enlace simple. Este hecho determina dos consecuencias importantes: 1) El grupo imino (~NH—) del enlace peptidico no posee ten- dencia significativa a ionizarse o a captar protones en el intervalo de pH entre 0 y 14. 2) El enlace C—N del enlace peptidico (fig. 5-1) es relativamente rigido y no puede girar libremente, propiedad que es de suprema importancia con respecto a la conformaci6n tridimensional de las cadenas poli- peptidicas, como se vera en el capitulo 6. Péptidos de origen no proteinico Ademés del gran néimero de diferentes péptidos cortos, iden- tificados como productos de la hidrélisis parcial de las pro- teinas, se han encontrado en la materia viva, otros muchos no derivados de las proteinas (fig. 5-2). Tales péptidos no proteicos difieren habitualmente en estructura de los deriva- dos de las proteinas. Por ejemplo, el tripéptido glutatién ha- Ilado en todas las células de los animales superiores, contiene un resto de acido glutamico unido mediante un enlace pep- tidico poco frecuente en el que interviene su grupo y-carboxilo en lugar del grupo a-carboxilo. La carnosina dipéptido del misculo, contiene un B-aminoacido, Algunos péptidos no pro- teicos contienen D-aminodcidos, como el antibiético tirocidi- na A (fig. 5-2). En las proteinas no aparecen B-aminodcidos, ni enlaces y-peptidicos ni D-aminodcidos; es probable que estas variaciones de estructura protejan a estos péptidos especia- lizados de la accién de las proteasas, las cuales son general- mente especificas para los péptidos que poseen L-aminoacidos unidos por enlace peptidico normal. Entre los péptidos no proteicos se encuentran algunos que poseen actividad hormo- nal, por ejemplo, el factor regulador hipotalamico, para la liberacién de la hormona tirotrépica de la glandula pituitaria anterior; las hormonas de la pituitaria posterior, la oxitocina y la vasopresina, y el nonapéptido bradiguinina del plasma sanguineo, el cual participa en la regulacion de la presién de la sangre (véase pag. 820). Muchos antibisticos son péptidos © derivados de péptidos, incluyéndose entre ellos la gramici- dina y el decapéptido ciclico valinomicina, Propiedades Acido-base de los péptidos Los péptidos poseen habitualmente puntos de fusion eleva- dos, lo cual indica que cristalizan de las disoluciones neutras en forma de reticulo iénico como iones dipolares igual que los aminoacidos (pag. 80). Dado que ninguno de los grupos a-car- boxilo ni de los grupos «-amino, que estan combinados cons- tituyendo enlaces peptidicos, pueden ionizarse en el intervalo 98roura 5-2 Igunos péptidos biolégicos de origen no roteinico, Tales péptidos contienen, ‘ecuentemente, aminodcides distintos de ws hallados en las proteinas. Las flechas, 1 los casos que se emplean, muestran 1 polaridad o la direccién de los enlaces eptidicos: estén orientadas desde ef xtremo N-terminal hacia el extremo terminal de la cadena. COOH HANGH,CH,G-— NHCHGH,C === GH HN. UN Noo H Camosina (@-alanilhistidina) COOH Coon Glutation (y-glutamilcisteinilglicina) LOm—t-Len wyal DPho I 4 “tye Le ro i 16a LPhe LAsn—p-Phe Tirocidina A [Orn es el simbolo de la Ornitina (pag. 79)] Capitulo 5 Proteinas: esqueleto covalente y secuencia aminodcida er ; ro 4 Phe | Arg Bradiquinina pe Cys 4 | 5 ] yt yt { \ le S Phe $ 1 ; oy i Gin $s Gn s 7 t Asn Asn &ys— b { 7 Pro i | jou Arg ély—NH, conn Oxttocina Vasopresina bovina bovina o Ht VN, Noe | Resto de acide Hi; boda Ppiroglutémico nN c=0] LN, HNC He “pa Resto de ~ _ ca histidina | HO—CH—C—NH =c. \ cl Resto de 4 rolinamida / i mrtanit Joo“, Na Factor liberador tirotrépico de pH comprendido entre 0 y 14, el comportamiento acido- base de los péptidos viene determinado por el grupo a-amino libre del resto N-terminal, por el grupo a-carboxilo libre del resto carboxi-terminal (abreviadamente C-terminal) y por los grupos R de los restos situados en posiciones intermedias que pueden ionizarse (pag. 81). En las cadenas polipeptidicas largas, los grupos R que se ionizan sobrepasan en gran ni- mero a los grupos ionizables de los restos terminales. Puesto que los grupos libres e-amino y a-carboxilo, se hallan mucho més separados entre si en los péptidos que en los simples aminodcidos, las acciones electrostaticas e inductivas entre ellos decrecen; por tanto, los valores de pK’ de los grupos a-carboxilo terminales son algo mayores, y los de los grupos amino algo menores, que en los a-aminodcidos libres (ta- bla 5-1). Los valores de pK’ de los grupos R en los péptidos cilPARTE | COMPONENTES MOLECULARES DE LAS CELULAS ‘Tasta 5-1, Valores de pk’ de algunos aminodcidos y péptidos (25°C). pk’, pK’, PR's @COOH a NEY grupo R pH Gly 234 96 - 597 Gly-Gly 3,06 813 - 5.59 Giy-Gly-Gly 326 791 - 5.58 Ala 234 9469 = 602 Ala-Ala-Ala-Ala 342 794 ~ 5.68 Ala-Ala-Lys-Ala 3.58 801 10,58 ~93 Gly-Asp 2.81 8,60 445 ~36 cortos, se aproximan mucho a los que exhiben los correspon- dientes a-aminoacidos libres. Las curvas de valoracién acido-base de los péptidos cortos son muy semejantes a las de los a-aminodcidos libres. Las especies iénicas predominantes en las diferentes etapas de las curvas de valoracién son comparables a las de los aminoacidos libres (fig. 5-3). Los péptidos poseen también un pH isoeléc- trico que puede calcularse a partir de sus valores de pK’ (tabla 5-1). Propiedades épticas de los péptidos Si Ja hidrélisis parcial de una proteina se realiza en condi- ciones lo suficientemente suaves, de modo que no se produzca racemizacién del atomo de carbono a asimétrico, los péptidos formados son 6pticamente activos, ya que sélo contienen restos L-aminoacidos. En los péptidos relativamente cortos, la acti- vidad éptica total observada es una funcién aditiva aproxi- mada de las actividades épticas de los restos aminoacidos componentes. Sin embargo, la actividad éptica de las cadenas polipeptidicas largas de las proteinas en su conformacién na- tiva (pg. 133) es mucho menor que aditiva, lo que constituye un factor de gran significacién con respecto a la estructura secundaria y terciaria de las proteinas, como veremos en el capitulo 6. Propiedades quimicas de los péptidos Los grupos amino N-terminales de los péptidos experimentan idénticas clases de reacciones quimicas que los grupos e-amino de los aminoacidos libres, tales como la acilacién y la carba- milacién (pg. 87). El resto aminoacido N-terminal de los péptidos reacciona también cuantitativamente con la ninhidri- na (pag. 87) para formar derivados coloreados; esta reaccién se emplea profusamente para la identificacién y determinacion cuantitativa de los péptidos mediante los procedimientos elec- troforéticos y cromatograficos. De modo similar, el grupo carboxilo C-terminal de un péptido puede ser esterificado 0 reducido. Ademas los diversos grupos R de los diferentes restos aminoacidos encontrados en péptidos dan usualmente las mis- mas reacciones caracteristicas que las de aminodcidos libres. Una reaccién coloreada, muy empleada, que dan los péptidos y las proteinas, y que no producen los aminodcidos libres, es la reaccién del biuret. El tratamiento de un péptido o de una proteina con Cu’ y Alcali produce un complejo purptreo del Cu*-péptido, que puede medirse cuantitativamente en un es- pectrofotémetro. 100 Fioura 5-3 Especies iénicas principales de la alanilglicina. my H.N—CH—G—NH—CH.COOH 0 A pH~ 10, especie cationica fe HA—CH—F-—NH—CH,COO A pH ~ 60, especie isoeléctrica oe ee ane A pH ~ 11, especie aniénicaFicura 5-4 Alquilacién de S de un péptido que contiene un resto de cisteina. ye Race c° HN HS—cH,— L ‘Tripéptido | ue contiene a elsteina a Rog COOH + Acido ICH,COOH jodoacético hua R cm HN Derivado lt ‘S-carboximetilado Gtk —-S—CH,— GH del péptido boos dug que contiene f cisteina “ ROH coon Capitulo 5 Proteinas: esqueleto covalente y secuencia aminodcida Etapas de la determinacién de la secuencia aminoacida Con esta informacién sobre las propiedades de los péptidos sencillos como base, podemos examinar la estrategia general empleada para determinar la secuencia aminoacida de los pép- tides y de las proteinas, ideada por Frederick Sanger en 1953 para la determinacién de la secuencia aminoacida de las cade- nas polipeptidicas de la insulina, que marcé un hito, ya que fue la primera proteina de la que se Ilegé a conocer su estruc- tura covalente completa. Aunque cada proteina ofrece proble- mas especiales, se emplea generalmente la secuencia de etapas que se indica a continuacion: 1. Si la proteina contiene mas de una cadena polipeptidica, en primer lugar, se separan las cadenas individuales y se purifican, 2. Se reducen todos los grupos disulfuro, y los grupos sul- fhidrilo resultantes se alquilan. 3. Se somete una muestra de cada cadena polipeptidica a la hidrélisis total, y se determina su composicién en amino- acidos. 4, Sobre otra muestra de la cadena polipeptidica se identi- fican los restos N- y C- terminales. 5. La cadena polipeptidica intacta se escinde en una serie de péptidos menores mediante hidrolisis enzimatica o quimica, 6. Los fragmentos peptidicos resultantes de la etapa 5 se separan, y se determina su composicién en aminoacidos y su secuencia. 7. Se hidroliza parcialmente otra muestra de Ja cadena poli- peptidica original por un procedimiento distinto, que pro- vogue la ruptura de la cadena en puntos diferentes a aquéllos por los que tuvo lugar la hidrélisis parcial inicial Se separan los fragmentos peptidicos y se determinan su composicién en aminoacidos y su secuencia (tal como en las etapas 5 y 6). 8. Por comparacién de las secuencias aminodcidas de los dos conjuntos de fragmentos peptidicos, particularmente cuando los fragmentos de Ia primera hidrdlisis parcial se superponen sobre los puntos de ruptura de la segunda, se pueden situar los fragmentos peptidicos en el orden adecuado para proporcionar la secuencia aminodcida com- pleta. 9. Se determinan las posiciones de los enlaces disulfuro y de los grupos amida en la cadena polipeptidica original. Describiremos a continuacién los métodos empleados en la realizacién de las etapas individuales de la estrategia global. Raptura de los enlaces disulfuro y separacién de las cadenas polipeptidicas Antes de comenzar el analisis de la secuencia aminodacida de una proteina el investigador debe determinar si la pro- teina contiene una o varias cadenas polipeptidicas. El ntimero de cadenas se deduce habitualmente del nimero de restos aminoacidos N-terminales por molécula de proteina, por mé- todos que se describiran mas adelante (véase también pagi- na 104). Esta claro que el ntimero de cadenas de polipéptido sera igual al nimero de restos aminodcido N-terminales por 101PARTE | COMPONENTES MOLECULARES DE LAS CELULAS Ficura 5-5 Escisién oxidativa de los enlaces disulfuro transversales, por oxidacién con écido perférmico. eh tk Cadena 1 Poy TeroeT Cadena 1 ooh ow om OK Enlace 3 Ouidacion con, poe disulfuro--~| iio peracid a transversal} SOH HO OCH, H 4" CH, H Cadena 2 GN thn —G-N—CH-C“N— Cadena 2 0 ° 0 Restos de ‘Acido cisteico molécula de proteina. Si las cadenas polipeptidicas no poseen enlaces covalentes transversales, pueden separarse tratando Ja proteina con un acido, una base o con concentraciones ele- vadas de sales o de un agente desnaturalizante (pag. 153). Si las cadenas polipeptidicas se hallan unidas transversal- mente por enlaces covalentes mediante uno o varios enlaces disulfuro entre hemirrestos de cistina (pag. 89), estos enlaces transversales deben escindirse mediante reacciones quimicas apropiadas. El procedimiento més corriente consiste en redu- cir el enlace disulfuro a grupos sulfhidrilo, empleando un ex- ceso de mercaptoetanol (pag. 89). A continuacién se emplea un agente alquilante como el iodoacetato, para alquilar el gru- po sulfhidrilo de los restos de cisteina y formar los derivados ‘S-carboximetilados (fig. 5-4). Cuando la cadena polipeptidica es subsiguientemente hidrolizada, estos residuos aparecen como S-carboximetilcisteina, la cual se identifica con facilidad por los procedimientos cromatograficos empleados para el anali- sis de aminoacidos. La alquilacién de los restos de cisteina es conveniente, ya que el grupo sulfhidrilo de la cisteina es relativamente inestable, y tiende a experimentar oxidacion, Otros reactivos tales como la iodoacetamida y la etilenimina se emplean también para la alquilacién de los grupos sulfhi- drilo, Un método mas antiguo pero menos frecuente para la ruptura de los enlaces disulfuro transversales, desarrollado inicialmente por Sanger, es la oxidacién del grupo disulfuro para dar restos de dcido cisteico a partir de las hemi-cisteinas (fig. 5-5). Una vez que se han escindido los enlaces disulfuro intercadenas, se separan las cadenas polipeptidicas individua- les, generalmente por electroforesis (pag. 170). Aunque la proteina examinada contenga solamente una ca- dena polipeptidica, se deben romper, en caso de poseerlos, sus enlaces disulfuro intracatenarios y alquilar todos los restos de cisteina transformandolos en los derivados S-carboximetilados, mas estables. Hidrélisis completa de las cadenas polipeptidicas y determinacién de la composicién aminodcida Una vez que la cadena polipeptidica a examinar se ha obte- nido en forma homogénea, sin que quede ya ningun enlace transversal disulfuro 0 grupos sulfhidrilo libres, se somete a 102Capitulo 5 Proteinas: esqueleto covalente y secuencia aminocida hidrélisis completa y se determina su composicién en amino- Acidos. Los enlaces peptidicos se hidrolizan con facilidad por calefaccién, ya sea con un acido o con una base. La calefac- cién de los polipéptidos con exceso de acido clorhidrico 6 N, entre 100 y 120°C durante 10 a 24 h, normalmente en un tubo cerrado en el que se ha hecho el vacio, constituye el procedimiento mas frecuente de efectuar la hidrdélisis com- pleta, En estas condiciones apenas se produce la racemizacién de los aminoacidos. Sin embargo, no todos los aminoacidos pueden recuperarse cuantitativamente después de una hidréli- sis acida; el tript6fano generalmente, se destruye por este trata- miento, el cual provoca también la pérdida de alguna cantidad de serina y de treonina. Ademas, los grupos amida de la aspa- tagina y de la glutamina (pag. 76) experimentan hidrdlisis completa transformandose en Acidos, para rendir los acidos aspartico y glutamico respectivamente, y ademés iones amonio libres. Los polipéptidos pueden hidrolizarse también por ebullicién con disoluciones concentradas de hidréxido sédico, pero la hidrélisis alcalina provoca la destruccién de la cisteina, la Tasta 5-2, Composicién en aminodcidos de algunas proteinas representativas: niimero de restos por molécula, Las letras del cédigo de las proteinas son arbitrarias, No polares Ala Val Leu lle Pro Met Phe Tp Polares (sin carga) Gly Ser Thr Cys Tyr Asn Gin Cargado negativamente Asp Glu Cargados positivamente Lys Arg His A 12 6 nu 1 Porcentaje de no polares 35 Restos totales 129 Letras del cédigo de las proteinas (véase abajo para la clave) BoC bD E F G H «I J «kK i 9 ou 7 2% 4 3 9 7 39 9 2 17 «68 «619 2 Hk wo om 4 w@ 9s 6 2 06 2m 38 8 7 4 9 8 4 7 17 4 4 5 O08 2 0 2 80 2 9 4 Oe eee i 2 2 41 8 3 4 1 6 2 0 3 9 6 2 6 12 74 16 3 38 7 7 ie 0 ae a @ 5 8 22% 6% W 2 14 2 10 5 0 58 WwW 42 2 2 1 w Se ee ee 5 8 2 4 WwW 58 1 Ww 8 w O74 0 6 7s os 7 uu Zo. 0 3 a ee a OO OO fm fm fm 3 6 1 4 11 2 3 7 wm 4 5 1 2 0 3 2 MW 7 4 46 40 «36 «400 «430 83 3G 160 199 97 245 158 104 © 206-260 974124 ‘tocromo © equino naam B = B-lactoglobulina bovina D=erredoxina de espinacas proteina de la capsida del virus del mosaico del tabaco fibroina de la seda del Bombyx mori = anhidrasa carbénica humana J =alcohol deshidrogenasa equina ‘bonucleasa bovina 103PARTE 1 COMPONENTES MOLECULARES DE LAS CELULAS cistina, la serina y la treonina, y la racemizacién de todos los aminodcidos. La hidrélisis alcalina se utiliza normalmente, sélo para la valoracién, por separado del triptéfano, que es ines- table frente a los Acidos, pero estable en presencia de las bases. La composicién en aminodcidos de los hidrolizados de las proteinas y de los polipéptidos se determina por cromatogra- fia de intercambio iénico automatizada, mediante un analiza- dor de aminoacids (pag. 92). La primera proteina pura cuya composicién completa en aminoacidos pudo deducirse, fue la &-lactoglobulina de la leche. El anilisis, que requirié varios afios de trabajo mediante los métodos clasicos, se completé en 1947, En la actualidad, el analizador de aminoacidos deter- mina la composicién completa en aminoacids de un hidroli- zado de una proteina en el intervalo de 2 a 4h. Se precisan solamente muestras muy pequefias. En este punto resulta instructivo considerar la composicién en aminoacidos de proteinas puras representativas (tabla 5-2). A partir de éstos y otros datos disponibles pueden hacerse algunas generalizaciones: 1. No todas las proteinas contienen todos los 20 aminodcidos hallados normalmente en ellas. Por ejemplo, la ribonu- cleasa carece de triptéfano. En las proteinas fibrosas, tales como la fibroina de la seda y el colageno, faltan varios aminodcidos. 2. Algunos aminoacidos existen en las proteinas con mucha menor frecuencia que otros. Por ejemplo, en la mayor parte de las proteinas hay relativamente pocos restos de histidina, de triptéfano y de metionina, tal como se pone de manifiesto en las tablas 5-2 y 5-3. 3. En la mayor parte de las proteinas, el 30-40 por ciento de los restos son aminoacidos con grupos R no polares. Las proteinas de las membranas tienden a poser un con- tenido algo mas elevado. Cerca del 90 por ciento de los restos aminoacidos de la proteina fibrosa insoluble, elas- tina, son no polares. 4. En algunas proteinas, tales como la lisozima, el citocro- mo ¢, y las histonas, los grupos R cargados positivamente predominan (a pH 7,0); tales proteinas son basicas. En otras, los grupos R con carga negativa de los acidos glu- tamico 0 asp&rtico son los predominantes, como en la pepsina, que es muy acida. Identificaci6n del resto N-terminal de un péptido En el procedimiento para establecer Ja secuencia aminoacida, son muy importantes los métodos usados para identificar los restos aminoacidos terminales. El primer método itil para de- terminar el resto N-terminal de los polipéptidos fue descrito por Sanger, quien encontré que el grupo a-amino libre de los péptidos, que no han captado protones, reacciona con el 2,4-dinitrofluorobenceno (DNFB) y forma derivados 2,4-dini- trofenilados (fig. 5-6). Cuando tales derivados de un péptido, independientemente de su longitud, se someten a hidrdlisis con HCl 6 N,, todos los enlaces peptidicos se hidrolizan, pero el enlace entre el grupo 2,4-dinotrofenilo y el grupo a-amino del aminoacido N-terminal es relativamente estable frente a la hidrélisis acida. Por consiguiente, el hidrolizado del péptido 104 ‘Tapia 5-3. Frecuencia relativa de aparicién de aminodcidos en las proteinas de E. coli, basado en Ala = 100. Aminoécido Ala Glx Asx Leu Gly Lys Ser val Arg Thr Pro le Met Phe Tyr Cys Tp His Frecuencia relativa 100 33 76 60 60 54 46 46 a 35 35 34 29 25, 1” 4Capitulo 5 Proteinas: esqueleto covalente y secuencia aminodcida Ficura 5-6 Identificacién del resto aminoacido ‘Neterminal de un tetrapéptido, mediante a reaccién de Sanger. DNEB 2,4-Dinitrofenilaminoscido NO, NO, NO, ‘NO, 2 1 ‘NO, F NH ‘ Sono. j R,—CH NH, NH i I I COOH CH eau + bao =0 yi ny net 1 3m,0. a OH Root corny i on i HN Ro—CH not oon G=0 + Ni a Ren Ry—CH i = | ‘COOH boon COOH Tetrapéptido 2,4-Dinitrofenil- Aminodcidos libres tetrapéptido: Ficura 5-7 Identificacién del resto N-terminal de un tripéptido como dansil-derivado. Cloruro de dansilo Dansil-aminodcido Ch CH Nn7 CH, CHy Ch CHs Na ws 7 | A eo OO o-$30 | i xn Ni ie wo, RTH RG {dessa} doou g=0 + “ ea RCH | a cooH f + a iy RCH RH COOH COOH Tripéptido Dansil-tripéptido Aminoacidos libres 105PARTE 1 COMPONENTES MOLECULARES DE LAS CELULAS dinitrofenilado contiene todos los restos aminodcidos de la cadena peptidica en forma de aminoacidos libres, a excepcion del resto N-terminal, el cual aparece como derivado 2,4-dini- trofenilado, de color amarillo. Este resto marcado puede se- pararse facilmente de los aminoacidos no sustituidos e iden- tificarse por comparacién cromatografica con los derivados dinitrofenilados conocidos de los diferentes aminoacidos. El método de Sanger ha sido ampliamente sustituido por procedimientos mas sensibles y eficaces. Uno de ellos, emplea como reactivo marcador el cloruro de 1-dimetilaminonaftaleno- 5-sulfonilo (abreviadamente cloruro_de dansilo), tal como muestra la figura 5-7. Como el citado reactivo es muy fluores- cente, los derivados de dansilo del aminodcido N-terminal pueden ponerse de manifiesto y medirse en cantidades pe- quefias mediante métodos fluorimétricos. El procedimiento que utiliza el dansilo es 100 veces mas sensible que el método de Sanger. El reactivo marcador mas importante y que se emplea con mayor profusién, es el propuesto por P. Edman (fig. 5-8). En el procedimiento de Edman, el feniltioisocianato reacciona cuantitativamente con el grupo amino libre de un péptido y rinde el correspondiente péptido feniltiocarbamilado. Por tra~ tamiento con acido anhidro, el resto N-terminal se separa en forma de aminoacido feniltiocarbamilado, dejando intacto al resto de la cadena peptidica. El aminodcido feniltiocarbamilado se cicla a continuacién, con lo que se transforma en el corres- pondiente derivado de la feniltiohidantoina, que puede sepa- rarse e identificarse, habitualmente, por cromatografia gas- liquido (pag. 289). El resto N-terminal separado en forma de derivado feniitiocarbamilado puede identificarse sencillamente por determinacién de la composicién aminoacida del péptido, antes y después de la eliminacién del resto N-terminal; este procedimiento alternativo recibe el nombre de método de subs- traccién de Edman. La gran ventaja del método de Edman es que el resto de la cadena peptidica después de eliminar el aminoacido N-ter- minal queda intacta para efectuar ulteriores ciclos del proce- dimiento; de este modo, el método de Edman puede utilizarse de modo secuencial para identificar varios, e incluso muchos, restos aminodcidos consecutivos a partir del extremo N-ter- minal, Esta gran ventaja ha sido explotada ulteriormente por Edman y por G. Begg, quienes han perfeccionado un «secuen- ciador» automatizado de aminoacidos que permite efectuar la degradacién secuencial de los péptidos por el procedimiento del feniltioisocianato. Los secuenciadores de aminoacidos auto- matizados, empleados profusamente en la actualidad, permi- ten la determinacién muy rapida de la secuencia aminoacida de péptidos constituidos por hasta 20 restos. En algunas proteinas nativas, el resto N-terminal se halla profundamente enterrado dentro de la molécula estrechamente plegada, y resulta inaccesible al reactivo marcador; en tales casos la desnaturalizacién de la proteina puede hacerlo ase- quible. En otras proteinas, por ejemplo, en la proteina de la cubierta del virus del mosaico del tabaco, el grupo «-amino del aminoacido N-terminal se halla acetilado y de aqui que no reaccione con los reactivos marcadores. Algunos péptidos na- turales no tienen grupo a-amino N-terminal libre, debido a que son ciclicos; por ejemplo, el antibidtico tirocidina A, posee 106Capitulo 5 Proteinas: Figura 5-8 Identificacion del resto N-terminal mediante la degradacion de Edman. Obsérvese que la cadena peptidica permanece intacta después de la separacién del aminodcido N-terminal. Fenilisotiocianato N NH be ay Rt I bo ay ay ao RG t-o ba aN Hy noe RH =o ¢=o ay Hy RH ROH boon boon Tetrapéptido ‘Tetrapéptide feniltiocarbamilado esqueleto covalente y secuencia aminoacida Derivado feniltichidantoinico det aminodcido N-terminal (seido) Péptido original menos el aminodcido N-terminal 10 restos aminoacidos con una ordenacién circular (fig. 5-2). Sin embargo no existe evidencia de que en las proteinas apa- rezcan péptidos circulares. Identificacién de los restos C-terminales de los péptidos El aminoacido C-terminal de los péptidos puede reducirse con borohidruro de litio al a-aminoalcohol correspondiente (pag. 86). Si después la cadena peptidica es completamente hidrolizada, el hidrolizado contendra una molécula de un a-aminoalcohol correspondiente al aminoacido C-terminal ori- ginal. ste puede ser facilmente identificado por métodos cro- matograficos; todos los demas restos se hallaran como amino- acidos libres. Otro procedimiento importante es la hidracindlisis (figu- ra 5-9), que provoca la ruptura de todos los enlaces peptidicos por conversién de todos los aminodcidos, excepto el amino- a como aminoacid dad cromatogr: ficamente. ido C-terminal, en hidracidas. El resto C-terminal aparece libre, que puede ser identificado con facili- El aminoacido C-terminal de un péptido puede separarse también, selectivamente, por accién del enzima carboxipepti- dasa, que ataca de modo especifico al enlace peptidico COOH-terminal de los péptidos. Un inconveniente es que el 107PARTE 1 COMPONENTES MOLECULARES DE LAS CELULAS Ni i na er Rn ve b=0 at NEGA, IHNH; Xt 1 Tripéptido oa we eae | ie hidracidas t a uy Re ie Ry—CH a H SHINE, COOH + wy Aminodcido RoGH“Cterminal COOH enzima, después de separar el resto terminal, ataca al nuevo enlace peptidico C-terminal. Resulta por tanto necesario me- dir la velocidad de liberacién de los aminoacidos del péptido con objeto de identificar los restos C-terminales de modo inequivoco. Hidrélisis parcial de las cadenas polipeptidicas Una vez identificados los restos aminoacidos N- y C-termi- nales de una cadena polipeptidica, la etapa siguiente en la gran estrategia para determinar la secuencia de los amino- acidos, consiste en fragmentar la cadena para dar un con- junto de péptidos cortos que puedan separarse e identificarse. Esto se consigtie por hidrélisis parcial o selectiva de la cadena polipeptidica. A veces puede conseguirse el objetivo por hi- drélisis parcial con Acido diluido, ya que los enlaces peptidicos entre ciertos pares de aminodcidos son mas susceptibles a la hidrlisis acida que otros, pero el método de eleccién para la hidrélisis parcial es el de utilizar proteasas, enzimas que hidro- lizan los enlaces peptidicos. Con este fin, se han empleado diversas proteasas de elevado grado de pureza (tabla 5-4). La mas especifica es la tripsina, un enzima digestivo secretado por el pancreas al intestino delgado, en forma de su precur~ sor, el tripsindgeno, (pag. 572). La tripsina se obtiene facil- mente en forma cristalina. Sélo cataliza la hidrélisis de aque~ los enlaces peptidicos en que la funcién carbonilo es aportada por el resto de lisina 0 por el de arginina, con independencia Tana 5-4. Escision especifica de cadenas polipeptidicas HOE HR \beld J Geb ce RO HO Aminoseide 1 Aataotede 2 Método Enlaces peptidicos escindidos ‘Tripsina Aminoacido 1 = Lys 0 Arg Quimotripsina Aminoacido 1 Phe, Trp, o Tyr Pepsir Aminoacido 1 Phe, Trp, Tyr, y otros varios Termolisina Aminoacido 2 Leu, Ile, 0 Val Bromuro de cianégeno Aminoacido 1 Met 108 Figura 5.9 Identificacién del resto C-terminal por reaccién de un péptido con la hidracina (NH:NH;) (método de Akabori)Ficura 5-10 Escisién de una cadena polipeptidica en el resto de metionina (coloreado) por bromuro de ciandgeno. El resto de metionina se transforma en una lactona de la homoserina C-terminal. 4 BOG N GHG NR, | chy Che é CH, GaN Bromuro de Sor cianégeno far 4 H ! { cry Tiocianato de metilo Capitulo 5 Proteinas: esqueleto covalente y secuencia aminoacida de la longitud o la secuencia aminoacida de la cadena. El numero de fragmentos peptidicos (y de aminoacidos libres) resultantes de la accién de la tripsina puede asi predecirse segin el ntmero total de restos de lisina o de arginina pre- sentes en la cadena, Otros enzimas ttiles para la hidrélisis parcial de las cade- nas polipeptidicas son la quimotripsina, (pags. 225 y 237), la pepsina, (pags. 250 y 572) y la termolisina. Sus especificida- des respecto al enlace peptidico aparecen en la tabla 5-4. Aungue son menos especificos que la tripsina, pueden ser muy dtiles segin la composicién aminoacida de la cadena polipeptidica en estudio. La termolisina, que es una proteasa bacteriana termoestable, puede hidrolizar enlaces peptidicos en los que la funcién amino es aportada por los aminoacidos no polares, leucina, isoleucina y valina. Es especialmente util para la hidrélisis parcial de polipéptidos que no contienen ar- ginina o lisina y son, por tanto, resistentes al ataque por la tripsina, La termolisina ha resultado también stil para esta blecer la secuencia de aminodcidos en las protaminas, pro- teinas basicas del nicleo celular que contienen tantos restos de arginina y de lisina, que la hidrélisis por tripsina no pro- porciona ninguna informacién dtil acerca de la secuencia. Se han desartollado métodos quimicos especificos para la escisién de cadenas polipeptidicas por restos aminoacidos es- pecificos, El mas satisfactorio es el que utiliza la reaccién del bromuro de cianégeno con el péptido: en ella se rompe el enlace peptidico cuya funcién carbonilo es aportada por um resto de metionina. Este ultimo se convierte en un resto C-terminal que es la lactona de la homoserina (fig. 5-10). El namero de fragmentos producidos a partir de un polipéptido por el bromuro de cianégeno puede predecirse seguin el nimero de restos metionina de la cadena. Parte de la estrategia del andlisis de la secuencia amino- Acida consiste en fragmentar la cadena polipeptidica, al menos por dos caminos diferentes, de modo que los fragmentos pep- tidicos pequefios resultantes de un procedimiento se solapen con los resultantes de otro (véase mas adelante). Por ejemplo, si la tripsina se emplea para la primera ruptura, la segunda escisién debe Ilevarse a cabo empleando otra proteasa, como la quimotripsina, la pepsina o la termolisina, o mediante la reaccién con el bromuro de cianégeno. A veces se precisa de una tercera o cuarta hidrélisis parcial con objeto de obtener los necesarios péptidos solapados. Separacién y anélisis de péptidos Las mezclas complejas de péptidos resultantes de la hidrélisis parcial de las proteinas resultan mucho mas dificiles de sep: rar que las mezclas de aminodcidos (pig. 92), porque el ni- mero de péptidos posibles es mucho mayor que el mimero de aminoacidos presentes en las proteinas. Son posibles dos mé- todos generales de abordar el problema; las técnicas sobre papel, es decir, la cromatografia sobre papel y Ia electrofore- sis sobre papel, y la cromatografia en columna, mas eficaz y més profusamente empleada. Ambos grupos de métodos aprovechan las diferencias en el comportamiento acido-base de los péptidos. Cuando se emplean técnicas sobre papel, los métodos bid 109PARTE 1 COMPONENTES MOLECULARES DE LAS CELULAS mensionales resultan muy eficaces (pag. 91). La mezcla de péptidos se somete en primer lugar a electroforesis en una direccién del papel, seguida de una cromatografia (0 electro- foresis a distinto pH) en direccién que forme Angulo recto con la primera (fig. 5-11). Este proceso en dos etapas da por resultado un mapa peptidico bidimensional. Los péptidos pue- den localizarse sobre el papel desecado, pulverizandolo con ninhidrina seguida de calentamiento. De un papel obtenido en condiciones idénticas, pero que no ha sido tefido, pueden recortarse las manchas que contienen los péptidos y proceder a su elucién para recuperar los péptidos individuales. En caso de que dos 0 mas péptidos se superpongan en una mancha, pueden eluirse y someterse de nuevo a cromatografia en un sistema diferente de disolventes. Los mapas peptidicos, lama- dos también de huellas peptidicas, son especialmente ttiles para la identificacién de las diferencias entre proteinas homé- logas de las diferentes especies (pag. 114), y para la localiza- cién de los lugares en que se ha producido sustitucién de aminoacidos en las proteinas mutantes (pag. 118). La cromatografia en columna de mezclas de péptidos se realiza habitualmente en columnas de intercambio iénico. La elucién se realiza con gradientes de pH o de concentracién salina, como en el anélisis de aminoacidos. Este método tiene la gran ventaja de que puede automatizarse y Ilevarse a cabo en un analizador de aminodcidos (pag. 92). Otro camino muy eficaz para la separacién de mezclas de péptidos es la croma- tografia de exclusisn o filtracién con gel, que se efectiia sobre columnas del derivado carbohidrato polimerizado conocido con el nombre de Sephadex. Este tipo de cromatografia separa los péptidos basandose en su peso molecular en lugar de ha- cerlo en sus propiedades acido-base. Los principios fisicos en los que se apoya la cromatografia de exclusion en gel apare- cen detallados en el capitulo 7 (pag. 163). La combinacion de Ja cromatografia de intercambio iénico automatizada y la de exclusién resulta sumamente eficaz para lograr la separacion de mezclas complejas de péptidos. Analisis de la secuencia de fragmentos peptidicos Una vez que todos los fragmentos peptidicos resultantes de la hidrélisis parcial de una cadena polipeptidica se han separado, se hidroliza por completo una muestra de cada uno y se de- termina su contenido en aminodcidos. Después sobre otras muestras se determina la secuencia aminoacida de cada uno de los péptidos, mediante la degradacién secuencial de Edman. Si el péptido es demasiado largo para ser «secuenciado> por este método, se identifican sus restos N- y C- terminales por los métodos anteriormente sefialados y se fragmente ulterior- mente el péptido por hidrélisis parcial mediante algin método distinto del empleado en la primera fragmentacién. Los pép- tidos menores resultantes pueden entonces analizarse tal como se ha descrito. Ordenaci6n de los fragmentos peptidicos Una vez que se han obtenido dos conjuntos de fragmentos peptidicos por dos procedimientos diferentes de ruptura de la cadena polipeptidica original y se ha establecido la secuencia 110 Fiura 5-11 Cromatogeama bidimensional sobre papel. Se deposita la mezcla de péptidos y se desarrolla en una dimensién con un sistem: disolvente A. A continuacién, se seca el papel, se gira 90° y se desarrolla ‘con el disolvente B, dejando extender las manchas de los péptidos, sobre foda la hoja. Véase la figura 5-19 como ejemplo f Direccisn det flujo del disolvente Mancha que contiene| la mezcla de / Péptidos Cromatografia en el primer sistema disolvente oe ee a eee = El papel después de la cromatografia en el sistema disolvente A { Diceccioa de flujo disolvente Sistema disolvente *\ EI papel después del giro de 90° y en desarrollo en el disolvente B Cromatograma Didimersional completoroura 5-12 Determinacién de la secuencia aminodcida vor solapamiento de péptidos. ‘iura 5-13 Fecuencia aminoacida de la insulina bovina 1 posiciones de los enlaces transversales -S-S—. Extremos N-terminales Gly fa | He Val Lik. Lea Ser Yan ie i ie Ala Gn vs Lew r r daw Leu hen Yat ° ee ae Men dy Cadena A hve Gly he 3s bh tyr tur a i 0 ka Cadena B Extremos C-terminales Capitulo 5 Proteinas: esqueleto covalente y secuencia aminoacida Glu-Met-Leu-Gly-Arg AlaGly Fragmentos procedentes [ T™L¥S de la hidrdlisis triptica Fragmentos procedentes de la escisién con bromuro de cianégeno (ee Leu-Gly-Arg-Ala-Cly Secuencia deducida —_[ Tyr-Lys-Glu-Met-Leu-Gly-Arg-Ala-Gly aminoacida de todos los fragmentos, es posible el deducir la secuencia aminoacida completa, de los solapados de las se- cuencias peptidicas. Se puede ver tal principio en la figu- ra 5-12. Sin embargo, es frecuente que no se establezcan superposiciones inequivocas para todas las porciones de una cadena determinada y se precise de un tercer o un cuarto tipo de hidrélisis parcial del polipéptido original para conse- guir el solapamiento necesario. Asignacién de la posicién de los enlaces disulfuro transversales Una vez que se ha deducido la secuencia aminoacida completa de las cadenas polipeptidicas de una proteina, la etapa siguien- te consiste en establecer cuales de los restos de cisteina se hallan apareados para formar enlaces disulfuro transversales, tanto dentro de una misma cadena como entre dos cadenas, caso de que exista algun enlace de tal tipo. Esto se realiza en general por fragmentacién de una muestra de proteina cuyos enlaces transversales permanecen todavia intactos, nor- malmente mediante hidrdlisis con tripsina. Los péptidos que contienen los puentes disulfuro se aislan, se reducen dichos puentes y se alquilan los grupos sulfhidrilo resultantes, tal éomo se describié anteriormente (pag. 101). Los dos péptidos que se derivan de cada uno de los fragmentos que contienen el grupo disulfuro se identifican después por comparacién con los péptidos procedentes de la hidrélisis triptica de la cadena polipeptidica original reducida. Asignacién de las posiciones de los grupos amida Los grupos amida de la asparagina y de la glutamina se pierden en forma de amoniaco durante la hidrélisis acida o basica para dar los correspondientes restos de los acidos aspartico y glutamico. Aunque el mimero de moléculas de amoniaco formadas por mol de proteina durante la hidrolisis acida puede proporcionar la suma de los restos de asparagina y de glutamina, las posiciones de los grupos amida, particular- mente en las proteinas que contienen tanto los acidos aspar- tico y glutamico como sus amidas, no puede deducitse de los fragmentos peptidicos obtenidos de la hidrélisis acida; sin embargo, éstas se establecen a partir de los fragmentos pep- tidicos obtenidos por la accién de proteasas especificas que no hidrolicen los grupos amida, Secuencia aminodcida de algunos péptidos y proteinas La figura 5-13 muestra la secuencia aminoacida completa de la insulina bovina, que es la primera proteina cuya secuencia aminodcida fue establecida, Esta constituida por dos cadenas naePARTE 1 COMPONENTES MOLECULARES DE LAS CELULAS Ficura 5-14 Secuencia aminodcida de la adrenocortico- tropina humana. Ser-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-Trp -Gly-Lys-Pro-Val-Gly-Lys-Lys-Arg-Arg-Pro-Valyg- Lys-Val-Tyr-Pro-Asp-Ala-Gly-Glu-Asp-Gln-Ser-Ala-Glu-Als-Phe-Pro-Leu-Glu-Phe ss Ficura 5-15, Secuencia aminodcida de la ribonucleasa bovina. Mas abajo se muestran las posiciones de los puentes disulfuro intracatenarios. Lys-Glu-Thr-Ala-Ala-Ala-Lys-Phe-Glu-Arg-Gln-His-Met-Asp-Ser-Ser-Thr-Ser-Ala-Ala-Ser-Ser-Ser-Asn-Tyr-Cys-Asn-Gln-Metyy- Met-Lys-Ser-Arg-Asn-Leu-Thr-Lys-Asp-Arg-Cys-Lys-Pro-Val-Asn-Thr-Phe-Val-His-Glu-Ser-Leu-Ala-Asp-Val-Gln-Ala-Val-Cysy- Ser-Gln-Lys-Asn-Val-Ala-Cys-Lys-Asn-Gly-Gln-Thr-Asn-Cys-Tyr-Gln- Ser-Tyr-Ser-Thr-Met-Ser-Ile-Thr-Asp-Cys-Arg-Glu-Thtyy- Gly-Ser-Ser-Lys-Tyr-Pro-Asn-Cys-Ala-Tyr-Lys-Thr-Thr-Gln-Ala-Asn-Lys-His-lle-Ile-Val-Ala-Cys-Glu-Gly-Asn-Pro-Tyr-Valis- Pro-Val-His-Phe-Asp-Ala-Ser-Valiz. peptidicas: la A, que posee 21 restos aminodcidos, y la B, que consta de 30, Las dos cadenas polipeptidicas de ia insu- lina se hallan unidas transversalmente por dos puentes disul- furo; ademas existe otro enlace disulfuro intracatenario. San- ger provocé la ruptura de los enlaces disulfuro intracatenarios asi como de los intercatenarios, separando después las cade- nas A y B, Después de establecer la secuencia aminoacida de cada una de ellas mediante el sistema ya esbozado, localizé la posicién de los enlaces cruzados inter e intracatenarios. El trabajo de Sanger, que se completé en 1953, abrié la puerta para el analisis secuencial de cadenas polipeptidicas mas largas. Poco después, dos grupos distintos de investiga- dores informaron sobre la secuencia de los aminoacidos en la adrenocorticotropina, hormona de la glandula pituitaria ante- rior que estimula la corteza adrenal (fig. 5-14). Esta hormona se halla constituida por una simple cadena de 39 restos, con un peso molecular de cerca de 4600. Varios aiios mas tarde, S. Moore y W. Stein en Nueva York, lograron con éxito el primer andlisis secuencial de una proteina enzimatica, la ribo- nucleasa, con importantes estudios independientes efectuados por C, B. Anfinsen, en Bethesda. La ribonucleasa posee 124 restos aminoacidos dispuestos en una sola cadena, y contiene cuatro enlaces disulfuro intracatenarios cruzados (fig. 5-15). El siguiente hito importante fue Ia identificacion de las’ secuencias aminodcidas de los dos tipos de cadenas peptidicas en la hemoglobina (fig. 5-16). Fue éste el primer analisis se- cuencial de una proteina oligomérica multicatenaria realizado por dos grupos en los Estados Unidos y otro en Alemania. La hemoglobina contiene cuatro cadenas polipeptidicas, dos cadenas @ idénticas (141 restos), y dos cadenas 8 también idénticas (146 restos), Las cadenas « y poseen restos ami- noacidos idénticos en muchas posiciones (fig. 5-16), es decir 112cura 5-16 ecuencia aminodcida de las cadenas a B de la hemoglobina normal. Los restos lénticos en ambas cadenas aparecen en olor. Los restos idénticos en ambas adenas y la cadena tinica de la mioglobina mana estan sombreados, Restos NHsterminales val Ala B val His Lew Thr Pro. Glu Glu Lys Ser Ala val Thr Alo Lys val Asn Capitulo 5 Profeinas: esqueleto covalente y secuencia aminodcida 8 « 8 Met Leu Pro Lys Thr Thr Asn Gly Pro Pro Ala Thr 120 Ala Pro w Leu Phe Val Val ‘Ser Ala His Gin Ala Thr Ala Ala Leu Lew Ser Ala Ser Ser Leu Tyr spe acs Phe Val Leu Val 10 Ala Ala Ser Gly Val Val Asn Asn Phe Phe Lys Arg mo Leu Leu yD Leu Leu Restos COOH-terminales Ser Gly His Asn Cys Val Leu Lew Leu Val Val Cys Thr Val Leu Leu 0 Ala Ala Ala His His His ne Leu Phe Fy Pro Gly Asp Ala Lys Asn vo GAGES las dos cadenas poseen lo que se conoce como una homologia secuencial. La cadena polipeptidica tnica de la proteima mus- Gular mioglobina, que también contiene un grupo ferro-porfi- rina y se parece a la hemoglobina en su capacidad para unirse con el oxigeno, posee también una homologia secuencial con las cadenas de la hemoglobina. El significado de las homo- logias secuenciales en proteinas funcionalmente semejantes o 113PARTE 1 COMPONENTES MOLECULARES DE LAS CELULAS en proteinas homélogas de especies diferentes se discutira en el capitulo 6 (pag. 148). Las cadenas polipeptidicas mas largas para las cuales se han deducido, hasta el momento, las secuencias aminoacidas completas, son las de la alcohol-deshidrogenasa de caballo 374 restos) y la glutamato-deshidrogenasa bovina (500 restos). A partir del analisis de la secuencia aminoacida de muchas proteinas globulares pueden hacerse algunas generalizaciones cautelosas. Hasta el momento no se han encontrado en las proteinas globulares secuencias periédicas, repetidas con frecuencia, tales como ABABABABAB --- o ABCDABCD- ABCD «+=, Sélo excepcionalmente aparece un aminodcido simple més de tres veces en sucesién excepto en las protami- nas, que contienen secuencias de cuatro, cinco y seis, restos de arginina consecutivos. Es obvio que existe poca regularidad en la secuencia aminoacida. El anilisis estadistico de las se- cuencias conocidas de proteinas globulares muestra que apa- recen todas, o casi todas, las posibles secuencias cortas de dos y tres aminoacidos, pero sin ninguna pauta periédica aparente. No hay tampoco regularidad apreciable en la presencia o en la posicién de los enlaces cruzados —S—S— intracatenarios; algunas proteinas no poseen ninguno, mientras que otras pue- den poseer varios. Por otra parte, en algunas proteinas fibrosas aparecen cier- tos aminoacidos en secuencias periédicas. En el colageno hay preponderancia de restos de glicocola, prolina e hidroxiprolina, los cuales se presentan en la secuencia periédica -Gly-X-Y-, donde Y es frecuentemente prolina o hidroxiprolina. Casi el 80 % de los restos aminoacidos de la fibroina de la seda esta constituido por alanina, glicocola y serina (cap. 6). Las pro- teinas anticongelantes de ciertos peces antarticos (pag. 281) poseen la secuencia repetida -Ala-Ala-Thr-, con un disacdrido esterificado al resto de treonina. Variaciones de especie en la secuencia de proteinas homélogas Una amplia informacién sobre las secuencias aminoacidas de las proteinas homélogas de diferentes especies ha mostrado que algunos restos aminoacidos situados en posiciones espe- ficas de las proteinas homélogas son relativamente invariat es decir, son idénticos en todas las especies o se hallan sustituidos con poca frecuencia. Las proteinas homélogas con- tienen también restos variables, normalmente la mayoria de los restos de la cadena, los cuales varian mucho mas amplia- mente de una especie a otra, y en las cuales aminoacidos dife- rentes pueden reemplazarse entre Se conocen las secuencias aminodcidas completas de las in- sulinas aisladas de muchas especies distintas de vertebrados. Estas insulinas poseen virtualmente una misma actividad hor- monal especifica y un mismo peso molecular. La cadena A de las insulinas del hombre, el cerdo, el perro, el conejo y el cachalote, son idénticas y la cadena B de las insulinas de vaca, cerdo, perro, cachalote, oveja, cabra y caballo, son tam- bién idénticas, Las cadenas B de las insulinas humana y de elefante, son asimismo idénticas. En la cadena A, la sustitu- cién de aminoacidos de una especie a otra, tiene lugar por lo general, en las posiciones 8, 9 y 10, es decir, las posiciones 114cura 5-17 0s 27 restos aminodcidos invariables de 3s citocromos ¢ eucari6ticos. Se examinaron incuenta citocromos c diferentes de 4 mamiferos, 4 aves, 2 reptiles, 1 anfibio, peces, 4 insectos, 5 hongos, 11 plantas uperiores y 2 levaduras de panificacién. 1 medida que se investigan més especies, I nimero de restos invariantes puede er menor. [Modificado de E. Margoliash, n Hemes and hemoproteins, de B. Chance R. Estabroock (eds.), p. 373, Academic ress Inc., Nueva York, 1966.) 10+Phe vtCys 10+ His »tGly sof Pro otLeu arly utang. ately + tly «of Tyr ottrp oot Lew, 2+Phe s}Gly ortarg Hemo 20+ Asn Pro Lys Lys Tyr Thr Lys 10} Met Capitulo 5 Proteinas: esqueleto covalente y secuencia aminodcida entre los dos restos de hemicistina que forman el enlace cru- zado intracatenario. Sin embargo, se han observado también sustituciones en las posiciones 4, 13, 14, 15 y 18. El estudio ulterior de las secuencias de la insulina en diferentes especies, muestra que en la posicién A 8 la alanina, la histidina y la treonina se sustituyen mutuamente; en la posicién A 9 lo hacen Ia serina, la arginina, la lisina, la asparagina y la glicocola, y en la A 10, la valina, la isoleucina, la prolina y Ja treonina, Veremos que tales sustituciones especificas de aminoacidos se hallan relacionadas con la constitucién del cédigo genético (pag. 973 a 978). La insulina se encuentra solamente en los vertebrados y esté aparentemente ausente en los animales inferiores, en las plantas y en las bacterias. Por esta razén y también porque es una molécula relativamente pequefia, la insulina no se presta bien por si misma al examen de las posibles relaciones exis- tentes entre secuencia aminoacida y taxonomia. Mucho mas conveniente, en este aspecto, resulta el citocromo c, proteina que interviene en la transferencia de electrones y que aparece en todos los animales, plantas y microorganismos aerobios. El citocromo c posee una cadena de 104 restos en los verte- brados terrestres, de 103 a 104 en los peces, de 107 en los insectos, entre 111 y 112 en las plantas verdes y de 107 a 109 en las levaduras y hongos. E. Margoliash y sus colabo- radores han efectuado un amplio estudio de las variaciones de la secuencia aminoacida en el citocromo ¢, aislado de unas 50 especies diferentes. En todas ellas, 27 restos aminoacidos son absolutamente invariantes (fig. 5-17), Los restos inva- riantes se hallan espaciados irregularmente a lo largo de la cadena polipeptidica, aunque 7 de ellos aparecen en las posi- ciones 70 a 80. En todas las especies menos una, los restos de cisteina 14 y 17, a los que se halla unido el anillo de porfirina, son invariantes. La tnica especie en la que esto no ocurre tiene un resto de alanina en la posicién 14. Esta claro que estos restos de cisteina son importantes para la estructura y la funcién del citocromo c. Ademas de los restos absoluta- mente invariantes, en este grupo de 50 ejemplares diferentes de citocromos c, existen otros diversos restos que estan sustituidos sélo de vez en cuando, y aun en este caso, tinica~ mente por un determinado aminoacido. El nimero de dife- rencias de restos entre las especies es aproximadamente propor- cional a sus diferencias filogenéticas; asi, dos especies tan diferenciadas como el caballo y la levadura difieren en 48 restos en las moléculas de sus respectivos citocromos c, mien- tras que los de dos especies tan intimamente relacionadas como el pollo y el pato, sélo se diferencian en dos restos. La molécula de citocromo c es idéntica en el pato y en el pavo y también lo es en el cerdo, la vaca y la oveja. El numero de diferencias de restos en las moléculas de cito- cromo c de muchas especies ha sido utilizado para construir un Arbol filogenético que no solamente muestra el curso de 1a evo- lucién biolégica del citocromo c, sino que también permite calcu- lar la época probable en la que los géneros y especies principa- les de los organismos vivos iniciaron su divergencia (fig. 5-18). Evolucién de proteinas relacionadas Los estudios de las secuencias aminodcidas revelan que ciertos conjuntos de proteinas pueden proceder de un antecesor evo- 115PARTE | COMPONENTES MOLECULARES DE Las CELULAS Fioura 5-18 Arbol filogenttico que muestra la evolucién del citocromo c. Fue construido mediante computador a partic de las secuencias aminodcidas del citocomo ¢ de muchas especies. Cada circulo representa ta secuencia del citocromo ¢ deducida para la que seria la antecesora de todas las especies superiores en las ramas que surgen de tal circulo. Las cifras pequefias a lo largo de cada rama, indican el mimero de diferencias de restos aminodcidos, por cada 100 restos, con respecto al antecesor. Asi el citocromo ¢ de la alubia Phaseolus aureaus difiere de su antecesor en 5 restos por 100, mientras que el citocromo c del sésamo sélo difiere en dos restos por cada 100. (Adaptado de M. O. Dayhoff. CM. Park y P. J. McLaughlin en M. O. Dayhoff (ed.). Atlas of Protein Sequence and Structure, vol. 5, pag. 8. National Biochemical Research Foundation, Washington D. C., 1972). Hombre, 7 chimpance Pingiino aye — Lr ——CL Caballo 2,5 ' Tortuga REPTILES 3 Conejo 4 Cerdo, vaca, oveja 3 65. Bowito me Og 5 vo &) PECES Debaryanyces Sy ana Candida Lija (pez) mugidora 6 9° 4 Lamprea * Alubia HONGOS Mosca deb-43 11 Phaseoulus aureaus 145 poutla del “OF Mosca 12,5 gusano de seda_ 2 Calliphorida 3) _Sesamo Polilla de 3 ynericans iy sa 2 Levadura esfingidos 5 o Trigo Ricino 2 INSECTOS Sy a ECTOR PLANTAS Oo ca O ° a ™ O86 ‘Neurospora : 2 18 O 25 oO QO 25 12 45 oO lucionista comin. Ya hemos visto que la cadena polipeptidica simple de la mioglobina, proteina muscular, muestra una con- siderable homologia de secuencia con las cuatro cadenas po- lipeptidicas de la hemoglobina de adulto. Ambas proteinas desempefian la funcién de unir oxigeno reversiblemente a sus grupos hemo, la primera en el misculo y la segunda en los eritrocitos, Veremos mas adelante (pag. 139) que la confor- maci6n tridimensional de la cadena de la mioglobina es muy semejante a la de las cadenas a y £ de la hemoglobina. Es probable que ambas, la hemoglobina y la mioglobina, deriven 116Capitulo 5 Proteinas: esqueleto covalente y secuencia aminodcida de un antecesor comtin que, con toda probabilidad, poseyo una sola cadena y un sélo grupo hemo, Otro par de proteinas bien conocido son ia tripsina y la quimotripsina, que son primas; H. Neurath y sus colabora- dores han sefialado la extensa semejanza de sus secuencias aminoacidas. La tripsina y la quimotripsina son ambas enzimas digestivos sintetizados por el pancreas y secretados en forma de sus respectivos zimégenos inactivos, el tripsinégeno y el quimotripsinégeno; sin embargo, como hemos visto, muestran especificidades de substrato muy. diferentes. De todos los res- tos aminoacidos de la quimotripsina, el 41% se hallan presentes en posiciones homélogas en la tripsina; ademés, cuatro de los cinco puentes disulfuro de la quimotripsina apa- recen en las mismas posiciones que cuatro de los seis puentes en la tripsina. A veces dos proteinas con funcién aparentemente diferente y localizacién completamente distinta muestran una homolo- gia de secuencia inequivoca, R. L. Hill y sus colaboradores descubrieron que 54 de los 124 restos de la a-lactalbémina, una proteina de la leche, son idénticos a los hallados en el enzima lisozima, de la clara de huevo de gallina. Estas pro- teinas, que aparentemente no se hallan relacionadas, com- parten un comin denominador: la a-lactalbimina es una sub- unidad reguladora del enzima lactosa-sintetasa (pg. 656). la cual forma lactosa a partir de sus componentes monosacari- dicos, y la lisozima es un enzima capaz de hidrolizar cadenas polisacaridicas de la pared celular bacteriana (pag. 239). De este modo ambos enzimas son capaces de activar grupos car- bohidrato, Otro caso interesante lo constituye la homologia de secuen- cia entre la hormona insulina (fig. 5-13, pg. 111) y el factor del crecimiento neural, proteina que se halla en la glandula submaxilar de los mamiferos y que aumenta considerablemente el crecimiento de ciertos ganglios nerviosos. Esta observacién sugiere una posible relacién evolucionista y funcional entre las glandulas endocrina y secretora y el modo de actuacién de sus secreciones. Duplicacién de los genes Los estudios de la secuencia aminoacida han revelado otro principio importante en la evolucién de las proteinas: la du-. plicacién de los genes. El caso mas sencillo es la ferredoxina de las bacterias, proteina transportadora de electrones que contiene hierro, (pag. 619) y posee 55 restos aminoacidos en su cadena polipeptidica. Ambas mitades de esta cadena poli- peptidica muestran claras hotiologias aminodcidas, sugitiendo que el gen para la molécula completa surgié durante la evo- lucién por duplicacin de un solo gen codificador de una mitad de la molécula de alrededor de 28 restos aminodcidos. Ademés, las cadenas polipeptidicas de las ferredoxinas de las plantas superiores son dos veces mas largas que las de las bacterias, indicando que la prolongacién ulterior y la fusién de los genes tuvo lugar durante la evolucién de estas formas superiores. La duplicacién de los genes se ha producido también en la familia de proteinas de la mioglobina y de la hemoglobina, que puede haber tenido un antecesor comin de cadena tinica. 117PARTE, 1 COMPONENTES MOLECULARES DE LAS CELULAS De acuerdo con esta idea se halla el descubrimiento de que la hemoglobina de la sangre de la lamprea actual, no posee sino una cadena polipeptidica tinica y un solo grupo hemo; es la unica especie conocida con una hemoglobina de cadena unica. Es probable que el gen correspondiente al antecesor de la hemoglobina de cadena unica se duplicase y condujese a genes separados para las cadenas a y 8 de las hemoglobinas » modernas, Jas cuales muestran una considerable homologia de secuencia (fig. 5-16). La duplicacién de los genes ocurrié también en la evolucién de las cadenas polipeptidicas de las inmunoglobulinas, aspecto que sera discutido en el capitulo 35. Cambios mutacionales en la secuencia aminoacida de una especie En la enfermedad humana denominada anemia falciforme, los eritrocitos tienden a adoptar forma de hoz cuando la presién de oxigeno es baja; es decir, adoptan la forma de luna en cuarto creciente, en vez de la conformacién discoidal, plana, de los eritrocitos normales (fig. 5-19). La movilidad electro- forética de la hemoglobina de las células falciformes difiere ligeramente de la de hemoglobina normal. Estudios quimicos han demostrado que la hemoglobina de las células falciformes (hemoglobina S$) difiere de la hemo- globina normal (hemoglobina A) solamente en un resto ami- noacido, Las cadenas « de las dos formas son idénticas, pero el resto de acido glutamico situado en la posicién 6 de la cadena 8 de la hemoglobina normal, se halla sustituido por un resto de valina en la hemoglobina S. Las dos valinas de las posiciones 1 y 6 forman asociacién hidrofébica que con- duce a la molécula de hemoglobina S a adoptar una confor- macién tal que al apilarse, lo hace de manera que la forma del propio eritrocito resulta distorsionada. La anemia falci- forme es, por tanto, una enfermedad de origen genético; la substituci6n del aminoacido es el resultado de una mutacién en la molécula de DNA que codifica la sintesis de la cade- na B de la hemoglobina. La hemoglobina S se hereda como un simple caracter men- deliano, La mayoria de las personas que poseen hemoglo- bina S en sus eritrocitos, son heterozigotos, y portadores de un gen para la hemoglobina normal y de otro para la hemo- globina S; se dice que tales individuos son poseedores de rasgos falciformes. La minoria, llamados homozigotos, son por- tadores de dos genes, correspondientes a la hemoglobina S; tales individuos padecen de anemia falciforme, y sus eritro- citos solamente contienen hemoglobina S, Aunque 1 de cada 10 americanos de ascendencia africana es heterozigoto, sola- mente 1 de cada 400 resulta heterozigoto respecto a la hemo- globina S. La mayoria de los heterozigotos mueren de anemia falciforme antes de cumplir los treinta afios. Las células falci- formes duran la mitad del tiempo que las células normales, produciéndose la anemia, y se apelotonan, sobre todo si se hallan desoxigenadas, debido a la estructura terciaria anormal de la hemoglobina S. Las agrupaciones bloquean los capilares que transportan el suministro sanguineo a regiones vitales y produce una crisis clinica. Por otra parte, los heterozigotos desarrolian su vida casi con completa normalidad. Resulta de algiin interés saber que las células rojas de los individuos con 118 Figura 5-19 Fotomicrografia de gidbulos rojos sanguineos normales (forma de disco) y falciformes (forma de media luna). [Walter Dawn, de la National Audubon Society. ] 20,0 2m Mapas peptidicos de los péptidos de la hemoglobina A y de la hemoglobina falciforme. Solamente aparece desplazado un péptido (en color); contiene el aminoacido ~ genéticamente sustituido. [Reproducido de C. Baglioni, Biochem. Biophys. Acta,48: 392 (1961).]‘Tasta 5-5. Sustituciones de aminodcidos en hemoglobinas humanas. Resto y Hemoglo- posicién bina normales Sustitucion Cadena @ 1 16 Lys ———— Glu Gronoms —-30.Glu Gin Norfolk 97 Gly Asp Maosin 58 His —————> Tyr Grostatn 68 Asn Lys Orndoneia 116 Glu ————> Lys. Cadena 8 c 6 Gu ————— Lys 's 6 Glu ————> val Gran tne 7. Glu —_——— Gly 26 Glu ————— Lys sino 63 His ————> Tyr Ziirich 63 His Arg Myivausee 67 Val ————> Glu Drunay 121 Glu Gln Ficura 5-20 Condensacién de un aminoacido con el grupo amino protegido, y de otto con el grupo carboxilo protegido, para rendie un dipéptido protegido. Los grupos protectores se separan a continuacion ¥ proporcionan el dipéptido libre. Capitulo 5 Proteinas: esqueleto covalente y secuencia aminodcida rasgos falciformes, son resistentes a la invasin por pardsitos de la malaria, lo que les confiere ventajas al vivir en Africa, en donde la malaria es todavia corriente. Muchos nifios afri- canos con hemoglobina normal mueren de malaria cerebral, pero los que poseen la peculiaridad falciforme son resistentes a la enfermedad. Se han encontrado en total unas 150 clases diferentes de hemoglobinas mutantes en los seres humanos. El aminoacido especifico substituido en una proteina mutante puede deter- minatse muy sencillamente por aplicacién de la técnica del mapa peptidico (fig. 5-11). Casi todos los cambios genéticos observados en hemoglobinas mutantes se deben a la substitu- cién de un solo resto aminoacido, tanto en la cadena a como en la cadena . La tabla 5-5 contiene una relacién de algunas de las muchas mutaciones observadas; los nombres de estas formas anormales derivan, frecuentemente, del lugar de su descubrimiento. En un estudio efectuado en Taiwan se de- mostr6 que 165 individuos de un total de 100000, cuyas hemoglobinas fueron sometidas a electroforesis, tenian hemo- globinas anormales. Puesto que mediante este ensayo sola- mente pueden determinarse, por término medio, uno de cada tres tipos de hemoglobina anormal, se ha Ilegado a la conclu- sién de que 5 de cada millar de seres humanos son portadores de una hemoglobina mutante. Algunas mutaciones de la hemoglobina son letales, es decir, que el paciente nunca puede vivir hasta la madurez debido a que la substitucién del aminoacido origina una molécula de hemoglobina funcionalmente defectuosa. Por otra parte, en algunas mutaciones la funcién fisiolégica de la hemoglobina se ve mucho menos afectada, y en otros incluso las mutaciones son aparentemente inocuas. Tales mutaciones no estan limita- das sélo a la hemoglobina; es muy factible que todos los tipos de proteinas en todos los organismos experimenten cambios mutacionales, algunos de los cuales son ventajosos, mientras que otros son perjudiciales, En la evolucién de las proteinas parece que ocurren muchos cambios que son inocuos. Sintesis en el laboratorio de cadenas polipeptidicas La sintesis quimica de cadenas polipeptidicas largas resulta de especial interés debido a las formidables dificultades téc- nicas implicadas, y a los ingeniosos métodos que se estén aplicando al problema. La dificultad basica consiste en que | COOH + ccadensante Agente Seca, Dipéptido protecteres 119PARTE 1 COMPONENTES MOLECULARES DE LAS CELULAS los reactivos necesarios para formar enlaces peptidicos pueden reaccionar también con otros grupos funcionales de los amino- Acidos que no intervienen en el enlace peptidico; por ejemplo, el grupo amino libre del resto N-terminal, el grupo carboxilo libre del resto C-terminal, 0 ciertos grupos R, tales como el grupo tiol de la cisteina. Estos grupos sensibles, tienen, por tanto, que ser bloqueados 0 protegidos mediante reacciones apropiadas, en primer lugar, para resguardarlos del reactivo formador del péptido (fig. 5-20). Después de la formacién del enlace peptidico, los grupos bloqueantes protectores deben Ficura 5-21 Etapas en la sintesis de un tripéptido en fase silida. La cadena se construye por adicin de sucesivos restos aminoacilos al resto C+terminal, que se halla unido a una particula de resina. Los grupos amino estin protegidos por el grupo ter-butiloxicarbonilo (en color), que se elimina fécilmente en forma de productos volatiles por acidificacién. Por repeticién de estas etapas se pueden consteuir cadenas polipeptidicas muy largas. Una vez ferminada la cadena, se separa de la particula de resina. Particula de resina Resto carboxilo terminal HN—CHE— ee * Arminoacido bloqueado ,, | coo! a CAI OF MMOD a Lc Oy carbodiaida Grupo bloqueante Dipeptidil-particula Oe de resina, bloqueado § CH,—C-——O—C. su grupo amino i G6 cH, -¢ +c0, cH, Isobutileno R : Dipeptidl-particula aaa ByNCHENHCHE— ° a by inoscido Dicictobea- Ait ecg anecoon ~ | ° ‘Tripeptidil-particula ’ & & de resina, blogueado (CH), C—O—C— NHCHCNHCHCNHCHG— su grupo amino ! q I os ° ° Particula de resina tee unida a un resto tripeptidilo HuNGHENHCHENECHE | I oO 120Figura 5-22 Cloruro de ter-butil-oxicarbonilo, agente de bloqueo de los grupos amino. Se elimina Fécilmente con formacién de productos gaseosos (véase fig. 5-21). ve CHy—F-0-F-a CH 0 Ficura 5-23 Diciclohexilcarbodiimida, poderoso agente condensante. Se hidrata y se transforma en diciclohexilurea al eliminar los elementos del agua de dos restos aminodcidos. Na jo fre N Ny Diciclohexil- _ Diciclohexil- carbodiimida urea Capitulo 5 Profeinas: esqueleto covalente y secuencia aminodcida eliminarse. Por dicha raz6n, la adicién de cada resto amino- Acido durante la sintesis de una cadena polipeptidica precisa de varias etapas de reaccién individuales para introducir y separar los grupos bloqueantes. Es evidente que el rendi- miento de cada etapa de reaccién quimica debe ser muy ele- vado si se ha de sintetizar una cadena polipeptidica de cierta longitud. A comienzos de siglo Emil Fischer sintetizé cadenas poli- peptidicas de hasta 16 restos, pero ningun polipéptido que existiese en la naturaleza fue sintetizado hasta 1953, en que V. du Vigneaud y sus colaboradores, lograron la sintesis de Jas hormonas de la pituitaria posterior oxitocina y vasopresina, que contienen nueve restos aminoacidos (fig. 5-2). Desde en- tonces, se han sintetizado por métodos quimicos y sin el empleo de enzimas, cierto ntimero de otros polipéptidos activos, como Ja hormona reguladora de la presién sanguinea llamada bra- digquinina, (9 restos), la hormona_a-melanocito-estimulante (24 restos) y la adrenocorticotropina (39 restos) (fig. 5-14). Grupos de investigacién en Alemania, Estados Unidos y China han sintetizado, también, las dos cadenas de la insulina. R. B. Merrifield y sus colaboradores han desarrollado un ingenioso método, la técnica de la fase sélida, para la sintesis quimica de polipéptidos. En este procedimiento la cadena poli- peptidica se construye resto a resto partiendo del aminoacido C-terminal, el cual se halla anclado covalentemente a una particula de resina s6lida insoluble lo suficientemente grande para que se pueda separar de la fase liquida por filtracién. Los excesos de reactivos de las etapas repetidas se separan por filtracién y mediante lavado de las particulas de resina con los disolventes apropiados, operaciones sencillas que se realizan automaticamente con un aparato programado. Todas Jas reacciones tienen lugar en una misma camara de reaccién, con reactivos afiadidos automaticamente desde recipientes ade- cuados mediante bombas dosificadoras. Una vez finalizada la sintesis de la cadena, se libera de la particula de resina a la que se halla anclada mediante una reaccién que no ataque a los enlaces peptidicos formados (fig. 5-21). Las simples operaciones de filtracién y de lavado entre las diferentes eta~ pas de reaccién y la eliminacién de la necesidad de aislar a los productos intermedios en forma pura, significa que este procedimiento proporciona rendimientos muy elevados en cada etapa y requiere relativamente poco tiempo. La sintesis de la cadena polipeptidica (fig. 5-21) comienza por la unién del grupo carboxilo del resto aminoacido C-ter- minal de la cadena que se va a construir, a Ja particula de la resina insoluble. El siguiente aminoacido a introducir, después de haber bloqueado su grupo amino con el reactivo cloruro de ter-butiloxicarbonilo (fig. 5-22), se deja reaccionar con el grupo amino libre del resto C-terminal en presencia del agente con- densante diciclohexilcarbodiimida (fig. 5-23). Esta reaccién forma un dipéptido con el grupo amino bloqueado, unido covalentemente a la particula de resina insoluble a través del grupo carboxilo C-terminal. A continuacién se separa por aci- dificacién el bloqueante del grupo amino, que se descompone en diéxido de carbono e isobutileno. Estas etapas se repiten ciclicamente muchas veces. Merrifield y sus colaboradores sintetizaron el nonapéptido bradiquinina por este procedimiento automatico, con un rendi- 121PARTE 1 COMPONENTES MOLECULARES DE LAS CELULAS miento global del 85 9%, en 27 horas; la velocidad media de sintesis fue asi de 3 horas por enlace peptidico, Las dos cade- nas de la insulina, fueron sintetizadas por el mismo proce- dimiento; la cadena A (21 restos) necesit6 s6lo 8 dias, y la B (30 restos), solamente 11 dias. Del mismo modo sintetizaron la ribonucleasa de pancreas bovino (124 restos), que es la Primera proteina que se sintetiz6 en el laboratorio a partir de sus componentes aminoacidos. El rendimiento global fue del 18 %. Un segundo grupo de investigadores consiguié si- multéneamente sintetizar ribonucleasa utilizando un camino algo distinto; sintetizaron varios segmentos de la cadena de la ribonucleasa y después los empalmaron. Homopolimeros de aminoacidos Pueden sintetizarse con mucha facilidad cadenas peptidicas de gran longitud, si contienen solamente un tipo de resto ami- noacido, Tales cadenas reciben el nombre de homopolipép- tidos, y constituyen ejemplos de ellas, la poliglicina, la pol Tanina y el Acido poliglutamico. El procedimiento implica el empleo de reacciones de polimerizacién que se automantienen. La longitud del homopolimero puede controlarse por la natu- raleza del iniciador de la reaccién, la temperatura y el disol- vente, Aunque en la naturaleza no se encuentran homopoli- meros de los aminodcidos, éstos han resultado ser compuestos- modelo muy valiosos para el estudio de los diversos pard- metros que influyen en la estructura y en el comportamiento de las cadenas peptidicas, levandonos, por ejemplo, a im- portantes conocimientos de las relaciones entre la rotacién Optica de los péptidos y su estructura secundaria (cap. 6). Resumen El enlace peptidico es el sinico enlace covalente entre los aminodcidos sucesivos del esqueleto de Jas cadenas polipeptidicas. El comportamiento cido-base de un polipéptido esta en funcién de su grupo amino N-terminal, de su grupo carboxilo C-terminal y de aquellos grupos R que puedan jonizarse. La hidrélisis parcial de las cadenas polipeptidicas, mediante ebullicién con Acidos 0 por accién de los enzimas, da lugar a la forma- cién de mezclas de péptidos pequefios, que pueden separarse por electro- foresis o por cromatografia. La hidrélisis completa de una proteina pro- duce todos sus aminodcidos en forma libre, No todas las proteinas rinden todos Jos aminoécidos, ni todos los aminoacides se encuentran con igual frecuencia. Para determinar la secuencia de aminofcidos en una proteina se sepa- ran en primer lugar sus cadenas polipeptidicas después de haber reducido Jos puentes disulfuro a grupos sulfhidrilo, A continuacién se alquilan los restos de cisteina, Se determinan sus restos N- y C-terminales y la com- posicién total en aminodcidos de Ia cadena en un hidrolizado completo. Una muestra de la cadena se escinde parcialmente mediante el empleo de tripsina, que hidroliza los enlaces peptidicos a los que [a lisina o Ja arginina aportan el grupo carbonilo. Se separan los péptidos tripticos, se determina su contenido en aminodcidos y se establece su secuencia nor- malmente mediante Ja degradacién de Edman. Otra muestra, intacta, de la cadena polipeptidica se escinde entonces mediante un segundo método, utilizando quimotripsina, pepsina o bromuro de cianégeno, para producit un conjunto diferente de fragmentos, los cuales son separados y analizados como en la primera ruptura. Del filo- genéticos. Algunas proteinas de funciones diferentes se hallan relaciona- das entre si por homologias de secuencia; por ejemplo, la tripsina y la quimotripsina, Durante la evolucién de las proteinas, sus genes experi- mentan con frecuencia el fenémeno de que su longitud se dobla, 0 dupli- cacién. Se han desarrollado métodos eficaces para la sintesis quimica de polipéptidos. Se han sintetizado guimicamente varios polipéptidos y un enzima. Sus actividades biolégicas confirman la correccién de las estruc- turas de estas proteinas, deducidas por métodos analiticos. Bibliogratia Libros BAILEY, J. L.: Techniques of Protein Chemistry, 2.* ed., American Elsevier Publishing Company, Nueva York, 1967. Valioso compendio de técnicas de laboratorio. DAYHOFF, M, 0.: Atlas of Protein Sequence and Steacture 1972, National Biochemical Research Foundation, Washington, D.C. 1972. Atlas com- pleto de las secuencias aminodcidas de las proteinas, con mucha in- formacién interesante sobre diferencias entre las especies, relaciones evolucionistas y el cédigo genético para los aminoacides, asi como secuencias de RNAs de transferencia. DICKERSON, R. E. y 1 GEIS: The Structure and Action of Proteins, Har- per & Row, Nueva York, 1969. Informe corto y esclarecedor, brillan- temente ilustrado, HASCHEMEYER, R. Hay A. E, Vs HASCHEMEYER: Proteins: A Guide to Study ‘by Physical and Chemical Methods, Wiley, Nueva York, 1973. Ma- nual de metodologia, breve y_prictica. MEANS, G. E., y R. E. FEENEY: Chemical Modification of Proteins, Holden- Day, San Francisco, 1971. NeuratH, H., (ed.): The Proteins: Composition, Structure and Function, 2 ed. vols 15, Academic, Nueva York, 1963-1970. Coleccién de revisiones detalladas. STEWART, J. M., Y J.D YOUNG: Solid-Phase Peptide Synthesis. Freeman, San Francisco, 1969. Breve manual de métodos de laboratorio. Articulos EDELMAN, G. My B.A, CUNNINGHAM, W. E, GALL, P. D. GOTTLIEB, V. RU TISHAUSER, y M. J. WARDEL: , Europ. J. Biochem.. 1, 80-91, 1967, Equipo automatico para la determinacién de secuencias. FRAZIER, W. Ay RH. ANGELETTI y R. A. BRADSHAW:

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